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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

JETHE NUNES DE OLIVEIRA FILHO

ANTICORPOS ANTI-Trypanosoma cruzi COMO PREDITIVOS DE

INFECÇÃO POR Leishmania infantum

NATAL-RN 2013

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JETHE NUNES DE OLIVEIRA FILHO

ANTICORPOS ANTI-Trypanosoma cruzi COMO PREDITIVOS DE

INFECÇÃO POR Leishmania infantum

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Bioquímica. Orientadora: Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes

NATAL-RN 2013

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AGRADECIMENTOS

À minha família, em especial à minha mãe Gilvânia, às minhas irmãs Jeane e Érica e à minha sobrinha Melina, pelo amor, carinho e compreensão

dispensados durante essa trajetória. Aos meus primos Vanessa, Vandésia, Vanderson, Cláudia, Janeth, Vívian, Wilkson e Wilker. À minha tia Vânia que me amou e me ama como filho. Aos meus cunhados e amigos Fernando e

Miguel aos quais estimo grande admiração.

Aos professores e colegas de trabalho do Departamento de Bioquímica, por compartilharem seus conhecimentos comigo. Em especial às professoras Maria

de Fátima F. M. Ximenes e Selma M. B. Jerônimo pela contribuição imensurável na minha formação profissional. Sinto-me orgulhoso de ter sido

discípulo de duas grandes profissionais reconhecidas nacional e internacionalmente.

À todos do Laboratório de Imunogenética/ Instituto de Medicina Tropical-UFRN.

À todos os colegas e parceiros do LABENT-UFRN, Patrícia, Edson, Marcos,

Hilário, Glaucia, Rodrigo e Juliana, mas em especial à Katrine, Vanessa e Kel por além de contribuírem diretamente no trabalho se tornaram grandes

amizades que levarei comigo onde quer que eu esteja. Sem a participação da equipe do LABENT chefiado pela profª Fátima Ximenes eu não teria

conseguido atingir meus objetivos durante o ano de 2010.

À todos do Hemocentro Dalton Barbosa Cunha (HEMONORTE), pelo apoio e amizade oferecidos de bom grado. Em especial à Drª Linete Rocha, atual

diretora, e aos Bioquímicos Manuel Josué, Erika Valena e Geraldo Barroso pelos seus tempos dedicados a me ensinar cada detalhe do funcionamento do Banco de Sangue. À toda a equipe que me ajudou no HEMONORTE, Drª Cléa, aos bioquímicos Lilia, Nadja e Erinaldo, à enfermeira Conceição, aos tecnicos

Brasilina, Daletti, Patricia, Altina, Sara, Edna, Djania, e aos funcionários Rosejane e Socorro do setor pessoal.

Aos colegas e amigos da turma de mestrado: Luciana, Raquel, Fernanda,

Alexandre, Monique, Paulo, Joyce, Sara, Daniel, Adilson e Airton.

À todos os voluntários que consentiram em participar da pesquisa.

À todos os meus amigos que estiveram e estão presentes em minha vida e foram/são fundamentais para eu continuar a sonhar e buscar alcançar meus

objetivos: Pamella Salsa, Daniel Nogueira, Bruno Gazola, Anita Dantas, Cristina Iglesias, Rafaela Mansur, Rodrigo Holanda, Thais Guedes, Fernanda

Medeiros, Vanessa da Escossia, Fabíola Soares, Fernanda Soares, Bruna Wanderley, Renata Ribeiro, Glenda Patrícia, Williane Alves, Denise Barcelos,

Geovanine Araújo, Luana Alves, Ronaldo Ponte, Felipe Saú, Marcelo Zacarkin, Mauro Montenegro e Kleber Pessoa.

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"A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original."

Albert Einstein

http://pensador.uol.com.br/autor/albert_einstein/

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RESUMO

Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi são tripanossomatídeos de importância médica e são, respectivamente, os agentes etiológicos da leishmaniose visceral (LV) e da doença de Chagas (DC) no Brasil. Pessoas infectadas por L. infantum ou por T. cruzi podem evoluir de forma assintomática, possibilitando a transmissão destes patógenos através de transfusão sanguínea e/ou órgãos. A avaliação da infecção por T. cruzi está contemplada entre os exames realizados para triagem de doadores no Brasil, no entanto, não há disponibilidade de exames para Leishmania. Os testes sorológicos para T. cruzi são muito sensíveis, mas não específicos, podendo apresentar reações cruzadas com outros microorganismos. Desta forma, o objetivo desse estudo foi determinar a prevalência da infecção por Leishmania em doadores de sangue e avaliar se os teste sorológicos para T. cruzi detectam L. infantum. Dentre as 300 amostras de sangue de doadores, descartadas em 2011, 61 eram T. cruzi positivas, 203 eram de doadores com outras infecções e 36 eram oriundas de bolsas com baixo volume de sangue, mas sem infecção. Foram também avaliadas 144 amostras de doadores sem infecções e aptos a doarem sangue, totalizando 444 voluntários. DNA foi extraído do sangue de todas as amostras para realizar PCR quantitativa (qPCR) a fim de detectar DNA de Leishmania. O creme leucocitário obtido de todas as amostras foi cultivado em meio Schneider e NNN suplementado. Todas as amostras foram avaliadas quanto a presença de anticorpo anti-Leishmania. Os resultados sorológicos apontam um percentual de 22% de infecção por Leishmania nas amostras de sangue obtidas das bolsas descartadas. Um total de 60% das amostras positivas no ELISA para T. cruzi foram negativas na RIFI, teste usado como confirmatório, ou seja, 60% falso positivos para Chagas. Dentre essas amostras falso positivas para Chagas, 72% foram positivas no ELISA para Leishmania caracterizando a ocorrência de reação cruzada entre os ensaios sorológicos. Do total de 300 culturas realizadas, 18 cresceram parasitas que foram tipados por isoenzimas e qPCR específica, sendo encontrada a espécie Leishmania infantum nas culturas. Dentre as 18 culturas, 4 foram provenientes de bolsas expurgadas por baixo volume e negativas em todas as sorologias do banco de sangue, demonstrando assim que há um risco real de transmissão de Leishmania por via transfusional. Conclui-se que em área endêmica para leishmanioses no Brasil, diagnósticos sorológicos realizados para detectar infecção por T. cruzi em doadores de sangue podem identificar a infecção por L. infantum e, apesar de ocasionar resultados falso positivos para Chagas, essa reatividade cruzada reduz o risco de infecção por Leishmania via transfusão sanguínea, visto que não são aplicados testes específicos detecção desse parasita. Desde modo, persiste a necessidade de se discutir a implementação de um teste de triagem sorológica específico para Leishmania em países endêmicos como o Brasil. Palavras-chave: Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi, reatividade cruzada, doador de sangue.

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ABSTRACT

Leishmania infantum and Trypanosoma cruzi are trypanosomatids of medical importance and are, respectively, the etiologic agents of visceral leishmaniasis (VL) and Chagas disease (CD) in Brazil. People infected with L. infantum or T. cruzi may develop asymptomatically, enabling the transmission of pathogens through blood transfusion and / or organs. The assessment of the infection by T. cruzi is included among the tests performed for screening blood donors in Brazil, however, there is no availability of tests for Leishmania. Serological tests for T. cruzi are very sensitive, but not specific, and may have cross-reactions with other microorganisms. Thus, the aim of this study was to determine the prevalence of Leishmania infection in blood donors and assess whether the serological test for T. cruzi detect L. infantum. Among the 300 blood samples from donors, discarded in 2011, 61 were T. cruzi positive, 203 were from donors with other infections and 36 were from handbags with low blood volume, but without infection. We also assessed 144 samples from donors without infections and able to donate blood, totaling 444 subjects. DNA was extracted from blood samples of all to perform quantitative PCR (qPCR) to detect Leishmania DNA. The buffy coat obtained from all samples was grown in Schneider medium supplemented and NNN. All samples were evaluated for the presence of anti-Leishmania antibody. The serological results indicate a percentage of 22% of Leishmania infection in blood samples obtained from discarded bags. A total of 60% of samples positive in ELISA for T. cruzi were negative by IFI, used as confirmatory test, ie 60% false positive for Chagas. Among these samples false positive for Chagas, 72% were positive by ELISA for Leishmania characterizing the occurrence of cross reaction between serologic assays. Of the 300 cultures performed, 18 grew parasites that were typed by qPCR and specific isoenzymes, found the species Leishmania infantum crops. Among the 18 cultures, 4 were purged from scholarships for low volume and all negative serology blood bank, thus demonstrating that there is a real risk of Leishmania transmission via transfusion. It is concluded that in an area endemic for leishmaniasis in Brazil, serological diagnosis performed to detect infection by T. cruzi among blood donors can identify infection by L. infantum and although cause false positive for Chagas, this cross-reactivity reduces the risk of Leishmania infection via blood transfusion, since tests are not applied specific detection of the parasite. In this way, there remains the need to discuss the implementation of a specific serological screening test for Leishmania in endemic countries such as Brazil. Keywords: Leishmania infantum, Trypanosoma cruzi, cross-reactivity, blood donor.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo de vida do L. infantum. Esquema ilustrando os estágios de vida de Leishmania desde o hospedeiro flebotomíneo até o hospedeito mamífero representado pelo homem.................................................................................15 Figura 2: Expansão da LV. Nos últimos 30 anos o número de casos notificados de leishmaniose visceral vem aumentando significativamente ........................16 Figura 3: Epidemiologia da LV no Brasil. Ilustração da distribuição dos casos de LV notificados nos anos de 2008 e 2009 no Brasil. Ministério da Saúde.................................................................................................................17 Figura 4: Ciclo de vida do T. cruzi. O esquema mostra em oito passos o ciclo de vida do agente etiológico da doença de Chagas passando pelos hospedeiros invertebrado e vertebrado.............................................................24 Figura 5: Área de Estudo. Mapa do Rio Grande do Norte mostrando as unidades do HEMONORTE distribuídas nos cinco municípios sede: Natal, Currais Novos, Caicó, Mossoró e Pau dos Ferros.............................................31 Figura 6: Desenho do Estudo. Esquema ilustrativo das etapas da pesquisa onde "A" representa o grupo 1 (n=300) e "B" representa o grupo 2 (n=144)...............................................................................................................33 Figura 7: População de doadores de sangue. Número absoluto de doações de sangue realizadas em cada um dos cinco municípios coletores no ano de 2011. Fonte: Hemonorte RN, Secretaria de Saúde do Estado do Rio Grande do Norte..................................................................................................................41 Figura 8: Prevalência de Infecção. O gráfico traz uma estimativa da prevalência (%) de

infecções em doadores, segundo o município onde o sangue foi doado. Os cinco

municípios foram representados por cores distintas: azul (Natal), roxo (Caicó), amarelo

(Mossoró), verde (Pau dos Ferros) e violeta (Currais Novos).......................................45

Figura 9: Teste RIFI. O gráfico mostra em números absolutos os resultados do teste RIFI com os soropositivos no ELISA para T. cruzi (n=61). RIFI+ (doadores positivos na RIFI); RIFI- (doadores negativos na RIFI)...................................................................................................................46 Figura 10: ELISA: T. cruzi vs L. infantum. Resultado da sorologia para detecção de anticorpo anti-Leishmania usando SLA como antígeno em testes com doadores Chagas-positivos e Chagas-negativos. ***P<0.0001. Cut-off = 0,2. ...........................................................................................47

Figura 11: Resultados dos testes com doadores RIFI-negativos distribuídos segundo o resultado da sorologia que detecta anticorpo anti-Leishmania circulante no soro. ***P<0.0001. Cut-off = 0,2...................................................48

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Figura 12: Doadores segundo os marcadores MAG1 Ct e kDNA7 Ct, Positivos ou Negativos pela Cultura Leish. Veja que a chance de ser positivo aumenta com a redução de MAG1 Ct.....................................................................................................49

Figura 13: Doadores segundo os marcadores Mag1 Ct e kDNA7 Ct, Positivos ou Negativos pelo ELISA para Chagas..................................................................50 Figura 14: Distribuição da sorologia relativa (Resposta/Cutoff) para T. cruzi, segundo a positividade da cultura de Leishmania.............................................51 Figura 15: Distribuição da sorologia relativa (Resposta/Cutoff) para Leishmania (SLA), segundo a positividade da cultura de Leishmania..................................51 Figura 16: Amplificações da região ITS1 em amostras de Leishmania obtidas em meio de cultura. Linha M: Marcador de peso molecular 100 pb; Linha 1 – 15: Amostras de cultura; Linha B: Branco; Linha CP: Controle Positivo de Leishmania infantum..........................................................................................52 Figura 17 - Amplificações da região HSP70 em amostras de Leishmania obtidas em cultura. Linha M: Marcador de peso molecular 200 pb; Linha 1 – 3: Amostras de cultura; Linha B: Branco; Linha CP: controle positivo de Leishmania infantum..........................................................................................53 Figura 18: Alinhamento entre as seqüências nucleotídicas de L. infantum e produto amplificado de PCR. (-) GAP, (.) nucleotídeo idêntico, amostra 25 a 33 = seqüência nucleotídica do produto de PCR amplificado (amostras de cultura).........................................................................................54

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Listagem de agentes infecciosos cujos anticorpos são pesquisados na triagem sorológica no banco de sangue ......................................................31 Tabela 2: Primers ultilizados na PCR quantitativa ............................................35

Tabela 3. Primers usados na PCR ...............................................................................37

Tabela 4: Prevalência de infecções detectadas através de exames de rotina de doações de sangue no estado do Rio Grande do Norte em 2011, agrupados por cidade de doação de sangue. Valores indicando o número total de doações em cada categoria, seguido pelo percentual do total ou percentual de doações infectadas em parênteses .................................................................................42 Tabela 5: Número de doações, idade e sexo dos doadores de sangue agrupadas por motivo da rejeição da doação de sangue .................................43 Tabela 6: Avaliação das bolsas de sangue para identificação de infecção por T. cruzi e Leishmania utilizando os diferentes métodos de diagnóstico ...............55

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SIGLAS E ABREVIATURAS

AIDS

Anti-HBS

Anti-HBsAg

DAT

DC

DNA

DMSO

DTH

ELISA

HAI

HBV

HBsAg

HCV

HIV

HTLV-I

IgG

IgM

RIFI

ITS

kDNA

LV

MS

N

NO

PBMC

PBS

PCR

rK39

RNA

qPCR

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

Anticorpo contra o vírus da Hepatite B

Anticorpo anti-antígeno de superfície do vírus da hepatite B

Teste de Aglutinação Direta

Doença de Chagas

Ácido desoxiribonucléico

Dimetilsulfóxido

Reação de Hipersensibilidade do tipo Tardia

Ensaio Imunoenzimático

Hemaglutinação Indireta

Virus da Hepatite B

Antígeno de Superfície do Vírus da Hepatite B

Vírus da Hepative C

Vírus da Imunodeficiência Humana

Vírus T-linfotrópicos Humanos Tipo I

Imunoglobulina G

Imunoglobulina M

Reação de Imunofluorescência Indireta

Internal Transcribed Spacer

Ácido Desoxirribonucleico do Kinetoplasto

Leishmaniose Visceral

Ministério Público da Saúde

Normal

Óxido Nítrico

Células Mononucleares do Sangue Periférico

Solução Salina Tamponada com Sulfato

Reação em Cadeia da Polimerase

Proteína recombinante 39 do Kinetoplasto

Ácido Ribonucleico

Reação em Cadeia da Polimerase em Quantitativa

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SDS

SLA

Th1

Th2

VDRL

BLAST

dNTPs

LC

LCD

LCM

LDPC

Pb

TCLE

Duodecil Sulfato de Sódio (Sodium Dodecyl Sulfate )

Antígeno Solúvel de Leishmania

Linfócitos T auxiliares Tipo I

Linfócitos T auxiliares do Tipo II

Teste Laboratórial de investigação de doenças Venéreas

Basic local alignment search tool

Desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dATP, dTTP, dCTP,

dGTP)

Leishmaniose Cutânea

Leishmaniose Cutâneo difusa

Leishmaniose Mucosa

Leishmaniose Dérmica Pós-Calazar

Pares de base

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..............................................................................................

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .........................................................................

2.1. Tripanossomatídeos ...................................................................................

2.2. Leishmaniose Visceral ................................................................................

2.2.1. Agente Etiológico .....................................................................................

2.2.2. Epidemiologia de LV ................................................................................

2.2.3. Manifestão Clínica ....................................................................................

2.2.4. Diagnóstico de LV ....................................................................................

2.2.5. Infecção assintomática por L. infantum e o risco de transmissão via

transfusão sanguínea .........................................................................................

2.3. Doença de Chagas ......................................................................................

2.3.1. O agente etiológico ...................................................................................

2.3.2. Patogenia e curso da infecção .................................................................

2.3.3. Diagnóstico da infecção por T. cruzi .........................................................

2.3.4. Infecção por T. cruzi em candidatos a doadores de sangue ....................

3. OBJETIVOS....................................................................................................

4. MATERIAIS E MÉTODOS ..............................................................................

4.1. Caracterização da Área de Estudo ..........................................................

4.2. Considerações Éticas ..................................................................................

4.3. Caracterização do Sujeito da Pesquisa e Desenho do Estudo ...................

4.4. Diagnóstico sorológico da infecção por T. cruzi ...........................................

4.4.1. Métodos ELISA e Imunofluorescência Indireta .........................................

4.5. Diagnóstico da infecção por Leishmania infantum .......................................

4.5.1. Pesquisa de Anticorpos anti-Leishmania no soro dos doadores .............

4.5.2. Avaliação da parasitemia por PCR quantitativa .........................................

4.6. Cultura de Leishmania ..................................................................................

4.7. Caracterização das espécies de Leishmania ................................................

4.7.1. Extração de DNA de cultura de tripanosomatídeos ...................................

4.7.2. Amplificação das sequências do ITS1 e do gene HSP70 por PCR .........

4.7.3. Sequenciamento ........................................................................................

4.7.4. Isoenzimas .................................................................................................

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4.8. Prevalência da infecção por Leishmania em amostras de sangue total de

doadores sem sinais de infecção .........................................................................

4.9. Análise Estatística .........................................................................................

5. RESULTADOS ................................................................................................

5.1. Características da amostra estudada ...........................................................

5.2. Resultados da triagem sorológica primária (ELISA) para detecção de

infecção por T. cruzi e demais parasitas trasmissíveis via transfusional ............

5.3. Reação de Imunofluorescência Indireta .......................................................

5.4. Diagnóstico sorológico da infecção por Leishmania .....................................

5.5. Resultados da RIFI vs ELISA para Leishmania ............................................

5.6. Detecção de DNA de Leishmania no sangue periférico dos doadores de

sangue ..................................................................................................................

5.5.1. Prevalência da infecção por Leishmania por métodos moleculares e

cultura ...................................................................................................................

5.7. Cultura de Leishmania ...................................................................................

5.8. Caracterização das cepas de Leishmania por PCR, sequenciamento e

Isoenzimas ............................................................................................................

6. DISCUSSÃO ....................................................................................................

7. CONCLUSÃO ..................................................................................................

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................

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Jethe N. de O. Filho Página 15

1. INTRODUÇÃO

As espécies Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi são

tripanossomatídeos de importância médica e são, respectivamente, os agentes

etiológicos da leishmaniose visceral (LV) e da Doença de Chagas no Brasil.

Esses protozóarios são transmitidos por insetos vetores flebotomíneos e

triatomíneos, respectivamente. Essas duas doenças são prevalentes no Brasil,

sendo no passado endemias tipicamente de áreas rurais, no entanto, nos

últimos trinta anos tem havido uma expansão das áreas endêmicas,

principalmente decorrente do processo migratório populacional de áreas rurais

para áreas periurbanas (1-3). É conhecido que pessoas infectadas por

Leishmania ou por T. cruzi podem evoluir de forma assintomática, podendo

atuar como reservatórios desses patógenos sendo possível a transmissão dos

mesmos, quando de doações de sangue ou órgão, conforme já previamente

relatados em outros países (4-6).

A taxa de infecção por Leishmania é elevada em grande parte das

cidades brasileiras. No Brasil, é obrigatória a determinação dos antígenos ABO

e Rh (D), além de testes sorológicos para identificação de infecção por vírus

(hepatites B e C, HIV e HTLV I/II), T. cruzi, e Treponema pallidum, em

hemoderivados, além de avaliação de história progressa de malária e

hemoglobinopatias . No entanto, não há avaliação de infecção por Leishmania,

apesar do aumento das áreas endêmicas de LV no Brasil. Na verdade, ainda

não há disponibilidade testes imunológicos sorológicos específicos para

Leishmania no Brasil ou em outras áreas endêmicas (7) e não há

documentação do risco de transmissão de Leishmania por via sanguínea, nem

a confirmação do homem como hospedeiro importante de L. infantum em áreas

urbanas.

Estudos realizados pelo nosso grupo demonstram que em área

periurbana do município de Natal a taxa de infecção assintomática para

Leishmania é de 32% (8). Portanto, este estudo teve como hipótese que a taxa

de infecção por Leishmania é elevada em doadores de sangue oriundos de

áreas endêmicas para LV, considerando a alta taxa de prevalência de infecção

em pessoas assintomáticas residentes nas áreas periurbanas, havendo,

portanto, um risco de transmissão de Leishmania por via transfusional. No


entanto, esse risco é menor em virtude dos ensaios sorológicos para detecção

da infecção por T. cruzi também identificarem Leishmania devido a ocorrência

de reação cruzada. Como os bancos de sangue fazem o rastreio sorológico,

normalmente utilizando métodos ELISA e Imunofluorescência para T. cruzi,

esses testes também poderiam idenficar presença de anticorpo anti-

Leishmania e, portanto, a amostra de sangue seria excluída do processo

transfusional, diminuindo assim, a possibilidade de transmissão de Leishmania

por esta via.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Tripanosomatídeos

Os tripanosomatídeos constituem um grupo de protozoários flagelados de

ampla distribuição na natureza que podem ser encontrados parasitando

diferentes grupos animais (9, 10). Podem ainda ser considerados monoxenos,

parasitando apenas invertebrados, ou heteroxenos quando parasitam ambos

invertebrados e vertebrados (Endotrypanum, Leishmania e Trypanosoma) (9).

Alguns tripanossomatídeos são parasitas digenéticos que apresentam em seu

ciclo de vida, dependendo do hospedeiro, inseto ou vertebrado, formas

evolutivas distintas, tal como ocorre com as espécies, Trypanosoma cruzi e

Leishmania infantum, endêmicas na América Central e do Sul. A relevância

médica deste grupo de parasitas continua a ser evidente de acordo com a

Organização Mundial de Saúde (OMS) que estima que cerca de 550 milhões

de pessoas nos países em desenvolvimento estão sob o risco de contrair

leishmanioses, doença de Chagas e doença do sono (The World Health

Report, 2009, http://www.who.ch).

Os diferentes tripanosomatídeos patogênicos compartilham

características celulares semelhantes como formas especiais de

processamento do RNA (trans-splicing), edição de RNA mitocondrial,

organização peculiar do DNA nuclear, e DNA mitocondrial com mini e

maxicírculos formando o cinetoplasto, característica morfológica típica da

família Trypanosomatidae (9, 11, 12). Além disto, há similaridade entre os

genes, conforme demonstrado pelo sequenciamento dos genomas de T. cruzi,


T. brucei, L. major, e L. donovani, resultando em proteínas com sequências

contendo epitopos comuns.

2.2. Leishmaniose Visceral

As leishmanioses são enfermidades causadas por protozoários

patogênicos que infectam hospedeiros vertebrados e se multiplicam no interior

de macrófagos, sendo endêmicas em áreas tropicais, subtropicais e área

mediterrânea. As leishmanioses apresentam um espectro clínico amplo e

podem ser causadas por espécies distintas de Leishmania. Esses parasitas

são transmitidos por diferentes espécies de flebotomíneos (13, 14). Há

diferentes formas de apresentação clínica das leishmanioses incluindo as

formas cutânea, cutânea difusa, mucocutânea, disseminada e visceral (LV,

também conhecida como calazar), além de envolvimento dérmico pós-

tratamento da LV, conhecida como leishmaniose dérmica pós-calazar (PCDL).

A LV é uma doença sistêmica que pode ser fatal mesmo quando tratada e é

causada pelo complexo Leishmania donovani no leste da África e no

subcontinente indiano e por Leishmania infantum na Europa, África do Norte e

América Latina (15, 16).

2.2.1. Agente etiológico

No seu ciclo de vida, a Leishmania apresenta duas formas básicas, a

forma amastigota e a promastigota. As amastigotas apresentam forma oval, ou

esférica, intracelulares obrigatórias e parasitam vacúolos lisossomais de

macrófagos de hospedeitos vertebrados (175, 176, 177). A forma promastigota

flagelada, extracelular, encontrada livre no trato digestivo do inseto ou aderido

ás microvilosidades da cutícula intestinal (178). A transmissão do protozoário

ocorre quando o inseto vetor pica animais infectados com Leishmania e

juntamente com o sangue ingere as formas amastigostas do protozoário. Após

o repasto sanguíneo, o parasito passa por uma série de modificações

morfológicas, bioquímicas e funcionais no interior do trato digestivo do inseto

(178, 180). Essas modificações são determinantes para a sobrevivência do

parasito em um meio totalmente distinto do existente no interior do macrófago

(179). Uma vez no trato digestivo do invertebrado, o protozoário assume sua


forma promastigota, diferenciando-se em promastigota proxíclica, evitando a

expulsão do parasito do intestino médio do vetor. Sequencialmente, o parasita

assume sua forma promastigota metacíclica infectante, estágio em que migra

para as peças bucais do inseto e se torna capaz de infectar diversos outros

hospedeiros no próximo repasto do vetor (Figura 1).

Figura 1: Ciclo de vida do da Leishmania. Esquema ilustrando os estágios de vida de Leishmania desde o hospedeiro flebotomíneo até o hospedeito mamífero representado pelo homem (http:www.dpd.cdc.gov/dpdx).

2.2.2. Epidemiologia de LV

Como já foi mencionado, a LV pode ser causada por espécies distintas de

Leishmania, dependendo da área geográfica. L. infantum causa doença

principalmente em crianças e pessoas com imunosupressão na Europa, norte

da África, China e América Latina, enquanto L. donovani causa LV na India,

Bangladesh, Nepal, Sudão e outros países da Ásia, sendo uma doença que

ocorre entre adultos jovens (17). Há uma estimativa anual de 500.000 novos

casos de LV e mais de 50.000 óbitos (17). Mais de 90% dos casos de LV


ocorre em seis países: Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão, Etiópia e Brasil. Os

principais fatores condicionantes dessa expansão da LV são a migração, a

aparente ineficácia das medidas de controle e a co- infecção LV-HIV (18, 19). A

LV atinge primariamente as comunidades mais pobres de áreas periurbanas e

rurais.

A LV está em processo de expansão no Brasil, e está presente na maioria

dos estados brasileiros, incluindo estados da região sul (20). Anteriormente era

uma doença de ocorrência rural, no entanto atualmente é notificada em áreas

urbanas e periurbanas de cidades do Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste do

Brasil (20). O número de casos de LV no nordeste e no Brasil apresentou um

grande aumento de 1980 até 2009, e esse fato está relacionado ao processo

de urbanização da doença (20) (Figura 2). Na década de 90,

aproximadamente 90% dos casos notificados de LV correram na região

Nordeste. Na medida em que a doença expandiu para as outras regiões, essa

situação vem se modificando e, recentemente, a região Nordeste representa

48% dos casos do país (20).

Figura 2: Total de casos de leishmaniose visceral notificados no Brasil entre os anos de 1980 a 2009.


A periurbanização e a urbanização da leishmaniose visceral tem ocorrido

em todas as regiões brasileiras, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de

Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá

(MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luis (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA)

e, mais recentemente, as epidemias ocorridas nos municípios de três Lagoas

(MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO) (20). As áreas com maior

concentração de casos de LV no Brasil estão representadas na (Figura 3).

Figura 3: Áreas de maior concentração de casos de leishmaniose visceral. Os casos notificados vão de 0 (áreas em branco) à aproximadamente 6.000 casos (áreas mais escuras). As áreas em tons de cinza apresentaram menor densidade de casos notificados em relação ás áreas mais escuras.

A LV no Rio Grande do Norte também era uma doença tipicamente rural,

no entanto, no início da década de 90 passaram a ser documentados surtos da

doença na cidade de Natal e região metropolitana (21). A LV em Natal acomete

primariamente crianças, sendo estas referentes à metade dos casos (21). Os

frequentes surtos em Natal estão associados com o crescimento populacional

em locais de periferia da cidade (21, 22). No passado, a maioria dos casos de

LV no RN era em pessoas menores de 15 anos (23). A infecção assintomática

é frequente nas áreas endêmicas podendo chegar até 32% dos residentes

oriundos de áreas onde há detecção de LV humana ou canina (8).


2.2.3. Manifestação clínica

No homem, a infecção por L. infantum apresenta um amplo espectro

clínico, podendo existir formas assintomáticas, manifestações clínicas discretas

(subclínica ou oligossintomática), moderadas e até formas graves. Em regiões

endêmicas do Nordeste do Brasil, estima-se que 5 a 10% das crianças

infectadas por L. infantum desenvolvem a LV (24, 25), e o período de

incubação pode variar de 2 a 14 meses (25), mas há registros de

desenvolvimento de LV décadas após a infecção inicial, conforme relatado para

pessoas oriundas de área endêmica da Bahia que desenvolveram LV após

imunosupressão (26).

Há diversos fatores de risco determinantes na suscetibilidade a

desenvolver LV, tais como má nutrição, tipo de resposta imunológica, idade,

sexo, co-infecção HIV-Leishmania, transplantes, ou qualquer co-morbidade que

leve a diminuição transitória ou permanente da resposta imune (2, 27, 28).

As pessoas com LV apresentam sintomas e sinais de infecção sistêmica

incluindo anemia, febre, fadiga, fraqueza, perda de apetite e perda de peso,

hepatoesplenomegalia e hipergamaglobulinemia. As formas oligossintomática e

assintomática podem evoluir para a cura espontânea nos indivíduos

imunocompetentes (29).

2.2.4. Diagnóstico de LV

O diagnóstico para a LV baseia-se em dados epidemiológicos, clínicos e

laboratoriais. O diagnóstico clínico de LV tem como base os seus principais

sintomas, em especial: a febre, hepatoesplenomegalia, anemia, leucopenia e

manifestações hemorrágicas. As formas oligossintomáticas da LV são de difícil

diagnóstico, principalmente fora das áreas endêmicas, com quadros de tosse

persistente, diarréia por mais de três semanas, adinamia, discreta

hepatoesplenomegalia, geralmente sem febre. Esses quadros, frequentemente,

são confundidos com processos virais ou enteroparasitoses, o que impede ou

dificulta, um diagnóstico precoce da doença.

O exame parasitológico da LV é realizado pela demonstração do parasita

em lâminas contendo material fixado e corado, obtido por punção de órgãos ou

medula óssea; como também pela observação de parasitas isolados em cultura

ou por inoculação em cobaias de uma amostra de biópsia ou aspirado do baço


ou da medula óssea. A sensibilidade dos testes parasitológicos, que é a

frequência com que o teste detectará presença de Leishmania, é mais elevada

em amostras obtidas por aspirado esplênico (aproximadamente 98%), porém

há risco de complicações tais como hemorragia. Punção hepática, aspirados de

linfonodos e esfregaços da camada leucoplaquetária, particularmente nos

casos de co-infecção HIV-Leishmania são também usados (13, 30-32) embora

com sensibilidade menor. As técnicas convencionais de esfregaço ou cultura

possuem baixa sensibilidade na detecção de infecções assintomática e sub-

clínica e nos casos de LV confirmada a sensibilidade dos métodos de cultura é

em torno de 70% (33), ou seja, a cada 100 indivíduos infectados,

aproximadamente 70 serão positivos no teste.

O diagnóstico sorológico baseia-se na presença de resposta imune

humoral específica nos casos de LV, ou resposta imune mediada por células,

nos casos de leishmaniose cutânea e leishmaniose cutâneo-mucosa (13). Uma

ampla variedade de métodos sorológicos com diferentes sensibilidade e

especificidade está disponível para o diagnóstico de LV, isto é, quanto menos

resultado falso-positivo e/ou reação cruzada com outras doenças o teste

apresentar, maior será sua especificidade. Do mesmo modo, para um teste

possuir alta sensibiliade, é preciso que ele seja capaz de detectar baixos títulos

de anticorpos presentes no soro de uma pessoa infectada. Dentre os mais

utilizados estão a Reação de Imunofuorescência Indireta (RIFI), aglutinação

direta (DAT), ensaio imunoenzimático (ELISA) e imunoblotting. No entanto, eles

não são disponíveis na maioria das áreas endêmicas, sendo o diagnóstico

baseado principalmente na história epidemiológica e na clínica, além de

confirmação parasitológica em material obtido através de aspirado medular.

Este último é positivo em 75-80% dos casos de LV.

A imunofluorescência indireta é um dos testes mais sensíveis disponíveis

(90-100%) e apresenta boa especificidade (80%) (34, 35). O teste é utilizado

desde a década de 60, e baseia-se na detecção de anticorpos. Os antígenos

utilizados na RIFI são obtidos a partir de macerado de promastigotas de

culturas de Leishmania, parasitos intactos ou moléculas solúveis. Existe a

possibilidade de reação cruzada desses antígenos com soros de indivíduos

que possuem anticorpo anti-Trypanossoma. O resultado da imunofluorescência

indireta é normalmente expresso em título, ou seja, consideram-se como


positivas as amostras reagentes a partir da diluição de 1:80. Nos títulos iguais a

1:40, com clínica sugestiva de LV, recomenda-se a solicitação de nova amostra

em 30 dias.

O método imunoenzimático (ELISA) é uma ferramenta valiosa no

diagnóstico sorológico da infecção por Leishmania. O teste é útil para a análise

de laboratório, bem como para aplicações de campo. No entanto, a

sensibilidade e a especificidade do ELISA são influenciadas pelo tipo de

antígeno utilizado. Foram desenvolvidos e testados vários antígenos

recombinantes de L. donovani, rgp63, rK9, rK26 e rK39 de L. infantum para

serem usados em ensaios sorológicos de rotina (38-43). Destes, o antígeno

rK39 é altamente sensível e preditivo da manifestação sintomática em

pacientes com LV. (142) Os títulos de anticorpos para esse antígeno se

correlacionam diretamente com a doença ativa, podendo ser usado no

monitoramento dos doentes. Porém, em geral os testes sorológicos possuem

duas grandes limitações: altos níveis de anticorpos permanecem detectáveis

por vários meses ou anos após a cura (44, 45) e grande parte das pessoas

saudáveis sem história de LV que residem em áreas endêmicas são reativos

na sorologia devido infecções assintomáticas (46-48).

Diversos métodos de detecção de ácidos nucleicos, tanto DNA quanto

RNA, foram desenvolvidos. Entre estes, a Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR) provou ser uma técnica sensível e específica. Diferentes sequências de

DNA no genoma de Leishmania como a região ITS (Internal Transcribed

Spacer) , locus gp63, sequências teloméricas, sequências alvo em genes rRNA

como 18s rRNA e SSU-rRNA e as regiões conservadas quanto as variáveis

nos minicírculos de DNA do cinetoplasto (kDNA) são usados por diversos

pesquisadores (49-53).

Nos últimos anos, a detecção de parasitas no sangue periférico pela

técnica PCR tem sido preconizada para diagnóstico e acompanhamento da LV,

e na detecção de parasitemia em portadores assintomáticos, no entanto, esses

ensaios só estão disponíveis em laboratórios de pesquisa (54-56). A

sensibilidade aumentada da PCR, em comparação com a detecção de

anticorpos específicos aliado ao fato de que o DNA do parasita pode


desaparecer rapidamente do sangue (57-59), indicam que a PCR pode ser

usada para detectar infecções em curso na população assintomática (60).

2.2.5. Infecção assintomática por L. infantum e o risco de transmissão

via transfusão sanguínea

A forma assintomática é o tipo mais frequente de infeção por L. infantum e

ocorre normalmente quando há história de LV na família ou na vizinhança (61,

62). Diversos estudos para avaliar a prevalência de infecção por Leishmania

assintomática no homem têm sido realizados em diferentes regiões do Brasil e

em outros países endêmicos para LV, e os resultados se mostram variáveis de

acordo com a região ou país, podendo até alcançar uma soroprevalência de

até 52% (2, 8, 23, 28, 61, 63-66). Define-se o diagnóstico da forma

assintomática da infecção por L. infantum pela detecção de anticorpo anti-

Leishmania ou pela resposta celular a antígenos de Leishmania, na ausência

de sintomas clínicos. Pessoas com infecção assintomática apresentam

resposta de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH), semelhante a aqueles

pacientes com LV pós-tratamento (64).

Diversas pesquisas têm demonstrado a possibilidade de transmissão de

Leishmania por via transfusional (4, 6, 67-70). Em alguns países do

Mediterrâneo, a leishmaniose é hipoendêmica e a LV clássica em indivíduos

não imunocomprometidos é encontrada principalmente em crianças (71). No

entanto, nos últimos 20 anos aumentou o número de casos em adultos,

especialmente naqueles infectados com o vírus da imunodeficiência humana

(HIV). Aproximadamente 30% dos casos de pacientes com LV apresentam co-

infecções com Leishmania e HIV (72). A elevação da taxa de LV em pessoas

infectadas pelo HIV, em comparação aos imunocompetentes sugere que a

maioria dos casos de LV se deve tanto a uma reativação da forma latente

quanto pelo novo contato com o parasita. Em tais casos, a LV se desenvolve

devido à supressão do sistema imune causada pelo vírus HIV (73). Outra forma

de transmissão de Leishmania é via compartilhamento de agulha entre

usuários de drogas (173), como relatado em Madrid na Espanha, onde um

estudo indicou que o compartilhamento de seringas pode elevar o risco de

contaminação e coinfecção entre HIV e Leishmania (174).


Na Europa, casos de aquisição de infecção por Leishmania via transfusão

foram relatados na França, Suécia, Bélgica e Reino Unido (78), e também,

caso similar foi notificado na Índia (67). Em estudos realizados com doadores

de sangue do sul da França (74) e Espanha (75) foi encontrada elevada taxa

de infecção. Outras pesquisas com doadores de sangue sugerem que a

presença de L. infantum no sangue de portadores assintomáticos é episódica e

também indica que tais indivíduos são portadores assintomáticos por um

período variável. Também, há relatos de longos períodos de incubação

assintomática (76), e mesmo após a recuperação clínica o parasita pode

permanecer em indivíduos infectados (77). Em Ibiza, um estudo realizado em

doadores de sangue revelou um número acentuado de pessoas assintomáticas

infectadas com L. Infantum (75).

No Brasil, estudos mostraram que a forma assintomática da infecção por

L. infantum ocorre com mais frequência do que se acreditava na população em

geral (8, 17, 31, 37, 38). O relato de alguns casos sugere a possibilidade de

transmissão de Leishmania em pacientes transfundidos (68). Em cães a

trasmissão de Leishmania por transfusão também foi observada (79, 80).

Também, em condições de laboratório, foi demonstrado que o parasita é

transmitido a hamsters por meio de derivados sanguíneos (81-83). Em áreas

endêmicas é possível detectar DNA de Leishmania no sangue de pessoas

saudáveis, mesmo na ausência de resposta imune humoral (55, 60, 75, 84, 85).

Esta ausência de anticorpos também foi observada em cães assintomáticos

(86, 87).

2.3. Doença de Chagas

A doença de Chagas (DC) é uma antropozoonose que atinge

primariamente indivíduos que vivem em áreas rurais sendo uma das

parasitoses com ampla distribuição na América Latina. De acordo com a

Organização Mundial de Saúde (OMS), um total de 17 milhões de indivíduos

estão infectados no continente americano, sendo que deste total

aproximadamente 6 milhões residem no Brasil, 3 milhões são sintomáticos e a

incidência por ano é de 200 mil casos em 15 países (88).


Nas últimas décadas, a taxa de mortalidade, a incidência e a prevalência

da doença de Chagas no mundo apresentaram valores variáveis, devido às

migrações das populações entre áreas rural e urbana, as mudanças nos

padõres sócio-econômicos e devido ao impacto de programas de controle do

inseto vetor (89).

2.3.1. Agente etiológico

O agente etiológico da DC é o protozoário Trypanosoma cruzi, que no seu

ciclo de vida passa por diferentes estágios de desenvolvimento: a forma

epimastigota, a tripomastigota metacíclica infectante presentes no inseto vetor

e as formas amastigotas e tripomastigota sanguíneas presentes no hospedeiro

vertebrado (90).

Na natureza, o ciclo evolutivo de T. cruzi ocorre tanto em hospedeiros

vertebrados quanto em invertebrados. Os humanos se tornaram parte do ciclo

de transmissão a partir do momento que estabeleceram moradia na área de

abrangência dos insetos vetores. Nas habitações humanas, os vetores são

encontrados em buracos ou fendas nas paredes, atrás de objetos presos na

parede ou pintura solta. A incidência é maior em habitações com condições

precárias como casas de pau a pique, sapé, madeira e barro, localizados em

zonas rurais e entre populações com baixa renda familiar (91).

Os insetos vetores são hemípteros da família Reduviidae, subfamília

Triatominae, possuem hábitos geralmente noturnos e ingerem as formas

tripomastigotas junto com o sangue ao se alimentarem em mamíferos

infectados. Após multiplicação e metaciclogênese no tubo digestivo, os

parasitas são eliminados junto com as fezes do inseto durante um novo repasto

sobre a pele do vertebrado, e nesse momento pode ocorrer a infecção pela

forma tripomastigota metaciclica que peneta pela lesão da picada do inseto ou

por membranas mucosas (92). A transformação e todo desenvolvimento do

flagelado no vetor estão relacionados à espécie do triatomíneo e às diferentes

cepas do parasita (93).

No sangue do hospedeiro vertebrado, a forma tripomastigota de T.cruzi

invade diferentes tipos celulares, principalmente do sistema mononuclear

fagocitário, nas quais irão se multiplicar sob a forma de amastigotas (Figura 4)

(94). Contudo, existem outros mecanismos de infecção: transmissão congênita,


durante a amamentação, transfusão sanguínea e através da ingestão de

alimentos contaminados com o parasita, além de formas excepcionais como:

transmissão acidental em laboratório, transplantes de órgãos e sexual (95, 96).

Figura 4: Ciclo de vida do T. cruzi. O esquema mostra as etapas do ciclo de vida do T. cruzi, passando pelo inseto (hospedeiro invertebrado) e pelo humano (hospedeiro vertebrado), (http:www.dpd.cdc.gov/dpdx).

2.3.2. Patogenia e curso da infecção

A patogenicidade de T. cruzi depende tanto de caraterísticas do

hospedeiro quanto da cepa infectante. Deste modo, a evolução da infecção no

vertebrado suscetível depende da idade, sexo, estado nutricional e genótipo do

hospedeiro, e por características genéticas, morfológicas e biológicas da cepa

infectante, bem como fatores ambientais como temperatura (96). Todavia, no

hospedeiro imunocompetente, a infecção é controlada e resolvida. Estes

indivíduos passam para uma fase assintomática onde somente exames

sorológicos podem detectar de forma indireta a infecção. Dependendo da cepa

e estado imunológico do hospedeiro, dentre outros fatores, uma proporção

desses indivíduos desenvolve doença cardíaca e/ou digestiva, vários anos

após a contaminação, enquanto a maioria permanece assintomática (97).


O curso da doença de Chagas no homem pode apresentar as fases:

aguda e crônica. O início da fase aguda acontece logo após a entrada do

parasita no organismo (89) e caracteriza-se normalmente por apresentar

parasitemia abundante (98) e pela relativa facilidade com que se evidencia o

parasita tanto no sangue periférico, mediante métodos diretos, ou por métodos

sorológicos por meio da detecção de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgM.

As manifestações clínicas na fase aguda, quando presentes, aparecem

sob a forma de reações locais como chagoma de inoculação (inoculação

cutânea) e o sinal de Romaña (edema bipalpebral unilateral) seguidos por

febre, hepatomegalia e esplenomegalia (89). Algumas pessoas podem

desenvolver complicações neurológicas, cardíacas e pulmonares durante esse

período (98, 99), especialmente crianças menores de 15 anos e pacientes

imuno-comprometidos (100).

A fase crônica acontece quando as manifestações clínicas da fase aguda

desaparecem e o número de formas tripomastigotas no sangue periférico

diminui, chegando a níveis indetectáveis. A resposta imune do hospedeiro é

responsável por essa queda da parasitemia, principalmente em pessoas não

tratadas (101). Durante a fase crônica da doença de Chagas, muitos indivíduos

infectados permanecem assintomáticos. Esse período sem manifestações

clínicas é conhecido como forma indeterminada da doença e cerca de 50 a

70% dos pacientes ficam nessa fase pelo resto da vida (102).

Entretanto, cerca de 30% das pessoas que permanecem assintomáticas

podem, eventualmente, vir a desenvolver sintomas da doença caracterizados

por distúrbios no sistema digestivo, nervoso e no coração, ocasionalmente

fatais, além de outras alterações sistêmicas como hepatoesplenomegalia,

linfadenopatia e linfocitose (103).

2.3.3. Diagnóstico da infecção por T. cruzi

Na fase aguda da infecção por T. cruzi os exames parasitológicos são

baseados na demonstração do parasito na corrente sanguínea do paciente

sendo considerados os exames de maior especificidade (100%). Nessa fase,

quando a densidade de parasitas no sangue está elevada, é mais eficaz a

demonstração do parasito por meio de esfregaço do sangue periférico do

paciente. É possível realizar também, o exame a fresco e a visualização das


formas tripomastigotas do T. cruzi. A hemocultura e o xenodiagnóstico também

são empregados. O xenodiagnóstico consiste em verificar se o barbeiro não

infectado iria se infectar após sugar o sangue de paciente doente (104). Ainda

na fase aguda pode ser empregada a Reação de Imunofluorescência Indireta

(RIFI) para pesquisa de IgM contra T. cruzi. (105).

Durante a fase crônica, a parasitemia diminui consideravelmente

dificultando o encontro do flagelado em esfregaços de sangue periférico corado

pelo método Giemsa. O xenodiagnóstico é um dos exames parasitológicos

aplicados à forma crônica, registrando-se positividade entre 9% a 87,5% (106-

109). O cultivo do sangue ou hemocultura alcança, na forma crônica da

doença, 0% a 94% de positividade (110-112).

A hemocultura é um exame demorado, requer repicagens frequentes e

controle rígido do ambiente e dos meios de cultura para se evitar a

contaminação com bactérias ou fungos, o que de certa forma dificultaria ou

inviabilizaria o resultado do exame. A sensibilidade é baixa, porém a

especificidade é alta e inquestionável.

Os testes sorológicos apresentam vantagens na fase crônica da DC, visto

que possuem alta sensibilidade se comparado com os exames parasitológicos.

Nessa fase, o hospedeiro apresenta um aumento na resposta humoral contra o

parasito, permanecendo detectável por longos períodos. Desta forma, o teste

de Machado-Guerreiro (1913) foi o primeiro exame sorológico a ser

padronizado para a doença de Chagas, baseando-se na fixação do

complemento e utiliza como antígeno o extrato bruto obtido de órgãos de cães

infectados por T. cruzi. Atualmente, são empregados novos métodos

sorológicos com boa sensibilidade e especificidade, tais como o ELISA e a RIFI

(113). A técnica de Machado-Guerreiro deixou de ser usada em virtude

principalmente, das reações cruzadas com indivíduos com hanseníase (113).

A hemaglutinação indireta (HAI) foi empregada para o diagnóstico da

doença de Chagas pela primeira vez em 1947 (114). É utilizada para triagem

devido sua praticidade e boa sensibilidade, entretanto, tem especificidade

inferior a RIFI e ao ELISA.

A RIFI para a infecção por T. cruzi foi inicialmente padronizada utilizando

formas de T. cruzi em tubos (115). Posteriormente, a técnica foi padronizada

em lâminas (116) sendo considerada uma técnica de uso vantajoso em


laboratórios clínicos, pois é possível utilizar reagentes como os conjugados

anti-globulínicos marcados com fluoresceína, os sais reagentes para a técnica

e utilizar o próprio parasita, na forma epimastigota, obtida em culturas sem

necessidade de processos de extração ou fracionamento. Neste método

também se observa reação cruzada com leishmaniose, e com sensibilidade

em torno de 95% (117).

O ELISA, apresenta sensibilidade e especificidade próximas ao teste RIFI,

porém a RIFI ainda é mais específica que o ELISA. Neste último também se

observa reação cruzada com leishmaniose, não sendo 100% específico (118).

No entanto, o ELISA trouxe diversos benefícios, sendo possível a realização de

exames de muitos pacientes por vez, diferentemente da técnica de RIFI, além

de utilizar um equipamento para leitura de densidade óptica, dispensando a

leitura do técnico em microscopia. Desta forma, foi viabilizada a execução de

grande quantidade de exames em bancos de sangue, por exemplo, na triagem

de doadores de sangue, além da automatização de procedimentos laboratoriais

de rotina. Os métodos sorológicos são importantes no diagnóstico da doença

de Chagas crônica devido à boa sensibilidade e especificidade, pois mesmo

décadas após a infecção os níveis de imunoglobulinas são demonstráveis no

sangue do indivíduo (119, 120). Porém, a titulação de anticorpos não é um bom

indicador do estágio da doença, não servindo para indicar cura ou evolução em

formas mais graves da doença.

Atualmente, os estudos de biologia molecular estão sendo empregados

tanto em testes confirmatórios para infecção por T. cruzi como para

acompanhamento do paciente chagásico crônico. Na técnica de PCR usada

para o diagnóstico de Chagas, são amplificados fragmentos oriundos do DNA

genômico do T. cruzi ou do DNA de minicírculos do cinetoplasto do parasito (k-

DNA), podendo ser empregada em amostras de sangue de pacientes

chagásicos e fezes de triatomíneos (121, 122), estando livre da ocorrência de

reações cruzadas.

Para pessoas assintomáticas que foram identificadas infectadas por T.

cruzi quando da triagem em Banco de Sangue, também é fundamental o

diagnóstico de certeza no intuito de diminuir a preocupação e até a ansiedade

desses indivíduos em relação à confirmação ou não da infecção pó T. cruzi


uma vez que essas pessoas se sentem saudáveis, ou seja, não apresentam

qualquer sintoma de doença.

Os métodos moleculares oferecem também maior rapidez e sensibilidade

em comparação com os testes considerados padrão ouro como os

parasitológicos. Porém, sua aplicação pelos serviços saúde pública ainda é

inviável devido aos altos custos de tais métodos.

2.3.4. Infecção por T. cruzi em candidatos a doadores de sangue

Há relatos de transmissão de Trypanosoma cruzi por transfusão

sanguínea. A ocorrência da DC entre doadores de sangue de diferentes países

na América do Sul é variável em cada país (89, 123), tendo sido descrita mais

recentemente nos Estados Unidos (89, 124-126). A via de infecção

transfusional da DC foi comprovada nos anos 50 (127). Os primeiros doadores

infectados foram descritos no Brasil por Pellegrino (128), e os primeiros casos

de doença de Chagas transfusional em brasileiros foram descritos em São

Paulo (129). Até meados dos anos 80, a doença era considerada um grave

problema de saúde pública, estimando-se que, na década de 70, em 100 mil

novos casos, 20 mil correspondiam à transmissão transfusional. Os testes

foram aperfeiçoados com técnicas como a imunofluorescência, hemaglutinação

indireta e, finalmente, o teste ELISA, mais utilizado atualmente.

Em meados dos anos 80 surgiram importantes avanços na luta contra a

DC no Brasil, por meio de modificações fundamentais nos procedimentos

hemoterápicos, por ex. proibição do doador remunerado e obrigatoriedade da

seleção sorológica dos candidatos à doação. Com estas medidas, a situação

melhorou consideravelmente, e a ocorrência atual de reações sorológicas

positivas para T. cruzi é de 0,6% (130), em contraste com o índice de 7,0% dos

anos 70 (131). Um estudo realizado na cidade de Porto Alegre, entre 2005 e

2006, indicou uma prevalência sorológica para doença de Chagas em

doadores de sangue de 0,5% (132). Dados disponibilizados pela Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) indicam uma retenção sorológica

para doença de Chagas em doadores de sangue de 0,85% no Rio Grande do

Sul (133).


Apesar da melhoria no controle da transmissão vetorial em áreas

endêmicas, a doença de Chagas ainda infecta quase 10 milhões de pessoas

(134), e as transfusões têm sido uma importante via de transmissão (135). O

risco de infecção via transfusão de sangue contaminado é de 12% - 25%,

sendo um desafio para os bancos de sangue a identificação e exclusão de

portadores assintomáticos e crônicos do parasita (136). Estima-se que haja

cerca de 12 a 14 milhões de pessoas infectadas com T. cruzi na América

Latina (137). Em um estudo realizado recentemente, a retenção de bolsas de

sangue depois de realizado exame sorológico para doença de Chagas

correspondeu a uma taxa média de 0,41% do total (138). Outro estudo também

relata retenção de bolsas de sangue por sorologia positiva para Chagas de

0,6% nos laboratórios de origem e 0,5% em um serviço de referência (130).

Além disso, uma vez que a maioria dos pacientes com doença de Chagas

são assintomáticos e desconhecem sua condição, esses potenciais doadores

de sangue representam uma ameaça grave à segurança do suprimento de

sangue de áreas não-endêmicas (5). Desde 1988, no Brasil e em outros países

latino-americanos, é obrigatória a triagem de doadores de sangue para Chagas

e, desde 1997, 100% de cobertura sorológica foi obtida em bancos de sangue

(139). Concomitantemente, o controle da transmissão vetorial tem reduzido

significativamente a prevalência da doença de Chagas em doadores de sangue

(140). Uma das estratégias utilizadas para avaliar a segurança do suprimento

de sangue é avaliar a prevalência de infecções transmitidas por transfusão em

pacientes politransfundidos (141).


3. OBJETIVOS

Geral

Analisar a ocorrência de reação cruzada entre os ensaios sorológicos que

identificam a infecção por Trypanosoma ou por Leishmania infantum em

doadores de sangue no Rio Grande do Norte.

Específicos

1. Avaliar a extensão da reatividade cruzada entre T. cruzi e L. infantum em

doadores de sangue;

2. Identificar a presença de Leishmania no sangue periférico de doadores

de sangue;

3. Caracterizar as cepas de Leishmania isoladas em indivíduos com

infecção assintomática.

4. Determinar a prevalência de infecção por Leishmania entre a população

de doadores de do Rio Grande do Norte.


4. Materiais e Métodos:

4.1. Caracterização da Área de Estudo.

O Estado do Rio Grande do Norte possui 5 unidades fixas de Bancos de

Sangue HEMONORTE distribuídas em 5 municípios: Natal (Hemocentro Dalton

Cunha), Mossoró, Caicó, Pau dos Ferros e Currais Novos. Estes 5 municípios

estão sistematicamente distribuídos nas quatro regiões geográficas do estado

(Figura 5).

As áreas localizadas no Oeste do Estado do Rio Grande do Norte

(Mossoró e Pau dos Ferros) e no Seridó (Caicó e Currais Novos) são

consideradas como áreas tradicionalmente endêmicas para doença de Chagas.

Enquanto que na cidade do Natal e em arredores nos últimos 30 anos têm-se

relatado epidemias de LV humana e canina (JERONIMO, 2004; DUARTE,

2012). Adicionalmente, nos últimos 10 anos vem crescendo a ocorrência de LV

em Mossoró e arredores, além de relatos em outras cidades pertencentes as

micro regiões do Seridó e Oeste (MATOS; FILGUEIRA; AMORA, 2006).

Figura 5: Área de Estudo. Mapa do Rio Grande do Norte mostrando as unidades do HEMONORTE distribuídas nos cinco municípios sede: Natal, Currais Novos, Caicó, Mossoró e Pau dos Ferros.


4.2. Considerações Éticas

O presente estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP-UFRN) em

04/05/2011, CAAE 0093.0.051.000-11. No período de março de 2011 a

fevereiro de 2012, um total de 444 indivíduos que realizaram doação de sangue

em uma das 5 unidades coletoras de sangue, foram recrutados.

4.3. Caracterização do Sujeito da Pesquisa e Desenho do Estudo

A presente pesquisa tem o caráter de estudo transversal no qual a

amostra foi dividida em dois grupos: grupo 1 (n=300) e grupo 2 (n=144). O

grupo 1 é caracterizado por voluntários cuja bolsa de sangue doada foi

descartada do banco devido a presença de algum tipo de infecção detectada

na triagem sorológica ou por baixo volume na doação (volume ideal =450 mL)

de acordo com a resolução - RDC Nº 57, de 16 de dezembro de 2010. Na

triagem sorológica, o soro do doador é examinado na busca de anticorpos

marcadores de infecções pelos vírus das hepatites B e C, HIV, HTLV-1,

Treponema pallidum e T. cruzi (Tabela 1). O grupo 2 consistiu de 144

voluntários aparentemente saudáveis que, no momento da doação de sangue,

aceitaram participar da pesquisa.

Tabela 1: Listagem de agentes infecciosos cujos anticorpos são pesquisados na triagem sorológica no banco de sangue.

* Apenas em algumas regiões do Brasil.


Um fluxograma esquematiza a dinâmica das etapas da pesquisa a partir

do momento da seleção da amostra (Etapa 1), o qual é dividido em grupo A

(n=300) e B (n=144). Na etapa 1A é mostrado o passo-a-passo até a obtenção

do TCLE junto aos voluntários que tiveram suas bolsas de sangue expurgadas

por sorologia positiva ou baixo volume da bolsa de sangue. Na etapa 1B é

trazido o esquema de obtenção do TCLE dos voluntários do grupo 2 onde 144

voluntários foram escolhidos aleatoriamente. Os diversos exames para detectar

Leishmania são mostrados no esquema (Figura 6).


Figura 6: Desenho do Estudo. Esquema ilustrativo das duas etapas da pesquisa onde "A" representa o grupo 1 (n=300) e "B" representa o grupo 2 (n=144). Na etapa 1A/B temos o recrutamento dos sujeitos. Na etapa 2A/B vizualizamos os testes laboratoriais realizados.

# Para alcançar o objetivo 1 (Avaliar a extensão da reatividade cruzada entre

T. cruzi e L. infantum em doadores de sangue) seguiram-se os métodos

abaixo:

4.4. Diagnóstico sorológico da infecção por T. cruzi

4.4.1. Métodos ELISA e Imunofluorescência Indireta

Os exames sorológicos de todos os doadores de sangue do Rio Grande

do Norte é realizada na unidade de Natal (Hemocentro Dalton Cunha).

Portanto, as unidades de Mossoró, Caicó, Currais Novos e Pau dos Ferros

funcionam apenas como centros coletores, e enviam diariamente os tubos para

serem feitos os exames em Natal.

No HEMONORTE, as amostras de soro dos doadores são primeiramente

testadas para avaliar a presença de anticorpo anti-T. cruzi sendo utilizado Kit-

Test ELISA Chagas III do fabricante GrupoBios (BIOSChile, BiosWerfen,

AUSTRAL). O exame ELISA foi realizado em equipamento automático. Quando

uma amostra de soro era considerada reagente, uma 2ª amostra era coletada

para avaliação método da RIFI.


Assim como o ELISA, a RIFI foi realizada no HEMONORTE de Natal.

Apenas o soro dos indivíduos positivos no ELISA são testados na RIFI. O

método utiliza o kit Imunocruzi® do fabricante Biomérieux (BioManguinhos/

FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil). A amostra foi considerada reagente na

presença de fluorescência uniforme nas membranas dos parasitos, e não

reagente na ausência de fluorescência. Os títulos ≥ 80 foram considerados

como reação positiva. Em todos os testes foram incluídas amostras de soros

controles positivo e negativo para doença de Chagas. Os indivíduos

considerados positivos na RIFI eram encaminhados para o ambulatório de

Chagas no Hospital Giselda Trigueiro, centro especializado em doenças

infecto-contagiosas no RN.

4.5. Diagnóstico da infecção por Leishmania infantum

4.5.1. Pesquisa de Anticorpos anti-Leishmania no soro dos doadores

Para o exame sorológico da infecção por Leishmania, os soros dos

doadores foram obtidos da seguinte forma: para o grupo 1 (n=300) foram

retirados 500 µL de soro do tubo de cada doador na soroteca do banco de

sangue; para o grupo 2 (n=144) o soro foi obtido a partir do sangue total

coletado diretamente do voluntário no momento da doação de sangue. Todos

os exames para pesquisa de Leishmania foram realizados no Laboratório de

Imunogenética/UFRN.

A presença de anticorpos anti-Leishmania foi determinada pelo método

imunoenzimático (ELISA), utilizando extrato bruto de L. infantum isolado de um

paciente oriundo de Natal (25). As placas com 96 poços, de baixa afinidade

(Linbro – MP Biomedicals, Ohio) foram sensibilizadas com 500 ng/poço da

fração solúvel de promastigostas de Leishmania infantum. Os antígenos foram

ressuspensos em 100 μL de tampão bicarbonato-carbonato de sódio

(Na2CO3 15 mM, NaHCO3 30,8 mM, Timerosal 0,01%), pH 9,6, incubados por

24 horas, a 4ºC. O excesso de antígeno foi removido e as placas foram

bloqueadas com tampão PBS pH 7,4/Tween-20 a 1%, e mantidas por 1 hora, a

temperatura ambiente. Em seguida as placas foram lavadas 4 vezes com

PBS/tween 20 a 0,1% seguidas da adição de 100 µL de soro, por poço na

diluição de 1/500, incubadas por 1 hora, a temperatura ambiente.


Após a remoção do soro, as placas foram lavadas como descrito e

adicionados 100 µL do conjugado humano anti-IgG peroxidase na diluição

1:2000 (Promega, WI, EUA), por poço, diluído em tampão PBS, e incubadas

por 1 hora. O anticorpo secundário foi removido e as placas foram novamente

lavadas, sendo adicionados 100 µL de solução reveladora contendo peróxido

de hidrogênio (H2O2), na presença do cromógeno ABTS [2,2’azino-di-(ácido

sulfônico 3-etilbenzotiazolino) (Sigma Chemical Co. St. Louis, MI, EUA)] por 30

minutos, a temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de 100

mL de SDS 5% (C12H25NaO4S-Sulfato dodecil de sódio) do BDH Laboratory

supplies - Broom Rd Poole England. A intensidade da cor desenvolvida é

proporcional a quantidade de anticorpo presente na amostra. A leitura foi

realizada no leitor de ELISA (Titerteck instruments, Inc., Huntsville, AL, EUA) a

405 nm (25, 142).

4.5.2. Avaliação da parasitemia por PCR quantitativa

A PCR quantitativa foi usada para confirmação da presença de DNA de

Leishmania no sangue de todos os doadores voluntários da pesquisa. A

extração de DNA de sangue periférico foi realizada pelo método de salting out,

conforme adaptado (143). Foram usados 10 mL de sangue para extração de

DNA total. A curva padrão da carga parasitária foi estabelecida a partir do DNA

extraído de 5x106 parasitas, na forma promastigota, em uma diluição seriada de

4.000 a 0,4 parasitas.

A reação de PCR em tempo real foi realizada utilizando os

oligonucleotídeos já descritos (56), com algumas sequências adaptadas (55)

(Tabela 2). Foram utilizados um gene de expressão no cinetoplasto (kDNA7) e

um gene nuclear MAG1 (Gene Associado ao MSP). O volume final foi de 10 μL,

composto de 10 µL de 2x taqman (Applied Biosystems, EUA) e 200 nmol de

cada primer e 100 ng de DNA. O DNA foi amplificado em um total de 40 ciclos

com temperatura de 95ºC e 10 segundos de desnaturação, 95ºC e 15

segundos de anelamento e 60ºC e 1 minuto de extensão, a cada ciclo.


Tabela 2: Primers ultilizados na PCR quantitativa (Weirather et al, 2011)

Gene Sequência do Primer

MAG1 Senso: 5’ – AGAGCGTGCCTTGGATTGTG - 3’

Anti-senso: 5’ – CGCTGCGTTGATTGCGTTG - 3’

Sonda

MAG1 5’- FAM – TGCGCACTGCACTGTCGCCCCC

KDNA7 Senso: 5’ – AATGGGTGCAGAAATCCCGTTC - 3’

Anti-senso: 5’ – CCACCACCCGGCCCTATTTTAC - 3’

Sonda

KDNA7 5’- FAM – CCCCAGTTTCCCGCCCCGGA

# Para atingir o objetivo 2 (Isolar Leishmania do sangue periférico de doadores

de sangue) o passo subsequente foi seguido:

4.6. Cultura de Leishmania

Foi realizada cultura de Leishmania a partir de 10 mL do sangue da bolsa

dos 300 voluntários do grupo 1. A camada leucoplaquetária, formada após

centrifugação dos 10 mL de sangue a 1000 x g por 15 min, foi usada para

realização de cultura de Leishmania. Uma alíquota de 1 mL do creme

leucocitário foi adicionado ao tubo contendo ágar sangue. O tubo com ágar

sangue foi preparado pela mistura de 3 partes de sangue humano com 7 partes

de meio NNN estéril (5 g de carne Bacto, 2 neopeptone g, 2 g Bacto ágar e 0,5

g de NaCl por 100 mL de água, pH 7,4) aquecido (43°C). Cinquenta μL de Ágar

Sangue foram adicionados a cada tubo de 15 mL, sendo estes inclinados a um

ângulo de 45º até a solidificação do ágar. Os tubos de cultura foram incubados

a 27°C. O crescimento das culturas foi examinado a cada dois dias com o

auxílio de lâminas por meio de um microscópio. Após o período de 30 dias, as

culturas não crescidas foram desprezadas com hipoclorito de sódio. As culturas

que cresceram foram passadas do meio NNN ágar sangue para o meio

Schneider mais adaptado para o crescimento de Leishmania.


# Para alcançar o objetivo 3 (Caracterizar as cepas de Leishmania isoladas

em indivíduos com infecção assintomática) os seguintes passos foram

seguidos:

4.7. Caracterização das espécies de Leishmania

4.7.1. Extração de DNA de cultura de tripanosomatídeos

As formas promastigotas isoladas foram mantidas em cultura até

atingirem 1x107 células/mL, sendo obtidos 10 mL de cultura para extração de

DNA. Esse volume foi centrifugado a 3.500 rpm, por 10 minutos a 25ºC.

Desprezou-se o sobrenadante com auxilio de uma pipeta. Ressuspendeu-se o

pellet em 900 μL do tampão TELT e misturou-se por inversão. Adicionou-se

900 μL de fenol/clorofórmio na proporção de 1:1, em seguida retirou-se a fase

superior do fenol. O material foi homogeneizado por 5 minutos. Uma nova

centrifugação foi realizada por 20 minutos a 4.500 rpm a 25ºC. Transferiu-se o

sobrenadante para um novo tubo. Adcionou-se 600 μL de etanol absoluto

gelado e misturou-se vagarosamente por 5 minutos em homogeneizador e em

seguida centrifugou-se por 10 minutos a 3.000 rpm. Desprezou-se o

sobrenadante com auxilio de uma pipeta e adicionou-se 300 μL de etanol 70%

gelado. O precipitado foi resuspenso em 50 μL de TE. O DNA foi quantificado e

armazenado a -20ºC por 24 horas, após esse período foi mantido a -80ºC.

4.7.2. Amplificação das sequências do ITS1 e do gene HSP70 por PCR

Foram feitas PCRs utilizando os DNAs extraídos das culturas crescidas a

partir do sangue retirado da bolsa de sangue dos 300 voluntários. As PCRs

foram desenvolvidas na tentativa de amplificar os segmentos dos genes HSP70

(Heat shock protein 70) e ITS1 (Internal Transcribed Spacer) presentes em

parasitos do gênero Leishmania.

As reações de amplificação da região intergênica (ITS1) foram realizadas

em volume final de 50 μL, contendo 19,05 μL de água bidestilada estéril, 25

pmoles de cada primer (Tabela 3), 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2,

2,5 μL de buffer 10 x, 0,2 μL (1U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen®) e 1 μL

de cada DNA extraído.


O controle positivo foi realizado com amostras de DNA extraídas de

cultura de L. infantum e o controle negativo, com água bidestilada estéril. A

amplificação foi realizada em termociclador automático (Applied Biosystems

GeneAmp PCR System 2400). As amostras foram inicialmente desnaturadas a

95 °C por 2 minutos, seguido por 34 ciclos constituídos de desnaturação a

95ºC por 20 s, anelamento a 53°C por 30 s e extensão a 72°C por 1 minutos. A

extensão final foi 72 °C por 6 minutos (144).

Tabela 3. Primers usados na PCR

Genes Primers Sequências

ITS1 LITSR 5' CTG GAT CAT TTT CCG ATG 3'

ITS1 L5.8S 5' TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT 3'

Heat Shock Protein HSP70F 5' GAC GGT GCC TGC CTA CTT CAA 3'

Heat Shock Protein HSP70R 5' CCG CCC ATG CTC TGG TAC ATC 3'

A amplificação do gene HSP70 foi realizada em uma solução de 50 µL

contendo tampão com a Taq polimerase, 1,5 mM MgCl2, uma concentração de

200 µM de cada desoxinucleósido trifosfato, 5% de dimetilsulfóxido (DMSO), 20

pmol de primers, e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Eurogentec). A amplificação

foi realizada iniciando-se a 94°C durante 5 minutos, seguido por 33 ciclos, cada

um consistindo de 30 s, a 94°C, 1 minuto a 61°C, e 3 minutos a 72°C, e um

passo de extensão final de 10 minutos a 72°C (145).

Os produtos obtidos das PCRs foram analisados por meio de eletroforese

em cuba horizontal (80 v por 60 min) em gel de agarose a 1,5%, diluído em

tampão TBE, corado com brometo de etídio e utilizando-se marcador de peso

molecular de 100 pb. As bandas de DNA separadas por meio de eletroforese

foram visualizadas em transiluminador de luz ultravioleta e fotografadas. Para

os primers utilizados, espera-se visualizar bandas em aproximadamente 120

pb.

4.7.3. Sequenciamento

A identificação das cepas circulantes foi determinada por PCR-

sequenciamento utilizando primers específicos para genes HSP70 (fw: 5' GAC


GGT GCC TGC CTA CTT CAA 3' rev: 5' CCG CCC ATG CTC TGG TAC ATC

3') e ITS1 (5' CTG GAT CAT TTT CCG ATG 3' e 5' TGA TAC CAC TTA TCG

CAC TT 3'), estes primers permitem a identificação de espécies de Leishmania

a partir de DNA proveniente de cultura e amostras biológicas. Os produtos de

PCR foram purificados e submetidos à separação no analisador genético ABI

3100 Avant (Applied Biosystems).

4.7.4. Isoenzimas

Os isolados de Leishmania também foram identificados pelo padrão de

isoenzimas em laboratório de referência da Organização Mundial de Saúde. A

tipagem dos isolados foi realizada no Laboratório de Leishmaniose da

Fundação Oswaldo Cruz no Rio de Janeiro conforme descrito por Cupolillo

(146).

4.8. Prevalência da infecção por Leishmania em amostras de sangue total de

doadores sem sinais de infecção

No período de dezembro de 2011 a fevereiro de 2012 foram convidados a

participar do estudo 144 doadores, no qual foram extraídos 5 mL de sangue

total para ser realizada a PCR quantitativa a fim de se investigar a prevalência

de infecção assintomática dentre a população de doadores que chega ao

HEMONORTE para realizar doação de sangue.

4.9. Análise Estatística

A amostra de doadores selecionada para teste foi de 300 doadores, cujo

objetivo foi testar a hipótese de que os ensaios imunológicos para T. cruzi

realizados em banco de sangue no Rio Grande do Norte identificam também

infecção por Leishmania infantum. O cálculo amostral foi baseado no

conhecimento de que a taxa de infecção para Leishmania é de 32% (23) e em

torno de 0,5% (147) para T. cruzi em áreas focais do Rio Grande do Norte.

O cálculo do erro limite foi feito do seguinte modo:

= 1.96. 0.021.


Então, o erro limite relativo é de , aceitável, indica que a

amostra selecionada é robusta e pode responder as questões de reatividade

cruzada.

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software

SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os resultados foram considerados

significativos quando o valor de p for menor ou igual a 0,05 (p <0,05).


5. RESULTADOS

5.1. Características da amostra estudada

No ano de 2011 o total de doações de sangue no estado do Rio Grande

do Norte foi de 46.624 doações, sendo 33.638 doações em Natal, 7.126 em

Mossoró e 6.000 doações nos municípios de Pau dos Ferros, Caicó e Currais

novos juntos (Figura 7). Dentre os doadores, 74% eram do sexo masculino.

Quanto à naturalidade, observou-se que o maior percentual (26,0%) é de Natal,

seguido por Mossoró (5,3%) e Santo Antônio (2.0%). Quanto ao município de

residência, (38,7%) residem em Natal, (14,7%) residem em Mossoró e (8,7%)

em Parnamirim, ou seja, 62% são provenientes das três maiores cidades do

estado.

Doações de Sangue

0

10000

20000

30000

40000

Natal

Mossoró

Pau dos Ferros

Caicó

Currais Novos

Municípios

Nú

me

ro d

e In

div

ídu

os

Figura 7: População de doadores de sangue. Número absoluto de doações de sangue realizadas em cada um dos cinco municípios coletores no ano de 2011. Fonte: Hemonorte RN, Secretaria de Saúde do Estado do Rio Grande do Norte.


5.2. Resultados da triagem sorológica primária (ELISA) para detecção de

infecção por T. cruzi e demais parasitas trasmissíveis via transfusional

O sangue doado no banco de sangue passou por triagem sorológica

(ELISA) para detecção de infecção por HIV, Treponema pallidum (Sífilis),

Hepatite B e C, HTLV e Trypanosoma cruzi. Conforme pode ser observado

(Tabela 4), 1108 (2,4%) de todas as doações de sangue no ano de 2011 foram

expurgadas devido a resultados positivos em algum dos testes sorológicos.

Desse total de bolsas reativas, 899 (80%) foram doações realizadas no

HEMONORTE de Natal. Dentre a população de 46.624 doadores de sangue

em 2011, 77 doadores foram reativos no ELISA para Chagas e, portanto, a

prevalência de infecção por T. cruzi foi de 0.17%. Destes 77 doadores, 49

(63%) doaram sangue na unidade de Natal e 22 (28%) doaram em Mossoró,

porém apenas 61 dos 77 doadores entraram para o estudo.

A amostra pretendida de 300 voluntários (Grupo 1) foi pesquisada para

determinar o percentual de infecção por T. cruzi e quanto desse percentual

corresponde a resultado falso-positivo devido real infecção por L. infantum,

caracterizando a reatividade cruzada. Dentre as 300 bolsas de sangue

avaliadas, 61 (21%) foram descartadas por serem reativas no teste de Chagas,

203 (67%) foram reativas em algum outro teste (porém negativas para

Chagas), e 36 (12%) foram expurgadas do banco de sangue por motivo de

baixo volume mesmo sendo negativas na sorologia. No que concerne às

características dos doadores de sangue como idade e sexo, verificou-se que na

amostra de 300 doadores a média da idade foi de 36 anos, e 74% dos

voluntários eram do sexo masculino. Também, foi possível relacionar essas

variáveis ao motivo da exclusão da doação (Tabela 5).


Tabela 4: Prevalência de infecções detectadas através de exames de rotina de doações de sangue no estado do Rio Grande do Norte em 2011, agrupados por cidade de doação de sangue. Valores indicando o número total de doações em cada categoria, seguido pelo percentual do total ou percentual de doações infectadas em parênteses.

Cidade Natal Mossoró Caicó Pau dos Ferros

Currais Novos

Total, n (%)

Total de doações de sangue

33638 7126 2218 2220 1422 46624

Doações de sangue

reativas no exame

sorológico ELISA

Anti-HBc 306 68 5 8 3 390 (0.84)

HIVS PS 136 24 1 13 3 181 (0.38)

HCV 127 34 3 10 7 177 (0.37)

VDRL 132 30 0 8 0 170 (0.36)

Chagas 49 22 2 3 1 77 (0.17)

HIV REC 91 0 0 0 0 91 (0.19)

HTLV1 29 13 20 1 0 63 (0.13)

HBsAg 29 5 15 1 0 50 (0.10)

Número total de amostras de sangue reativas na triagem

primária, n (%)

899 (2.7) 196 (2.8) 46 (2.1) 44 (2.0) 14 (1.0) 1108 (2.4)

VDRL=Teste laboratorial de pesquisa de doença venérea; ELISA=ensaio imunoenzimático; HIVS PS=peptídeo sintético; HIV REC=proteína recombinante; HTLV1=tipo 1 de vírus humano T-linfotrópico; HBsAg=antígeno de superfície do vírus da hepatite B; HCV = vírus da hepatite C; HBC = IgG anti-hepatite B. Fonte: Hemonorte RN, Secretaria de Saúde do Estado do Rio Grande do Norte.

http://www.labes.com.br/teste_laboratorial_de_pesquisa_d.htm


Tabela 5: Número de doações, idade e sexo dos doadores de sangue agrupadas por motivo da rejeição da doação de sangue.

Motivo de exclusão da doação

Chagas

Chagas & HIV

Chagas & VDRL

HIV HCV HBV HTLV VDRL Baixo

Volume TOTAL

Número doações

56 2 3 59 21 80 4 39 36 300

Idade (ano +/- DP)

35.8 +/- 10.3

40.9 +/- 15.2

40.3 +/- 11.8

34.1 +/- 9.9

32.5 +/- 11.0

36.2 +/- 10.1

37.2 +/- 9.2

36.0 +/- 8.4

35.7 +/- 10.2

35.8 +/- 10.3

Masculino n (%)

40 (71) 2 (100) 2 (67) 47 (80) 14 (67) 58 (73) 3 (75) 31 (79) 26 (72) 223 (74)

DP=Desvio Padrão; VDRL=Teste Laboratorial de Pesquisa de Doença Venérea; ELISA=Ensaio Imunoenzimático; HIVS PS=Peptídeo Sintético; HIV REC=Proteína Recombinante; HTLV1=Tipo 1 de Vírus Humano T-linfotrópico; HBsAg=Antígeno de Superfície do Vírus da Hepatite B; HCV=Vírus da Hepatite C; HBC = IgG anti-Hepatite B.

http://www.labes.com.br/teste_laboratorial_de_pesquisa_d.htm


Também, foi possível estimar a prevalência de cada infecção na

população de 46.624 doadores de sangue, cujos padõres apresentados são

particulares de acordo com a região (municípios) onde foram realizadas as

coletas de sangue. Quando agrupamos os cinco municípios de acordo com

cada infecção (HIV, HBV, HCV, Chagas, sífilis-VDRL e HTLV) fica possível

visualizar qual infecção tem maior prevalência em cada região. Deste modo,

Mossoró apresentou aproximadamente 0,3% de infecção por T. cruzi enquanto

que Natal esse valor foi aproximado de 1,8% (Figura 8).

0.0%

0.2%

0.4%

0.6%

0.8%

1.0%

1.2%

VDRL

CHAGAS (elisa 1)

HIV

S P

S

HIV

REC

HTLV

1

HBSAG

HCV

HBC

Infecção

%

Natal Caicó Mossoró Pau dos Ferros Currais Novos

Figura 8: Prevalência de Infecção. O gráfico traz uma estimativa da prevalência (%)

de infecções em doadores, segundo o município onde o sangue foi doado. Os cinco

municípios foram representadoogdops por cores distintas: azul (Natal), roxo (Caicó),

amarelo (Mossoró), verde (Pau dos Ferros) e violeta (Currais Novos).

5.3. Reação de Imunofluorescência Indireta

As amostras que se apresentaram positivas no ELISA para T. cruzi (n=61)

foram submetidas a avaliação pela RIFI, ensaio empregado para confirmação

da infecção por T. cruzi no HEMONORTE. Dos 61 indivíduos Chagas-positivos,

um total de 25 (40%) soros foram positivos na RIFI e 36 (60%) negativos

(Figura 9).


Deste modo, os resultados mostraram que a maioria dos sujeitos que

recebem resultado positivo para Chagas no ELISA foram negativados na RIFI,

o que caracteriza resultado falso-positivos para Chagas. Ainda assim, todo

doador que recebe um resultado positivo no banco de sangue é encaminhado

para um centro referência em doenças infecto-contagiosas para realização de

exames mais criteriosos.

Chagas+

RIFI+ RIFI-0

10

20

30

40

Figura 9: Teste RIFI. O gráfico mostra em números absolutos os resultados do teste RIFI com os soropositivos no ELISA para T. cruzi (n=61). RIFI+ (doadores positivos na RIFI); RIFI- (doadores negativos na RIFI). 5.4. Diagnóstico sorológico da infecção por Leishmania

Com o objetivo de verificar ocorrência de reação cruzada nos exames

sorológicos entre T. cruzi e L. infantum, a mesma amostra que foi testada para

Chagas (n=300) pelo ELISA, foi também testada para detecção de anticorpo

anti-Leishmania usando SLA como antígeno. Os dados apontaram um total de

67 (22%) soropositivos no ELISA para Leishmania dentre a amostra de 300

doadores.


Contudo, dividindo a amostra em Chagas-positivos ou Chagas+ (n=61) e

Chagas-negativos ou Chagas- (n=239), observamos que dentre os doadores

Chagas+, 40 (65%) foram positivos no ELISA usando SLA como antígeno,

enquanto que 21 (35%) foram negativos no SLA. Em contrapartida, dentre os

doadores Chagas-, 29 (12%) foram positivos no SLA, e 210 (88%) negativos no

mesmo teste. Ao cruzarmos os dados da sorologia para T. cruzi com os dados

da sorologia para L. infantum, podemos inferir que quando o doador é

Chagas+, a chance de ele ser positivo no ELISA para Leishmania é elevada se

comparado com os doadores Chagas- (Figura 10), ou seja, um resultado

positivo para Chagas não significa necessariamente infecção por T. cruzi,

sendo necessário mais exames para se comprovar a etiologia da infecção.

Estes resultados sugerem que ocorre reação cruzada nos diagnósticos

sorológicos que identificam infecção por T. cruzi e L. infantum em doadores de

sangue, não descartando a possibilidade de coinfecção. Foi aplicado o teste

Mann Whitney e os resultados foram considerados significativos com P<0.0001.

ELISA Chagas(+)

SLA+ SLA-0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

Cut-off

ELISA Leishmania

De

ns

ida

de

Óti

ca

ELISA Chagas(-)

SLA+ SLA-0.0

0.5

1.0

1.5

Cut-off

***

ELISA Leishmania

De

ns

ida

de

Óti

ca

Figura 10: ELISA: T. cruzi vs L. infantum. Resultado da sorologia para detecção de anticorpo anti-Leishmania usando SLA como antígeno em testes com doadores Chagas-positivos e Chagas-negativos. ***P<0.0001. Cut-off = 0,2.


5.5. Resultados da RIFI vs ELISA para Leishmania

Os resultados para o ELISA-SLA realizado com os doadores negativos no

teste confirmatório para Chagas (RIFI) demonstraram que dos 36 doadores

negativos na RIFI, 26 (72%) foram positivos no ELISA-SLA. Deste modo, os

dados sugerem que os antígenos usados no ELISA-Chagas reagem com os

anticorpos anti-Leishmania, configurando a reatividade cruzada (Figura 11). O

teste Mann Whitney foi aplicado sendo os resultados significativos com

P<0.0001.

RIFI (-)

SLA+ SLA-0.0

0.5

1.0

1.5

***

Cut-off

ELISA Leishmania

De

ns

ida

de

Óti

ca

Figura 11: Resultados dos testes com doadores RIFI-negativos distribuídos segundo o resultado da sorologia que detecta anticorpo anti-Leishmania circulante no soro. ***P<0.0001. Cut-off = 0,2.

5.6. Detecção de DNA de Leishmania no sangue periférico dos doadores

de sangue

5.5.1. Prevalência da infecção por Leishmania por métodos moleculares e

cultura.


Sabendo que MAG1 (MSP associated gene 1) é um gene nuclear

presente somente em Leishmania, os resultados da qPCR apontam que em

doadores de sangue com cultura positiva o produto foi amplificado em um ciclo

onde a reação cruza o limiar de detecção (cycle threshold) ou Ct mais baixo,

sugerindo que tais doadores são positivos para Leishmania (Figura 12).

Da mesma forma, os dados obtidos da qPCR quando os doadores de

sangue são positivos ou negativos pelo ELISA para Chagas estão de acordo

com o esperado, visto que aproximadamente 14 indivíduos (positivos para

Chagas) foram positivos para Leishmania segundo os marcadores MAG1 e

KDNA7, e 4 indivíduos (negativos para Chagas) foram positivos usando os

mesmos marcadores (Figura 13).

Figura 12: Doadores segundo os marcadores MAG1 Ct e kDNA7 Ct, Positivos ou Negativos pela Cultura Leish. Veja que a chance de ser positivo aumenta com a redução de MAG1 Ct.


Figura 13: Doadores segundo os marcadores Mag1 Ct e kDNA7 Ct, Positivos ou Negativos pelo ELISA para Chagas.

5.7. Cultura de Leishmania

Do total de 300 culturas realizadas para isolamento de Leishmania, 18

foram positivas, sendo 14 (22,9%) positivas na sorologia para T. cruzi e 4

(1.6%) negativas no mesmo teste. Como já esperado, a mesma configuração

ocorre quando cruzamos os resultados do ELISA para Leishmania, onde 13

culturas positivas (72%) foram positivas no teste sorológico e apenas 5 culturas

positivas (28%) tiveram resultado negativo no mesmo teste.

Percebe-se que aproximadamente 75% dos indivíduos com cultura

positiva são T. cruzi-positivos. O contrário ocorre para a cultura negativa

(Figura 14). A mesma configuração ocorre com o SLA (Figura 15). Deste modo,

é possível inferir que quando o resultado da sorologia para T. cruzi é positivo a

chance de a cultura ser positiva é maior se comparado quando T. cruzi é

negativo.


Figura 14: Distribuição da sorologia relativa (Resposta/Cutoff) para T. cruzi, segundo a positividade da cultura de Leishmania.

Figura 15: Distribuição da sorologia relativa (Resposta/Cutoff) para Leishmania (SLA), segundo a positividade da cultura de Leishmania.


5.8. Caracterização das cepas de Leishmania por PCR, sequenciamento e

Isoenzimas

As 18 culturas de tripanosomatídeos foam submetidas a PCR-

sequenciamento para determinar se o DNA extraído continha o gene HSP70 e

a região ITS1, sequências essas específicas do gênero Leishmania. A figura do

gel mostra que ocorreu a amplificação dos segmentos nucleotídicos alvos,

sendo possível observar bandas fortemente coradas com 300pb na altura do

controle positivo correspondente à região ITS1 na foto do gel de agarose

(Figura 16). O mesmo pode ser observado na PCR para o gene HSP70 (Figura

17). A espécie de Leishmania presente nas culturas foi também confirmada por

sequenciamento dos produtos amplificados, onde foi possível visualizar o

alinhamento destes com uma sequência nucleotídica específica de L. infantum.

Tal alinhamento sugere que 100% das amostras de DNA extraídas das culturas

são de parasitos da espécie L. infantum (Figura 18).

Figura 16: Amplificações da região ITS1 em amostras de Leishmania obtidas em meio de cultura. Linha M: Marcador de peso molecular 100 pb; Linha 1 – 15: Amostras de cultura; Linha B: Branco; Linha CP: Controle Positivo de Leishmania infantum. Fabricante do marcador de peso molecular: Bioline HyperLadder IV.


Figura 17 - Amplificações da região HSP70 em amostras de Leishmania obtidas em cultura. Linha M: Marcador de peso molecular 200 pb; Linha 1 – 3: Amostras de cultura; Linha B: Branco; Linha CP: controle positivo de Leishmania infantum.

Os isolados de Leishmania também foram identificados pelo padrão de

isoenzimas no Laboratório de Leishmaniose da Fundação Oswaldo Cruz. De

acordo com a eletroforese de isoenzimas, 100% das culturas eram de L.

infantum. Todavia, os resultados de todos os testes que identificam infecção

por Leishmania podem ser obervados separadamente de acordo com a causa

da exclusão da bolsa no banco de sangue. Notavelmente, quando o motivo da

exclusão é devido sorologia positiva para Chagas, os testes que definem

infecção por Leishmania tem um elevado grau de positividade quando

comparado com outros motivos para expurgo da bolsa de sangue (Tabela 6).


Figura 18: Alinhamento entre as sequências nucleotídicas de L. infantum e produto amplificado de PCR. (-) GAP, (.) nucleotídeo idêntico, amostra 25 a 33 = sequência nucleotídica do produto de PCR amplificado (amostras de cultura).


Tabela 6: Avaliação das bolsas de sangue para identificação de infecção por T. cruzi e Leishmania utilizando os diferentes métodos de diagnóstico.

Motivo da exclusão da doação

Chagas ELISA (n=56)

Chagas ELISA & HIV (n=2)

Chagas ELISA

& VDRL (n=3)

HIV (n=59)

HCV (n=21)

HBV (n=80)

HTLV (n=4)

VDRL (n=39)

Baixo volume (n=36)

Total (n=300)

Testes

ELISA-L. infantum, n

36 1 1 7 4 8 1 1 8 67

Leishmania Culture

13 0 1 0 0 0 0 0 4 18

Mag1 PCR, 17 0 0 2 0 2 0 2 5 28

kDNA7 PCR, 46 2 3 50 16 62 3 30 28 240

RIFI = Reação de Imunofluorescência Indireta; RIPA = radioimunoprecipitação ensaio; ELISA = ensaio imunoenzimático.


6. DISCUSSÃO

A existência de infecções assintomáticas por T. cruzi e L. infantum,

associada a um período subclínico, no qual o parasita pode já estar circulante

no sangue a uma densidade muito baixa, tem sido a causa principal da

transmissão através do sangue. Em cães, infecções por Leishmania

transmitidas por transfusão foram confirmadas (79, 80) e os ensaios

experimentais com hamsters provaram que todos os produtos derivados do

sangue são infecciosos (82, 83). Os resultados obtidos pelos métodos

imunológico, parasitológico e molecular neste estudo indicam que a prevalência

de infecção assintomática por Leishmania em doadores de sangue do Estado

do Rio Grande do Norte é elevado, o que está de acordo com um estudo

anterior realizado em doadores de sangue em Ibiza e nas ilhas Baleares (60,

75) na Espanha, e com outras descobertas sobre indivíduos assintomáticos da

área do Mediterrâneo (148, 149) e Nordeste do Brasil (8, 68, 74, 85).

A falta de um método com elevada sensibilidade/especificidade e

confiável para a detecção de T. cruzi críptico dificulta a determinação da

extensão da forma assintomática da infecção. Tradicionalmente, a triagem para

a infecção assintomática por T. cruzi nos bancos de sangue tem sido realizada

por métodos imunológicos (ELISA e RIFI).

No Estado do Rio Grande do Norte, esses dois ensaios são realizados

nas principais unidades de coleta de sangue. Comparando-se a positividade

para doença de Chagas em doadores de sangue no Brasil, nosso resultado

(0,17%) foi superior ao observado em Ribeirão Preto, São Paulo (0,14%) (150).

No entanto, a prevalência de infecção neste estudo foi inferior ao observado no

Estado da Bahia (0,35%), Rio Grande do Sul (0,47%), Rio de Janeiro (1,2%) e

Paraná (1,3%) (151-154). Esse dado demonstra claramente que, comparado a

outros Estados, a incidência de soropositividade de doença de Chagas no Rio

Grande do Norte é menor. Esta baixa prevalência provavelmente se deve ao

eficiente trabalho de combate aos triatomíneos, que culminou na eliminação do

Triatoma infestans (155), pondo em evidência outras formas de transmissão da

infecção por T. cruzi: transmissão acidental pela alimentação, congênita,

transplantes de órgãos e sangue e por acidentes em laboratório.


Entretanto, a prevalência de infecção por L. infantum na população do Rio

Grande do Norte é elevada, apontando como um dos estados brasileiros de

grande importância na epidemiologia da leishmaniose visceral. Deste modo, o

atual estudo deu o primeiro passo para conhecermos o cenário do Rio Grande

do Norte quanto à prevalência de infecção por L. infantum entre a população de

doadores de sangue.

Sabe-se que o percentual de infecção depende do teste sorológico

empregado. No presente estudo, a sorologia utilizada para Leishmania foi o

ELISA com SLA como antígeno, e o percentual de infecção na amostra de 300

pessoas foi de 22%, superior à prevalência de infecção encontrada no

Maranhão de 19,4% usando também o ELISA (28). Em um estudo onde se

testou 1604 pessoas de Sabará/ MG, foi encontrado de 2,4% a 5,6% de

prevalência de infecção empregando diferentes testes laboratoriais (156, 157).

Observando a literatura, vemos que a reatividade das amostras de soros

de pessoas portadores de Leishmania com polipeptídeos de T. cruzi é

considerada um produto de estimulação específica, com base na presença de

epítopos comuns a ambos parasitos (158). Semelhanças antigênicas são bem

documentadas entre esses microrganismos e podem confundir o diagnóstico

(159, 160). Neste estudo, foi possível observar que a chance de o exame

sorológico para Leishmania ser positivo é grande quando o resultado da

sorologia para T. cruzi é positivo. Porém, quando o teste para T. cruzi é

negativo, o número de resultados positivos para Leishmania decresce. Além

disso, 60% dos doadores que tiveram triagem positiva para Chagas no ELISA

foram negativos quando foi realizado a RIFI como teste confirmatório,

caracterizando resultados falso-positivos. Também, dentre os indivíduos que

tiveram o teste RIFI confirmatório negativo, aproximadamente 67% são

positivos para o SLA no ELISA e 25% positivos na cultura de Leishmania,

configurando reação cruzada, conforme foi observado em outros estudos (161,

162). Desta forma, a ocorrência de reação cruzada entre os testes sorológicos

que definem infecção por T. cruzi e L. infantum contribui significativamente para

a diminuição do risco de infecção através da transfusão sanguínea, visto que o

canditato à doação de sangue portador de infecção por Leishmania é impedido

de doar seu sangue em virtude da detecção de IgG anti-Leishmania circulante

em um teste proposto para detectar IgG anti-Trypanossoma. Porém, ainda que


uma parcela dos indivíduos portadores de infecção por L. infantum seja

identificada no teste de Chagas, nosso estudo mostrou também que isso não

ocorre em 100% dos casos visto que das 18 culturas isoladas de Leishmania, 4

(22%) culturas não apresentaram resposta de anticorpo em nenhum dos testes

aplicados no banco de sangue e apenas 2 culturas foram positivas no ELISA

usando o SLA como antígeno, ou seja, o risco de infecção por Leishmania

através da transfusão sanguínea no Rio Grande do Norte é real. Nosso

resultado é concordante com o observado em estudos anteriores em áreas

endêmicas, onde se sugere ser possível a existência de DNA de Leishmania

circulante no sangue de pessoas aparentemente saudáveis, não sendo

detectável uma resposta imune humoral (55, 84, 85). A falta de anticorpo

durante a infecção assintomática também foi observada em cães infectados por

L. infantum (86, 87).

As 18 culturas isoladas dos doadores de sangue foram caracterizadas

como sendo da espécie L. infantum. Este dado é confirmado pela distribuição

epidemiológica das espécies de Leishmania e suas áreas endêmicas, como é o

caso do Rio Grande do Norte que apresenta baixa incidência de leishmaniose

tegumentar visto que são poucos os casos notificados de pacientes portadores

do parasita Leishmania brasiliensis notificados quando comparados com os

casos confirmados de indivíduos infectados por L. infantum. Isso se deve em

parte a distribuição dos insetos flebotomíneos vetores nas áreas urbanas do

Rio Grande do Norte, que apresenta uma elevada representatividade

populacional do inseto Lutzomya longipalpis, vetor da leishmaniose visceral, e

poucos insetos capturados da espécie Lutzomyia whitimani ou L. intermedia

vetores potenciais de Leishmania braziliensis (22, 163, 164). Porém, no

presente estudo, os dados de distribuição das populações de flebotomíneos

servem apenas para nortear a epidemiologia dos parasitos Leishmania no Rio

Grande do Norte, visto que o objeto deste estudo foi a via de transmissão

transfusional e não vetorial.

Assim, a ocorrência de parasitemia de Leishmania em pessoas sem

história de LV, pode estar relacionada a formas de transmissão que não

dependam da presença do vetor, como a transfussão sanguínea.


As culturas foram isoladas a partir da camada leucoplaquetária, ou seja,

a amastigota foi a forma encontrada nas amostras de sangue dos doadores. A

presença de parasitas livre nos produtos de sangue pode estar relacionada ao

rompimento de monócitos durante fracionamento de sangue e leucodepleção e

pode representar um risco potencial de transmissão adicional via transfusão

(165-168).

Contudo, até o presente momento, os relatos que sugerem transmissão

transfusional de Leishmania não foram confirmados, e em nenhum caso foi

identificado o doador que transmitiu a infecção (6, 67, 69, 169-171).

Na região Nordeste, onde a prevalência de soropositividade para

Leishmania é alta e, do mesmo modo, onde é elevada a densidade de

potenciais doadores assintomáticos, a transmissão de infecção por Leishmania

via transfusão com posterior desenvolvimento da doença, que ocorre dentro de

alguns meses após uma transfusão, não foi documentada. O presente estudo

mostra que o rastreio sistemático para o descarte de bolsas de sangue de

doadores positivos para Leishmania diminuiria o fornecimento de sangue em

nossa região em 22%, o que certamente implicaria em uma considerável

redução na quantidade de bolsas disponíveis para transfusão. Até aqui,

nenhum teste em grande escala barato e prático para rastreio de doadores de

sangue foi disponibilizado.

Mediante os resultados, se torna necessária a discussão de implicações

técnicas e éticas, uma vez que, embora a legislação não determine que a

leishmaniose visceral deva ser testada em bancos de sangue, o conhecimento

de uma sorologia positiva impõe aos técnicos a exclusão desta bolsa. Diante

da situação atual de expansão da leishmaniose e a ineficácia no controle da

doença, cabe questionar e implementar pesquisas que respondam de maneira

consistente sobre o potencial risco de transmissão transfusional em áreas

endêmicas. A legislação atual da hemoterapia Brasileira (172 ) trata de maneira

genérica, no item B 5.2.6, sobre as doenças infecciosas transmissíveis pelo

sangue e considera inaptos permanentes os candidatos à doação que já

tiveram história de LV.

Nossos resultados apontam para a necessidade de aprimoramento no

uso das ferramentas diagnósticas disponíveis, bem como padronização de


ensaios que garantam maior seguridade aos indivíduos que necessitam dos

serviços dos bancos de sangue.

Ficou evidente, também, em nosso estudo, que o teste empregado nos

bancos de sangue para detecção de indivíduos infectados por T. cruzi, tem

contribuído, mesmo que indiretamente, para a identificação de indivíduos

infectados por L. infantum, visto que o estado do Rio Grande do Norte é área

endêmica de LV. Porém, faz-se necessário o emprego de um teste específico

para a leishmaniose visceral nos bancos de sangue de áreas consideradas

endêmicas no Brasil. Finalmente, métodos moleculares, com aqui

demonstrados são eficientes em identificar a presença de Leishmania

circulantes em sangue e, portanto, deveriam ser considerados para

implementação em áreas endêmicas para leishmaniose visceral.

.


7. CONCLUSÃO

A prevalência de infecção assintomática por L. infantum entre a população de doadores foi de 22,9%;

Ensaios imunoenzimáticos para detecção de anticorpo anti-T. cruzi apresentam reação cruzada com L. infantum, contribuindo para reduzir o risco de infecção por Leishmania via transfusão sanguínea.

Leishmania infantum foi a única espécie de Leishmania encontrada;

A combinação de métodos moleculares e imunológicos podem estimar parasitemia;

É necessária a realização de exames confirmatórios adicionais das pessoas que foram identificadas positivas para infecção por T. cruzi, seja por ELISA ou RIFI, em áreas geográficas onde há sobreposição de áreas endêmicas para Doenças de Chagas e Leishmanioses.


8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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