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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

SONIA CARMEN LOPO COSTA

AVALIAÇÃO DA TRANSMISSÃO TRANSPLACENTÁRIA E EFICÁCIA DA

QUIMIOPROFILAXIA CONTRA Anaplasma marginale

ILHÉUS – BAHIA

2012

ii

SONIA CARMEN LOPO COSTA



Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Ciência Animal Orientador: Prof. Dr. Alexandre Dias Munhoz

ILHÉUS – BAHIA 2012

iii

C837 Costa, Sonia Carmen Lopo.

Avaliação da transmissão transplacentária e eficácia da quimioprofilaxia contra anaplasma marginale. / Sonia Carmen Lopo Costa. – Ilhéus, BA: UESC, 2012.

xi, 54 f. : il. ; anexo. Orientador: Alexandre Dias Munhoz. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências e apêndice.

1. Anaplasmose . 2. Carrapato – Controle. 3. Bovino – Doenças. 4. Carrapato como

transmissor de doenças. 5. Boophilus microplus. I. Título.

CDD 636.20896

v

AGRADECIMENTOS

A Deus por me iluminar a cada dia e dar forças, saúde, alegria e perseverança para cumprir todas as tarefas. Ao Senhor dirijo minha eterna gratidão. Aos meus filhos Victor e Lucas, e esposo Luciano, agradeço pelo amor, companheirismo, incentivo, apoio e paciência nos momentos difíceis, por compartilharem comigo os momentos de alegria, por me perdoarem as ausências quando priorizei o trabalho em detrimento a eles, em fim por fazerem parte da minha vida. À minha família agradeço pelo amor, apoio, valores, ensinamentos, que formaram o alicerce do meu caráter e personalidade. Ao meu orientador Professor Alexandre Dias Munhoz, agradeço pelo convite para retornar à vida acadêmica, pois sem este incentivo jamais teria me aventurado por este caminho, pela paciência ao orientar alguém completamente enferrujado neste mister, agradeço pela compreensão com a falta de tempo e ensinamentos, sou muito grata por tudo. Aos meus colegas, amigos e alunos em especial Vanessa Magalhães, Fábio Santos Carvalho, Uillians Volkart de Oliveira e Lucimar Amorin. Ao pessoal do laboratório de análises clínicas Ivanildo dos Anjos Santos, Clebson Pereira de Almeida, Daniele Andrade Mota, Wanessa Camboim pela grande ajuda, não seria possível se não tivessem pessoas como vocês me ajudando. Ao Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Estadual de Santa Cruz e aos orientadores presentes, em especial George Rêgo Albuquerque e Amauri Arias Wenceslau, obrigada pela ajuda.

Aos colegas de trabalho do Centro de Controle de Zoonoses que em muitas ocasiões criaram condições para que eu pudesse dedicar mais tempo ao mestrado.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para a realização

desse trabalho.

vi



RESUMO

Neste trabalho foram realizados dois experimentos. No primeiro experimento

objetivou-se determinar a percentagem de transmissão transplacentária de

Anaplasma marginale em um rebanho composto por bovinos mestiços leiteiros,

naturalmente infectado. Coletou-se o sangue de 60 bezerros até três horas após o

parto e das respectivas mães, ao parto. Utilizando-se PCR/nPCR foi detectado um

percentual de 16,7% de transmissão vertical de A.marginale. No segundo

experimento objetivou-se determinar a efetividade da utilização do dipropionato de

imidocarb como quimioprofilático em bezerros na faixa etária entre 30 e 120 dias,

para isto foram selecionados 18 bezerros divididos aleatoriamente em três grupos:

T1, T2 e controle; foi coletado o sangue e feita a avaliação clínica dos 18 bezerros

selecionados em quatro ocasiões, a primeira no dia do início do experimento (D0)

quando foi também aplicada a primeira dose do quimioprofilático (3mg/kg/PV) em

todos os animais do experimento. A segunda 21 dias após a primeira (D21) quando

o T1 recebeu a segunda dose do quimioprofilático. A terceira 28 dias após o início

do experimento (D28) quando os animais do T2 receberam a segunda dose do

quimioprofilático e finalmente 35 dias após o início do experimento (D35) quando o

grupo controle recebeu a segunda dose do quimioprofilático. Neste período houve

um óbito e dois casos clínicos, todos no grupo controle. Detectamos uma flutuação

da parasitemia de acordo com o momento da aplicação da segunda dose do

quimioprofilático e conclui-se no experimento que a transmissão transplacentária

está presente na região e que o melhor intervalo entre aplicações é o de 21 dias

favorecendo a diminuição da intensidade dos casos clínicos e evitando óbitos por

anaplasmose.

Palavras - Chave: anaplasmose, transmissão transplacentária, quimioprofilaxia.

vii

EVALUATION OF TRANSPLACENTAL TRANSMISSION AND EFFECTIVENESS OF CHEMOPROPHYLAXIS AGAINST Anaplasma marginale

ABSTRACT

In this work, two experiments were conducted. In the first experiment objective was to

determine the percentage of transplacental transmission of Anaplasma marginale in

a herd composed of dairy crossbred cattle naturally infected. To determine this

information was collected blood of 60 calves up to three hours after birth and their

mothers at parturition. Using PCR / nPCR detected a percentage of 16.7% of vertical

transmission of A.marginale. The second experiment objective was to determine the

effectiveness of using dipropionate imidocarb as chemoprophylaxis in calves aged

between 30 and 120 days, were selected for this 18 calves divided into three groups:

T1, T2 and control, blood was collected and performed the clinical evaluation of the

18 calves selected on four occasions, the first, day of the beginning of the experiment

(D0) was also applied the first dose of chemoprophylaxis (3mg/kg/PV) in all animals

in the experiment. The second, 21 days after the first (D21) when T1 received a

second dose of chemoprophylactic. The third, 28 days after the beginning of the

experiment (D28) when the T2 animals received a second dose of chemoprophylaxis

and finally 35 days after the beginning of the experiment (D35) when the control

group received a second dose of chemoprophylactic. In this period there was one

death and two clinical cases, all in the control group, we detect a fluctuation of

parasitemia according to the time of the second dose of chemoprophylaxis and

concluded that to decrease the intensity of the clinical cases and prevent deaths

caused by anaplasmosis, the best interval between injections was 21 days.

Key - Words: anaplasmosis, transplacental transmission, chemoprophylaxis.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Correlação entre Hematócrito e Temperatura detectada pelo

teste de Tukey para os animais do grupo controle no experimento

de quimioprofilaxia contra anaplasmose.

33

2 3

Flutuação das parasitemias medias dos grupos que receberam

quimioprofilaxia e grupo controle ao longo do período

compreendido entre o dia 0 e o dia 35 do experimento.

Gel de agarose com marcador molecular, controle positivo,

controle negativo, duas amostras positivas na PCR e três

amostras negativas na PCR.

34

35

4 Gel de agarose com marcador molecular, controle negativo,

controle positivo e sete amostras positivas na Nested PCR.

35

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela Página

1 Relação dos experimentos que fizeram levantamento epidemiológico do Anaplasma marginale.

20

2 Sequencias iniciadoras (“primers”) para amplificação de DNA de Anaplasma marginale.

28

3 Valores médios e desvio padrão obtidos para os parâmetros hematológicos de bezerros ao nascer e suas mães.

29

4 Valores médios e desvio padrão obtidos para os parâmetros hematológicos de bezerros submetidos a quimioprofilaxia contra anaplasmose entre 30 e 120 dias de idade.

30

5 Valores médios e desvio padrão obtidos para os parâmetros clínicos de bezerros submetidos a quimioprofilaxia contra anaplasmose entre 30 e 120 dias de idade .

32

6 Percentagem de positividade obtidos PCR/nPCR e parasitemia média (%) e desvio padrão determinada pela avaliação dos esfregaços sanguíneos de bezerros submetidos a quimioprofilaxia contra anaplasmose com idades entre 30 e 120 dias.

34

x

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................... 12

2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 14

2.1. BIOLOGIA .............................................................................................................................................14

2.2. PATOGENIA, FISIOPATOLOGIA E SINAIS CLÍNICOS ...................................................................14

2.3. DIAGNÓSTICO .....................................................................................................................................16

2.4. EPIDEMIOLOGIA .................................................................................................................................19

2.5. CONTROLE, PROFILAXIA E TRATAMENTO...................................................................................22

3. OBJETIVOS ........................................................................................ 25

3.1. OBJETIVO GERAL...............................................................................................................................25

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................25

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 26

4.1. LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO ...........................................................................................26

4.2. SELEÇÃO DA PROPRIEDADE ..........................................................................................................26

4.3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................27

4.3.1. EXPERIMENTO 1 ..............................................................................................................................27

4.3.2. EXPERIMENTO 2 ..............................................................................................................................27

4.4. COLHEITA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS .....................................................................28

4.5. EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO E REAÇÃO DE PCR E Nested-PCR (nPCR) PARA DIAGNÓSTICO DE Anaplasma marginale ..............................................................................................29

4.6. AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA ................................................................................................................31

5. RESULTADOS .................................................................................... 32

5.1. RESULTADOS EXPERIMENTO 1 ......................................................................................................32

5.2. RESULTADOS EXPERIMENTO 2 ......................................................................................................33

5.2.1. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E CLÍNICOS .......................................33

5.2.2. AVALIAÇÃO DA QUIMIOPROFILAXIA NA INFECÇÃO POR Anaplasma marginale .............36

xi

6. DISCUSSÃO ........................................................................................ 39

7. CONCLUSÕES .................................................................................... 43

8. REFERÊNCIAS ................................................................................... 44

9. ANEXO A ............................................................................................. 52

10. APÊNDICE A ..................................................................................... 54

12

1. INTRODUÇÃO

O Brasil detém o segundo maior rebanho bovino comercial do mundo,

com mais de 200 milhões de cabeças e uma grande diversidade de raças e

cruzamentos com aptidão leiteira ou de corte (MEISTER; MOURA, 2007;

JESUS-JUNIOR et al., 2008). A cadeia produtiva do leite é um componente

fundamental do agronegócio brasileiro e desempenha função social de extrema

relevância, representada pela fixação de milhares de famílias no campo e a

geração de inúmeros empregos diretos e indiretos (VIANA; FERRAS, 2007).

A tristeza parasitária bovina (TPB) é um complexo de doenças

causadas por infecções com Babesia e Anaplasma, transmitidas principalmente

por carrapatos (Rhipicephalus (Boophilus) microplus) e moscas hematófagas

(Stomoxys calcitrans, tabanídeos, culicídeos), constituindo-se fator limitante ao

desenvolvimento da pecuária nos países tropicais e subtropicais (DE VOS,

1992).

No Brasil, o principal agente etiológico da anaplasmose é a rickettsia A.

marginale (BRITO et al., 2007c). As perdas econômicas são devido à redução

na produção de leite e carne, infertilidade temporária de machos e fêmeas,

custo de tratamentos (LIMA, 1991), gasto com medidas preventivas

necessárias quando se introduz animais de áreas livres em áreas endêmicas,

prejuízos para o comércio internacional e, principalmente, devido à mortalidade

(BRITO et al., 2007c).

Segundo estimativas do Ministério da Agricultura, na pecuária

brasileira, as perdas econômicas associadas aos agentes causais da TPB são

significativas e estimadas em cerca de 500 milhões de dólares anuais (GRISI et

al., 2002). Esta doença é considerada uma das mais importantes na

bovinocultura e um fator limitante para o melhoramento dos rebanhos, em

áreas como Ásia, África e America do Sul os prejuízos causados são estimados

em milhões (KOCAN et al., 2003).

Tendo em vista os grandes prejuízos causados pela TPB à pecuária

regional e nacional, aliado ao fato de que poucos estudos voltados a este tema

foram realizados na Bahia, procurou-se abordar os principais aspectos

13

associados a transmissão, métodos de tratamento, controle e prevenção que

influenciam diretamente na produtividade do rebanho.

14

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. BIOLOGIA

Anaplasma marginale é uma rickettsia morfologicamente caracterizada

como um corpúsculo arredondado ou ovalado, com afinidade por corantes

basofílicos como os derivados do romanovski (BOCK et al., 2006) e encontrado

geralmente na periferia do eritrócito (MASSARD et al., 1998).

O ciclo de A. marginale no bovino começa com a adesão dos

corpúsculos iniciais à superfície dos eritrócitos, sua penetração nessas células

ocorre por meio de invaginação da membrana citoplasmática, onde iniciam a

formação de um vacúolo parasitóforo (CORRÊA, 1983; MASSARD et al.,

1998). A multiplicação de Anaplasma no vacúolo parasitóforo dá-se por divisão

binária e as colônias resultantes (corpúsculos de inclusão) possuem de oito a

dez novos corpúsculos iniciais aptos a infectarem outros eritrócitos. O

crescimento de Anaplasma no interior das hemácias é acompanhado por uma

redução dos fosfolipídios do estroma celular e pelo aparecimento de fragilidade

eritrocitária (CORRÊA, 1983; BARROS et al., 2005).

No caso da anaplasmose, o carrapato R. (B.) microplus é considerado

vetor biológico, uma vez que o Anaplasma marginale se multiplica no intestino

do mesmo (KESSLER, 2001) embora a transmissão direta por fômites

(agulhas, instrumentos cirúrgicos e objetos perfurantes), insetos hematófagos

(tabanídeos, culicídeos e muscídeos) (MASSARD et al., 1998) , e pela via

transplacentária sejam relatadas (CAVALCANTE, 2007; RIBEIRO et al., 1995;

POTGIETER; VAN RESBURG, 1987), porém, há a necessidade de avaliar a

real contribuição destas formas de transmissão na epidemiologia do agente

(KESSLER, 2001).

2.2. PATOGENIA, FISIOPATOLOGIA E SINAIS CLÍNICOS

As raças bovinas, em virtude da sua origem, reagem de forma diversa

frente às infestações por carrapatos. Raças zebuínas apresentam maior

15

resistência genética à infestação por R. (B.) microplus, enquanto que raças

europeias são mais susceptíveis (BRITO et al., 2007b). Essa característica

genética é transmitida aos descendentes, guardando uma proporção com

relação ao grau de sangue, desta forma, animais da primeira geração (F1)

resultantes de cruzamento entre taurino e zebuíno ainda são bastante

sensíveis ao carrapato e às doenças por ele transmitidas (BOCK et al., 2004).

Animais mais jovens são mais resistentes do que os adultos por isto,

quando adquirem a infecção manifestam sinais clínicos mais brandos

(MASSARD et al., 1998). Esta resistência deve-se ao fato de que animais mais

jovens ainda possuem soro e hemoglobina fetal, o que prejudica parcialmente a

multiplicação do hemoparasita e determina uma maior atividade eritropoiética

da medula óssea (FACURY-FILHO et al., 2003). A presença de anticorpos

maternos absorvidos juntamente com o colostro, confere uma imunidade

parcial (MASSARD et al. 1998). Em animais mais velhos, susceptíveis, as

infecções tendem a apresentar maiores parasitemias e anemia mais severa,

podendo apresentar curso agudo ou hiperagudo (GONÇALVES, 2000).

Em áreas endêmicas, com alta população de vetores, os animais são

infectados com A. marginale nos primeiros dias de vida, sendo que o parasita

aparece no exame do esfregaço sanguíneo entre 50 a 74 dias de idade. Desta

forma, devido à precocidade da infecção, o equilíbrio é rapidamente

estabelecido, consequentemente, apresentam parasitemia moderada. O pico

da parasitemia varia de dois a 13% e ocorre de uma a quatro semanas após o

aparecimento das primeiras hemácias parasitadas (ERIKS et al., 1989;

GONÇALVES, 2000). Outros autores relatam que em áreas onde o vetor esta

presente durante todo o ano espera-se que 100% dos bezerros com 3 a 4

meses de idade já tenham sofrido a infecção, embora a doença seja

normalmente inaparente (MASSARD et al., 1998).

Os eritrócitos são removidos da circulação sanguínea por fagocitose no

sistema fagocítico mononuclear, particularmente pelo baço (MASSARD et al.,

1998). Além da remoção de eritrócitos infectados, ocorre também a de não

infectados, devido à presença de auto-hemaglutininas e de opsoninas no soro

dos animais com anaplasmose, que são contra-antígenos da membrana dos

eritrócitos. A anemia nos casos de anaplasmose ocorre de um a seis dias após

16

o pico da parasitemia e parece estar relacionada com a concentração máxima

de anticorpos e auto-hemaglutininas (FACURY-FILHO et al., 2003).

Os bezerros parecem ser os principais reservatórios de A. marginale,

mesmo sem a constatação de sinais clínicos, pois eles apresentam parasitemia

superior a 0,3%, favorecendo a transmissão do hemoparasita de animais

portadores (bezerros convalescentes) para animais susceptíveis principalmente

nas imediações dos estábulos devido à presença maciça das moscas dos

estábulos (S. calcitrans) e carrapatos (R. (B.) microplus) (ZAUGG et al., 1986).

Existem variações antigênicas entre várias cepas de A. marginale o

que pode determinar a ocorrência da doença em animais adultos ou quando os

animais são transferidos para outras regiões (FACURY-FILHO et al., 2003).

Esta variação antigênica foi testada no experimento de Coetzee (2006), onde

foi comprovada uma diferença na resposta ao tratamento com diversos

princípios ativos.

No que diz respeito à transmissão congênita de A. marginale, Norton et

al. (1983) afirmam que esta poderia ser a causa de muitas das mortes

neonatais não diagnosticadas de bezerros. No entanto a informação de que

nenhum dos 12 bezerros que sofreram infecção transplacentária no estudo de

Potgieter e Van Resburg (1987) apresentou sintomatologia clínica de

anaplasmose ate serem esplenectomizados não sustenta a hipótese

levantada por Norton et al. (1983).

Na anaplasmose os sinais observados consistem de anemia hemolítica

extravascular (TERUEL et al.,2009), febre, apatia, desidratação (GONÇALVES,

2011), icterícia (KOCAN et al., 2010) taquicardia, anorexia, perda de peso,

lacrimejamento, dispneia, fadiga, sialorreia, micção frequente, aborto, às vezes

agressividade, podendo levar o animal ao óbito em menos de 24 horas

(VIDOTTO; MARANA, 2001; BOCK et al., 2006).

2.3. DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da anaplasmose em animais com sintomatologia clínica

é baseado nos sinais clínicos, na presença dos carrapatos vetores e no

histórico do rebanho. O diagnóstico laboratorial da anaplasmose evoluiu

consideravelmente, existe hoje uma variedade de testes. A pesquisa de

17

hemoparasitas no esfregaço sanguíneo é um método de baixa sensibilidade,

depende da experiência técnica de quem a faz e de uma alta parasitemia, entre

outros fatores. Entretanto, estão disponíveis técnicas sorológicas como

aglutinação e fixação do complemento (VIDOTTO; MARANA, 2001), a reação

de imunofluorescência indireta (RIFI), ELISA, dot-blot-elisa, western

immunoblotting (OLICHESKY, 2003) além de técnicas de biologia molecular

como a Reação em cadeia da polimerase (PCR) que têm demonstrado uma

melhor eficiência no diagnóstico das hemoparasitoses (CAVALCANTE, 2007).

O exame direto dos parasitas no esfregaço sanguíneo dos animais

infectados é rotineiramente usado para a determinação da espécie envolvida

em casos clínicos. O método mais utilizado é o exame de esfregaços de

sangue periférico corados pelo método de Giemsa (BRITO et al., 2007b). Os

esfregaços devem ser analisados para a determinação do agente e para o

calculo da parasitemia, ou seja, o percentual de hemácias parasitadas

(FACURY-FILHO et al., 2003; SANTANA et al., 2008).

Embora de grande simplicidade e utilidade, a técnica de exame direto

de esfregaço sanguíneo não tem sensibilidade suficientemente para detectar

os animais com baixa parasitemia que se estabeleceram como portadores após

sofrer um quadro clínico de anaplasmose. Do ponto de vista epidemiológico, a

identificação dos animais portadores é fundamental, pois a flutuação que

ocorre na parasitemia é suficiente para permitir a infecção de muitas fêmeas de

carrapatos (BRITO et al., 2007a).

A RIFI, apresenta boa sensibilidade e especificidade, porém, diferentes

níveis de fluorescência, fluorescência inespecífica, rastros de pontos

irregulares, além da subjetividade e fadiga do operador, são inconvenientes

que têm dificultado a padronização de resultados (VIDOTTO; MARANA,2001;

SANTOS et al., 2009).

O teste de ELISA é utilizado para detecção rápida da reação antígeno-

anticorpo. A possibilidade de execução de um grande número de amostras ao

mesmo tempo e a leitura não ser objeto de interpretação subjetiva, além de ser

altamente específico faz com que este teste seja bastante utilizado (MARTINS

et al., 1996). No entanto as técnicas sorológicas não permitem o diagnóstico

18

precoce, uma vez que a resposta imunológica não é demonstrável até 8-10

dias após a infecção parasitária (TABOADA, J.; MERCHANT, 1991).

Técnicas como a RIFI, ELISA (SANTOS et al., 2009), Reação em

cadeia da polimerase (PCR) e Nested PCR (nPCR), apresentam uma maior

sensibilidade e especificidade (VIDOTTO; MARANA, 2001), têm contribuído

significativamente para a realização de estudos mais detalhados sobre a

epidemiologia da doença, permitindo a adoção de medidas profiláticas mais

eficazes (CAVALCANTE, 2007).

Os avanços obtidos na área da biologia molecular possibilitaram o

desenvolvimento de novas técnicas para diagnóstico de parasitas, pois o DNA

permanece inalterado em todos os estágios do ciclo biológico do ser vivo. A

técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), desenvolvida por Mullis

e Faloona (1987) possibilitou o desenvolvimento de técnicas diagnósticas mais

sensíveis e específicas (BRITO et al., 2007a).

Para A. marginale os iniciadores utilizados amplificam um fragmento de

458 pares de base (pb) e possuem a seguinte sequência do gene msp5

Forward: 5’ CGC AGA TCT AGC AAA ATC GGC GAG AGG TTT ACC ACT TC

3’e msp5 Reverse: 5’ GCG CTG CAG TGG CGC AAA ATG CCC GAC ATA CC

3’ (BRITO et al., 2007a). A utilização da PCR tem permitido o diagnóstico

mais confiável da transmissão transplacentária do A. marginale

(CAVALCANTE, 2007). No entanto segundo Coetzee (2006) a PCR não pode

ser encarado como método diagnóstico perfeitamente confiável para

diagnosticar a cura da anaplasmose persistente devido a possibilidade de falso

positivos nestes casos.

O diagnóstico anatomopatológico é presuntivo e efetuado através da

observação das alterações presentes no animal durante a necropsia. As

alterações macroscópicas mais observadas são: mucosas e serosas anêmicas

ou ictéricas, sangue aquoso (VIDOTTO; MARANA, 2001), hepato-

esplenomegalia, vesícula biliar distendida com bile densa e grumosa, rins

aumentados escuros e congestão cerebral (TRINDADE et al., 2011). No

coração: miocárdio pálido, dilatação, hemorragias petequiais no epicárdio

(BOCK et al., 2004).

19

O diagnóstico laboratorial “post-mortem” é realizado através de

impressões sobre lâmina de baço, fígado e cérebro corados pelo Giemsa

(FACURY-FILHO et al., 2003).

2.4. EPIDEMIOLOGIA

A TPB esta amplamente distribuída, principalmente entre os paralelos

32°N e 32°S, regiões tropicais e subtropicais, áreas onde encontra-se presente

o R (B) microplus (MASSARD et al., 1998) sendo que a anaplasmose pode ser

encontrada também em zonas temperadas (KESSLER, 2001).

Defini-se como áreas de estabilidade enzoótica aquelas onde 75% dos

animais com idade acima de nove meses são portadores de hemoparasitos, o

que denota equilíbrio entre imunidade e doença (GONÇALVES, 2000). Isso

indica que a maior parte desses animais adquiriu a infecção ainda como

bezerros (primo-infecção precoce durante a fase mais resistente devido à

imunidade passiva) (FACURY-FILHO et al., 2003). Massard et al. (1998)

relataram que em áreas de estabilidade enzoótica aproximadamente 100% dos

bezerros entre 3 e 4 meses de idade já adquiriu a infecção, embora a doença

seja na maioria dos casos inaparente. A infecção se mantém

assintomaticamente nos animais mais velhos através das reinfecções pela

manutenção da população de R. (B.) microplus, infestando os animais durante

todo ano. Nessas áreas, não são esperados surtos da doença e nem de

mortalidade em animais adultos, pois eles já são portadores (BRITO et al.,

2007a).

Já áreas de instabilidade enzoótica ocorre quando a porcentagem de

animais com sorologia positiva acima de nove meses está entre 20 e 75%

(GONÇALVES, 2000). Esta situação é altamente indesejável, pois indica um

desequilíbrio entre imunidade e doença. A primo-infecção é verificada em idade

avançada, quando os animais já não possuem a imunidade passiva

(MASSARD et al., 1998), ocorrem surtos da doença em animais adultos e,

consequentemente, altas taxas de mortalidade. Isto se deve à ocorrência de

flutuações na população de vetores por condições climáticas desfavoráveis,

manejo ou medidas de controle dos vetores inadequados (BOCK et al., 2004).

20

A relação hemoparasito-hospedeiro influencia diretamente a

epizootiologia da anaplasmose, pois o fator primordial é a imunidade do

hospedeiro que é dependente da especificidade dos anticorpos. No entanto,

não existe uma correlação entre título de anticorpos e o nível de proteção,

sendo a exceção os animais jovens onde espera-se que mesmo baixos títulos

assegurem efetiva proteção (MASSARD et al., 1998).

Em um levantamento epidemiológico envolvendo surtos de TPB no Rio

Grande do Sul foram resgatados os dados de 221 surtos, em 65 (29,41%) foi

observada a presença de A. marginale, e em 21 (9,5%) foi detectada infecção

mista por Babesia sp e A. marginale (ALMEIDA et al., 2006).

Os resultados apresentados por Barros et al., (2005) mostram

condições de estabilidade enzoótica para A. marginale nas regiões de Senhor

do Bomfim, Euclides da Cunha, Uauá e Juazeiro, de acordo com o modelo

matemático desenvolvido por Mahoney (1975).

No Piauí , Souza et al. (2011) utilizou várias técnicas na detecção da

anaplasmose em 202 bovinos e encontrou os seguintes resultados: no

esfregaço sanguíneo foi possível visualizar A. marginale em 77,7% das

lâminas. Na sorologia utilizando-se a RIFI foi encontrada soropositividade para

A.marginale em 89,1% das amostras. Já utilizando o PCR foi possível detectar

os agentes da anaplasmose em 76,2% das amostras. Brito et al. (2007a)

analisaram 1.650 amostras de bovinos na faixa etária entre 4 e 12 messes

oriundas do Estado de Rondônia e detectaram 98,6% de positividade para A.

marginale utilizando a amplificação do gene msp5. No mesmo estudo foram

detectadas 208/225 amostras positivas para A.marginale em amostras oriundas

do Acre, o que corresponde a 92,87% de prevalência. Os resultados

apresentados por Amorin (2011) para o município de Ibicaraí no estado da

Bahia, utilizando para o diagnóstico técnicas moleculares foi de 63,1%, já

através da avaliação do esfregaço sanguíneo das mesmas amostras o

resultado foi de 49,2% das 309 amostras avaliadas (Tabela 1).

21

Tabela 1: Relação dos experimentos que fizeram levantamento epidemiológico

do Anaplasma marginale.

Autor Nº de animais Teste A. marginale

Local

Barros et al. 2005

823 ELISA >97% Senhor do Bonfim, Euclides da Cunha,

Uaua, Juazeiro – BAHIA

Souza et al 2011

202 RIFI 89,10% Piauí

PCR 76,20% Piauí

Esfregaço 77,70% Piauí

Brito et al. 2007a

1.650 PCR 98,60% Rondônia

225 PCR 92,87% Acre

Amorin 2011

309 PCR 63,1% Ibicaraí-BA

Esfregaço 49,2% Ibicaraí-BA

Ribeiro et al. (1995), detectaram através do ELISA a transmissão

transplacentária de A. marginale em 2,06% (2/97) dos fetos examinados em

abatedouro e em 36,36% (4/11) dos bezerros nascidos de vacas inoculadas

durante o terceiro trimestre da gestação, demonstrando assim que na fase

aguda da doença a transmissão congênita seria uma via frequente de infecção.

A alta (15,6%) taxa de transmissão congênita de A. marginale

encontrada por Potgieter e Van Resburg (1987) na África do Sul, indica que

esta forma de transmissão possa ter importância epidemiológica em algumas

regiões.

Utilizando a técnica de Reação em cadeia da polimerase (PCR) e

Nested PCR (nPCR), Cavalcante (2007) detectou a presença de DNA de A.

marginale em 5,89% (1/17) dos bezerros com menos de 24 horas após o

nascimento, evidenciando a ocorrência de transmissão congênita do

hemoparasita.

22

2.5. CONTROLE, PROFILAXIA E TRATAMENTO

O controle da doença inicia-se com uma boa transferência de

imunidade passiva para o bezerro, oferecendo aos animais condições para o

desenvolvimento de uma boa resposta imune autóloga, principalmente por

meio de nutrição adequada e controle de doenças concomitantes

(GONÇALVES, 2000). A importância desta estratégia é claramente

apresentada no trabalho de Pacheco et al. (2004) onde foi demonstrado que

100% dos bezerros (10/10) com baixos teores de imunoglobulina sérica,

indicativo de falha na transferência de imunidade passiva, foram negativos no

ELISA quanto à presença de anticorpos contra A. marginale aos 45 dias de

idade.

No Brasil, é utilizado o controle estratégico dos carrapatos em

determinadas áreas, mas frequentemente, observa-se o uso indiscriminado de

produtos carrapaticidas causando muitas vezes resistência aos princípios

ativos disponíveis (CAMPOS-JÚNIOR; OLIVEIRA, 2005; VIDOTTO, 2002). Os

prejuízos causados pelos carrapatos aos bovinos são decorrentes do

desconforto (irritação), da espoliação constante a que são submetidos, das

lesões da pele, da transmissão dos agentes do complexo “tristeza parasitária”,

dos gastos mensais com insumos e mão de obra necessária para o controle

(FURLONG, 1993; KASAI et al., 2000; ROCHA, 2003). É importante a

manutenção de uma população de carrapatos capaz induzir resposta

imunológica anterior ao aumento da parasitemia, contudo em níveis

economicamente viáveis sem causar prejuízos no desempenho dos bovinos

(FURLONG, 1993; GONÇALVES, 2000).

Vale ressaltar que em um determinado instante, considera-se que

apenas 5% da população de carrapatos esteja sobre os bovinos. Os outros

95% estariam no ambiente. Essa informação é muito importante, pois um

simples tratamento carrapaticida no hospedeiro atinge somente aqueles

carrapatos que estão na fase parasitária naquele momento e surte pouco ou

nenhum efeito na população de carrapatos, que se encontra, na sua maioria,

23

no ambiente. Portanto, é de se pressupor que os programas de controle de

R.(B.) microplus devem ser contínuos, com resultados evidenciados somente a

médio e longo prazo (PEREIRA et al., 2008).

A inoculação de sangue proveniente de animal portador em animais

susceptíveis é provavelmente o procedimento de imunização mais eficaz. Os

animais que são inoculados recebem tratamento com uso de drogas

específicas para evitar o surgimento da doença clínica após a inoculação

(GONÇALVES, 2000).

Vários métodos de vacinação têm sido desenvolvidos e estudados em

condições de laboratório e de campo, baseadas em organismos vivos e mortos,

como medidas imunoprofiláticas contra a anaplasmose bovina (BARROS et al.,

2005). Nos últimos anos esforços tem sido feito para o desenvolvimento de

uma nova geração de vacinas contra anaplasmose baseadas em proteínas da

membrana externa do parasito capazes de induzir resposta imune do

hospedeiro (ARAÚJO et al., 2003).

A quimioprofilaxia baseia-se no uso de drogas específicas em doses

subterapêuticas. As subdoses quimioterápicas permitirão ao animal adquirir a

infecção sem sinais clínicos ou com sinais brandos. Na anaplasmose pode ser

usada a tetraciclina na dose de 2-4mg/kg/PV em 2-4 aplicações em animais a

partir de 30 dias de idade (GONÇALVES, 2000), cloridrato de oxitetraciclina na

dose de 20mg/kg/PV por via intramuscular com intervalos de 7 dias ou

dipropionato de imidocarb (SACCO, 2002) na dose de 5mg/kg/PV, em

aplicação intramuscular com intervalos de 7 dias (KUTTLER, 1986) ou ainda

3mg/kg/PV, por via subcutânea (Imizol®, 2011).

O tratamento específico contra anaplasmose pode ser feito com

tetraciclinas (8 a 11mg/Kg PV por três dias), tetraciclinas de ação prolongada

(20 a 30mg/Kg/PV, dose única por tratamento) ou Imidocarb (3mg/Kg/PV, dose

única por tratamento). Adicionalmente, deve ser feito tratamento de suporte a

base de hidratação, transfusão de sangue, alimentação adequada e correção

da acidose (FACURY-FILHO et al., 2003).

24

A capacidade natural da medula óssea para produção de hemácias é

fundamental para a recuperação do animal. Drogas estimulantes da

eritropoiese devem ser utilizadas, mas podem não ter tempo para agir, nestes

casos a transfusão de sangue deverá ser feita (STOKKA et al., 2000).

Medidas de prevenção e controle dos vetores, principalmente o

carrapato R. (B) microplus, podem ser o ponto estratégico para que a doença

não ocorra, evitando assim grandes perdas econômicas (FURLONG, 1993). O

planejamento estratégico para a prevenção da anaplasmose é difícil e

específico para cada propriedade (STOKKA et al., 2000).

25

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar a transmissão transplacentária de Anaplasma marginale e

avaliar a eficácia da quimioprofilaxia com dipropionato de imidocarb em

rebanhos leiteiros naturalmente infectados.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Realizar o pareamento do diagnósticos molecular de A. marginale em vaca-

bezerro;

- Avaliar os parâmetros hematológicos dos bezerros infectados e não

infectados;

-Determinar a frequência da taxa de transmissão vertical da anaplasmose em

bovino mestiços gir x holandês;

-Avaliar a eficácia da quimioprofilaxia para anaplasmose, em diminuir a

parasitemia e sinais clínicos, em dois tratamentos com dipropionato de

imidocarb com intervalos entre aplicações de 21 e 28 dias e,

- Avaliar os parâmetros hematológicos durante o uso do dipropionato de

imidocarb na quimioprofilaxia da anaplasmose.

26

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO

O estudo foi realizado na fazenda São Pedro, localizada no sul da Bahia,

região cacaueira, no município de Ibicaraí. Geograficamente, o sistema está a

14° 51' 54'' de latitude sul e 39° 35' 16'' de longitude WGr, numa altitude de 270

metros. O valor médio anual da precipitação é de 1.444,9 mm, umidade

relativa do ar de 80% e temperatura de 24ºC (MAPA, 2010).

Na Pesquisa Pecuária Municipal realizada em 2002 (IBGE, 2004) a

microrregião Ilhéus-Itabuna é apontada como a 3º maior bacia Leiteira do

Estado, com um total de 718.990 bovinos, sendo 103.844 vacas ordenhadas e

uma produção de 54.855.000 litros de leite/ano. Segundo a pesquisa Pecuária

Municipal realizada em 2009 (IBGE, 2010) em Ibicaraí há um efetivo bovino de

17.900 cabeças, sendo, aproximadamente, 4.500 vacas ordenhadas com

produção de 2.675 mil litros por dia. A produção de leite tem importância

fundamental em todas as regiões brasileiras, tanto na área econômica quanto

social, ocupa o 4º lugar entre as commodities agrícolas nacionais (IBGE, 2010).

4.2. SELEÇÃO DA PROPRIEDADE

O estudo foi desenvolvido entre outubro 2010 a julho de 2011 em uma

propriedade com histórico de casos clínicos de anaplasmose. A propriedade

selecionada possuí rebanho mestiço voltado à produção de leite. O manejo é

realizado de forma semi-intensiva na forma de pastejo rotacionado, com

suplementação mineral e concentrado de carboidratos e proteínas. As vacas

são ordenhadas duas vezes ao dia através de ordenha mecânica.

O rebanho presente na propriedade é constituído por animais mestiços

(de ¼ Zebu, ¾ Europeu à ¼ Europeu, ¾ Zebu) e o sistema de criação é

extensivo. Os animais são agrupados levando-se em consideração o fato de

estar ou não em lactação.

Após o nascimento os bezerros permanecem com suas mães por 12 a

24 horas para mamarem o colostro, a partir daí permanecem separados das

27

mães 24h por dia, entrando em contato com as vacas apenas durante a

ordenha. Nesta propriedade os bezerros são agrupados por faixa etário-

ponderal. O primeiro lote é de bezerros do nascimento até 80kg. O segundo

lote de bezerros vai dos 80kg até a apartação com bezerros em média pesando

150kg. O terceiro grupo é formado por fêmeas pré-púberes, até 300kg. O

quarto grupo é formado por animais em período reprodutivo que não estão em

lactação e o quinto grupo por vacas em lactação.

4.3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

4.3.1. EXPERIMENTO 1

Foi coletado o sangue de 60 bezerros, entre outubro de 2010 e abril de

2011. As vacas gestantes foram inspecionadas a cada 3 horas no período pré

parto, desta forma as coletas de sangue dos bezerros ocorreram no período

entre o parto e até 3 horas após o parto e de suas respectivas mães, para a

observação da transmissão vertical de A. marginale no rebanho. Os animais

tiveram sua temperatura retal, bem como a coloração da conjuntiva palpebral

avaliada.

4.3.2. EXPERIMENTO 2

Foram colhidas amostras de sangue de 18 bezerros na faixa etária de

36 a 120 dias de idade que estavam recebendo quimioprofilaxia a base de

dipropionato de imidocarb (IMIZOL®, 2011)(3 mg/Kg/PV). Os bezerros foram

selecionados de um grupo de 40 animais de acordo com parâmetros

hematológicos (contagem total de eritrócitos e hematócrito) e da avaliação

clínica (temperatura e coloração da mucosa conjuntiva) normais. A divisão dos

animais nos grupos ocorreu de forma aleatória. Foi colhido sangue, aferida a

coloração da mucosa conjuntiva, temperatura e peso de todos animais em

quatro momentos. A primeira coleta no dia 0 (D0) inicio do experimento, a

segunda coleta 21 dias (D21) após a primeira, a terceira coleta 28 dias (D28)

após a primeira e a quarta coleta 35 dias (D35) após a primeira quando findou

o experimento. Todos os animais receberam a aplicação do dipropionato de

28

imidocarb 3mg/kg/PV no dia inicial do experimento (D0). Na segunda coleta

D21 apenas seis bezerros pertencentes ao grupo T1 receberam a segunda

dose do quimioprofilático. Na terceira coleta D28 apenas os seis animais

pertencentes ao grupo T2 receberam a segunda dose do quimioprofilático. Na

quarta coleta D35 apenas os animais pertencentes ao grupo controle

receberam a segunda dose do dipropionato de imidocarb sempre seguindo a

dose de 3mg/kg/PV. Com o sangue colhido de cada um dos animais foi

realizado hemograma, confecção de esfregaço sanguíneo e realização da

PCR.

Os parâmetros clínicos avaliados foram a temperatura retal e a

coloração da mucosa conjuntiva. Com o intuito de padronizar as informações

sobre a coloração da mucosa conjuntiva nos animais deste experimento,

utilizamos uma escala de 1 a 5 onde o número 1 representa a mucosa

considerada muito pálida e o 5 a mucosa muito corada. A temperatura retal

assim como a coloração da mucosa foram aferidas em cada uma das coletas

de sangue (D0, D21, D28 e D35).

4.4. COLHEITA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

O sangue, dos animais dos dois experimentos, foi obtido por punção

das veias jugular ou coccígea, para o hemograma completo, extração de DNA

e confecção dos esfregaços sanguíneos para determinação direta da

parasitemia em microscopia óptica, utilizando sistema Vacutainer® com vidro

siliconizado, com anticoagulante, com capacidade para 5mL. As amostras

foram acondicionadas em recipiente isotérmico, com gelo reciclável até seu

processamento.

As amostras de sangue foram processadas no Laboratório de Analises

Clínicas Veterinárias da UESC. No hemograma completo realizou-se a

contagem do: número total de leucócitos; número total de eritrócitos; número

total de plaquetas; a determinação da concentração de hemoglobina, do

volume globular; e das proteínas plasmáticas totais, bem como a determinação

dos índices hematimétricos, volume globular médio, hemoglobina globular

média e concentração de hemoglobina globular média, em contador

automático ABX Vet (Horiba™) . Os valores da proteína plasmática total foram

29

obtidos por meio do refratometria manual. A lecometria específica e a

parasitemia foi realizada através de esfregaços sanguíneos fixados em metanol

e corados pelo método Panótico Rápido (LABORCLIN®) ou Giemsa

(BIOTEC®) e posteriormente analisados ao microscópio óptico em aumento de

1000 x. A parasitemia foi estimada, apenas no experimento 2, pela contagem

do número de eritrócitos parasitados em 1000 eritrócitos e o resultado foi

expresso em percentagem.

Após a realização do hemograma, alíquotas de sangue total foram

acondicionados em criotubos plásticos de 2,0 mL, estéreis, em duplicata, e

mantidos a temperatura de -20°C, para posterior extração de DNA.

4.5. EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO E REAÇÃO DE PCR E Nested-PCR (nPCR) PARA DIAGNÓSTICO DE Anaplasma marginale

A extração de DNA das amostras de sangue foi realizada utilizando o

kit QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGENTM), seguindo as recomendações do

fabricante (ANEXO A). As soluções de DNA foram identificadas e mantidas

estocadas em freezer -20C° para posterior amplificação.

As reações de PCR e Nested-PCR (nPCR) foram realizadas utilizando

as sequências iniciadoras (“primers”) descritas por Echaide et al. (1998) que

amplificam no gene msp5 de A. marginale um fragmento de 458 pb na primeira

reação e um fragmento de 345 pb na segunda reação cujas descrições estão

apresentadas na tabela 2.

As reações foram realizadas em tubos de 0,2 mL empregando-se

volume final de 25 µL, sendo a composição no PCR de 5 µL da solução de

DNA das amostras teste, 7 µL de tampão de reação (5X), 3 mM de cloreto de

magnésio (ClMg2), 200 µM dNTPs, 1 µM de cada sequencia iniciadora externa

e 1,25 U de Taq Polimerase (Promega®) e completados com H2O ultrapura

seguindo descrição de Amorin (2011).

Uma vez aplicadas as amostras, os tubos foram submetidos a uma

breve centrifugação e posteriormente colocados em termociclador Biocycler

MJ96G, empregando-se a seguinte sequência de ciclos descrita por Amorin

(2011):

30

1. Desnaturação inicial: 95 °C/5 min

2.a. Desnaturação: 95 °C/1 min

2.b. Anelamento: 65 °C/1 min. 35 ciclos

2.c. Extensão: 73 °C/1 min.

3. Extensão final: 73 °C/1 min.

Para controle positivo das reações foram utilizadas amostras de DNA

de animais do experimento com diagnóstico positivo pelo exame do esfregaço

sanguíneo para A. marginale.

Para a nPCR foram utilizados 2 µL do produto resultante do PCR de

cada uma das amostra, 7 µl de tampão de reação (5X), 3 mM de cloreto de

magnésio (ClMg2), 200 µM dNTPs, 1 µM do primer externo R, 1 µM do primer

interno F e 1,25 U de Taq Polimerase (Promega®) e completados com H2O

ultrapura, até o volume final de 25 µL seguindo a descrição de Amorin (2011).

Realizou-se o nPCR apenas nas amostras negativas na primeira reação.

Uma vez aplicadas as amostras, os tubos foram submetidos a uma

breve centrifugação e posteriormente colocados em termociclador Biocycler

MJ96G, empregando-se a mesma sequência de ciclos utilizada na PCR.

Tabela 2: Sequencias iniciadoras (“primers”) para amplificação de DNA de Anaplasma marginale. Espécie Sequencia Oligonucleotídeos (5'-3') Produto

Amplificado (pb)

A.

marginale

(msp5)

Ext F 5'- gCA TAg CCT CCg CgT CTT TC - 3' PCR - 458*

Ext R 5'-TCC TCg CCT Tgg CCC TCA gA - 3'

Ext R 5'- TCC TCg CCT Tgg CCC TCA gA -3' nPCR - 345*

Int F 5’- TAC ACg TgC CTA CCg ACT TA-3’

Echaide et al. (1998) *pares de base

Para o controle de contaminação, em cada bateria de reações (PCR e

nPCR), foram realizadas duas amostras (controle negativo) semelhante ao

descrito anteriormente à exceção da substituição de DNA por água ultra pura.

A eletroforese dos produtos foi realizada em gel de agarose a 2% em

tampão de corrida TAE (40mM Tris-acetato, 2mM EDTA pH 8,0), corado

posteriormente à corrida com brometo de etídio (0,5µg/mL). Foi aplicado em

31

cada canaleta 12 µL de cada produto, acrescidos de 2 µL de tampão de

amostra (glicerol 40% e azul de bromofenol 0,02%). A corrida foi realizada a 80

V, 180 mA durante 30 min. O comprimento dos produtos amplificados foram

estimados utilizando-se um padrão de pares de base (1 Kb Plus DNA Ladder -

Invitrogen®) em cada gel de corrida. A visualização dos produtos amplificados

foi realizada em transiluminador ultravioleta (UV) L.PIX (Loccus Biotecnologia)

e fotografados por um analisador de imagens acoplado.

4.6. AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA

No experimento um foi utilizado o Teste t de Student para variáveis

paramétricas com nível de significância de 95%. No experimento dois foi

aplicado Teste de Tukey nas variáveis paramétricas com nível de significância

de 95%, o Teste exato de Fisher e o Coeficiente de Spearman nas variáveis

não paramétricas com nível de significância de 95%.

32

5. RESULTADOS

5.1. RESULTADOS EXPERIMENTO 1

Observou-se uma transmissão vertical de 16,7% (10/60) para A.

marginale através da PCR/nPCR em bezerros recém-nascidos, apenas 50%

(5/10) são filhos de vacas também positivas na PCR/nPCR. As vacas

acompanhadas apresentaram 53,3% (31/60) de positividade na PCR/nPCR.

A média e desvio padrão dos parâmetros hematimétricos para cada

categoria estão expostos na Tabela 3, tendo sido observada, durante todo o

experimento, diferença estatisticamente significativa (p>0,05), apenas para o

número de plaquetas aparentemente por motivo idiopático.

Dentre os bezerros acompanhados três bezerros positivos na

PCR/nPCR nasceram apáticos com hipotermia e mucosas pálidas. Um deles

apresentava leve icterícia evidenciada na mucosa vaginal. Todos vieram a

óbito nas primeiras 24 horas após o nascimento. Nestes animais foram

detectados hematócritos de 14%, 15% e 20,2%. Todos os outros bezerros

acompanhados neste experimento apresentaram parâmetros clínicos normais

ao nascer.

Tabela 3: Valores médios e desvio padrão obtidos para os parâmetros hematológicos de bezerros ao nascer e suas mães.

Parâmetros Bezerros Vacas

Positivos Negativos Positivas Negativas

Leucócitos (x103//µL) 8,2±2,0 9,3±3,0 10,7±3,7 10,8±4,8

Eritrócitos(x106/µL) 6,7±2,4 7,5±2,2 6,1±1,1 6,0±1,0

Hemoglobina (g/dL) 9,2±2,7 11,5±6,8 9,8±1,5 10,0±1,8

Hematócrito(%) 29,9±9,0 34,8±7,7 30,2±4,6 30,7±5,0

Plaquetas(x104/µL) 278±158

a 498±251

b 313±159 278±137

Volume globular médio (fl) 45,8±10,7 44,7±8,9 49,9±4,7 50,8±11,5

Hemoglobina Glob.Média(pg) 12,4±1,2 12,0±0,8 15,6±1,3 15,9±1,4

Concent. Hb glob.média (%) 31,0±2,0 30,8±1,8 32,5±0,9 32,5±0,9

Proteínas plas.totais (g/dL) 5,8±0,4 5,7±1,1 7,4±0,7 7,3±0,9

Análise estatística: Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas

(p<0,05) entre os grupos.

33

5.2. RESULTADOS EXPERIMENTO 2 5.2.1. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E CLÍNICOS

A média e desvio padrão dos parâmetros hematimétricos em cada um

dos tratamentos ao longo das diversas coletas estão expostas na Tabela 4, não

sendo observada em nenhum diferença estatisticamente significativa (p>0,05),

durante todo o experimento. De forma semelhante embora o escore médio das

mucosas e a temperatura corporal agrupadas por tratamento apresentem

pequena redução ao longo do tempo, não foi estatisticamente significativa

(Tabela 5), bem como a correlação entre os grupos nos parâmetros escore de

mucosa e média da temperatura corporal.

Houveram três casos clínicos suspeitos de anaplasmose (Temperatura

>40ºC, mucosas pálidas, e hematócrito<20%) ao longo do experimento nos

animais do grupo controle que foram tratados utilizando o protocolo adotado na

propriedade (Oxitetraciclina 20mg/kg/PV + Diaceturato de diminazine

4mg/kg/PV), o primeiro tratamento ocorreu no 24º dia do experimento quando o

animal apresentava 42ºC, mucosas pálidas e hematócrito de 13%, este animal

veio a óbito no 26º dia do experimento; o segundo tratamento ocorreu no dia

25º do experimento quando o animal apresentava 40,8ºC, mucosas pálidas e

hematócrito de 17%, o terceiro tratamento ocorreu no 28º dia do experimento

quando o animal apresentava 41,1ºC, mucosas pálidas e hematócrito de 20%,

ambos animais recuperaram-se. Estas interferências impactaram nos

parâmetros hematológicos da seguinte forma: o animal tratado no 25º dia

apresentou promoção no hematócrito de 17%(D21), 21%(D28) e 33%(D35), o

animal tratado no 28º dia apresentou melhora no hematócrito de 20%(D28)

para 31% (D35) (APÊNDICE A).

34

Tabela 4: Valores médios e desvio padrão obtidos para os parâmetros hematológicos de bezerros submetidos a quimioprofilaxia contra anaplasmose entre 30 e 120 dias de idade.

Parâmetros Médias Tratamento 1 Médias Tratamento 2 Médias Controle

D0 D21 D28 D35 D0 D21 D28 D35 D0 D21 D28 D35

Leucócitos (x10

3//µL)

11,9±4,0 11,2±3,5 11,8±3,1 13,4±4,2 11,7±3,1 12,7±5,1 12,8±3,8 12±3,4 11,5±3,8 13,1±4,7 10,4±3,5 9,2±0,0

Eritrócitos (x10

6/µL)

7,4±1,2 6,3±2,4 6,9±1,5 6,5±1,4 7,2±1,4 6,6±2,2 6,1±1,9 6,5±1,2 7±1,1 5,5±2,2 6,6±1,5 6.9±1,0

Hemoglobina (g/dL)

8,7±1,3 8,5±2,3 9,1±1,5 8,2±1,4 8,6±1,0 8,8±1,5 8,1±1,9 8,6±1,7 8,4±0,9 7±2,6 8,2±2,0 8,4±1,0

Hematócrito (%)

28,2±4,4 27,2±6,7 29,8±4,2 27,2±2,6 28,3±3,4 26,8±5,4 25,7±5,8 29,2±6,2 28,3±1,9 24±7,9 24,5±7,0 25,0±3,8

Plaquetas (x10

4/µL)

450±83 426±177 495±316 423±173 501±195 446±277 516±110 598±395 531±170 506±243 631±175 455±156

Volume Globular médio (fl)

35±1,4 41,8±8,7 39,7±5,3 37,7±3,0 36±6,7 42,7±11,1 40,7±9,3 39±6,0 35±5,9 36,8±4,9 36,5±3,1 36,0±1,0

Hemoglobina Glob.Média(pg)

11,9±0,3 14,1±2,8 13,6±2,0 12,6±0,8 12,3±1,8 14,4±3,5 13,7±2,9 13,4±1,7 12,1±1,5 13,2±1,6 12,4±0,6 12,2±0,7

Concent. Hb glob.média (%)

33,8±1,7 33,6±1,1 34±0,8 33,6±0,7 34,3±2,7 33,8±1,2 34±1,4 34,5±3,2 34,8±1,4 32,7±6,6 34,1±3,2 33,8±1,4

Proteínas plas.totais (g/dL)

6,5±0,5 6,8±0,4 6,7±0,5 6,6±0,4 6,7±0,5 7±0,8 6,6±0,8 6,3±0,6 6,6±0,3 6,6±0,7 6,8±0,6 6,8±0,7

35

Tabela 5: Valores médios e desvio padrão obtidos para os parâmetros clínicos de

bezerros submetidos a quimioprofilaxia contra anaplasmose entre 30 e 120 dias de idade.

Médias dos animais tratados aos 21 dias (T1)

D0 D21 D28 D35

Temperatura Retal (°C)

39,6±0,5 39,7±0,6 39,5±0,8 39,0±0,2

Mucosa conjuntiva

4,2±1,2 3,5±1,0 3,3±1,0 3,7±0,8

Médias dos animais tratados aos 28 dias (T2)

D0 D21 D28 D35


39,8±0,3 39,2±0,3 39,2±0,4 39,0±0,6

Mucosa conjuntiva

4,8±0,8 3,8±1,0 3,8±0,8 3,2±1,2

Médias dos animais do grupo Controle

D0 D21 D28 D35


39,5±0,4 40,2±1,1 39,3±1,2 38,7±0,3

Mucosa conjuntiva

3,8±0,8 3,2±1,5 3,5±1,0 3,3±0,5

Das correlações realizadas entre os tratamentos, parâmetros clínicos,

hematológicos e dos resultados da PCR/nPCR e parasitemia, houve correlação

significativa (p<0,05) apenas entre a temperatura e a parasitemia para os animais do

tratamento 1 e entre a temperatura retal e o hematócrito para os animais do grupo

controle apresentada na figura 1.

Figura 1: Correlação entre Hematócrito e Temperatura detectada pelo teste de

Tukey para os animais do grupo controle no experimento de quimioprofilaxia contra anaplasmose.

36

5.2.2. AVALIAÇÃO DA QUIMIOPROFILAXIA NA INFECÇÃO POR Anaplasma

marginale

Observou-se uma alta positividade (88,3% a 100%) nos três grupos

detectadas tanto na PCR/nPCR (Figuras 3 e 4), quanto no esfregaço sanguíneo, nos

quatro dias de coleta em quase todas amostras (Tabela 6), a exceção do T1 em D28

e D35 que obtiveram 0% de positividade no esfregaço sanguíneo . Na parasitemia

média dos grupos tratados verificou-se (Tabela 6 e Figura 2) uma redução nos

valores após a segunda dose do quimioprofilático. No 26º dia do experimento veio a

óbito um animal do grupo controle que havia apresentado a maior parasitemia de

todos os animais que constituíam o experimento (6,65%, D21), o que influenciou na

redução da parasitemia do grupo controle no dia 28 e 35. No 28º dia do experimento

outro animal apresentou hipertermia (41,1ºC), mucosas pálidas e hematócrito de

20% e foi clinicamente assistido para TPB (Oxitetraciclina 20mg/kg/PV+ Diaceturato

de diminazine 4mg/kg/PV), com declínio da sua parasitemia de 3,76% no dia 28

para 0% no dia 35 do experimento (APÊNDICE A).

Tabela 6: Percentagem de positividade obtidos PCR/nPCR e parasitemia média (%)

e desvio padrão determinada pela avaliação dos esfregaços sanguíneos de bezerros submetidos a quimioprofilaxia contra anaplasmose com idades entre 30 e 120 dias.

Tratamento Coleta PCR/nPCR Esfregaço

Positivo Negativo Parasitemia

Tratamento 1

Dia 0 83,3%(5/6) 16,7%(1/6) 1,13±0,88

Dia 21 100%(6/6) 0%(0/6) 0,47±0,02

Dia 28 83,3%(5/6) 16,7%(1/6) 0,00±0,0

Dia 35 100%(6/6) 0%(0/6 ) 0,00±0,0

Tratamento 2

Dia 0 83,3%(5/6) 16,7%(1/6) 0,76±0,36

Dia 21 83,3%(5/6) 16,7%(1/6) 2,08±1,74

Dia 28 83,3%(5/6) 16,7%(1/6) 2,72±1,72

Dia 35 100%(6/6) 0%(0/6) 1,67±0,15

Controle

Dia 0 100%(6/6) 0%(0/6) 2,22±1,66

Dia 21 100%(6/6) 0%(0/6) 3,51±2,74

Dia 28 100%(4/4) 0%(0/4) 2,46±1,14

Dia 35 100%(3/3) 0%(0/3) 2,30±0,57

37

A relação de positividade na PCR/nPCR em relação ao esfregaço foi de

2,4:1 pois obteve-se 65/70 (92,86%) amostras positivas na PCR/nPCR e apenas

27/70 (38,6%) esfregaços positivos (Apendice A).

Figura 2: Flutuação das parasitemias medias dos grupos que receberam

quimioprofilaxia e grupo controle ao longo do período compreendido entre o dia 0 e o

dia 35 do experimento.

38

Figura 3: Gel de agarose 2% apresentando amplificados do PCR de Anaplasma

marginale com 458pb. Colunas: 1 - marcador molecular (1Kb Plus DNA ladder); 2 - controle positivo; 3,5 e 7 amostras negativas; 4 e 6 amostras positivas; 8 controle negativo.

Figura 4: Gel de agarose 2% apresentando amplificados do nPCR de Anaplasma marginale com 345pb. Colunas: 1 - marcador molecular (1Kb Plus DNA ladder); 2 - controle negativo; 3, 4, 5 e 7 amostras positivas; 6 amostra negativa; 8 controle positivo.

39

6. DISCUSSÃO

A transmissão transplacentária tem sido relatada na maioria dos casos em

infecções agudas, experimentais (RIBEIRO et al.,1995; KESSLER, 2001;

POTGIETER; VAN RENSBURG, 1987), no entanto a transmissão por vacas

cronicamente infectadas tem sido registrada em estudos observacionais (NORTON

et al., 1983; POTGIETER, VAN RENSBURG, 1987), o que corrobora com o

observado no presente estudo, onde a transmissão ocorreu em vacas que não

tiveram histórico de anaplasmose clínica registrado na propriedade.

A comparação dos resultados referentes a transmissão transplacentária em

diferentes estudos remonta a necessidade da avaliação da área de estudo, manejo

dos animais, presença de vetores, susceptibilidade do hospedeiro, tipo de infecção e

teste utilizado para o diagnóstico. No presente estudo como todos os fatores são

favoráveis a manutenção constante da infecção nos rebanhos, associados a uma

técnica de diagnóstico sensível, nos permite supor que o percentual encontrado

possa ser o comumente observado nestas condições.

Diante do exposto, o resultado de 5,9% (1/17) observados por Cavalcante

(2007) possa ser em função da raça dos animais ser Nelore e a baixa infestação de

carrapatos relatada, enquanto que os 36,36% (4/11) relatada por Ribeiro et al.

(1995) possam ser em função do uso de um teste sorológico, que avalia exposição e

não a presença do agente. Neste contexto os resultados observados por Potgieter e

Van Rensburg (1987) de 15,7% dos bezerros positivos em vacas infectadas

experimentalmente no primeiro, segundo ou terceiro trimestre de gestação, mas que

se mantiveram com o curso crônico da doença foram semelhantes aos deste estudo,

sendo possível que a transmissão nesta pesquisa tenha ocorrido em qualquer

trimestre da gestação, o que justificaria 50% de mães negativas no momento do

parto.

No experimento de Potgieter e Van Rensburg (1987) nenhum dos bezerros

positivos apresentou sintomatologia clínica até serem esplenectomizados. No

entanto segundo Norton et al. (1983) no caso de A. marginale a transmissão

congênita poderia ser a causa de muitas das mortes neonatais não diagnosticadas

de bezerros. No presente estudo detectou-se sinais clínicos e hematológicos

40

sugestivos de anaplasmose em três animais positivos que vieram a óbito após o

nascimento, o que remete a importância epidemiológica desta forma de transmissão.

A quimioprofilaxia com utilização do dipropionato de imidocarb utilizada

também por Costa et al. (2005), permite controlar não só a anaplasmose mas

também a babesiose, é uma prática comum na região deste estudo, que apresenta

clima quente e úmido durante todo o ano, não apresentando períodos desfavoráveis

ao desenvolvimento e multiplicação dos vetores de A. marginale possibilitando a sua

transmissão de forma contínua ao longo do ano.

Nestas áreas o período de maior suscetibilidade é o de 30 até 120 dias de

idade devido à janela imunológica descrita por Pacheco et al. (2004) que ocorre a

depender da eficiência na transferência de imunidade passiva no momento da

colostragem entre 12 e 60 dias após o nascimento. Madruga et al. (1985),

demonstraram em seu estudo que a proporção de bezerros sorologicamente

negativos aumentou aos 30 dias e atingiu o máximo aos 60 dias, como resultado

detectou as mais altas parasitemias aos 90 dias, por isto espera-se que 100% dos

bezerros com 3 a 4 meses de idade já tenham sofrido a infecção (MASSARD et al.,

1998), assim os resultados deste estudo demonstraram que para esta faixa etária o

dipropionato de imidocarb em intervalos de 21 dias, evita o surgimento de casos

clínicos e reduz a parasitemia ao esfregaço, embora não tenha sido capaz de

diminuir a identificação do parasito através da PCR/nPCR.

Diversos autores pesquisaram os resultados da quimioprofilaxia com a

utilização de produtos como enrofloxacina (COETZEE et al., 2006), oxitetraciclina e

dipropionato de imidocarb (COSTA et al., 2005; KUTTLER, 1986). Coetzee et al.

(2006) testaram a utilização de enrofloxacina, oxitetraciclina e dipropionato de

imidocarb na eliminação da infecção persistente por A. marginale visando animais

para exportação, utilizaram aplicações semanais, concluíram que a enrofloxacina

não foi efetiva, e o dipropionato de imidocarb e a oxitetraciclina tiveram êxito em

25% dos casos não sendo portanto indicados para quimioesterilização, mas em

todos os casos houve redução das parasitemias. Kuttler (1986) testou a

oxitetraciclina e o dipropionato de imidocarb, duas doses com intervalo de 7 dias,

com uso quimioprofilático, concluiu que ambos aumentaram o período prepatente da

anaplasmose mas não impediram o estabelecimento de parasitemia detectável e o

surgimento de casos clínicos após a aplicação. Costa et al. (2005) testaram a

utilização de dipropionato de imidocarb como quimioterápico em bezerros aos 15 e

41

30 dias de idade, concluiu que o medicamento não impediu o surgimento de casos

clínicos de anaplasmose, mas reduziu a severidade dos sinais clínicos

apresentados. Para o presente estudo foi feita a opção pelo dipropionato de

imidocarb em função de ser efetivo também contra babesiose, não optamos pela

oxitetraciclina por ser este um principio ativo largamente utilizado na bovinocultura

de forma curativa e, portanto não seria pertinente oportunizar o desenvolvimento de

resistência a este principio ativo.

Ocorreram ao longo do trabalho três casos com suspeita clínica de TPB no

grupo controle. A suspeita clínica foi baseada na presença de hipertermia acentuada

e palidez da mucosa conjuntiva. A análise laboratorial indicou na ocasião

hematócrito menor que 20% e parasitemia maior que 3,5% em dois dos animais.

Esta informação corrobora os resultados obtidos por Coelho (2007) que

correlacionou o pico de hipertermia com o pico da parasitemia e com a queda do

hematócrito em animais inoculados com A. marginale.

No primeiro caso clínico deste experimento, apesar de já ter recebido a

primeira dose do quimioprofilático 26 dias antes e de ter sido assistido clinicamente

no momento quando a sintomatologia clínica foi detectada, o animal veio a óbito. No

entanto os dois outros casos clínicos ocorridos no período do experimento

responderam prontamente ao tratamento e recuperaram-se. Casos clínicos após a

aplicação da quimioprofilaxia também foram relatados por Costa et al. (2005) tendo

sido de menor intensidade e menor número no grupo tratado quando comparado ao

grupo controle.

Melo et al. (2001) demonstraram em seu trabalho o aumento da ocorrência

de infecções por A. marginale em épocas do ano quando o clima é favorável à

proliferação de seus vetores. As dificuldades em controlar a população de

carrapatos nesta região, seja devido à crescente resistência destes aos produtos

disponíveis no mercado (CAMPOS JÚNIOR; OLIVEIRA, 2005; FURLONG et al.,

2007), seja pela dificuldade em implementar o método de controle estratégico

recomendado por Prata et al. (2008) devido à instabilidade do clima, seja pelo risco

de resíduos em produtos de origem animal (IN 42, 1999) vem provocando um

desequilíbrio na população destes vetores, como o carrapato R. (B.) microplus e

insetos hematófagos (tabanídeos, culicídeos e muscídeos). Uma vez que bezerros

portadores de parasitemia superior a 0,3% funcionam como reservatórios

favorecendo a transmissão do hemoparasita principalmente nas imediações dos

42

estábulos devido à presença maciça das moscas dos estábulos (S. calcitrans) e

carrapatos (R. (B.) microplus) (ZAUGG et al., 1986;). As flutuações na parasitemia

neste experimento demonstram a importância da quimioprofilaxia, com intervalos de

21 dias por levarem a parasitemias não detectáveis no esfregaço ou níveis que

impossibilitem ou minimizem a transmissão mecânica.

Por fim, a utilização de técnicas moleculares para o diagnóstico de

hemopasitoses vem colaborar com o aumento na capacidade de detecção de

infecções incipientes, portadores assintomáticos e transmissão transplacentária. No

presente estudo, em função da característica da região e faixa etária dos animais, a

alta positividade observada na PCR/nPCR e no esfregaço sanguíneo já eram

esperadas, já que o intuito da quimioprofilaxia não é o de eliminar por completo o

parasito do organismo do hospedeiro, mas de reduzir as taxas de parasitemia de

forma que não ocorram casos clínicos de anaplasmose ou que estes sejam mais

brandos (GONÇALVES, 2000; COSTA et al., 2005).

Quando comparados os percentuais de positividade obtidos na PCR/nPCR

àqueles verificados na parasitemia determinada no esfregaço sanguíneo foi possível

verificar a maior sensibilidade da técnica molecular em detrimento ao método

tradicional. Resultados semelhantes foram obtidos por Cavalcante (2007) que

detectou parasitemia em 11,9% das amostras e DNA do parasito em 40,3% das

amostras. Neste experimento as amostras que foram positivas na PCR/nPCR e

negativas na lâmina foram consideradas como parasitemias muito baixas e por este

motivo não foram detectadas no esfregaço sanguíneo.

Pelo cenário descrito neste experimento, sugere-se que o equilíbrio entre

parasita e hospedeiro esperado em áreas consideradas de estabilidade enzoótica

para anaplasmose como esta, depende também de um equilíbrio perfeito entre

natureza, manejo, e seus principais vetores, representados nesta área

principalmente pelo R. (B.) microplus.

43

7. CONCLUSÕES

Com base nos resultados dos experimentos pode-se concluir que:

1. A transmissão transplacentária de A. marginale tem importância epidemiológica

neste estudo.

2. A utilização da quimioprofilaxia com dipropionato de imidocarb, em intervalos de

21 dias, em bezerros com 30 a 120 dias, não permitiu casos clínicos de

anaplasmose e reduziu a parasitemia, possibilitando uma menor infecção dos

vetores e consequentemente uma diminuição da transmissão.

44

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52

9. ANEXO A

Protocolo de Extração de DNA de sangue

Providências importantes antes de começar:

Todas as etapas de centrifugação são executadas em temperatura ambiente

(15-25°C)

Equilibrar a temperatura de todos os componentes à temperatura ambiente.

Aquecer o banho-maria à 56°C para uso na etapa 4.

Equilibrar o tampão AE ou água destilada à temperatura ambiente para

eluição na etapa 11

Certificar de que o tampão AW1, Tampão AW2 e QUIAGEN protease foram

preparados de acordo com as instruções.

Se houver formação de precipitado no tampão AL, incubar à 56°C.

Procedimento

1. Pipetar 20µl de QUIAGEN protease (ou proteinase K) para o ependorf de

1.5ml

2. Acrescentar 200µl da amostra ao ependorf.

3. Acrescentar 200µl do tampão AL à amostra. Misturar no vórtex por 15s. Para

se obter uma lise eficiente, é essencial que a amostra e o tampão AL sejam

bem misturados de forma a obter uma solução homogênea.

4. Incubar à 56°C por 10min.

5. Breve centrifugação no ependorf 1.5ml para remover gotículas da tampa e

laterais

6. Acrescentar 200µl de etanol (96-100%) à amostra, misturar no vórtex por 15s.

Após a mistura, centrifugar no ependorf para remover gotículas da tampa e

laterais

7. Cautelosamente transferir a mistura da etapa 6 para a Mini Coluna sem

umedecer a borda. Fechar a tampa e centrifugar a 6.000 x g (8000 rpm) por

1min. Colocar a coluna num novo tubo de 2ml, e descartar o tubo contendo o

filtrado. Se o material lisado não tiver passado completamente pela coluna

53

após a centrifugação, centrifugue outra vez numa velocidade maior ate a

coluna ficar vazia.

8. Cuidadosamente abra a coluna e acrescente 500µl do tampão AW1 sem

umedecer as bordas. Feche a tampa e centrifugue a 6.000 x g (8.000 rpm)

por 1min. Coloque a coluna num novo tubo de 2ml, e descarte o tubo

contendo o filtrado.

9. Cuidadosamente abra a coluna e acrescente 500µl do tampão AW2 sem

umedecer as bordas. Feche a tampa e centrifugue a 20.000 x g; 14.000 rpm)

por 3min.

10. Recomendação: Coloque a coluna num novo tubo (não fornecido) ou

despreze o conteúdo e recoloque o mesmo tubo, leve para uma nova

centrifugação na velocidade máxima por 1min.

11. Posicione a coluna num tubo de 1.5ml (não fornecido) e descarte o tubo com

o filtrado. Cuidadosamente abra a coluna e acrescente 200µl do tampão AE

ou água destilada. Encubar na temperatura ambiente por 1min (5min), e

centrifugue a 6.000 x g (8.000 rpm) por 1min.

54

10. APÊNDICE A

Relação da Temperatura, hematócrito, parasitemia, PCR, nPCR de todos os bezerros submetidos a quimioprofilaxia em todas as coletas. Coleta Trat. No.Animal T°C HTCm Lâmina PCR Nested Coleta Trat. No.Animal T°C HTCm Lâmina PCR Nested

D0 T1 1 39,8 28 1,75 P P D0 T2 10 40,2 28 1,01 P

D21 T1 1 40 29

P P D21 T2 10 39,6 30 4,04 P

D28 T1 1 39,7 33

P P D28 T2 10 38,8 33 5,3 P

D35 T1 1 39,3 28

P P D35 T2 10 38,7 38 1,8 P

D0 T1 2 39,8 27

P

D0 T2 11 39,6 25 0,5 P

D21 T1 2 39 17

P

D21 T2 11 39,6 23 1,49 P

D28 T1 2 39,6 22

P

D28 T2 11 39,8 23 1,47 P

D35 T1 2 39 22

P

D35 T2 11 40 30

P

D0 T1 3 39,6 36

P

D0 T2 12 39,4 32

N N

D21 T1 3 39,6 38

P

D21 T2 12 38,8 33 0,71 P

D28 T1 3 39,3 32

P

D28 T2 12 39,5 21

P

D35 T1 3 38,8 29

P

D35 T2 12 39,3 20 1,5 P

D0 T1 4 39,4 26 0,5 P

D0 Cont. 13 39,4 30

P

D21 T1 4 40,6 26

P

D21 Cont. 13 39,8 22

P P

D28 T1 4 38,6 32

P

D28 Cont. 13 38,6 25 1,61 P P

D35 T1 4 38,8 27

P

D35 Cont. 13 38,4 27 2,7 P P

D0 T1 5 38,8 29

P

D0 Cont. 14 39,8 28 3,23 P P

D21 T1 5 39,8 27 0,45 P

D21 Cont. 14 39,6 33 1,6 P P

D28 T1 5 38,8 32

N P D28 Cont. 14 38,9 35 2,01 N P

D35 T1 5 38,9 29

P

D35 Cont. 14 39 38 1,9 N P

D0 T1 6 40,2 23

N N D0 Cont. 15 39,6 30

P P

D21 T1 6 39,2 26 0,48 P

D21 Cont. 15 39 29

P P

D28 T1 6 40,8 28

N N D28 Cont. 15 38,6 27

P P

D35 T1 6 39 28

P

D35 Cont. 15 38,7 24

P P

D0 T2 7 40 26

P P D0 Cont. 16 39 29 0,3 P

D21 T2 7 39,2 21

P P D21 Cont. 16 39,8 30 2,27 P

D28 T2 7 39 33 4,11 P P D28 Cont. 16 41,1 20 3,76 P

D35 T2 7 38,5 33

P P D35 Cont. 16 39,1 31

P

D0 T2 8 40 33

P

D0 Cont. 17 39 28

N P

D21 T2 8 39 22

N N D21 Cont. 17 40,8 17

P

D28 T2 8 39,2 21 0,01 N N D28 Cont. 17 38,5 21

P

D35 T2 8 38,8 25

P

D35 Cont. 17 38,5 33

P

D0 T2 9 39,6 26 1 P

D0 Cont. 18 40 25 3,13 P

D21 T2 9 39 32

P

D21 Cont. 18 42 13 6,65 P

D28 T2 9 39,1 23

P

D28 Cont. 18

D35 T2 9 38,7 29 1,7 P

D35 Cont. 18

universidade estadual de santa cruz sonia … · using pcr / npcr detected a percentage of 16.7% of...

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