UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

EFEITOS DO ESTRESSE CRÔNICO NA

LINFOPROLIFERAÇÃO E NA PRODUÇÃO IN VITRO

DE IFN-gama E IL-10 POR CÉLULAS DO BAÇO

E DO TIMO DE RATOS HIPOTIREOIDEANOS

Paula Regina Santana Moreira

Salvador – Bahia 2006

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

EFEITOS DO ESTRESSE CRÔNICO NA

LINFOPROLIFERAÇÃO E NA PRODUÇÃO IN VITRO

DE IFN-gama E IL-10 POR CÉLULAS DO BAÇO

E DO TIMO DE RATOS HIPOTIREOIDEANOS

Paula Regina Santana Moreira

Orientadora: Profa. Dra. Maria José Pedreira de Ramalho

Co-Orientadora: Prof a. Dr a. Songeli Menezes Freire

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Imunologia.

Salvador – Bahia

2006

2

M838 Moreira, Paula Regina Santana, Efeito do estresse crônico na Linfoproliferação e produção in vitro de IFN-gama e IL-10 por células do baço e timo de ratos hipotireoidianos / Paula Regina Santana Moreira . – Salvador, 2006. 000 f. ; il. Orientadora: Profa. Dra. Maria José Pedreira de Ramalho. Co-Orientadora: Profa. Dra. Songeli Menezes Freire.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Imunologia, 2006. 1. Estresse crônico. 2.Hipotireoidismo. 3. Citocinas. 4. Linfoproliferação. 5. Interleucina-10. 6. IFN-gama. 7. Timócitos. 8. Esplenócitos. I. Ramalho, Maria José Pedreira de. II. Freire, Songeli Menezes. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. IV. Titulo. CDU: 616.441-008.64

3

Considerações gerais Este trabalho faz parte da linha de pesquisa em Neuroimunoendocrinologia (NIE)

com ênfase na Fisiologia do Estresse, desenvolvido em laboratório pela Profa.

Dra. Maria José Pedreira de Ramalho, do Departamento de Ciências da

Bioregulação do ICS-UFBA. As dosagens hormonais foram realizadas com a

colaboração do Laboratório de Neuroendocrinologia da USP/Ribeirão Preto,

coordenado por Prof. Dr. José Antunes-Rodrigues. O projeto foi desenvolvido em

parceria com o Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (Labimuno) do

Departamento de Ciências da Biointeração do ICS-UFBA, coordenado por Prof.

Dr. Roberto Meyer.

Este presente Projeto foi realizado com apoio financeiro PRONEX -

Laboratório de Ribeirão Preto -, do Labimuno-ICS-UFBA, do Programa de Pós-

Graduação em Imunologia – UFBA e do Laboratório do Hospital Santa Isabel.

Ao longo do período de execução desta pesquisa, os seus resultados parciais

foram apresentados nos seguintes eventos nacionais:

1- CIBANIM 2005 - I Congresso Ibero-americano de Neuroimunomodulação - RJ

com apresentação do pôster:

Chronic Stress Effects on Production of Il-10 and IFN-γ

in Spleen and Thymus of Thyroidectomized Rats.

Autores: Moreira PRS, Amoedo MK, Rodrigues TT, Roseghini R, Rocha

DS, Vale V, Paule B, Freire SM, Ramalho MJP.

Local do Evento: Rio de Janeiro – RJ.

Data: 10 a 13 de abril de 2005.

4

2-Congresso da SBI – MG com apresentação do pôster:

Chronic Stress Effects on Production of IL-10 and IFN-γ

in Spleen and Thymus of thyroidectomized Rats

Autores: Moreira PRS, Amoedo MK, Rodrigues TT, Roseghini R, Rocha

DS, Vale V, Paule B, Freire SM, Ramalho MJP.

Local do Evento: Centro de Artes e Convenções da Universidade Federal

de Ouro Preto, Ouro Preto-MG, Brasil

Data: 4 a 7 de outubro de 2004.

5

6

"A ausência de evidência não significa evidência da ausência". Carl Sagan - Astrônomo americano

7

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Anita, min

ha mãe. Um nome que diz tudo em minha vida. Um exemplo de como o amor

pode ser infinito.

8

AGRADECIMENTOS

Agradeço: A Profa. Dra. Maria José Pedreira de Ramalho, pela sua rica orientação neste

trabalho e pelo seu grande exemplo de vida. Ela é merecedora do meu respeito e

da minha admiração.

A Profa Dra. Songeli Menezes Freire, por sua contribuição valiosa para a

realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Roberto Meyer, coordenador do Labimuno, pessoa de alma brilhante

e sempre pronto a ajudar.

A Dra. Ângela Maria D’Oliveira, chefe do Laboratório Lutz-Hospital Santa Isabel,

pelo incentivo e apoio para a realização deste mestrado.

A Johnson & Johnson® Company, e sua assessora científica Tatiana Lícia de

Carvalho Oliveira, pelo apoio material.

A Profa Tereza Bittencourt, professora de Bioestatística do PPGIm, pelo suporte

estatístico e boa vontade em me atender nas horas mais impróprias.

A Prof Luiz Calumbi, professor de português, pelas correções preciosas do

português.

A Profa. Lilia Ferreira M. Costa, sempre paciente em tirar minhas dúvidas.

A todos os funcionários do Laboratório de Imunologia do ICS, continuamente

gentis em atender aos meus pedidos.

A todos os funcionários do Biotério da Universidade de Feira de Santana (UEFS),

em especial ao Dr. Orestes, veterinárioconstantemente prestativo e cuidadoso no

fornecimento dos ratos e a Profa Dra. Suzi, coordenadora desse Biotério, por sua

generosidade e apoio aos experimentos.

9

Aos funcionários do Laboratório da Fiocruz, em especial a José Fernando de

Oliveira Costa, pelo suporte técnico para a leitura das placas de Linfoproliferação.

Ao pessoal do Laboratório de Imunologia do HUPES: Ângela, Tânia Luna,

Josiane, Márcia, Paulo, pela infinita paciência e pelo companheirismo.

Aos Professores do PPGIm , pelos importantes ensinamentos ministrados.

Aos Prof. Dr. José Antunes-Rodrigues, chefe do Laboratório de

Neuroendocrinologia da USP/Ribeirão Preto, pelas colaborações nas dosagens

dos hormônios.

A Sra. Dilcéia Reis Santana, secretária do PPGIm, pela paciência em me atender

mesmo nos dias mais impróprios.

Aos meus queridos colegas e eternos amigos do mestrado e, em especial Soraia

Trindade, Lívia Pugliese, Paulo Juiz, Alexandre Pinheiro, Milene Salomão, Bruno

Paule, Zoraida Oliveira, Robson Bahia e Renato Carminati.

A minha amiga Vera Vale, companheira de muitos experimentos, pelo apoio nas

horas difíceis. Seu comportamento é, também, um exemplo a ser seguido.

A Renata Rosheginni, companheira em vários experimentos, nos inesquecíveis

domingos e feriados dedicados a esta pesquisa.

Aos meus queridos colegas e amigos do Hospital Santa Isabel, pela imensa

paciência nos meus momentos de puro cansaço.

A Rosana Sousa minha irmã de alma, sempre presente em todos os meus

momentos alegres ou tristes também.

A Tânia T. Rodrigues, uma verdadeira doutora, de opiniões perspicazes,

inteligentes e fundamentais para a realização deste trabalho.

10

A Maurício Amoedo, estudante de iniciação científica, um verdadeiro amigo,

sempre pronto a sacrificar seus horários de folga em meu auxílio neste labor.

As minhas amigas Nalva e Terezinha mais que amigas verdadeiras, irmãs, que

sempre estão ao meu lado.

A minha prima Jússiara, um ser humano belo por dentro e por fora, com que

tenho o privilégio de conviver nesta vida.

A José, um amigo para a eternidade.

A Miguel Setúbal, um ser humano brilhante no saber viver, irmão de outras vidas.

A Rogério Santos-Jesus aos ricos ensinamentos em estatística e que iniciou

comigo o sonho.

A Guido, paciente ao tolerar meus momentos de estresse, e pelo amor sem

cobranças.

A minha família, base de tudo que sou hoje.

A minha mãe pelo amor incondicional a mim devotado.

11

I. RESUMO Em situações de estresse, o organismo age com o objetivo de restabelecer o equilíbrio interno ameaçado. A persistência da situação e das ações antiestresse, por longos períodos, causa prejuízos ao organismo. O aumento da secreção das catecolaminas pelo sistema simpático e a secreção de glicocorticóides, por ativar o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal durante o estresse, são regulados através de mecanismos de retroalimentação. No entanto, apesar da adaptação do sistema neuroendócrino, no estresse crônico as conseqüências são inúmeras, entre elas a diminuição de algumas funções do sistema imune. Este trabalho avaliou os efeitos do estresse crônico na linfoproliferação e na produção de citocinas no baço e no timo de ratos hipotireoideanos. Ratos Wistar, divididos em dois grupos, normais (N) e tireoidectomizados (TX), foram colocados em tubos de contenção durante 2 horas por dia, por 14 dias. No 15º dia, os ratos foram sacrificados para coleta do baço e do timo para posterior proliferação celular e dosagem de citocinas. Amostras de sangue foram coletadas para dosagem de triiodotironina (T3), tiroxina (T4), prolactina (PRL) e corticosterona (CORT). Os resultados mostram aumento na secreção de PRL nos ratos N estressados quando comparados com os ratos N (p<0.05). Em ratos TX, o estresse foi incapaz de elevar os valores de PRL que permaneceram similares aos dos ratos TX não-estressados. Em ambos os grupos, N e TX, os níveis de CORT não se alteraram após 14 dias de estresse. Em relação à produção de citocinas estimulada pelos três mitógenos, os esplenócitos dos ratos N e TX não estressados, produziram IL-10 de forma similar. Já os ratos N e TX estressados, produziram menos IL-10 quando comparados com os ratos N não-estressados e sob estímulo de Con A. A produção de IFN-γ pelos esplenócitos não foi alterada pelo estresse nos ratos N e nos ratos TX. Os timócitos dos ratos N e TX não-estressados produziram de forma semelhante IL-10, estimulados por Con A e PWM. No entanto, nos ratos estressados menores concentrações foram achadas. Os ratos N, TX e N estressados produziram de forma semelhante IFN-γ sob estímulo dos dois mitógenos. Já os ratos TX estressados produziram menos IFN-γ comparado aos outros grupos. Entre os ratos N e TX não-estressados a capacidade linfoproliferativa foi semelhante nos esplenócitos e nos timócitos. O estresse crônico reduziu a capacidade linfoproliferativa dos esplenócitos estimulados com Con A, em ambos os grupos N e TX, ou seja, a função das células T do baço estava deprimida pelo estresse crônico nesse paradigma experimental. Já no timo, a capacidade linfoproliferativa apenas foi afetada nos ratos TX estressados. Esses resultados demonstram que períodos prolongados de estresse ativam o eixo hipotálamo–hipófise-adrenal e, logo após, ocorre um controle por retroalimentação desse eixo, demonstrado pelos baixos índices de corticosterona. Isto é provado pelo estado de estresse crônico nos ratos do experimento - mesmo tendo a prolactina aumentada nos ratos normais, fato explicado por a prolactina ser um hormônio hipofisário com um controle diferente do que ocorre com a corticosterona. Portanto, o estresse por longos períodos, acarreta em imunossupressão da produção de citocinas por células localizadas no baço e no timo, importantes centros de maturação e proliferação de células do sistema imune.

12

II. ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1: Produção de T3 nos ratos N e TX submetidos ao estresse crônico. 48

Figura 2: Produção de T4 nos ratos N e TX submetidos ao estresse crônico.

Figura 3: Produção de prolactina nos ratos submetidos ao estresse crônico. 51

Figura 4: Produção de corticosterona nos ratos submetidos ao estresse crônico

Figura 5: IL-10 produzida in vitro por células esplênicas, estimuladas com ConA,

provenientes dos ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob

estresse crônico ou não.

59

Figura 6: IL-10 produzida in vitro por células tímicas, estimuladas com ConA,

provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob

estresse crônico ou não.

64

Figura 7: IL-10 produzida in vitro por células tímicas, estimuladas com PWM,

provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob

estresse crônico ou não.

65

Figura 8: IFN-γ produzido in vitro por células tímicas, estimuladas com Con A,

provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob

estresse crônico ou não.

66

Figura 9: IFN-γ produzido in vitro por células tímicas, estimuladas com PWM,

provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob

estresse crônico ou não.

67

Figura 10: Linfoproliferação in vitro medida por incorporação de timidina

triciada (cpm) de células esplênicas, estimuladas com ConA, provenientes de

ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico

ou não.

73

Figura 11: Linfoproliferação in vitro medida por incorporação de timidina triciada

(cpm) de células tímicas, estimuladas com ConA, provenientes de ratos

normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou

não.

74

13

III. LISTA DE TABELAS

PáginaTabela 1: IL-10 produzida in vitro por células esplênicas de ratos normais

eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. 57

Tabela 2: IFN-gama produzido in vitro por células esplênicas de ratos normais

eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não.

58

Tabela 3: IL-10 produzido in vitro por células tímicas de ratos normais

eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não

62

Tabela 4: IFN-γ produzido in vitro por células tímicas de ratos normais

eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não.

63

Tabela 5: Linfoproliferação medida por incorporação de timidina triciada in vitro

de células esplênicas provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou

tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não.

71

Tabela 6: Linfoproliferação medida por incorporação de timidina triciada in

vitro de células tímicas provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou

tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não.

72

14

IV. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACTH hormônio Adrenocorticotrófico

ADE adrenalina

APCs células apresentadoras de antígeno

AVP vasopressina

BBB barreira hemato-encefálica

BSA albumina sérica bovina

µCi microcurie

CORT corticosterona

CRH hormônio liberador de corticotrofina

Células Th1 células T helper (auxiliares) tipo 1

Células Th2 células T helper (auxiliares) tipo 2

Con A concanavalina A

cpm contagem por minuto

EDTA ácido etileno diamino tetracético

ELISA nsaio imunoenzimático (enzyme linked immmunosorbent assay)

µg micrograma

ng nanograma

pg picograma

GM-CSF fator estimulador de colônia de granulócito e monócito

GC glicocorticóides

GH hormônio do crescimento

HHA eixo Hihotálamo-hipófise-adrenal

HHT eixo hipotálamo-hipófise-tireóide

IL-6 interleucina -6

IL-10 interleucina-10

IL-12 interleucina-12

IFN-γ interferon-gama

Ig imunoglobulinas

µL microlitro

LPS lipopolissacarídeo

15

hPL lactogênio placentário humano

mL mililitro

MHC complexo de histocompatibilidade principal

NK célula matadora natural (natural killer)

N ratos normais

NA noradrenalina

N+EA ratos normais submetidos a estresse agudo

N+EC ratos normais submetidos a estresse crônico

OMS organização mundial de saúde

PAMPs padrões moleculares associados a patógenos

PBS salina tamponada com fosfato

PSN penicilina estreptomicina neomicina

PWM mitógeno pokeweed

PRL prolactina

POMC pró-opiomelanocortina

RPMI meio de Cultura (roswell park memorial institute)

SNC sistema nervoso central

TCD4+ células T expressando marcador CD4 na membrana celular

T CD8+ células T expressando marcador CD8 na membrana celular

TNF-β fator de necrose tumoral β

T3 triiodotironina

T4 tiroxina

TLR receptor do tipo toll like

TRH hormônio liberador de tireotrofina

TSH hormônio estimulante da tireóide

TX ratos tireoidectomizados

TX+EA ratos tireoidectomizados submetidos a estresse agudo

TX+EC ratos tireoidectomizados submetidos a estresse crônico

NOS núcleo supra-ótico

16

SUMÁRIO Página

I. Resumo 10

II. Índice de Figuras 11

III. Lista de tabelas 12

IV. Lista de Abreviaturas 13

V. Introdução 17

VI. Revisão Bibliográfica 1. O estresse

2. O eixo HHA

3. O eixo autônomo

4. Aspectos gerais do sistema imune

5. O timo

6. O baço

7. Modelos de estudos linfoproliferativo

8. A produção de citocinas

9. IL-10

10. IFN-gama

11. O sistema imune – endócrino

12. Os efeitos do estresse no sistema imune

13. Os corticosteróides

14. As catecolaminas

15. A prolactina

19 19 21 24 25 26 27 28 30 32 33 34 34 35 37 38

VII. Objetivos 1. Objetivo Geral

2. Objetivos específicos

40

VIII. Hipóteses 1. H0

41

17

2. H1

IX. Material e Método

1. Animais

2. Tireoidectomia

3. Protocolo de estresse de imobilização

4. Preparação das células esplênicas e tímicas e condições de cultura

5. Dosagem de citocinas

6. Ensaios de linfoproliferação

7. Coleta de sangue

8. Ensaios hormonais

9. Análise estatística

42 42 43 43 44 45 45 46 46 47

X. Resultados e Discussão

1. Hormônios

Prolactina

Corticosterona

T3/T4

2. Citocinas

Produção de IL-10 por células no baço

Produção de IFN-γ por células no baço

Produção de IL-10 por células no timo

Produção de IFN-γ por células no timo

3. Linfoproliferação

Capacidade linfoproliferativa por células no baço

Capacidade linfoproliferativa por células no timo

48 48 49 51 53 56

61

70

XI. Conclusões 77

XII. Referências Bibliográficas 78

18

V. INTRODUÇÃO

Os seres vivos convivem com o meio ambiente em equilíbrio dinâmico. Em

situações de estresse, este equilíbrio é abalado. Para restabelecer o equilíbrio

ameaçado, o organismo lança mão de diversas ações. Entretanto, a persistência

das situações que geraram o estresse e a própria atuação conseqüente e crônica

das ações antiestresse prejudicam o organismo. O estresse é um problema de

ordem mundial. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), mostram que o

estresse afeta mais de 90% da população mundial, sendo considerado uma

epidemia. Na verdade, sequer é uma doença em si - sim uma forma de adaptação

e proteção do corpo contra agentes externos ou internos.

O conjunto de ações que o organismo monta para combater o estresse

envolve inicialmente o hipotálamo, que ativa o sistema nervoso autônomo

simpático. O hipotálamo secreta, também, alguns neurotransmissores, como a

dopamina, anoradrenalina e o fator liberador de corticotrofina. Este último

estimula a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) pela hipófise, que

também aumenta a produção de outros hormônios, tais como ADH, prolactina,

hormônio somatotrófico (GH - hormônio de crescimento) e o hormônio tireotrófico

(TSH). O ACTH estimula as glândulas supra-renais a secretarem glicocorticóides.

Além disso, as glândulas adrenais aumentam a liberação de adrenalina. Os

hormônios do estresse, cortisol e a adrenalina, aceleram os batimentos cardíacos,

dilatam as pupilas, aumentam a sudorese e as concentrações de glicemia,

reduzem a digestão - e ainda o crescimento e o interesse pelo sexo -, contraem o

baço - que expulsa mais hemácias para a circulação sangüínea - e causam a

19

imunodepressão. A função dessa resposta fisiológica é preparar o organismo para

a ação imediata, que pode ser de “luta” ou de “fuga”.

Na fase de adaptação, o organismo tenta reparar os danos causados pela

reação inicial ao estresse agudo e controlar a sua resposta por mecanismos de

retroalimentação. No entanto, se o agente estressante permanecer ou se repetir,

se instalará o estresse crônico. Este, conseqüentemente, provoca falha dos

mecanismos de adaptação, déficit nas reservas de energia e disfunções das

defesas imunológicas.

Os hormônios da tireóide, essenciais para a manutenção da secreção

circadiana dos hormônios associados ao estresse, tem um significante impacto no

sistema imune. O hipotireoidismo está associado com diminuição do timo e com

a diminuição de linfócitos circulantes (DORSHKIND & HORSEMAN, 2000). Outros

estudos revelaram que baixas concentrações dos hormônios tireoideanos

reduzem a síntese de mRNA para o CRH e o POMC (RITTENHOUSE E

COLABORADORES, 1997). No entanto, as interações entre o estresse crônico, o

sistema imune e a resposta neuroendócrina em ratos hipotireoideanos, ainda não

estão bem elucidadas.

Em trabalhos realizados no laboratório de imunoneuroendocrinologia, provou-se

que os hormônios tireoideanos são essenciais para uma liberação normal de PRL

e CORT durante o estresse agudo por imobilização em ratos (RODRIGUEZ E

COLABORADORES, 2003).

O presente estudo avaliou o efeito do estresse crônico na linfoproliferação

e na produção de citocinas no baço e no timo de ratos. É de relevância oportuna e

hodierna, portanto, aprofundar os conhecimentos acerca das conseqüências do

20

estresse crônico sobre as funções imunes de organismo metabolicamente

alterado devido à deficiência de hormônios tireoideanos comparando ao

organismo normal submetido às mesmas condições de estresse.

VI. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1. O ESTRESSE

O organismo se empenha para manter o equilíbrio interno em meio ao

ambiente em que vive. Este equilíbrio pode ser quebrado por ameaças físicas ou

psicológicas. A qualquer ameaça à estabilidade interna, o organismo contra-ataca

com várias ações, proporcionando condições para o seu próprio

restabelecimento. Entretanto, quando as ações montadas pelo organismo se

tornam exacerbadas em intensidade e duração, podem ocorrer doenças

emocionais ou somáticas (STRATAKIS, 1999).

As ações montadas pelo organismo para combater o estresse, denominada

por Selye como “Síndrome de Adaptação Geral” são várias, e relativamente

específicas quanto ao tipo de estresse que as gerou. Contudo, essa

especificidade é perdida de acordo com a intensidade do estresse. Os

mecanismos de resposta ao estresse levam às seguintes alterações no indivíduo:

• Mobilização da energia corporal para as funções cerebrais e musculares;

• Aguçamento da percepção e do foco da atenção no perigo;

• Aumento da taxa de perfusão cerebral e do conseqüente maior uso de glicose

pelo cérebro;

• Aumento dos batimentos cardíacos e respiratórios e da redistribuição do fluxo

sanguíneo com aumento da energia livre para o cérebro e músculos;

21

• Modulação da função imune;

• Inibição das funções reprodutivas;

• Diminuição do sono e do apetite.

Os sistemas acionados no organismo contra estímulos considerados como

ameaças ao equilíbrio são basicamente coordenados em duas áreas do cérebro -

no hipotálamo e no tronco cerebral. Logo, simultaneamente o eixo Hipotálamo-

Hipófise-Adrenal e o Sistema Nervoso Simpático (locus ceruleus / medula

espinhal / adrenal) são estimulados a liberar glicocorticóides e catecolaminas na

corrente sanguínea (CHROUSOS, 1999, STRATAKIS, 1999; TSIGOS, 2002).

Alterações cognitivas como o aumento da vigilância e do alerta, do

comportamento defensivo e da agressividade são processos coordenados nas

estruturas do sistema límbico, que incluem o hipocampo, a amígdala e o córtex

pré-frontal (BLACK E COLABORADORES 2003). Com o aumento da liberação de

catecolaminas e de cortisol na corrente sanguínea, ambos mobilizam mais

energia de forma rápida para o cérebro. Todavia, os glicocorticóides além de

mobilizar energia, eles regulam a reação inflamatória e a impede de se tornar

disruptiva em vez de protetora.

22

O esquema simplificado acima é baseado no esquema proposto por

Chrousos, representando os sistemas acionados durante o estresse e suas

relações (ELENKOV, 1999).

2. O EIXO HIPOTÁLAMO HIPÓFISE ADRENAL

Quando a situação é percebida pelo organismo como ameaçadora o

hipotálamo estimula a secreção de ACTH pela hipófise, este age no córtex

adrenal instigando a secreção de glicocorticóides. O hipotálamo secreta o

hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e a vasopressina (AVP). Estes

hormônios comandam o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA). A região no SNC

responsável por regular a hipófise e a adrenal é o núcleo paraventricular (PVN),

localizado no hipotálamo. O PVN é a principal fonte de CRH, que controla a

secreção de ACTH pela adenohipófise. O PVN é dividido em duas partes: a

divisão magnocelular (mPVN) e o parvocelular (pPVN).

HIPOTÁLAMO (PVN)

TRONCO MEDULA CEREBRAL ESPINHAL (LC) (SNC)

GC ADRE

CORTEX ADRENAL

ACTH

MEDULA ADRENAL

RESPOSTAS HORMONAL E NEURAL

GANGLIOS SIMPÁTICOS

ACETILCOLINA

NA

23

O mPVN, junto com núcleo supraótico (NOS), formam os neurônios

magnocelulares, que secretam o AVP e a ocitocina para a neurohipófise. Já o

pPVN é a principal fonte dos neurônios hipofisiotróficos, que liberam CRH para a

circulação portal, terminando na adenohipófise. Os neurônios hipofisiotróficos

também produzem uma quantidade de AVP, que interage sinergicamente com o

CRH, para estimular a secreção do ACTH. O AVP sozinho não é eficaz para

estimular o ACTH, mas é um importante fator sinérgico junto com o CRH

(CHROUSOS, 1999).

O AVP, ou hormônio antidiurético, além de agir sinergicamente com o CRH

na liberação de ACTH, desempenha várias funções - tem ação antidiurética nos

rins, diminui a perspiração e faz a constrição das arteríolas, elevando a pressão

arterial. O objetivo é conservar água e regular a tonicidade dos líquidos corporais.

Essas ações são importantes nas situações em que o equilíbrio está ameaçado

por perda de sangue ou ainda quando é necessária a conservação de água no

organismo em locais inóspitos (BLACK, 1994).

O CRH interage com receptores acoplados à superfície das células

corticotróficas (CRF-R1), o que resulta na síntese de ACTH a partir do precursor

pró-opiomelanocortina (POMC) e de outros peptídeos derivados do POMC. O

ACTH é potente indutor da secreção de glicocorticóides (GC) da zona fasciculada

do córtex adrenal (TURNBULL E COLABORADORES, 1999). Devido à

diversidade das situações de estresse a que o corpo pode se expor, o pPVN

recebe informações de várias regiões do cérebro, de receptores viscerais,

somatosensoriais, auditivos, nociceptivos e visuais e também informações

provenientes das regiões límbicas, envolvidas com as emoções. São informações,

24

inclusive, provenientes de um núcleo dentro do hipotálamo (hipotálamo anterior

pré-ótico) e de áreas fora do hipotálamo, localizados dentro e fora da barreira

hemato-encefálica (BBB). (TURNBULL E COLABORADORES, 1999). Todas

estas ações geralmente estão condicionadas por um curto período de tempo, com

efeitos mais benéficos do que danosos. Porém, no estresse crônico, como o CRH

coordena adaptações do comportamento, do neuroendócrino e da adaptação

autônoma durante as situações de estresse, seu aumento prolongado pode levar

a várias patogenias como a depressão melancólica e a imunodepressão

(DHABHAR, 1997;TSIGOS, 2002).

Os glicocorticóides mobilizam energia e mantém sob controle a resposta

inflamatória deflagrada durante o estresse. Os níveis geralmente retornam ao

normal duas horas após o início do estresse. Na fase inicial da resposta, agentes

de ação rápida como as catecolaminas, os neuropeptídeos, e os próprios

glicocorticóides, contribuem para rápida resposta, configurada pelo aumento do

alerta, da atenção e mobilização da energia para o cérebro, coração e músculos.

Gradualmente, ocorre a transcrição de genes para receptores mineralocorticóides

(MRs) e glicocorticódes (GRs), o que mantém o sistema de resposta ao estresse

ativado por mais tempo. Os receptores MRs são os responsáveis pela

manutenção do sistema neuronal ativo durante a fase de estresse. Já os GRs,

além de sua importância para o restabelecimento do equilíbrio, conduzem o

armazenamento das informações adquiridas durante o estresse, que poderão ser

utilizadas em situações futuras (KLOET, 2005).

O CRH também faz com que a adenohipófise secrete o hormônio

estimulante da tiróide (TSH). O TSH estimula a glândula tireóide a secretar os

25

hormônios tireoideanos - a tiroxina (T4) e a triiodotironina (T3) -, que estimulam o

metabolismo aumentado da glicose a produzir ATP, fornecendo-o para as células

ativas. São duas as formas conhecidas - T4, um pró-hormônio, e o T3, um

hormônio biologicamente ativo, que interage com receptores nucleares nas

células e age na diferenciação celular ativando o metabolismo energético. Os

hormônios da tireóide aumentam o metabolismo basal - BMR ou taxa metabólica

basal - pelo aumento do consumo de oxigênio celular para produção de ATP em

repouso, estimulam a enzima que mantém a bomba Na+/K+ ATPase - importante

para a manutenção da temperatura corporal normal -; e aumentam a síntese de

proteínas e o uso de glicose para produzir ATP (SMITH E COLABORADORES,

2002).

Os hormônios da tireóide também são necessários para a manutenção dos

níveis de ACTH e glicocorticóides, sendo envolvidos com a resposta adaptativa

ao estresse (TSIGOS, 2002). Em modelos animais de hipotireoidismo, foram

encontrados níveis reduzidos de POMC e mRNA de CRH, diminuição das

glândulas adrenais e baixos níveis de corticosterona plasmática (SHI, 1994).

3. O EIXO AUTONOMICO

O sistema nervoso autônomo reage rapidamente ao estímulo estressante,

com alterações cardíacas, respiratórias, renais e gastrointestinais. A inervação

simpática nos órgãos periféricos tem origem nos neurônios pré-ganglionares, da

coluna intermediolateral da medula espinhal. Estes nervos fazem sinapse com

neurônios pós-sinápticos localizados nos gânglios simpáticos, que inervam vários

órgãos e tecidos como os músculos, a vasculatura, o coração, o fígado e o

intestino. Os neurônios pré-ganglionares utilizam como neurotransmissor a

26

acetilcolina, já os neurônios pós-ganglionares são principalmente noradrenérgicos

e atuam nas células-alvo no local de liberação. Com o estímulo do estresse, o

sistema nervoso autonômico, aumenta a secreção de adrenalina, via as adrenais,

para a corrente periférica, atuando sobre células-alvo distantes. O locus ceruleos

é a principal fonte noradrenérgica no tronco cerebral. Os neurônios deste núcleo

enviam fibras nervosas para praticamente todas as áreas do SNC (medula

espinhal, cerebelo, áreas límbicas e córtex).

As catecolaminas elevam a pressão arterial e o débito cardíaco, além de

mobilizar energia para os tecidos de relevância para a defesa imediata do

organismo. A noradrenalina (NA) também ativa a amígdala, principal núcleo

cerebral responsável pelo comportamento relacionado com o medo, bem como

fundamental agente no armazenamento da memória emocional em sítios límbicos

(TSIGOS, 2002).

4. ASPECTOS GERAIS DO SISTEMA IMUNE

Os componentes celulares envolvidos na defesa inata e adaptativa do

sistema imune são vários. Podem ser citadas as células apresentadoras de

antígeno ou APCs (linfócitos B, células dendríticas, macrófagos), linfócitos T

CD4+, linfócitos T CD8+, que agem promovendo respostas imunes celulares e/ou

humorais a depender do tipo de antígeno. As células exterminadoras naturais

(células NK), descritas como não T e não B, envolvidas principalmente na defesa

inata, juntamente com os outros linfócitos citados anteriormente, são somadas as

células de tecido conjuntivo e, excepcionalmente, a algumas células epiteliais,

27

para compor as estruturas e tecidos dos órgãos do sistema imune (ELENKOV,

1999; LODISH, 2000).

Linfócitos T CD4+ tipo Th1 promovem uma resposta imune do tipo celular

devido ao perfil de citocinas produzidas - IFN-γ, TNF-β e IL-12 - que agem

basicamente contra bactérias intracelulares. Estas três citocinas também

estimulam a síntese de óxido nítrico e outros mediadores inflamatórios.

Os linfócitos T CD4+ tipos Th2 produzem um perfil distinto de citocinas,

como IL-10, IL-4, IL-13 e IL-5 que levam a um tipo de resposta denominada

humoral, muito importante na proteção contra bactérias extracelulares e toxinas.

Também na resposta a alérgenos. Respostas Th1/Th2 são mutuamente

inibitórias. Citocinas IL-12 e IFN-gama - perfil Th1 - inibem resposta Th2, assim

como citocinas IL-10 e IL-4 - perfil Th2 - inibem a resposta Th1. A dominância do

tipo de resposta Th1/Th2 dependerá do microambiente de citocinas produzidas

durante o ataque do patógeno ao hospedeiro (KANG E COLABORADORES,

2005).

Dentre os órgãos do sistema imunitário mais utilizados para estudos in vitro,

pode-se citar o timo e o baço. O timo é um órgão linfocitário, classificado como

primário ou central. O baço, no animal adulto, é considerado órgão linfocitário

secundário, apesar de desempenhar como a de hemocaterese, fundamental para

a manutenção do equilíbrio fisiológico e da homeostase do organismo.

5. O TIMO

O timo é um órgão bilobulado, encapsulado, com septos que o dividem em

lóbulos, que por sua vez consistem de córtex e medula, com uma rica irrigação

vascular e vasos linfáticos eferentes que drenam para os linfonodos

28

mediastínicos. Dispersas por todo o timo, além dos linfócitos T, estão células

reticulares epiteliais, células dendríticas interdigitantes (IDC), outras células do

conjuntivo e macrófagos. Na medula tímica, encontram-se os corpúsculos de

Hassall descritos como células reticulares epiteliais em espiral (JANEWAY, 2002).

No timo, a maioria dos timócitos nos vários estágios de maturação, sofre

seleção positiva no córtex e negativa na medula. As células T maduras saem da

região medular tímica para os órgãos linfóides secundários, via circulação

sangüínea. A inervação do timo é feita pelo sistema nervoso simpático, por via

noradrenérgica, principalmente nas regiões dos timócitos maduros e células

epiteliais tímicas (TEC), também nas zonas perivasculares e parenquimais

(CHROUSOS, 1999).

6. O BAÇO

O baço é um órgão que coleta antígenos do sangue e também se desfaz de

células vermelhas senescentes. É irrigado pela artéria esplênica, que penetra no

hilo e se divide em ramos progressivamente menores - cápsula, septos e

parênquima. No baço encontramos seu parênquima rico em diferentes tipos de

células. Os aglomerados linfóides e a bainha periarteriolar compõem a polpa

branca . O restante do parênquima é definido como polpa vermelha. A camada

linfóide periarteriolar contém, principalmente, células T e células dendríticas,

revestidas por uma coroa de células B. Há, também ali, uma organização de

cordões de macrófagos e plasmócitos (BLACK, 2000).

O baço apresenta inervação simpática com terminações que abrangem as

áreas dos linfócitos. Foram identificados dois tipos de adrenoceptores - o tipo alfa

29

(α-AR) e o tipo beta-2 (β2–AR) -, que tornam o baço susceptível às catecolaminas

(HENNINGER, 1995). O baço também apresenta receptores para glicocorticóides

(GRs) tanto do tipo I como do tipo II, que variam por sua afinidade pela

corticosterona. O Tipo I, que tem maior afinidade, não é achado no timo. O tipo II,

com menor afinidade, porém sendo mais disperso nos órgãos imunes, é

encontrado no baço, no timo e nos linfonodos. A presença destes receptores

indica que o sistema imune é sensível à ativação do eixo HPA e que os linfócitos,

em vários órgãos imunes, são diferentemente afetados por estressores (BAUER e

COLABORADORES, 2001).

7. MODELOS DE ESTUDO DE LINFOPROLIFERAÇÃO

Um modelo de estudo de linfoproliferação reflete a ativação proliferativa de

linfócitos sob ação de diversos estímulos, específicos ou inespecíficos. Ligações

específicas entre o receptor de superfície de um linfócito e um ligante

desencadeiam a transdução de sinal que se inicia por interações membrana-

citoesqueleto seguido de ativação da fosfolipase C e hidrólise do fosfatidil inositol

4,5-difosfato (PIP2) em inositol-trifosfato (PIP3) e diacilglicerol (GDA). Isto

provoca aumento da concentração de cálcio citoplasmático com conseqüente

ativação da proteína quinase C e ativação gênica. Tal processo de sinalização

pode produzir uma série de modificações nos linfócitos - como redistribuição e

expressão de novos receptores de superfície, secreção de linfocinas e anticorpos,

motilidade celular, interações célula-célula e início de divisão celular (TAYLOR e

colaboradores, 2004). Esta habilidade dos linfócitos de responderem a ligantes

30

particulares também in vitro faz da linfoproliferação uma ferramenta útil para o

estudo da imunidade mediada por células.

Várias moléculas tem sido utilizadas como substitutas para o estímulo

antígeno específico para células B e T. Entre as mais utilizadas estão as lectinas

ou mitógenos. O termo mitógeno se aplica a qualquer substância capaz de induzir

divisão celular por mitose, também denominada de transformação blástica

(ASHRAT e colaboradores, 2003). As lectinas, são derivadas de plantas, se ligam

a grupos de carboidratos na membrana das células B e T. Entre elas encontram-

se a Phytohemaglutinina (PHA) e a Concanavalina A (Con A) extraídas de

leguminosas, que estimulam preferencialmente células T, e o Pokeweed (PWM),

extraído de Phytolacca americana, mitógeno estimulador tanto de células B

quanto T. Outros mitógenos comumente utilizados são os produtos bacterianos

como o lipopolissacarídeo (LPS) e o da cepa I do Staphylococcus aureus Cowan

(SAC), ambos estimulantes de células B, e também o toxóide tetânico e a

Candida albicans mitógenos específicos de células T (ASHRAF e colaboradores,

2003).

Os lipopolissacarídeos são moléculas anfipáticas, presentes em alguns

microrganismos como as bactérias gram-negativas, são importantes na ativação

humoral após ligação a receptores tipo Toll (TLR), presentes em diferentes

células do sistema imune. Os TLR reconhecem uma ampla variedade de ligantes,

chamados padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Esta interação

pode ativar tanto células B quanto células T (MEDZHITOV, 2001). As diferenças

de ação dos mitógenos estão provavelmente associadas a mudanças nos eventos

iniciais de transdução de sinal após a ligação das lectinas (ASHRAF e

31

colaboradores, 2003). No caso do LPS de E. coli, na cascata iniciada pela ligação

do LPS ao TLR que envolve CD14 e a proteína ligante do LPS (LPB), há uma

série de proteínas acessórias como MD2, MyD88, IRAK e TRAFs (MEDZHITOV,

2001).

Pelo fato de os linfócitos proliferarem, preferencialmente, em resposta a

determinados antígenos, medidas de proliferação tem sido amplamente aplicadas

na Imunologia Clínica. Ensaios de linfoproliferação são utilizados para descrever

anormalidades associadas a imunodeficiências congênitas, câncer,

envelhecimento, doenças infecciosas, desnutrição, estresse, choque e doenças

autoimunes bem como na pesquisa terapêutica de tais desordens (ASHRAF e

colaboradores, 2003).

A principal vantagem do trabalho com estes mitógenos foi sua abrangência

celular de ativação, pois não houve desafio bacteriano ou viral especifico. Com

isso avaliou-se o comportamento de células do baço e do timo diante de um

estado alterado do organismo - o hipotireoidismo sob condição de estresse. A

ativação induzida por mitógenos tem sido amplamente utilizada como ferramenta

para a pesquisa das alterações causadas pelo estresse no sistema imune. Bauer,

em 2001, apresentou um estudo comparando as diferentes alterações das

funções linfoproliferativas em ratos submetidos a vários tempos de estresse -

curtos e longos períodos - e mostrou uma diminuição da resposta proliferativa em

linfócitos de ratos submetidos ao estresse crônico. Outros estudos mostram clara

alteração da função linfoproliferativa em relação a diferentes modelos

experimentais de estresse, com vários tipos de células do sistema imune,

ativados por mitógenos mas sem um desafio bacteriano ou viral.

32

8. A PRODUÇÃO DE CITOCINAS

As citocinas são glicoproteínas ou peptídeos de baixo peso molecular

essenciais na regulação do sistema imunológico. Podem atuar de maneira

autócrina, parácrina ou endócrina, apresentando diversos efeitos em diferentes

tecidos e tipos de células. Para tal finalidade de regulação, elas possuem

receptores de membrana nas células alvo, aos quais se ligam e desencadeiam

uma cascata de sinalização intracelular que pode levar à síntese de novos

receptores, produção de outras citocinas, ativação ou morte celular, entre outros

eventos. Podem ser classificados de acordo com sua função biológica. Operando

como fatores de crescimento para células T - IL-1α e β, IL-2, IL-4, IL-7. IL-9 e IL-

15 -; como fatores de crescimento para células B - IL-4, IL-6 e IL-14 -; como

citocinas pró-inflamatórias - IL-1, IL-6 e TNF-α-; de ação inibitória - IL-10, IL-13,

IFN-α, β e γ -; ou de ação antiviral - IFN-α, β e γ -; como fatores de crescimento-

diferenciação hematopoiética - GM-CSF, G-CSF, M-CSF e LIF -; como agentes

quimiotáticos e como fatores citotóxicos-citostáticos. Aproveitando-se destas

características, a dosagem de citocinas tem sido amplamente utilizada para a

determinação e a caracterização da atividade biológica das células em diferentes

sistemas. Outra classificação bastante explorada atualmente leva em

consideração o perfil da resposta imunológica induzida pelas células T. O mesmo

precursor de uma célula T helper (CD4+) pode se diferenciar em Th1 ou Th2

dependendo do micro ambiente em que se encontra. A IL-12 promove o

direcionamento para Th1 enquanto que a IL-4 promove o direcionamento para

resposta Th2. Estas duas subpopulações de células se diferenciam não por

33

marcadores de superfície, mas sim, pelo tipo de citocinas que produzem,

resultando em respostas imunológicas diferentes (MEDZHITOV, 2000).

O perfil de citocinas Th1 é caracterizado pela produção de IL-12 e IFN-

gama, envolvidas preferencialmente na eliminação de patógenos intracelulares e

imunidade na específica para o órgão; enquanto que o perfil de Th2 se distingue

pela produção de citocinas como IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, essenciais na ativação

da resposta anti-helmíntica e da resposta alérgica. Além disso, o IFN- γ e a IL-4

produzidos por Th1 e Th2, respectivamente, podem atuar tanto como fatores de

crescimento autócrino como fatores inibitórios para a subpopulações opostas

(MEDZHITOV, 2000). Desta forma, a caracterização do perfil de citocinas tem

sido extremamente útil na identificação do tipo de resposta imunológica frente a

diferentes estímulos.

A IL-10 e o IFN-gama, bem como IL-19,IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26 fazem

parte da mesma família de citocinas, as de α-hélice da classe 2. A interação

destas citocinas com seus receptores específicos inicia uma ampla e variada

gama de sinais que induzem a resposta antiviral, modulam a resposta

inflamatória, inibem ou estimulam fatores de crescimento, promovem ou inibem

apoptose e afetam muitos mecanismos imunológicos (TAYLOR, 2004).

9. INTERLEUCINA -10

A citocina IL-10 foi inicialmente dita como um fator inibitório na síntese de

citocinas (CSIF) provenientes de células Th2 que inibiam a produção de citocinas

como IL-2, TNF-α e IFN-γ e GM-CSF vindo de células Th1, em resposta a

antígenos apresentados por células apresentadoras de antígeno (PESTKA, 2004).

As atividades biológicas da IL-10 são variadas - inibe a capacidade de

34

apresentação dos antígenos pelos macrófagos e células dendríticas; bloqueia a

produção de citocinas e a expressão de moléculas co-estimulatórias incluindo

CD80, CD86 e MHC Classe II; modifica a expressão do receptor de citocinas com

o aumento do ligante β2-integrina (ICAM-1), inibe a indução de atividades

iniciadas por outras citocinas como o IFN-γ, IL-2, TNF-α e IL-4 e promove o

desenvolvimento de células B1; estimula a sobrevivência de células B, T; e,

paradoxalmente, induzem a apoptose de células B leucêmicas crônicas. Entre

tantas atividades, a mais relevante é a de limitar a magnitude da resposta imune,

comprovada em experimentos com ratos com deleção do gene para a produção

de IL-10. Nesses ratos não somente apresentaram aumento da resposta Th1 e,

conseqüentemente, aumento da resposta às infecções contra bactérias, fungos e

toxoplasma, como também mostraram uma exagerada resposta alérgica e

asmática (PESTKA, 2004).

10. INTERFERON-GAMA

Os interferons de um modo geral são proteínas com atividades antivirais,

produzidas por células frente a uma variedade de estímulos. O IFN-gama é uma

citocina pró-inflamatória crucal na resistência a infecções. Indivíduos que

possuem mutações nos receptores dos genes de IFN-gama são mais

susceptíveis a agentes infecciosos, inclusive cepas de Salmonella e Micobactéria

(KADOWAKI, 2000).

O IFN-gama é secretado por células NK, macrófagos e células T CD4+ e T

CD8+. Possui receptores em quase todas as células, onde é capaz de ativar

diversas respostas antimicrobianas. Nos tecidos, seus alvos são as células não

infectadas, macrófagos, células B em proliferação e células T CD4+. Estima-se

35

que esta citocina regule a expressão de mais de 1200 genes relacionados com a

produção de proteínas envolvidas na criação de barreiras efetivas contra os

patógenos. Para cada célula-alvo, o IFN-gama apresenta uma função específica -

inibição da replicação viral, aumento da atividade fagocitária dos macrófagos,

aumento da expressão de moléculas MHC Classe l e Classe ll. Nas células B

induz a mudança para a produção de anticorpos do tipo IgG2a e bloqueia a

mudança de classe para IgE (induzida pela IL-4), inibindo a proliferação das

células Th2 (PESTKA, 2004, TAYLOR, 2004).

11. O SISTEMA IMUNE - ENDÓCRINO

O sistemas imune, o sistema endócrino e o sistema nervoso se

comunicam, respectivamente, através de citocinas, hormônios neuromoduladores

e de neurotransmissores. Citocinas provenientes de células imunes, produzidas

em resposta a infecções, estimulam os eixos hipotálamo-hipofisários. Os

glicocorticóides, liberados por ativação do eixo HHA, regulam a resposta

inflamatória, prevenindo sua exacerbação. Outra evidência destas interações é a

presença de inervação simpática no baço, no timo, na medula óssea e nos

linfonodos, indicando que estímulos oriundos do sistema nervoso simpático são

transmitidos aos tecidos linfóides (FELTEN, 1993; KHOM, 2000). Astrócitos,

migroglia e neurônios apresentam receptores para IL-1, IL-2 e TNF-α, sendo estas

citocinas identificadas nas células gliais e neurônios do hipocampo (SCHIEPERS,

2005); hormônios como o CRH e a prolactina são também produzidos por

linfócitos e há receptores de catecolaminas expressos em linfócitos, sugerindo

36

ação direta destes hormônios sobre as células imunes (BLACK, 1994). (FELTEN, 1993 #81;KHOM,

2000 #82) (SCHIEPERS, 2005 #76)

12. OS EFEITOS DO ESTRESSE NO SISTEMA IMUNE

Entre as ações montadas pelo organismo no combate ao estresse

conhecemos aquelas que afetam o sistema imune. O aumento dos glicocorticóides,

envolvidos na regulação do sistema imune e na produção de citocinas são exemplos

clássicos (SCHIEPERS, 2005). A IL-1, citocina secretada por macrófagos, é um elo

importante entre estresse e imunidade. Em resposta à infecção e à inflamação, a IL-1

estimula a produção de substâncias imunes pelo fígado, aumenta o número de

neutrófilos circulantes e induz a febre. Essas ações induzem a resposta imune

potente. Entretanto, a IL-1 também estimula a secreção de glicocorticóides, fazendo

um retro-controle negativo de si mesma. Esse mecanismo de controle, mantém

regulada a resposta imune (TURNBULL e colaboradores, 1999). (TURNBULL, 1999 #78).

O período de tempo e o tipo de estresse afetam de forma distinta o sistema

imunológico. Em ratos, o estresse agudo levou ao estímulo da linfoproliferação. Já

no estresse prolongado, ocorreu diminuição da linfoproliferação (SILBERMAN,

2003). Hormônios da adenohipófise, como o hormônio do crescimento e a

prolactina, podem ser mencionados como imunoestimulantes, mas durante

ativação prolongada devido ao estresse pode ocorrer inibição ou diminuição da

liberação destes hormônios , explicado por mecanismos de autoregulação

negativa (BLACK, 1994, YU-LEE, 2002). (BlACK, 1994 #16;YU-LEE, 2002 #29). (DHABHAR, 1997 #11;SILBERMAN, 2002 #60;SILBERMAN, 2003 #63;CHROUSOS, 1999 #54).

O estresse agudo estimula a proliferação linfocitária e o estresse crônico a

inibe. A diminuição linfoproliferativa depende do modelo de estresse empregado e do

tempo decorrido sob esta condição (DHABHAR, 1997; CHROUSOS, 1999,

37

SILBERMAN, 2002, 2003). Portanto, vários hormônios liberados durante o

estresse afetam o sistema imune estimulando ou suprimindo suas funções, a

depender do tempo e do tipo de estresse a que o organismo foi submetido.

13. OS CORTICOSTERÓIDES

Os corticosteroides ou glicocorticóides participa das ações que o

organismo monta contra situações de estresse, que ameaçam seu equilíbrio. Os

níveis séricos de corticosteróide aumentam após a ativação do eixo HHA np

organismo exposto ao estresse. Os glicocorticóides liga-se a receptores presentes

no citoplasma dos leucócitos e levam a regulação destes. Alguns leucócitos

sofrem alteração na quantidade presente no sangue periférico e em outros

tecidos. Também ocorre aumento temporário de neutrófilos na corrente sanguínea

e redução do número de linfócitos circulantes, que são deslocados para os

tecidos, principalmente para a pele, onde se tornam ativos e formam uma barreira

de proteção contra as infecções (DHABHAR, 1997).

Na resposta aguda ao estresse, os níveis séricos de glicocorticóides

aumentam, resultando imunosupressão no sistema linforeticular, bem como

marcante efeito antialérgico e antiinflamatório (BLACK, 1994).(BlACK, 1994 #16).

Os corticosteróides inibem funções nos linfócitos e nos macrófagos. Afetam

o deslocamento das células do sistema imune. Fazem decrescer a produção

citocinas e de mediadores inflamatórios diminuem seus efeitos nos tecidos-alvos.

Com a continuação do estímulo estressante, os níveis de glicocorticóides tendem

a cair, mas os efeitos imunosupressores, não são de todo eliminados, indicando

38

que outras moléculas mediam os efeitos imunológicos induzidos pelo estresse

(TSIGOS, 2002).(Tsigos C., 2002 #50).

A imunorregulação é realizada pelos glicocorticóides por meio de ligações

a dois tipos distintos de receptores citoplasmáticos - os receptores

mineralocorticóides (MR) e os glicocorticóides (GR). Apesar de os receptores MR

apresentarem maior afinidade aos GC circulantes dos que os GR, a maioria dos

efeitos no sistema imune são mediados pelos receptores GR. A presença destes

dois receptores indica que o sistema imune está preparado para a ativação do

eixo HHA e para o aumento dos níveis de GC (BAUER e colaboradores, 2003,

KLOET e colaboradores, 2005).(KLOET, 2005 #75;BAUER, 2003 #73).

A elevação crônica dos níveis de GC leva ao estado de resistência a

esteróides, tornando os linfócitos pouco responsivos aos GC (BAUER e

colaboradores, 2003).

14. AS CATECOLAMINAS

As fibras nervosas simpáticas – noradrenérgicas - inervam tanto o músculo

liso dos vasos sanguíneos como o parênquima de compartimentos específicos

dos órgãos primários e secundários linfóides (CHROUSOS, 1999; KHOM, 2000). (CHROUSOS, 1999 #54;KHOM, 2000 #82)

Alterações causadas por infecções e presença de citocinas inflamatórias,

como a IL-1, influenciam a liberação de noradrenalina (NA) nos órgãos linfóides.

É possível que a noradrenalina, liberada das fibras simpáticas, controle o fluxo

sanguíneo dos órgãos linfóides e o deslocamento leucocitário. Algumas fibras

noradrenérgicas, não associadas aos vasos sanguíneos, estão presentes no

parênquima dos tecidos linfóides. A noradrenalina liberada dos nervos são

imunomoduladoras, ativando os leucócitos locais. A inervação noradrenérgica é

39

regional e específica, em geral zonas de linfócitos T e de macrófagos são muito

inervados, enquanto que as zonas nodulares e foliculares de desenvolvimento ou

de maturação de células B são pouco inervadas (CHROUSOS, 1999).( Ambos,

linfócitos e macrófagos, tem receptores β2-adrenérgicos para noradrenalina e

adrenalina. Os agonistas β-adrenérgicos geralmente regulam para baixo as

funções do sistema imune, principalmente na resposta imune tardia (BLACK,

1994; CHROUSOS, 1999, KHOM, 2000).

O estímulo desencadeado pela ligação a receptores β2-adrenérgicos, ativa

vários mediadores intracelulares que também são receptores de funções imunes,

como os receptores para citocinas das células B (BCR) e o CD40 (KHOM, 2000). (KHOM, 2000 #82).

Os receptores β2-AR são expressos na superfície de células B, de células T

CD4+ naíve e de células Th1, mas não são encontradas nas células Th2 (KHOM,

2000).

15. A PROLACTINA

A prolactina, é um hormônio polipeptídico, sintetizado e secretado pelos

lactotrofos da hipófise anterior, com funções amplamente conhecidas não apenas

na reprodução. A prolactina além de ser sintetizada na adenohipófise é também

produzida em tecidos extra-hipofisários, como o cérebro, a placenta e o miométrio

(BEN-JONATHAN E COLABORADORES, 1996) e em células do sistema imune

como linfócitos (MATERA E COLABORADORES 2000). Ao ligar-se às células ou

tecidos-alvo através de receptores, pode atuar de forma endócrina como

hormônio com funções regulatórias na diferenciação de várias glândulas

secretoras como a glândula mamária, o pâncreas e o fígado. Nos linfócitos T age

40

de forma autócrina como citocina, com ações na promoção da proliferação,

proteção contra apoptose e estímulo à sua sobrevivência (YU-LEE, 2002).

O controle de liberação da PRL é diferente dos outros hormônios

hipofisários em um aspecto - o hipotálamo estimula principalmente a produção de

todos os outros hormônios, enquanto inibe a produção de prolactina.

Conseqüentemente, em lesões do hipotálamo, ou no bloqueio do sistema porta

hipotalâmico-hipofisário, aumenta a secreção de prolactina , enquanto deprime a

secreção dos outros hormônios adenohipofisários. Por conseguinte, acredita-se

que dois fatores diferentes formados no hipotálamo sejam transportados até a

adenohipófise, através do sistema porta hipotalâmico-hipofisário, para controlar a

liberação de prolactina pela adenohipófise. O primeiro, seria o hormônio inibidor

da prolactina (PIH) - hormônio dominante na maioria das condições normais -, o

segundo é o fator de liberação da prolactina (PRF), que pode aumentar de modo

intermitente a secreção de prolactina. O PIH é quase certamente a catecolamina

dopamina, secretada pelo hipotálamo e que pode reduzir por até 10 vezes a

secreção de prolactina. O TRH secretado do hipotálamo, age como hormônio

liberador (RH) da prolactina, mas outras moléculas, tais como a arginina, a

vasopressina, a serotonina e a ocitocina, também podem contribuir para a

liberação da prolactina. O receptor de PRL é uma proteína ligada à membrana e

pertence à superfamília de receptores de citocinas classe 1. Seu receptor tem

sido encontrado numa gama grande de células e tecidos (YU-LEE, 2002).

Aumentos séricos de prolactina ocorrem precocemente em humanos

estressados agudamente. O efeito imunoestimulante do estresse agudo é

benéfico ao organismo, mas com a persistência do estado de estresse e a

41

conseqüente queda das taxas da prolactina, esta proteção também diminuiria,

levando a estados imunosupressivos, comumente visto nos casos de estresse

crônico (YU-LEE, 2002; YUFANG-SHI, 2003; KLOET e colaboradores, 2005)..(

42

VII. OBJETIVOS 1. OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos do estresse crônico na capacidade linfoproliferativa e na

produção das citocinas IL-10 e IFN-γ em ratos hipotireoideanos.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Verificar os efeitos do estresse crônico na produção in vitro das citocinas

IL-10 e IFN-γ por células do baço e do timo de ratos normais e de ratos

hipotireoideanos.

2. Verificar os efeitos do estresse crônico na capacidade linfoproliferativa in

vitro de células do baço e do timo de ratos normais e de ratos

hipotireoideanos.

3. Verificar os efeitos do estresse crônico na secreção de prolactina,

corticosterona, T3 e T4 de ratos normais e de ratos hipotireoideanos.

43

VIII. HIPÓTESES 1. Hipótese Nula

O estresse crônico não foi capaz de causar alteração na linfoproliferação e

na produção das citocinas IL-10 e IFN-γ em células do baço e do timo de ratos

normais e de ratos hipotireoideanos.

2. Hipótese Alternativa

O estresse crônico alterou a linfoproliferação e a produção das citocinas IL-

10 e IFN-γ nas células do baço e do timo de ratos normais e de ratos

hipotireoideanos.

44

IX. MATERIAIS E MÉTODO

1. ANIMAIS

Ratos Wistar, machos, com peso médio entre 190 e 260 gramas, provenientes

do Biotério da Universidade Estadual de Feira de Santana-Ba (UEFS). Estes

foram agrupados em 4 a 5 ratos por gaiola, com suprimento de água e ração

(Nuvital) à vontade. Um total de 120 ratos foi utilizado nos experimentos,

distribuídos igualmente entre os grupos, segundo o tratamento:

1. Grupo N - ratos eutireoideos

2. Grupo N+EC - ratos eutireoideos submetidos a estresse crônico

3. Grupo TX - ratos tireoidectomizados

4. Grupo TX + EC - ratos tireoidectomizados submetidos a estresse crônico

Os ratos foram mantidos em temperatura ambiente, com ciclos

ininterruptos de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, e separados em gaiolas

por grupos, após serem submetidos a tireoidectomia. Os ratos TX e TX +EC

passaram a receber na água de torneira suplementação de lactato de cálcio a

1% (Gold Lab. Com. e Imp. LTDA), prevenindo os efeitos da

paratireoidectomia.

45

2. TIREOIDECTOMIA

Tireoidectomia é a retirada dos dois lobos da tireóide que tem por

finalidade a indução do hipotireoidismo em ratos. A anestesia foi realizada em

atmosfera de éter. Em seguida, os ratos são colocados em decúbito dorsal

sobre mesa cirúrgica. Uma incisão longitudinal é feita no pescoço do rato, é

afastada a pele, tecido subcutâneo e glândulas salivares submandibulares,

expondo os músculos esternomastoídeo e esternohioídeo. Os músculos são

separados na linha mediana para melhor exposição da traquéia e da glândula

tireóide e são retraídos por afastadores. Ë seccionado o istmo da tireóide com

o auxílio de 2 pinças e em seguida é dissecado cada lobo da tireóide por

tração com o auxílio de um cotonete, fez-se uso de pequenas bolas de

algodão para homeostasia do sangramento provocado durante a dissecação

da tireóide. Após a colocação dos músculos em posição, foi suturada a pele.

Foi aplicada 0.2ml via intramuscular de 5.000UI de penicilina e 10mg de

estreptomicina/100g de peso corporal, dose única (Pentabiótico Veterinário

Pequeno Porte-Fort Dodge) no músculo da perna. Passado o efeito da

anestesia são recolocados em gaiolas, em grupos de 4 a 5, com ração à

vontade e solução de lactato de cálcio a 1%.

46

3. PROTOCOLO DE ESTRESSE POR IMOBILIZAÇÃO

O estresse por imobilização foi realizado em estressadores compostos

por tubos plásticos de contenção, ajustáveis no comprimento, com

extremidades possuindo orifícios para cauda e focinho dos ratos. Os grupos N

e TX foram randomicamente alocados em 2 grupos - estressados (N+EC e

TX+EC) e seus respectivos controles, não estressados, N e TX. O estresse foi

realizado durante 14 dias consecutivos, 2horas por dia, sempre no mesmo

horário, das 7 às 9 horas. No 15º dia, no horário do estresse, foram realizados

os experimentos.

47

4. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ESPLÊNICAS E TÍMICAS E CONDIÇÕES

DE CULTURA

Os ratos foram anestesiados em câmara de éter para remoção do baço e

do timo que foram processados por disrupção e maceração. As células foram

colocadas em tubos estéreis contendo 5ml de meio de RPMI 1640 com L-

glutamina (SIGMA), com NaHCO3 a 2% e suplementado com 10% de soro

fetal bovino (GIBCO®), 5x10-5M 2-Mercaptoetanol e 1% de antibiótico PSN

(GIBCOBRL®). As células da suspensão foram contadas em câmara de

Neubauer, ajustadas para 2 X 106 células/mL e aplicado 1 mL/poço, em

placas de cultura de 24 poços (Costar). Os mitógenos foram acrescentados

após padronização nas seguintes concentrações: Concanavalina A (Con A,

C2631- SIGMA) 20 µl/mL, mitógeno Pokeweed {Phytolacca americana

[PWM, L-9379(63231-57-2) - SIGMA]} 2.5 µl /mL e o lipopolissacarideo de

E.coli (LPS 026:B6 - SIGMA) 5 µl/mL (somente nos poços contendo células

esplênicas).

Para o controle de proliferação foram adicionadas células ao meio de

cultura sem mitógenos (controle negativo). As placas foram incubadas a 37

ºC, em estufa de CO2 a 5% por 72 horas. Ao término da incubação, as

suspensões de cada poço das placas foram centrifugadas, e seus

sobrenadantes acondicionados em microtubos tipo eppendorf e mantidas a -

20 ºC, para dosagem de citocinas pelo método de ELISA. Os estudos de

linfoproliferação serão descritos no item 6.

48

5. DOSAGEM DAS CITOCINAS

O sobrenadante obtido das culturas das células esplênicas e tímicas,

guardados em freezer, foram descongelados no momento das dosagens. As

citocinas IL-10 e IFN-γ foram analisadas pelo teste ELISA sanduíche em

placas de poliestireno de fundo chato (3590-Costar) sensibilizadas com 100

µl do anticorpo de captura composto por Imunoglobulina de camundongo anti-

IL-10 de rato (R&D) ou anti-IFN-γ de rato (OptEIATM BD) com sensibilidade

de 15 pg/ml. A leitura da densidade óptica foi realizada em leitora para ELISA

(ELX-800 BioTek) na faixa de comprimento de onda entre 430 e 630nm, de

acordo com as instruções do fabricante.

6. ENSAIOS DE LINFOPROLIFERAÇÃO

As células esplênicas e tímicas obtidas, descrito no item 4, foram

cultivadas com ou sem estímulo mitogênico, em triplicata, em placas de cultura

de 96 poços (Costar). A quantidade de células por poço foi ajustada para 4 X

105células/poço, com volume final de 200µl. Adicionou-se mitógenos nas

mesmas proporções utilizadas e padronizadas na cultura de células

anteriormente descritas. A incubação foi realizada em estufa úmida a 37OC,

com 5% de CO2, por 72horas. Dezoito horas antes do término do tempo da

incubação, foram adicionados 10 µl/poço (1µCi) de Timidina triciada (Sigma).

As placas foram embaladas em papel laminado e congeladas à -20ºC até a

sua leitura. As células foram coletadas em filtro de fibra de vidro (Packard),

utilizando-se coletor de células (Filtermate 196, Packard, Meriden CT, EUA).

Depois de secos à temperatura ambiente durante 24 horas, a leitura foi

49

realizada em contador de radiação beta (Beta Counter, Matrix 9600, Packard

Meriden, CT, EUA). Os resultados foram expressos em contagem por minuto

(cpm).

7. COLETA DE SANGUE

Os ratos ao final do protocolo de estresse, foram sacrificados por

decapitação. O sangue de cada rato foi coletado em tubos com 2 gotas de

ácido etileno-diamino-tetracético (EDTA) a 2% e acondicionado em gelo. Após

centrifugação sob refrigeração (2500rpm, 15 minutos, 5ºC), o plasma foi

separado e congelado individualmente à -20º C para posterior realização das

dosagens hormonais.

8. ENSAIOS HORMONAIS

Foram dosados prolactina (PRL), corticosterona (CORT) e hormônios da

tireóide (T3 e T4) nas amostras de plasma obtidas dos ratos, descritas no item

7. As concentrações de PRL plasmática foram dosados em duplicata pela

técnica de radioimunoensaio de duplo anticorpo, utilizando-se reagentes

fornecidos pelo National Institute of Diabete and Digestive and Kidney

Diseases – NIDDK, Baltimore, USA – padrão NIDDK ratPRL.RP3; antígeno

NIDDK ratPRK I6; anticorpo NIDDK anti-ratPRL S9 - seus resultados foram

expressos em ng/ml. As concentrações de corticosterona foram obtidas por

radioimunoensaio em duplicata. O 1O anticorpo foi proveniente do Laboratório

de Neuroendocrinologia da Faculdade de Ribeirão Preto/SP (B12 8/9). O

hormônio marcado com 3H foi adquirido pela N.E.N. Dupont Net 182 - seus

resultados foram expressos em µg/100ml. Concentrações plasmáticas de T3 e

50

T4 foram determinadas pela técnica de eletroquimioluminescência, com Kits

comercias fornecidos pela Johnson & Johnson® company - seus resultados

foram expressos em nmol/L.

9. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados das citocinas IL-10 e IFN-γ , da linfoproliferação e dos

hormônios tireoideanos, foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis

analisando diferenças na distribuição dos resultados entre os grupos, e teste

de Mann-Whitney para perfazer os pós-testes. Diferenças estatisticamente

significantes só foram considerados com p< 0,05. Os resultados das citocinas,

linfoproliferação, T3 e T4 foram apresentados em forma de gráficos de

distribuição com medianas e intervalos interquartis, já os resultados dos outros

hormônios foram mostrados em forma de gráficos e tabelas com médias ±

desvio padrão, e comparados com o teste T de Student. O software utilizado

para as análises foi o SPSS, versão 9.0.

51

X. RESULTADOS E DISCUSSÃO 1. EFEITOS DO ESTRESSE CRÔNICO NA SECREÇÃO DE HORMÔNIOS

As figuras 1 e 2 mostram os níveis séricos de triiodotironina (T3) e tiroxina

(T4) nos ratos N e TX estressados cronicamente (EC) ou não. O estresse nos

ratos N (1,06nmol/L [1,01-1,11]) não diminuiu as concentrações de T3 nos

estressados (1,10nmol/L [0,93-1,21]). A concentração de T4 nos ratos N

(43,05nmol/L [41,80-45,12]) também foi similar entre os não estressados

(47,40nmol/L [44,55-50,35]). Os ratos TX (0,47nmol/L [0,42-0,69]) sem

estresse não apresentaram diminuição nas concentrações de T3 (0,39nmol/L

[0,35-0,43]) com o estresse. No entanto, o T4 nos ratos TX (10,42nmol/L [4,29-

24,70]) foram significantemente diminuídos (3,75nmol/L [2,89-4,80]) nos

estressados.

52

Figura 1: Produção de T3 em ratos N e TX submetidos ao estresse crônico (EC). Os resultados foram expressos em mediana e intervalos interquartis. n de cada grupo: N= 15, TX= 15, N+EC= 15, TX+EC= 15.

Figura 2: Produção de T4 em ratos N e TX submetidos ao estresse crônico (EC). Os resultados foram expressos em mediana e intervalos interquartis. n de cada grupo: N= 15, TX= 15, N+EC= 15, TX+EC= 15.

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

53

Os resultados obtidos para T3 e T4, mostraram que os ratos N estressados

não modificaram seu perfil de secreção dos hormônios da tireóide, pois tanto o

T3 e o T4 permaneceram com níveis normais. O grupo de Armário (2002)

comparou tipos diferentes de modelos de estresse, e o modelo de

imobilização, adotado para o estudo, é considerado severo, com efeitos

comprovados pelos resultados apresentados da PRL e CORT, hormônios

marcadores de estresse, que se encontraram perfeitamente adaptados,

caracterizando o estresse crônico (MARQUEZ e colaboradores, 2002). Dados

da literatura também relatam uma diminuição significativa na produção dos

hormônios tireoideanos em modelos de estresse que alternavam restrições de

água, alimentos, trocas do dia pela noite, com duração de até dez semanas de

estresse (Cremaschi e colaboradores, 2000). Os hormônios da tireóide são

essenciais para a manutenção circadiana de liberação dos hormônios e

neurotransmissores associados ao estresse. Baixas concentrações de

hormônios da tireóide reduzem a síntese de mRNa para o CRH e o POMC,

diminui a atividade do eixo hha, resultando em baixas concentrações de

glicocorticóides (RITTENHOUSE, 1997). RODRIGUEZ (2003), demonstrou

que o hipotireoidismo em ratos bloqueia parcialmente a liberação normal de

PRL. No sistema imune, o hipotireoidismo é associado com a diminuição no

crescimento tímico e com a diminuição de linfócitos circulantes (DORSHKIND,

2000).

Os ratos TX, apresentaram resultados de linfoproliferação e da produção

de citocinas semelhantes aos ratos normais. Diferenças ocorreram quando os

ratos foram submetidos ao estresse. Ratos hipotireoideanos, deste modo,

54

apresentam imunocompetência semelhante aos ratos normais, pois apesar da

menor liberação de PRL e CORT, estas concentrações foram capazes de

manter as funções imunes normais. Está provado que linfócitos e outras

células do sistema imune são capazes de produzirem localmente PRL, tendo

ação parácrina nas células vizinhas (MAVOUNGOU, 2004). Os resultados

mostraram que os ratos hipotireoideanos sustentaram a produção de citocinas

e linfoproliferação semelhantes a dos ratos normais, devido a produção de

PRL, apesar de menor que a dos ratos N, ser o suficiente para a manutenção

do estado hígido das funções imunes. Com o estresse, tanto os ratos N e TX

apresentaram diminuição das funções imunes, implicando que o

hipotireoidismo, por si só não deprime o sistema imune dos ratos.

55

A Figura 3 mostra as concentrações de prolactina (PRL) - no sangue de ratos N

e TX não- estressados e no sangue de ratos N E TX submetidos ao estresse

crônico (EC). As concentrações de PRL foram similares entre os ratos N (6,3 ±

5,0 ng/mL) e TX (4,1 ± 1,1 ng/mL) sem estresse. Os ratos N quando submetidos

ao estresse crônico, aumentaram a secreção de PRL (21,1 ± 15 ng/ml) em

relação aos ratos N (6,3 ± 5,1 ng/ml) e TX (4,1 ± 1,1 ng/ml) sem estresse

(*p<0,05). Já os ratos TX submetidos ao estresse (6,4 ± 6 ng/ml) apresentaram

resultados similares aos grupos N e TX não estressados.

Figura 3: Produção de Prolactina em ratos N e TX submetidos ao estresse crônico (EC). Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão n de cada grupo: N= 15, TX= 15, N+EC= 15, TX+EC= 15.

*p<0,05

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

56

A Figura 4 mostra as concentrações plasmáticas de corticosterona

(CORT) de ratos N (3,7 ± 2,3 µg/dL) e TX (3,6 ± 2,1 µg/dL) não estressados, e

ratos N estressados (4,2 ± 4,0 µg/dL) e TX (3,9 ± 4,0 µg/dL). Não houve

diferenças significantes nos níveis plasmáticos de CORT dos ratos N e TX

estressados ou não.

Figura 4: Produção de Corticosterona nos ratos submetidos ao estresse crônico (EC). Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. n de cada grupo: N= 15, TX= 15, N+EC= 15, TX+EC= 15

A prolactina (PRL) é um hormônio polipeptídico. É primariamente

sintetizada e secretada pelos lactotrofos da hipófise anterior, mas, também,

por outros tecidos extra-hipofisários. O controle hipotalâmico da secreção de

PRL é predominantemente inibitório, sendo a dopamina, ou hormônio inibidor

da prolactina (PIH), seu fator de inibição mais importante, podendo reduzir em

até 10 vezes a produção de prolactina. O TRH secretado no hipotálamo, age

como hormônio liberador (RH) da prolactina, mas outras moléculas como a

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

57

arginina, a vasopressina, a serotonina e a ocitocina, também podem contribuir

para a liberação da prolactina (YU-LEE, 2002).

A PRL, hormônio secretado pela hipófise anterior exibe um amplo leque

de atuação sobre o sistema imune, apresentando propriedades estimulatórias

dos linfócitos T e B, nas células NK, nos macrófagos, nos neutrófilos, nas

células hematopoiéticas e nas APCs (YU-LEE, 2002). (Yu-Lee, 2002 #29

A PRL é um hormônio liberado durante o estresse agudo, estimula a

resposta imune, principalmente a resposta celular tipo Th1 e o aumento da

atividade fagocítica (YU-LEE, 2002). (Yu-Lee, 2002 #29).

Nos experimentos, os ratos N submetidos ao estresse crônico,

apresentaram secreção de PRL aumentada. A PRL, hormônio hipofisário, não

está submetida a uma regulação por controle negativo tão rigorosa como os

glicocorticóides, isso explica, portanto, o aumento das suas concentrações

nos ratos normais Estes resultados encontrados nos ratos N estressados

também são similares aos trabalhos de Lilly (1999). Nesse experimento, ele

mostra, em macacos expostos ao estresse agudo, níveis de GC

significantemente elevados, PRL aumentada moderadamente e supressão de

vários parâmetros do sistema imune. Entretanto, quando expostos às mesmas

condições experimentais, por longos períodos, os níveis de GC estavam mais

baixos que os basais e os níveis de PRL aumentados, maior até que os níveis

observados no estresse agudo. Já os parâmetros imunológicos, estavam

recuperados, semelhantes aos parâmetros dos não estressados. Esses

resultados sugerem que a função fisiológica da elevação da PRL, nestes

casos, seria o de modular e diminuir os efeitos imunossupressivos dos GC em

58

períodos de estresse prolongado. Em outro estudo, a PRL, in vitro, inibiu a

apoptose de timócitos e esplenócitos tratados com dexametasona

(KRISHNAN, 2003). (KRISHNAN, 2003 #85)

Todavia, a secreção de PRL nos ratos TX estressados foram similares aos

ratos N e TX sem estresse. Rodrigues e colaboradores (2003), avaliaram a

influência dos hormônios tireoideanos sobre a secreção de prolactina (PRL)

em ratos sépticos submetidos ao estresse agudo de imobilização (IMO). O

trabalho demonstrou ratos N, sob estresse, com aumento da secreção de

PRL, mas os ratos TX não apresentaram aumento quando comparados com

os ratos N. Portanto, o trabalho mostrou os efeitos dos hormônios da tireóide

na secreção da PRL durante o estresse agudo, sendo necessário, para a

elevação da PRL durante o estresse, níveis normais de hormônios

tireoideanos (RODRIGUES, 2000).

A ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal induzido pelo estresse

pode é considerado um bom marcador da intensidade do estresse (GARCIA e

colaboradores, 2001). Perdurando a situação de estresse e a ativação do eixo

HHA, mecanismos de retroalimentação negativa de alça longa são acionados,

diminuindo a secreção da corticosterona, levando a adaptação. A

retroalimentação negativa de alça longa é exercida no hipotálamo e

adenohipófise por hormônios de glândulas periféricas e substratos resultantes

do metabolismo tecidual, cuja produção é induzida pelos hormônios

hipofisários. O gradual decaimento ou adaptação da atividade do eixo HHA

pode ser observado em exposições repetidas ao mesmo estressor, como, por

exemplo, o estresse por imobilização. Esta adequação ou adaptação é devido

59

a retroalimentação negativa mediada pelo aumento dos níveis plasmáticos de

corticosterona, inibindo o eixo HHA (KLOET E COLABORADORES, 2005).

Jaferi e colaboradores (2003), apresentaram dados sugerindo que certa

área no hipotálamo, mais especificamente, o núcleo paraventricular (pPVTh)

contribui para a retroalimentação negativa do eixo HHA, especificamente em

condições de estresse crônico. Portanto, no estresse crônico, são encontrados

concentrações plasmáticos de glicocorticóides menores em relação aos

encontrados no estresse agudo (BAUER e colaboradores, 2001; VEENEMA e

colaboradores, 2003).

O eixo hormonal é altamente reativo e oscila amplamente em resposta às

alterações do meio ambiente. O eixo imunológico, é mais indolente ou menos

reativo na ausência do desafio imunológico, representado por bactérias, vírus,

e outros patógenos que sejam uma ameaça ao corpo. Entretanto, o sistema

imune não é indiferente às oscilações e mudanças nos perfis de secreções

dos hormônios. As oscilações ocorridas na prolactina e corticosterona no

estresse crônico, modificaram o “ambiente” imunológico, com secreção de IL-

10 e IFN-gama claramente influenciadas pelos hormônios moduladores da

resposta inflamatória (PRL) e antiinflamatória (CORT).

60

2. CITOCINAS

PRODUÇÃO DE CITOCINAS NO BAÇO

A ativação e conseqüente produção de citocinas por células

estimuladas com mitógenos mostrou-se eficaz quando comparada com

resultados para células sem estimulo mitogênico, conforme se observa nas

tabelas 2, 3, 4, 5, 6 e 7.

Observa-se, especialmente, na tabela 2 e na Figura 5, os resultados das

concentrações de IL-10. Na tabela 3 vê-se as concentrações de IFN-gama

produzida in vitro por células de baço de ratos dos diferentes grupos

estudados no modelo de hipotireoidismo, sob estresse crônico de imobilização

de 14 dias, comparados aos ratos do grupo normal sem estresse. Os dados

mostram a produção de IL-10 por células de ratos N aumentada se

comparados aos ratos N estressados, quando as células esplênicas eram

estimuladas com Con A (*p=0,002) (Figura 3). Por outro lado, as células

estimuladas com Con A provenientes do grupo TX+EC apresentaram inibição

na produção de IL-10 em relação às provenientes dos ratos normais

eutireoideos, não estressados. A produção de interferon-gama pelas células

do baço, sem estímulo mitogênico e sob a ação dos três mitógenos, não

apresentou diferenças entre os ratos N e TX. O estresse crônico, no entanto,

também não alterou a produção de interferon-gama entre os ratos estressados

N e TX.

61

62

63

Figura 5 – IL-10 produzida in vitro por células esplênicas, estimuladas com

ConA, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados(N+EC=15),tireoidectomizados (TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 em relação aos ratos N.

O baço em um órgão linfóide secundário, onde ocorre recirculação

linfocitária. Bauer e colaboradores (2000), demonstraram em ratos

estressados cronicamente, uma diminuição na proliferação de células do baço.

Os resultados descritos no trabalho, mostraram que o estresse de restrição

teve efeito inibidor da produção de IL-10 de células esplênicas sob estímulo de

Con A, mitógeno que estimula preferencialmente células T, em ratos TX e N

sob o efeito do estresse crônico, o que sugere uma diminuição ou

imunodepressão das células produtoras de IL-10, células T tipo TH2. Células

*p< 0,05

*p<0,05

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

64

TH2 produzem IL-10 em resposta a antígenos como parasitas e toxinas e que

favorecem a resposta imune humoral (YU-LEE 2002).

A IL-10 é uma citocina antiinflamatória, pois inibe a produção de citocinas

como IL-2, TNF-α, IFN-γ e GM-CSF vindas de células Th1, em resposta a

antígenos apresentados por APCs (PESTKA e colaboradores, 2004).

Provavelmente, os ratos sob efeito do estresse crônico, no contexto do

experimento, o estresse realizado por imobilização – considerado de alto

impacto para causar o estresse (ARMARIO E COLABORADORES, 2004)

estão com o balanço TH1/TH2 em desequilíbrio, com claro prejuízo na

resposta antiinflamatória, devido a diminuição na secreção de IL-10.

Está amplamente demonstrado que o estresse agudo aumenta as

concentrações séricas de corticosterona em ratos. A persistência do estímulo

estressante reduz a elevação das concentrações da corticosterona, por

mecanismos de retroalimentação negativa no eixo hipotálamo-hipófise-

adrenal, o organismo tenta voltar aos valores da corticosterona antes do

estresse (RODRIGUEZ E COLABORADORES, 2003). Segundo Chrousos e

colaboradores (1999) os glicocorticóides agem nos receptores nucleares e

citoplasmáticos das APCs, dos monócitos e dos macrófagos suprimindo a

produção de citocinas do tipo Th1, como a IL-12, levando à diminuição da

produção de IL-4, mas não tem ação sobre a produção de IL-10 pelos

monócitos.

A prolactina sintetizada na adenohipófise é também produzida em tecidos

extra-hipofisários, como o cérebro, a placenta e o miométrio (BEN-JONATHAN

E COLABORADORES, 1996) e em células do sistema imune como linfócitos

65

(MATERA E COLABORADORES 2000). Nos linfócitos T, a prolactina age de

forma autócrina como citocina, com ações na promoção da proliferação,

proteção contra apoptose e estímulo à sua sobrevivência (YU-LEE, 2002). A

prolactina tem ação imunomoduladora, agindo principalmente na ativação de

macrófagos e linfócitos, e estimula a produção de IFN-gama e IL-12

(MATALKA, 2003).

A produção de IFN-gama não apresentou diferenças entre os ratos com e

sem o estresse, provavelmente a secreção de PRL, aumentada principalmente

nos ratos N estressados contribuiu para o para que a produção de IFN-gama

no baço tenha sido preservada dos efeitos do estresse crônico.

Os resultados apresentados mostram a secreção de IL-10 e IFN-gama

similar entre os ratos N e TX, provando que o hipotireoidismo não afeta a

produção destas citocinas nos ratos estressados ou não. Os ratos

hipotireoideanos, portanto, apresentam a mesma capacidade de secreção de

IL-10 e IFN-gama, mesmo submetidos a situações de estresse.

66

PRODUÇÃO DE CITOCINAS NO TIMO

Encontra-se na tabela 4, os resultados da produção de citocinas por

células tímicas, no modelo experimental descrito. Eles indicam que a produção

de IL-10 de ratos dos grupos N e TX não estressados foi semelhante entre si,

sob a ação dos dois mitógenos. A produção de IL-10 pelas células do timo

estimuladas com Con A, mostrou o grupo de ratos N com produção maior do

que no grupo N estressados (*p<0,05) (Figura 6). Por outro lado, o grupo de

ratos N e ratos TX não estressados apresentaram secreção maior quando

comparados aos TX estressados, respectivamente. Com PWM, nos ratos N

estressados, a produção foi menor que nos ratos N. Nos ratos TX e N não-

estressados a produção de IL-10 foi maior que a produção dos ratos TX

estressados, respectivamente (p<0,05) (Figura 7). Com relação à produção de

interferon-gama neste modelo de estudo, pode-se observar na tabela 5 que

entre os grupos de ratos N e de TX não estressados os valores foram

semelhantes com os dois mitógenos. Nas células tímicas estimuladas com

Con A e PWM dos ratos do grupo N o estresse não alterou a produção de IFN-

gama. Entretanto, neste modelo, a produção de interferon por células de timo

estimuladas com Con A provenientes dos ratos TX e N não-estressados foi

maior que a dos ratos TX estressados, respectivamente (Figura 8). Quando

estimulados com PWM, as células dos ratos TX e N não estressados mais em

relação aos ratos TX estressados, respectivamente (Figura 9).

67

68

69

Figura 6 – IL-10 produzida in vitro por células tímicas, estimuladas com ConA, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados (N+EC=15), tireoidectomizados (TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 em relação aos ratos N.

*p= 0,002

#p= 0,002

*p= 0,001

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

70

Figura 7 – IL-10 produzida in vitro por células tímicas, estimuladas com PWM, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados (N+EC=15), tireoidectomizados (TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 em relação aos ratos N.

*p= 0,048

#p= 0,005 *p= 0,001

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

71

Figura 8– IFN-γ produzido in vitro por células tímicas, estimuladas com Con A, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados (N+EC=15), tireoidectomizados (TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 em relação aos ratos N.

#p= 0,009 *p= 0,016

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

72

Figura 9– IFN-γ produzido in vitro por células tímicas, estimuladas com PWM, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados (N+EC=15), tireoidectomizados (TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 em relação aos ratos N.

Uma vez que o baço apresenta receptores para glicocorticóides do Tipo I e

II, e no timo foi identificado somente receptor do Tipo II, há evidência de que,

o sistema imune seja sensível à ativação do eixo HPA, e não exista um padrão

de resposta igual em todos os órgãos, inclusive pela diferença do perfil celular

e seus receptores, e características do microambiente (GERPE, 2001,

BAUER, 2001). O parênquima tímico é composto por distintas células epiteliais

e células do conjuntivo, além de timócitos que secretam diferentes citocinas no

microambiente (BERZINS, 2002).

#p= 0,018 *p= 0,008

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

73

Não foi observada alteração significativa na produção de IFN-gama por

células do timo de ratos N estressado ou não. Entretanto a produção de IFN-

gama foi menor na cultura de células do timo de ratos TX estressados do que

nas de TX não estressados. Já a produção de IL-10 observou-se diminuída

frente ao estresse nos ratos TX e N com estresse.

Os dados destes experimentos aqui apresentados demonstram que o

hipotireoidismo sem estresse não afeta a produção in vitro de IFN-gama ou de

IL-10 de células tímicas sob estímulo de mitógenos. Os ratos hipotireoideanos,

apresentam comprovadamente bloqueio parcial na secreção de PRL, mas com

secreção de CORT normal em casos de sepse induzido por LPS.

(RODRIGUEZ E COLABORADORES, 2003). No entanto, sem o estímulo do

estresse, estes se mostram com as funções imunes respondendo de forma

similar a dos ratos normais.

Apesar de serem órgãos diferentes, não se pode deixar de apreciar a

relevância do órgão imune estudado no que se refere à associação entre

estresse crônico e imunodepressão (CUNNICK, 1990, BAUER E

COLABORADORES, 2001). Provavelmente, diferentes mecanismos de ação

estejam envolvidos para cada órgão imune. Embora os animais estudados

nesse modelo sejam classificados como estressados crônicos, uma vez que o

rato é estressado no período indicado e ainda apresenta resposta frente a

estímulos, difere de um quadro de depressão, que torna o animal inerte a

qualquer estímulo. Quanto à imunodepressão, alguns autores a definem e

generalizam como a diminuição da resposta de células do sistema imune.

Neste caso, observa-se nos resultados uma diminuição da produção de IFN-γ

74

somente nos ratos TX que foram estressados, com produção de IFN-γ menor

em relação aos ratos N e TX não estressados. O hipotireoidismo, neste caso,

aparentemente tem ação sinérgica com o estresse com reflexo na menor

produção desta citocina, entretanto, se observa que só hipotireoidismo não

afeta o sistema imune. Pode-se pensar que, neste caso, faz-se necessário o

estímulo estressante, com sua conseqüente alteração do eixo HPA, para que

ocorra alteração no sistema imune e no órgão específico. Os ratos TX

apresentaram produção de IL-10 e IFN-gama diminuídos com o estresse,

cenário montado devido às mudanças de liberação dos hormônios no

estresse, estes ratos, podem apresentar prejuízos na resposta a antígenos.

O IFN-γ é produzido especificamente por células do sistema imune como

células NK, linfócitos T CD4+ (Th1) e linfócitos T CD8+ (CTL) (TAYLOR, 2004).

As funções principais do IFN-γ são de estimular a síntese de IgG2a em

linfócitos B, inibir o crescimento de células Th2, ativar macrófagos, aumentar a

expressão de moléculas MHC classe I e II nas células somáticas e em

macrófagos (papel antiviral), e ativar células NK. Uma diminuição na produção

de IFN-γ pode levar a respostas menos eficazes frente a patógenos que

exigem resposta celular eficiente e até à resposta imune inata, podendo

aumentar a vulnerabilidade à doenças infecciosas (VEDHARA, 2002). A IL-10

é uma citocina antiinflamatória, pois inibe a produção de citocinas como IL-2,

TNF-α, IFN-γ e GM-CSF vindas de células Th1, em resposta a antígenos

apresentados por APCs (PESTKA e colaboradores, 2004).

75

3. LINFOPROLIFERAÇÃO

Os resultados do estudo da linfoproliferação de células esplênicas e

tímicas no modelo experimental descrito, encontram-se nas tabelas 6 e 7. A

linfoproliferação das células de baço, mostra semelhanças nos grupos de ratos

N e TX não estressados e estressados estimulados com LPS e PWM.

Estimuladas com Con A, as células proliferaram mais nos ratos N e TX em

relação aos ratos N e TX não estressados, respectivamente (p<0,05). Na

análise da linfoproliferação das células dos ratos TX observou-se uma

diminuição na linfoproliferação em relação aos dos ratos N não estressados

(p<0,05) (Figura 10).

A tabela 7, mostra a linfoproliferação das células do timo semelhante

entre as dos ratos N e TX não estressados sob o estimulo de Con A e PWM.

Os ratos N não modificaram sua capacidade linfoproliferativa sob estresse ao

serem estimulados pelos dois mitógenos. Por outro lado, com o mitógeno Con

A, a capacidade linfoproliferativa das células tímicas dos ratos TX estressados

foi significantemente menor em relação aos ratos TX e N não estressados,

respectivamente (Figura 11).

76

77

78

Figura 10 – Linfoproliferação in vitro medida por incorporação de timidina triciada (cpm) de células esplênicas, estimuladas com Con A, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados(N+EC=15), tireoidectomizados(TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 em relação aos ratos N.

*p= 0,016 #p= 0,004

*p= 0,006 N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

79

Figura 11–Linfoproliferação medida por incorporação de timidina triciada in vitro por células tímicas, estimuladas com Con A, provenientes de ratos normais eutireoideos (N) ou tireoidectomizados (TX), sob estresse crônico ou não. Dados expressos em mediana e [intervalos interquartis]. Grupos de ratos normais eutireoideos (N=15), normais eutireoideos estressados (N+EC=15), tireoidectomizados (TX=15) e tireoidectomizados estressados (TX+EC=15). *p<0,05 vs ratos N. #p<0,05 vs ratos TX.

Assim, no presente trabalho, os estudos de avaliação do efeito do estresse

e do hipotireoidismo sobre a linfoproliferação mostraram que nas células do

baço e do timo somente se observou inibição da proliferação das células de

baço provenientes de ratos N e TX estressados em presença de Con A. O

hipotireoidismo não mostrou efeito sobre a linfoproliferação em células do

baço, enquanto que, nos estudos das células do timo dos ratos, o estresse

sozinho não apresentou efeito. A proliferação dessas células foi diminuída

somente quando eram do grupo TX estressados.

#p= 0,016

*p= 0,006

N- ratos normais N+NE- normais estressados TX-tireoidectomizados TX+EC-TX estressados

80

Silberman e colaboradores (2002) encontraram tendência de inibição da

proliferação de células de linfonodos e de baço em camundongos estressados

N e TX nas primeiras semanas de estresse crônico, embora a diferença

significativa de inibição tenha sido notada somente entre as semanas 4 e 6. A

partir da quarta semana observou-se diminuição da linfoproliferação de células

linfocitárias de camundongos Balb/c estressados estimuladas com ConA e

PHA. Os mesmos autores não encontraram alteração nas primeiras semanas

com LPS e observaram um aumento da proliferação a partir da quarta

semana com este mitógeno. Apesar dos modelos serem diferentes, uma vez

que o grupo de Silberman (2002) utilizou tempos e modelos de estresse

diferentes, os resultados com Con A mostraram semelhanças nos resultados

com o trabalho aqui apresentado.

O sistema imune sofre várias alterações como a diminuição do crescimento

tímico associado ao hipotireoidismo, levando ao abaixamento do número de

leucócitos circulantes, também à diminuição linfoproliferativa e redução da

resposta de células NK, o que sugere o papel imunoregulatório do TSH, que

se liga diretamente aos linfócitos de ratos (BAUER e colaboradores, 2001).

O estresse, agudo e crônico, reduz a proliferação induzida por mitógeno no

sangue periférico e que estes efeitos são inibidos por adrenolectomia,

sugerindo uma responsabilidade parcial dos fatores adrenais na

imunossupressão no sangue periférico (CUNNICK, 1990; BAUER,2001, 2003).

Em contraste com o sangue periférico, os linfócitos do baço parecem se

adaptar a exposição ao estresse crônico mostrando resultados aparentemente

contraditórios de diversos estudos em relação a linfoproliferação (BAUER e

81

colaboradores, 2001). Talvez o modelo de estresse estudado influencie nos

resultados de diversos autores. O modelo proposto para este estudo foi o de

imobilização, tido como um modelo altamente eficiente na produção de

estresse crônico (BELDA, 2004; MARQUEZ, 2004).

Os resultados mostram uma clara redução linfoproliferativa induzida por Con

A, mitógeno que ativa, preferencialmente, células T, no baço de ratos normais

e hipotireoideanos submetidos ao estresse crônico. Já com LPS e PWM,

mitógenos que estimulam células B, os resultados não apresentaram

diferenças significantes. Dhabhar refere que linfócitos B não possuem

receptores para hormônios do estresse, por isso a falta de resposta a

estímulos estressantes (ELENKOV, 1999).

82

XI. CONCLUSÕES

CITOCINAS:

♦ O modelo de estresse crônico de imobilização por 14 dias, foi capaz de

diminuir a produção de citocinas de formas diferentes no baço e no timo.

♦ Nas células do timo, diminuiu a produção de IL-10 in vitro quando

estimuladas com ConA e PWM. O hipotireoidismo não contribuiu para este

efeito.

♦ Nas células do timo, diminuiu a produção de IFN-gama in vitro apenas em

sinergia com o hipotireoidismo, estimulado com Con A e PWM.

♦ Nas células do baço, diminuiu a produção de IL-10 in vitro apenas com o

mitógeno Con A. O hipotireoidismo não afetou estes resultados

♦ As células do baço não apresentaram nenhuma alteração na produção de

IFN-gama in vitro.

♦ Os ratos hipotireoideanos mostraram-se competentes em produzir citocinas

da mesma forma que os ratos normais com e sem estresse.

LINFOPROLIFERAÇÃO

♦ O estresse crônico diminuiu a linfoproliferação induzida por mitógenos de

forma diferente no baço e no timo de ratos normais e hipotireoideanos. O

hipotireoidismo, por si só, não alterou a linfoproliferação.

♦ A linfoproliferação no baço e no timo foi diminuída nos ratos normais e

tireoidectomizados ao serem estimulados com Con A.

83

XII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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