UNIVERSITArsquo DEGLI STUDI DI PISA

FACOLTArsquo DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Farmacia

Tesi di Laurea

Heat shock proteins nuovi target per vari tipi di farmaci

Relatore Profssa Annalina Lapucci

Candidato

GIANFRANCO PERRI

ANNO ACCADEMICO 2010-2011

2

ldquoso please donrsquot cry I will always be your light

we will meet again one day I will shine on for everyonerdquo

The Jet ndash Shine on (Shine on ndash 2006)

3

INTRODUZIONE

Proteine dello shock termico (Hsp)

Le proteine dello shock termico (Hsp) sono una famiglia di proteine

indotte nelle cellule esposte a differenti insulti [1] Questa induzione di

Hsp permette alle cellule di sopravvivere in condizioni di stress Le Hsp

dei mammiferi sono state classificate in sei famiglie a seconda del peso

molecolare Hsp100 Hsp20 Hsp70 Hsp60 Hsp40 e piccole Hsp (da 15

a 30 KDa) comprese Hsp27 Queste proteine agiscono come chaperoni

molecolari sia nel ripiegamento di proteine mal ripiegate che nella loro

eliminazione se risultano irrimediabilmente danneggiate

bull Hsp 100 (100-110 kDa)

I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente

conservate scoperte per la prima volta nei batteri come sistema

proteasico a due subunitagrave detto Clp La subunitagrave piugrave grande detta ClpA

ha attivitagrave di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa

sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti dove svolgono

attivitagrave antiaggregante La subunitagrave piugrave piccola ClpP egrave una proteasi ed egrave

stata invece trovata solo nei batteri associata a ClpA

La funzione principale delle Hsp100 egrave quella di promuovere la

rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una

modalitagrave ATP-dipendente La ClpA favorisce il defolding

(denaturazione) dellrsquoaggregato che puograve andare incontro ad un processo

di refolding (rinaturazione) o essere idrolizzato dalla subunitagrave ClpP

4

bull Hsp 90 (85-90 kDa)

Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella

regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un

sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-

terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono

sopprimere lrsquoaggregazione

Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che

contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone

molecolare

I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e

dipendenza o meno dallrsquoATP

Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in

modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un

chaperone generale in modo ATP-indipendente

Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date

le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie

chinasi del ciclo cellulare

bull Hsp 70 (66-78 kDa)

Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave

quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e

come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle

proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio

carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il

polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente

il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano

come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui

amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro

stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una

5

Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente

coinvolto nei processi cellulari

bull Hsp 60

Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi

proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave

che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno

stato non nativo

Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave

costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire

una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici

sovrapposti

Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che

ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua

attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP

bull Hsp 40

Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione

e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e

caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK

(Hsp70)

bull Hsp a basso peso molecolare

Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto

che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione

proteica irreversibile

bull Hsp stress ossidativo e patologie

Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad

unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto

in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione

le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale

6

In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza

dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e

la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste

Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva

produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve

causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti

Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si

osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che

si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare

Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute

Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere

un segnale per lattivazione della cascata apoptotica

Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento

piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero

di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da

stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche

sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp

[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano

un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e

nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in

molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta

di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi

cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un

improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano

lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp

La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave

altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata

originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

2

ldquoso please donrsquot cry I will always be your light

we will meet again one day I will shine on for everyonerdquo

The Jet ndash Shine on (Shine on ndash 2006)

3

INTRODUZIONE

Proteine dello shock termico (Hsp)

Le proteine dello shock termico (Hsp) sono una famiglia di proteine

indotte nelle cellule esposte a differenti insulti [1] Questa induzione di

Hsp permette alle cellule di sopravvivere in condizioni di stress Le Hsp

dei mammiferi sono state classificate in sei famiglie a seconda del peso

molecolare Hsp100 Hsp20 Hsp70 Hsp60 Hsp40 e piccole Hsp (da 15

a 30 KDa) comprese Hsp27 Queste proteine agiscono come chaperoni

molecolari sia nel ripiegamento di proteine mal ripiegate che nella loro

eliminazione se risultano irrimediabilmente danneggiate

bull Hsp 100 (100-110 kDa)

I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente

conservate scoperte per la prima volta nei batteri come sistema

proteasico a due subunitagrave detto Clp La subunitagrave piugrave grande detta ClpA

ha attivitagrave di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa

sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti dove svolgono

attivitagrave antiaggregante La subunitagrave piugrave piccola ClpP egrave una proteasi ed egrave

stata invece trovata solo nei batteri associata a ClpA

La funzione principale delle Hsp100 egrave quella di promuovere la

rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una

modalitagrave ATP-dipendente La ClpA favorisce il defolding

(denaturazione) dellrsquoaggregato che puograve andare incontro ad un processo

di refolding (rinaturazione) o essere idrolizzato dalla subunitagrave ClpP

4

bull Hsp 90 (85-90 kDa)

Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella

regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un

sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-

terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono

sopprimere lrsquoaggregazione

Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che

contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone

molecolare

I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e

dipendenza o meno dallrsquoATP

Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in

modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un

chaperone generale in modo ATP-indipendente

Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date

le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie

chinasi del ciclo cellulare

bull Hsp 70 (66-78 kDa)

Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave

quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e

come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle

proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio

carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il

polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente

il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano

come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui

amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro

stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una

5

Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente

coinvolto nei processi cellulari

bull Hsp 60

Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi

proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave

che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno

stato non nativo

Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave

costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire

una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici

sovrapposti

Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che

ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua

attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP

bull Hsp 40

Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione

e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e

caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK

(Hsp70)

bull Hsp a basso peso molecolare

Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto

che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione

proteica irreversibile

bull Hsp stress ossidativo e patologie

Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad

unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto

in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione

le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale

6

In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza

dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e

la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste

Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva

produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve

causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti

Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si

osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che

si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare

Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute

Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere

un segnale per lattivazione della cascata apoptotica

Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento

piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero

di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da

stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche

sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp

[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano

un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e

nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in

molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta

di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi

cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un

improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano

lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp

La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave

altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata

originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

3

INTRODUZIONE

Proteine dello shock termico (Hsp)

Le proteine dello shock termico (Hsp) sono una famiglia di proteine

indotte nelle cellule esposte a differenti insulti [1] Questa induzione di

Hsp permette alle cellule di sopravvivere in condizioni di stress Le Hsp

dei mammiferi sono state classificate in sei famiglie a seconda del peso

molecolare Hsp100 Hsp20 Hsp70 Hsp60 Hsp40 e piccole Hsp (da 15

a 30 KDa) comprese Hsp27 Queste proteine agiscono come chaperoni

molecolari sia nel ripiegamento di proteine mal ripiegate che nella loro

eliminazione se risultano irrimediabilmente danneggiate

bull Hsp 100 (100-110 kDa)

I membri della famiglia delle Hsp100 sono proteine altamente

conservate scoperte per la prima volta nei batteri come sistema

proteasico a due subunitagrave detto Clp La subunitagrave piugrave grande detta ClpA

ha attivitagrave di unfolding ATP-dipendente e proteine correlate ad essa

sono state rilevate sia nei batteri che negli eucarioti dove svolgono

attivitagrave antiaggregante La subunitagrave piugrave piccola ClpP egrave una proteasi ed egrave

stata invece trovata solo nei batteri associata a ClpA

La funzione principale delle Hsp100 egrave quella di promuovere la

rimozione di aggregati proteici formatisi in condizioni di stress in una

modalitagrave ATP-dipendente La ClpA favorisce il defolding

(denaturazione) dellrsquoaggregato che puograve andare incontro ad un processo

di refolding (rinaturazione) o essere idrolizzato dalla subunitagrave ClpP

4

bull Hsp 90 (85-90 kDa)

Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella

regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un

sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-

terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono

sopprimere lrsquoaggregazione

Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che

contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone

molecolare

I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e

dipendenza o meno dallrsquoATP

Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in

modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un

chaperone generale in modo ATP-indipendente

Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date

le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie

chinasi del ciclo cellulare

bull Hsp 70 (66-78 kDa)

Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave

quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e

come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle

proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio

carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il

polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente

il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano

come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui

amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro

stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una

5

Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente

coinvolto nei processi cellulari

bull Hsp 60

Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi

proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave

che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno

stato non nativo

Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave

costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire

una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici

sovrapposti

Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che

ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua

attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP

bull Hsp 40

Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione

e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e

caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK

(Hsp70)

bull Hsp a basso peso molecolare

Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto

che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione

proteica irreversibile

bull Hsp stress ossidativo e patologie

Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad

unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto

in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione

le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale

6

In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza

dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e

la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste

Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva

produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve

causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti

Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si

osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che

si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare

Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute

Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere

un segnale per lattivazione della cascata apoptotica

Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento

piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero

di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da

stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche

sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp

[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano

un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e

nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in

molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta

di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi

cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un

improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano

lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp

La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave

altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata

originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

4

bull Hsp 90 (85-90 kDa)

Sono proteine dimeriche con un sito di dimerizzazione localizzato nella

regione C-terminale Nella regione N-terminale contengono invece un

sito di legame per lrsquoATP La rottura delle Hsp90 in un dominio N-

terminale e in uno C-terminale rivela che entrambi i frammenti possono

sopprimere lrsquoaggregazione

Questi risultati suggeriscono che le Hsp90 contengono due siti che

contribuiscono indipendentemente alla sua attivitagrave di chaperone

molecolare

I due siti inoltre mostrano specificitagrave diversa per il substrato e

dipendenza o meno dallrsquoATP

Il sito N-terminale interagisce con proteine e peptidi non ripiegati in

modo ATP-dipendente mentre il sito C-terminale sembra agire come un

chaperone generale in modo ATP-indipendente

Le Hsp90 sembrano essere coinvolte nella trasduzione del segnale date

le loro interazioni con i recettori degli ormoni steroidei e con varie

chinasi del ciclo cellulare

bull Hsp 70 (66-78 kDa)

Le proteine Hsp70 si ritrovano in tutte le specie e la loro funzione egrave

quella di favorire lrsquoassemblaggio di complessi multimerici proteici e

come chaperone molecolari di facilitare il folding intracellulare delle

proteine Queste sono costituite da due domini funzionali un dominio

carbossiterminale (circa 25 kDa) contenente il sito di legame per il

polipeptide ed un dominio amminoterminale (circa 40 kDa) contenente

il sito di legame per ADPATP e che ha attivitagrave ATPasica Funzionano

come monomeri o come dimeri riconoscendo porzioni di 7-8 residui

amminoacidici Un esempio egrave la DnaK di Ecoli che egrave un membro

stress-inducibile della famiglia delle Hsp70 e coopera con DnaJ (una

5

Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente

coinvolto nei processi cellulari

bull Hsp 60

Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi

proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave

che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno

stato non nativo

Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave

costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire

una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici

sovrapposti

Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che

ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua

attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP

bull Hsp 40

Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione

e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e

caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK

(Hsp70)

bull Hsp a basso peso molecolare

Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto

che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione

proteica irreversibile

bull Hsp stress ossidativo e patologie

Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad

unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto

in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione

le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale

6

In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza

dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e

la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste

Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva

produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve

causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti

Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si

osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che

si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare

Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute

Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere

un segnale per lattivazione della cascata apoptotica

Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento

piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero

di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da

stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche

sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp

[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano

un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e

nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in

molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta

di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi

cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un

improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano

lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp

La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave

altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata

originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

5

Hsp40) e GrpE nel formare un sistema chaperone ATP-dipendente

coinvolto nei processi cellulari

bull Hsp 60

Molte Hsp60 appartengono alla famiglia delle chaperonine complessi

proteici oligomerici costituiti da due anelli sovrapposti di 7-9 subunitagrave

che formano una cavitagrave centrale in cui vengono accolte proteine in uno

stato non nativo

Il sistema GroEL presente nei batteri egrave un esempio di Hsp60 Esso egrave

costituito da 14 subunitagrave identiche che si articolano tra loro a costituire

una complessa struttura quaternaria formata da due anelli eptamerici

sovrapposti

Ciascun anello presenta una cavitagrave interna di 50 Aring di diametro che

ospiteragrave la proteina parzialmente denaturata GroEL richiede per la sua

attivitagrave di chaperone anche il legame e lrsquoidrolisi dellrsquoATP

bull Hsp 40

Le Hsp40 come le Hsp60 sono coinvolte in processi di stabilizzazione

e di corretto ripiegamento delle proteine nascenti La piugrave studiata e

caratterizzata egrave DnaJ di Ecoli che agisce come co-chaperone con DnaK

(Hsp70)

bull Hsp a basso peso molecolare

Hanno diverse funzioni che sono specie-specifiche ed egrave stato proposto

che esse agiscano da chaperoni molecolari e impediscano lrsquoaggregazione

proteica irreversibile

bull Hsp stress ossidativo e patologie

Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad

unrsquoampia varietagrave di condizioni di stress Lo stress ossidativo egrave coinvolto

in una serie di condizioni patologiche compresa la neurodegenerazione

le malattie cardiovascolari e lrsquoictus e nellrsquoinvecchiamento naturale

6

In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza

dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e

la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste

Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva

produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve

causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti

Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si

osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che

si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare

Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute

Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere

un segnale per lattivazione della cascata apoptotica

Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento

piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero

di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da

stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche

sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp

[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano

un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e

nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in

molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta

di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi

cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un

improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano

lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp

La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave

altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata

originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

6

In queste condizioni lo stress ossidativo si verifica come conseguenza

dello squilibrio tra la produzione di specie reattive dellossigeno (ROS) e

la capacitagrave del corpo di disintossicarsi dagli intermedi reattivi di queste

Questo squilibrio puograve portare come conseguenza una eccessiva

produzione di ROS come osservato nelle malattie ischemiche o puograve

causare una diminuzione della capacitagrave degli enzimi antiossidanti

Come risultato il normale ambiente intracellulare egrave compromesso si

osserva ossidazione e aggregazione delle proteine e del DNA vitale che

si traduce nel fallimento della normale funzione cellulare

Le proteine ossidate si accumulano causando cosigrave infiammazioni acute

Tuttavia i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere

un segnale per lattivazione della cascata apoptotica

Fra i vari cambiamenti nellrsquoattivitagrave cellulare e nella fisiologia lrsquoevento

piugrave importante nelle cellule stressate egrave la produzione di un certo numero

di proteine altamente conservate le proteine dello shock termico o da

stress [2] Negli ultimi ventrsquoanni sono state eseguite numerose ricerche

sulla struttura e sulla funzione delle proteine da shock termico o Hsp

[3] Queste proteine sono risultate molto interessanti in quanto giocano

un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare e

nellrsquoapoptosi (o morte programmata della cellula) e sono coinvolte in

molte malattie La risposta allo shock termico o di stress egrave una risposta

di adattamento cellulare che aiuta al mantenimento dellrsquoomeostasi

cellulare in condizioni di stress Ersquo stato osservato che subito dopo un

improvviso aumento di temperatura tutte le cellule mostrano

lrsquoespressione indotta di una famiglia di geni conosciuti come geni Hsp

La sequenza del DNA che costituisce questa famiglia di geni egrave

altamente conservata tra le specie Questa famiglia di geni era stata

originariamente chiamata cosigrave a causa della loro espressione dopo

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

7

lrsquoesposizione al calore Tuttavia la stessa risposta si ottiene dopo

differenti insulti inclusi stress ambientali e metabolici come ipossie

ischemie iperossie anossie esposizione alla luce UV e sostanze

chimiche nicotina stress chirurgico deficienze nutrizionali (per es

privazione del glucosio) stress emozionale e meccanico lesioni

meccaniche e agenti virali o altri tipi di stress come esposizione a

radicali tossici o ad agenti cancerogeni [4 abc] In condizioni di stress

come lo shock termico e alcuni stati fisiologici le proteine da stress

sono rapidamente indotte attraverso meccanismi di trascrizione e

trasduzione (figura 1)

Figura 1 Meccanismo di attivazione delle Hsp e riparazione delle proteine denaturate(DP)

(1) Condizioni di stress portano alla denaturazione delle proteine (2) La presenza DP

stimola la dissociazione del complesso Hsp-HSF Questo complesso limita il processo di

trascrizione in assenza di DP (3) mentre le Hsp sono libere di legarsi a DP HSF viene

attivato attraverso la fosforilazione e

La risposta inducibile allo shock termico genera un segnale che porta

allrsquoattivazione di un fattore di trascrizione [5] La trascrizione del gene

Hsp egrave sotto il controllo di una famiglia di fattori di trascrizione dello

shock termico (HSF) Membri differenti della famiglia di HSF possono

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

8

essere attivati da specifici stress diversi Nonostante siano stati scoperti

varie HSF HSF-1 ha dimostrato di essere il regolatore principale di una

breve induzione termica di Hsp Le Hsp giocano un importante ruolo

regolatore nella trascrizione dei geni Se le Hsp fossero sovraespresse in

assenza di stress si legherebbero direttamente al dominio di trans-

attivazione di HSF-1 determinando cosigrave la sua soppressione Le Hsp

sono proteine ubiquitarie sia nelle cellule eucariote che in quelle

procariote Come suggerisce il nome le Hsp sono indotte in cellule

esposte al calore sebbene le proteine dello stress (Chaperoni) possono

essere attivate da alcuni differenti tipi di insulti facendo in modo che le

cellule sopravvivano in condizioni altrimenti letali La tabella 1 presenta

un sommario di queste proteine la loro locazione cellulare e la loro

funzione Le Hsp ad alto peso molecolare sono ATP-dipendenti mentre

le Hsp a basso peso molecolare agiscono in maniera ATP-indipendente

[6]

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

9

Tabella 1 Hsp umanepeso molecolare localizzazione e funzione

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

10

Ogni famiglia di Hsp egrave composta da membri espressi sia in maniera

costitutiva che induttiva e si rivolge a diversi scomparti subcellulari [7]

Lrsquoattivazione costitutiva delle Hsp puograve verificarsi nelle cellule anche in

assenza di fattori di stress ambientali Per esempio Hsp90 puograve costituire

fino allrsquo1 del totale delle proteine cellulari in cellule non stressate [3]

indicando che queste proteine hanno un ruolo nel mantenimento della

conformazione delle proteine anche in condizioni normali In

condizioni di stress i dimeri di Hsp90 tendono ad associarsi in tetra-

esa- e ottameri ed oligomeri ancora piugrave elevati [8] In condizioni

fisiologiche Hsp90 si trova in associazione con diverse proteine

intracellulari tra cui calmodulina actina tubulina diverse chinasi e

qualche proteina recettore [9] I componenti dei complessi di Hsp90

come proteine kinasi e recettori steroidei possono mediare il trasporto

nucleare dellrsquoHsp90 specialmente sotto stress da calore Probabilmente

Hsp90 forma complessi stabili con filamenti di actina e si lega alla

tubulina per proteggere i microtubuli quindi puograve mediare

lrsquoorganizzazione strutturale del proteasoma un complesso

multicatalitico quando i livelli di ATP cellulari diminuiscono [5] Allo

stesso modo Hsp27 tende a oligomerizzarsi in condizioni di stress ed egrave

stato precedentemente dimostrato che nelle cellule tumorali endogene

Hsp27 egrave la piugrave importante proteina argpirimidina modificata e che

questa modifica comporta lrsquooligomerizzazione di Hsp27 [10]

Argpirimidina egrave un addotto metilgliossale-arginina che risulta dalla

glicazione non enzimatica di residui di arginina delle proteine nelle

cellule tumorali mostrando un aumento della glicolisi [11] Hsp27 e

Hsp70 sono fortemente ed universalmente indotte da diverse

sollecitazioni mentre la loro espressione egrave bassa in condizioni

fisiologiche permettendo ad attivitagrave costitutive cellulari di procedere

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

11

[12] A prescindere dalla loro localizzazione intracellulare le Hsp70

sono state trovate anche sulla membrana plasmatica delle cellule

trasformate malignamente e nello spazio extracellulare [13] Hsp70

Hsp90 e la proteina GP96 chaperone residente nel reticolo

endoplasmatico (RE) appartenente alla famiglia di Hsp90 [14] sono

state trovate nel mezzo cellulare Questo mette in considerazione la

duplce funzione delle Hsp la funzione citoprotettivaantiapoptotica

intracellulare e la funzione immunogenica extracellulare [7] Le Hsp

intracellulari sono importanti in quanto assicurano il ripiegamento delle

proteine nella loro corretta struttra terziaria lrsquoincorporazione di

polipeptidi nelle membrane intracellulari o nel trasporto delle proteine

attreverso le membrane [9] mentre la funzione delle Hsp extracellulari egrave

immunogenica attreverso lo chaperoning di peptidi antigenici I membri

della famiglia di Hsp70 e Hsp90 sono stati rilevati nel mezzo delle

cellule presentanti lrsquoantigene (APC) Ersquo stato osservato che lrsquouptake di

complessi Hsp-peptidi da parte delle APC egrave specifico saturabile e

concentrazione dipendente e quindi egrave stata ipotizzata lrsquoesistenza di

recettori Hsp specifici [7] Quindi il potenziale coinvolgimento delle

Hsp in molti tipi di malattie le ha rese particolarmente importanti per lo

sviluppo di nuove terapie

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

12

CHAPERONINE MOLECOLARI E CONTROLLO

QUALITArsquo DELLE PROTEINE

Nelle cellule viventi sia le catene polipeptidiche di nuova sintesi che le

preesistenti sono a rischio costante di mal ripiegamento

(MISFOLDING) o aggregazione In conformitagrave con lrsquoampia diversitagrave di

forme mal ripiegate lrsquoelaborazione di strategie di controllo qualitagrave si

sono evolute per opporsi a questa inevitabile disavventura Recenti studi

descrivono la rimozione di aggregati dal citosol rivelano meccanismi di

controllo di qualitagrave per proteine nel reticolo endoplasmatico (RE) e

forniscono nuove intuizioni in due classi di chaperoni molecolari

lrsquoHsp70 (Heat Shock Protein 70) e lrsquoAAA+ (Hsp100) [15]

FOLDING DI PROTEINE NEL RETICOLO

ENDOPLASMATICO RICONOSCERE IL GIUSTO

DALLO SBAGLIATO

Il reticolo endoplasmatico (ER) un organulo presente sia nelle cellule

animali che vegetali svolge un ruolo premimente in numerosi processi

di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale

funzionamento cellulare LER occupa circa il 10 del volume della

cellula e la metagrave della superficie coperta da tutte le membrane della

cellula (endomembrane piugrave membrana plasmatica) [16]

Il reticolo endoplasmatico (RE) riveste numerose funzioni vitali per la

cellula Tra le tante egrave la stazione iniziale della via secretoria ed egrave quindi

il luogo nel quale circa un terzo di tutte le proteine di una cellula viene

sintetizzato e ripiegato correttamente [17] in secondo luogo lrsquoER egrave il

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

13

punto di partenza dal quale numerose proteine vengono smistate e

indirizzate verso la loro destinazione finale [18]

LrsquoER egrave quindi la sede della sintesi del ripiegamento (ldquofoldingrdquo) e delle

modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e secrete ed

egrave responsabile della maturazione strutturale di un quarto del proteasoma

che attraversa le vie secretorie

Il ripiegamento delle proteine secretorie fornisce una serie di sfide

uniche in quanto egrave accompagnato e dipendente dalla formazione di ponti

disolfuro ed inserzioni nel doppio strato lipidico con entrambi gli eventi

che si verificano piugrave lentamente di tipici cambi conformazionali che

accompagnano il ripiegamento Conseguentemente il RE fornisce le

condizioni ottimali per fronteggiare queste sfide includendo unrsquoalta

concentrazione di chaperoni generici oltre a una gamma di specifiche

strategie fatte su misura per favorire il ripiegamento delle proteine

secretorie Inoltre esiste un sofisticato sistema di controllo-qualitagrave nel

RE per trattenere e riparare proteine che non hanno raggiunto ancora il

loro stato naturale Malgrado la lunghezza con la quale le cellule vanno

a fornire un ambiente ottimale nel RE il ripiegamento delle proteine

secretorie puograve avvenire o manca a volte ad un ritmo allarmante Il RE

adopera due meccanismi di risposta in presenza di forme mal ripegate Il

primo meccanismo egrave una risposta allo stress RE-dedicato definito UPR

(risposta alla non corretta conformazione delle proteine) che attua il

rimodellamento del RE cosigrave da aumentare la sua capacitagrave di

ripiegamento [16] Una proteina malfunzionante rimane sequestrata nel

reticolo endoplasmatico quindi un eccesso di proteine mal strutturate

attiva la risposta da proteine con folding scorretto (Unfolded Protein

Response) Questo tipo di risposta inizia con il riconoscimento del

segnale di stress da parte di un recettore nel reticolo endoplasmatico e

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

14

prosegue con il blocco della sintesi proteica per permettere al

proteasoma di eliminare lrsquoeccesso di proteine mentre viene stimolata la

produzione di fattori di trascrizione Il secondo meccanismo chiamato

degradazione RE-associata (ERAD) riconosce in modo specifico le

parti terminali di proteine mal ripiegate e le loro retrotraslocazioni

attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico nel citosol dove

possono essere degradate dal sistema di degradazione ubiquitina-

proteosoma [17] Questi due meccanismi sono intimamente collegati

lrsquoinduzione UPR aumenta la capacitagrave dellrsquoERAD una diminuzione

dellrsquoERAD comporta unrsquoinduzione dellrsquoUPR costitutivo e

contemporaneamente la diminuzione di ERAD e UPR fa diminuire di

molto la viabilitagrave delle cellule I sistemi UPR ed ERAD fronteggiano

anche il comune problema del riconoscimento che richiede

lrsquoidentificazione delle forme mal ripiegate potenzialmente patologiche

nellrsquoambiente del RE La sorveglianza di UPR ed ERAD deve garantire

un buon equilibrio proteggendo le cellule dalle pericolose specie mal

ripiegate evitando la sovra vigilanza (come accade con forme mutate di

regolatori trans membrana della fibrosi cistica CFTR) che puograve portare

allrsquoeliminazione di forme potenzialmente sanabili Recenti studi hanno

rivelato come ERAD ed UPR identifichino forme mal ripiegate

Pertanto il RE rappresenta un preciso sistema di controllo di qualitagrave atto

ad assicurare che solo le proteine correttamente ripiegate e funzionanti

possano essere rilasciate dallrsquoER e raggiungere la loro destinazione

finale mentre le proteine malripiegate o non funzionanti sono trattenute

nel ER e in seguito traslocate nel citosol per la degradazione

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

15

RISPOSTA ALLA NON CORRETTA

CONFORMAZIONE DELLE PROTEINE

Le proteine designate per il riconoscimento dei segnali di stress

provenienti dal reticolo endoplasmatico sono generalmente IRE1

(Inositol Requiring Kinase 1) ATF6 (Activation of Transcription Factor

6) e PERK (PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)

Nel lievito la capacitagrave di ripiegarsi del RE egrave monitorata da IRE1 una

chinasi trans membrana altamente conservata che contiene un dominio

luminale responsabile del riconoscimento delle forme mal ripiegate

chinasi citosoliche e domini ribonucleasici Lrsquoaccumularsi delle proteine

mal ripiegate nel RE porta allrsquoattivazione delle chinasi IRE

Lrsquoattivazione delle IRE-chinasi promuove lo splicing non convenzionale

dei messaggi per un fattore di traduzione b-ZIP (Hac1 nel lievito e XBP-

1 nei metazoi) attraverso il suo dominio ribonucleasico La traduzione

del messaggio Hac 1 spliced crea un fattore attivo di trascrizione che

media direttamente la trascrizione dei target di UPR includendo

chaperoni del RE macchinario ERAD e tante altre proteine secretorie

In aggiunta alla IRE-1 gli eucarioti piugrave sviluppati utilizzano due altri

sensori le chinasi trans membrana del RE PERK ed il fattore di

trascrizione trans membrana del RE ATF6 (Figura 2) PERK contiene

un sensore luminale che egrave altamente correlato a quello di IRE-1 il

dominio citoplasmatico di PERK consiste in una chinasi elF2α

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

16

Figura 2 Struttura dei principali sensori dello stress nel reticolo endoplasmatico IRE1

ATF6 PERK

Lrsquoattivazione delle chinasi dovuta alla presenza di proteine mal

ripiegate determina unrsquoinibizione generalizzata della traduzione come

pure la up-regulation del fattore di trascrizione specifico ATF4

Lrsquoaccumulo di proteine mal ripiegate permette inoltre ad ATF6 di

raggiungere lrsquoapparato del Golgi dove le proteasi trans membrana

rilasciano il dominio citoplasmatico del fattore di trascrizione

permettendogli di entrare nel nucleo e mediare lrsquoinduzione genetica

Lrsquoesistenza di molteplici sensori UPR negli eucarioti piugrave avanzati

permette per lo piugrave una risposta piugrave sfumata alle proteine mal ripiegate

Per esempio una risposta iniziale alle proteine mal ripiegate potrebbe

portare ad una down-regulation generalizzata della traduzione seguita in

sequenza da unrsquoinduzione di chaperoni lrsquoinduzione del macchinario

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

17

ERAD ed infine contro lo stress prolungato lrsquoattivazione della morte

cellulare tramite apoptosi Molto recentemente ci sono stati notevoli

progressi nelle nostre conoscenze molecolari di come IRE-1 (e per

deduzione PERK) riconosce le proteine mal ripiegate Studi precedenti

avevano dimostrato che BIP (Binding Immunoglobulin Protein) lrsquo

omologo principale delle Hsp70 presente nel reticolo endoplasmatico si

lega in modo specifico con IRE1 e che questa interazione scompare in

condizioni di stress del RE Inoltre lrsquoiperespressione di BiP puograve

sopprimere lrsquoinduzione dellrsquoUPR Questo aveva suggerito un modello di

titolazione in cui BiP agisce come un regolatore negativo di IRE1 e

lrsquoaccumularsi di forme mal ripiegate porta indirettamente allrsquoattivazione

dellrsquoIRE1 attraverso il sequestro di BiP da parte proteine mal ripiegate

Tuttavia recenti studi hanno dimostrato che anche se il legame del BiP

possa avere un ruolo importante nella down-regulation di IRE1 ci sono

altri fattori importanti Analisi mutazionali hanno trovato che la

delezione della regione di IRE1 responsabile del legame con BiP non

altera la regolazione di IRE1 in risposta alle proteine unfolded [18] Piugrave

drammaticamente la struttura cristallina del core del dominio luminale

conservato (cLD) di IRE1 nel lievito rivela una profonda scanalatura

idrofobica che ricorda la tasca legante dei maggiori complessi di

istocompatibilitagrave (MHCs) che sono i responsabili per il riconoscimento

peptidico Che IRE1 possa legarsi direttamente a polipeptidi mal

ripiegati egrave unrsquoidea interessante (Figura 3) [19]

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

18

Figura 3 Un modello ipotetico descrive lrsquoattivazione di Ire1 attraverso la oligomerizzazione

determinata dal legame di proteine unfolded (indicate in rosso) Le interazioni dirette o

indirette fra le catene delle proteine unfolded possono contribuire allrsquoattivazione Sul lato

luminale della membrana del RE le proteine unfolded si legano alla scanalatura (indicata in

grigio) formata dalla dimerizzazione del core del dominio luminale di Ire1 attraverso

linterfaccia 1 Sul lato citoplasmaticodella membrana del RE la oligmerizzazione accosta i

domini della chinasi Ire 1 che subiscono un cambiamento conformazionale in seguito ad

autofosforilazione che porta allrsquoattivazione della funzione di RNA-ribonucleasi di Ire1

Attraverso il riconoscimento diretto delle forme mal ripiegate

lrsquoinduzione di IRE1 potrebbe verificarsi prima della completa titolazione

di BiP che data lrsquoestrema abbondanza di questrsquoultimo nel RE potrebbe

verificarsi solo dopo un catastrofico accumulo di proteine mal ripiegate

Inoltre il riconoscimento diretto di forme mal ripiegate da parte di IRE1

(e PERK) potrebbe consentire una serie di risposte piugrave sfumate in cui

diverse forme mal ripiegate potrebbero essere preferenzialmente

riconosciute da sensori diversi quali BiP IRE1 o PERK Cosigrave in linea

di principio la natura (per esempio traslazionale contro transcrizionale)

ed il ciclo di UPR potrebbe essere su misura per la classe specifica di

forme mal ripiegate che sono prevalenti nel RE [20]

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

19

DEGRADAZIONE DELLE PROTEINE ASSOCIATA AL

RETICOLO ENDOPLASMATICO

Come ci si poteva aspettare dalla diversitagrave delle proteine che si

ripiegano NEL RE studi recenti hanno dimostrato che la degradazione

ER-associata (ER-Associated Degradation ERAD) comprende una

serie di sistemi diversi ciascuno responsabile della degradazione di

sottoinsiemi di proteine che condividono proprietagrave fisiche comuni

Esistono anche regioni dedicate allrsquo ER Associated Degradation

(ERAD) nelle quali proteine che non raggiungono il corretto

ripiegamento vengono retrotraslocate al citosol e quindi degradate dal

proteasoma [21]

Ciograve forse egrave piugrave chiaramente dimostrato nel lievito dove ci sono almeno

due distinti meccanismi di sorveglianza per identificare le proteine mal

ripiegate del RE Il primo meccanismo chiamato ERAD-L analizza le

proteine che contengono domini luminali mal ripiegati (solubili o trans

membrana) chiamati CPY una forma mutante della proteina CPY

endogena che egrave incapace di folding Il secondo denominato ERAD-C

rileva domini mal ripiegati citosolici di proteine trans membrana [22]

Sebbene entrambe queste vie in ultima analisi convergano sul sistema

di degradazione ubiquitina-proteosoma esse dipendono da diversi

insiemi di componenti RE-associati per rivelare e fornire specie mal

ripiegate al citosol Nel caso di ERAD-C (e non di ERAD-L) la

degradazione egrave in genere dipendente da uno specifico sottoinsieme di

chaperoni citosolici inclusi i membri Hsp40 e Hsp70 Ciograve suggerisce

che queste proteine possono essere direttamente responsabili per il

riconoscimento di domini citosolici mal ripiegati di proteine trans

membrana Tuttavia le caratteristiche esatte che vengono monitorate e

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

20

come i substrati vengano consegnati al macchinario di

retrotranslocazione restano importanti questioni aperte per la maggior

parte dei substrati Il riconoscimento di una proteina contenente un

dominio luminale mal ripiegato dipende in modo determinante dallo

stato di glicosilazione della proteina Infatti anche piccole modifiche di

glicani N-linked puograve provocare danni gravi nella degradazione di

numerosi substrati Questo puograve effettivamente lasciare le proteine in un

limbo impossibile raggiungere lo stato nativo ma non riconosciuto dal

macchinario ERAD esse restano mal ripiegate nel RE a tempo

indeterminato A prima vista questa dipendenza dalla glicosilazione

sembra essere un miglioramento non necessario Tuttavia egrave ormai chiaro

che lo spettro di porzioni di zucchero presenti in una proteina egrave un

segnale fondamentale nel marcare il suo status di ripiegamento Infatti

dato che diverse proteine altamente abbondanti nel RE tra cui BiP e

PDI spesso non sono glicosilate la presenza e la natura covalente di

molto mannosio in un polipeptide puograve fornire un segnale importante che

aiuta il macchinario di controllo-qualitagrave del RE a distinguere le specie

ripiegate destinate ad altri scomparti da quelle piugrave abbondanti e

permanenti del RE Lrsquointuizione nel ruolo della glicosilazione nella

discriminazione tra le specie in via di ripiegamento e le proteine

terminali mal ripiegate nel RE egrave venuta dalla constatazione che

glicoproteine mal ripiegate subiscono un taglio dei loro N-glicani da una

varietagrave di glicosidasi tra cui una mannossidasi specifica In aggiunta a

proteine mal ripiegate persistenti si egrave pensato che il rimodellamento

dipendente dal tempo di N-glicani porti ad un segnale per la

degradazione del macchinario ERAD Questo permette intermedi

ripiegati in un periodo di tempo prima del rimodellamento dei loro N-

glicani in cui il polipeptide egrave immune dalla sorveglianza ERAD Egrave

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

21

interessante notare che un recente studio suggerisce che anche per i

polipeptidi citosolici vi egrave un periodo durante e subito dopo la sintesi in

cui le specie mal ripiegate sono immuni alla degradazione del

proteasoma [23] Recenti studi hanno identificato due differenti lettine

localizzate nel RE che svolgono un ruolo critico nellrsquoERAD La prima egrave

correlata alla proteina mannossidasi responsabile del taglio di N-glicani

nel RE ma sembra aver perso la sua attivitagrave catalitica Nel lievito si

chiama Htm1pMnl1p e nei mammiferi egrave chiamato EDEM Studi

condotti su cellule di mammifero suggeriscono che EDEM aiuta le

glicoproteine mal ripiegate a lasciare il ciclo calnexinacalreticulina del

chaperone lectina dove stanno cercando di ripiegarsi e cosigrave entrare nel

ciclo di degradazione [24 ab] Tuttavia nel lievito Htm1p egrave richiesto

per la degradazione efficiente di substrati come CPY che non

dipendono da calnexina Quindi sembra probabile che Htm1pEDEM

ricopra altri ruoli in ERAD La seconda lectina Yos9p forma un

complesso stabile con proteine mal ripiegate e la perdita di questa

lectina conduce ad un profondo e specifico difetto nella degradazione di

glicoproteine mal ripiegate [25] Sorprendentemente mentre mutazioni

puntiformi nella tasca di Yos9p legante il mannosio eliminano la sua

capacitagrave di supportare ERAD i mutanti stessi di Yos9p mostrano una

maggior interazione con i substrati Ciograve indica la possibilitagrave che la

lectina Yos9p svolga un ruolo piugrave informativo interrogando lo stato

dello zucchero di forme mal ripiegate per determinare se debbano essere

passate al macchinario di retrotranslocazione Tuttavia come con

ERAD-C sebbene ci siano stati grandi progressi nella caratterizzazione

del macchinario di retrotranslocazione [26] le caratteristiche strutturali

delle proteine mal ripiegate sono in fase di monitoraggio e sono ancora

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

22

limitate le conoscenzedi come le forme mal ripiegate sono passate a

questo macchinario

CLEARENCE DI AGGREGATI ATTRAVERSO

LrsquoAUTOFAGIA

Egrave sempre piugrave evidente che ci sono una varietagrave di condizioni in vivo che

anche con chaperoni e macchinari proteolitici presenti nello stesso

compartimento come proteine mal ripiegate questi meccanismi di

controllo-qualitagrave falliscono e le proteine mal ripiegate avanzano

formando aggregati Inoltre tali aggregati intracellulari sono associati

con una serie di malattie neurodegenerative come il morbo di

Huntington e di Parkinson La natura e la sorte di aggregati di proteine

nelle cellule eucariotiche egrave stata poco compresa Recentemente egrave stata

sempre piugrave sostenuta unrsquoazione protettiva della formazione di aggregati

piuttosto che unrsquoimmediata azione patogena Per esempio nel caso del

morbo di Huntington lrsquoesame di cellule neuronali in coltura

sovrapproducenti una fusione di poliglutamina espansa e huntingtina-

GFP rivelano che queste cellule contenenti aggregati fluorescenti

morfologicamente visibili esibiscono una migliore viabilitagrave rispetto a

quelle aventi per via diffusionale materiale fluorescente [27] Questo

sembra in accordo con il concetto che si tratta di piccoli assemblati di

proteine mal ripiegate inclusioni non morfologicamente visibili che

esercitano effetti tossici sulle cellule Analogamente un recente

confronto delle dimensioni rispetto a tossicitagrave per gli aggregati di

proteina prionica PrP suggerisce che piccoli aggregati contenenti da una

a due dozzine di molecole sono risultati i piugrave tossici per le cellule [28]

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

23

Ma le cellule dispongono di meccanismi di compensazione per questi

piccoli aggregati Studi recenti hanno suggerito che la via ubiquitina-

proteosoma possa essere il pilastro della rimozione di specie inclini

allrsquoaggregazione Infatti gli aggregati rilevati nel contesto di

neurodegenerazione di solito sono reattivi con gli anticorpi anti-

ubiquitina il che implica che le specie mal ripiegate sono state

riconosciute dal sistema di coniugazione dellubiquitina Eppure vari

studi di questi ultimi anni indicano che queste proteine modificate

rappresentano una sfida particolare per proteasomi che possono portare

alla loro inibizione [29 ab] Il meccanismo di questa inattivazione

rimane sconosciuto ma puograve coinvolgere il soffocamento della camera

del proteasoma [30]

Anatomia del proteasoma Il proteasoma egrave una macromolecola proteica del peso di circa 2 milioni

di Daltons Ersquo formata da ununitagrave base centrale (core) e 2 cappucci agli estremi (cap) Il core egrave

formato a sua volta da 4 anelli ciascuno costituito da 7 unitagrave proteiche I due ldquocaprdquo attaccati alle

due estremitagrave del core cilindrico consistono ciascuno di 20 subunitagrave

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

24

Ora sembra che la modifica dellrsquoubiquitina possa reclutare specie

aggregate mediante una via indipendente lrsquoAUTOFAGIA Lrsquoautofagia

implica il riconoscimento e lrsquoimpacchettamentofagocitazione di

proteine specifiche o organelli in vescicole autofagosomiche che si

fondono con i lisosomi in cui sia le vescicole che il loro contenuto sono

scomposti Piugrave di 20 componenti cosiddetti Atg (geni coinvolti

nellrsquoautofagia) mediano questo processo straordinario Recenti studi

hanno dimostrato che componenti centrali della formazione di autosomi

nei topi hanno attivitagrave nei tessuti dei mammiferi Per esempio carenza

di atg5 ha portato alla morte di animali appena nati a causa

dellrsquoincapacitagrave di fornire un apporto di aminoacidi attraverso la

degradazione di proteine del corpo durante la condizione di fame

relativa allrsquoimmediato periodo post-natale Sorprendentemente in un

altro studio in cui egrave stata indotta una carenza di atg7 piugrave avanti nella

vita con un gene ldquofloxedrdquo lrsquoaccumulo di aggregati positivi

allrsquoubiquitina egrave stata osservata nel fegato degli animali che sono stati

disabilitati nella produzione di autofagosomi La funzione del

proteasoma in questi animali egrave rimasta inalterata contenente specie mal

ripiegate etichettate con ubiquitina e possono essere eliminate attraverso

autofagia Egrave stato poi scoperto un componente denominato p62 (o

sequestosoma1) che costituisce un guscio attorno agli aggregati di

huntingtina [31] Questa proteina contiene un dominio C-terminale

associato allrsquoubiquitina (UBA) che puograve legare poliubiquitine in modo

tale che p62 si collochi con lrsquoubiquitina quando espressa in cellule

HeLa Inoltre nelle cellule che esprimono huntigtina p62 si associa con

LC3 una proteina localizzata negli autofagosomi In accordo con quanto

riportato e cioegrave che lrsquoautofagia riduce i livelli di aggregati di

huntingtina e con un ruolo critico di p62 in questo processo lrsquoinibizione

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

25

antisenso mediata dallrsquoesperessione di p62 aumenta lrsquoapoptosi delle

cellule che esprimono huntungtina Quindi sembra che la modifica

dellrsquoubiquitina delle proteine difettose possa offrire un ingresso sia al

sistema proteasoma o in contesti dove lrsquoaggregazione egrave in corso al

sistema autofagia

SISTEMI CHAPERONI HSP70

Le Hsp70 proteine dello shock termico di 70 KDa sono impegnate in

una serie di processi tra cui il ripiegamento di proteine di nuova sintesi

il trasporto delle proteine attraverso membrane il ripiegamento di

proteine mal ripiegate ed aggregate e il controllo delle attivitagrave delle

proteine regolatrici Questa versatilitagrave egrave ottenuta attraverso

lampliamento e la diversificazione evolutiva di geni hsp70 che ha

generato sia chaperoni Hsp70 specifici Hsp110 e proteine Hsp170 La

versatilitagrave egrave determinata attraverso lrsquoimpiego di cochaperoni proteine J

e fattori di scambio di nucleotide (NEF) che regolano lrsquoattivitagrave di Hsp70

(Figura 4)

26

Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

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Figura 4 Interazioni di Hsp70 Pannello a sinistra comunicazione fra il dominio di legame

del nucleotide (NBD in blue) e il dominio di legame del substrato (SBD in giallo) di una

Hsp70 come indicato dalla struttura cristallina di Hsc70 bovina (18)

Pannello centrale le caratteristiche del ciclo di Hsp70 NBD egrave in blue SBD in giallo e la

proteina substrato in rosso Le proteine J stimolano lrsquoidrolisi di ATP bloccando il substrato

allrsquointerno di SBD le proteine NEF scambianti ATP per ADP portano al rilascio del

substrato

Pannello a destra sono mostrati gli effetti di Ssz1p Lhs1p e Sse1p sul ciclo di Hsp70 di tre

specifiche proteine Hsp70 Ssb Kar2p e SsaSsb

Pannello in basso le interazioni dei fattori di scambio di nucleotide (NEF) con i domini di

legame del nucleotide di Hsp70 sono rivelati dalle tre strutture cristalline che mostrano un

numero di differenti modi nei quali le proteine NEF contattano il dominio di legame

dellrsquoATP per aprire la sua fessura e permettere lo scambio di nucleotidi

Recenti studi hanno avanzato la nostra conoscenza della macchina

Hsp70 e delle sue interazioni con i suoi cochaperoni

Sorprendentemente questi studi hanno anche scoperto legami funzionali

di Hsp70 con se stesso

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

27

INTERFERENZE ALLOSTERICHE IN Hsp70

Le Hsp70 possono transitoriamente associarsi con peptidi idrofobici di

proteine client tramite un dominio di legame del substrato (SBD figura

xy) prevenendo cosigrave lrsquoaggregazione e promuovendo il folding

appropriato Il legame tra lrsquoATP e il dominio di legame del nucleotide

N-terminale (NBD) induce cambiamenti conformazionali nellrsquo SBD

adiacente che apre la tasca di legame del substrato ed il suo coperchio

elicoidale (figura xy) Al contrario il substrato di legame in sinergia con

lazione delle proteine J innesca lidrolisi dellATP e la concomitante

chiusura di SDB che intrappola le proteine del substrato Fino a poco

tempo fa erano disponibili solo le strutture atomiche dei singoli domini

di Hsp70 il che precludeva la comprensione del meccanismo di

comunicazione tra domini Sousa e colleghi hanno ora risolto la struttura

di Hsc70 bovina in uno stato di nucleotide libero a 26 Aring di risoluzione

La struttura (figura xy) perde solo 10 kDa dal C terminale lasciando la

tasca di legame del substrato intatta (tranne lestremitagrave distale del suo

coperchio elicoidale) [32] Era stato dimostrato dalle strutture

precedentemente risolte di domini isolati che la NBD egrave costituita da una

proteina actina-like ripiegata con due sottodomini globulari separati da

una fessura legante il nucleotide mentre SBD assume una struttura β

ldquosandwichrdquo che forma la tasca di legame del substrato con unrsquoα-elica

compressa contro il sandwich da un lato (elica A) e un coperchio

elicoidale (elica B) di chiusura sulla parte superiore della tasca di

legame del substrato (Figura 5)

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

28

Figura 5 Conformazione della principale Hsp70 di E coli (DnaK) legata al corrispettivo

substrato

La nuova struttura rivela ora gli elementi che forniscono linterazione tra

domini coinvolgendo un collegamento flessibile di 10 residui che

collega la NBD e SBD lrsquoelica A della SBD egrave incorporata in un solo

solco alla base di NBD ed un contatto aggiuntivo viene fatto fra pochi

residui del ldquosandwichrdquo β della SBD e la scanalatura NBD Il legame

allrsquoATP puograve riorganizzare lrsquointerfaccia tra il solco NBD e lrsquo elica A

dellrsquoSBD facilitando cosigrave lrsquoapertura dellrsquoSBD stesso

Contemporaneamente il linker potrebbe ricollocarsi e formare un

legame piugrave stretto con la regione di collegamento in modo che in

nessuna fase del ciclo di Hsp70 determini che NBD ed SBD siano

completamente scollegati Sembra che il contatto supplementare di lieve

entitagrave riguardante i residui del ldquosandwichrdquo β della SBD giochi un ruolo

fondamentale percheacute un mutante con alterazione in uno dei residui

coinvolti presenta difetti di accoppiamento [33] La trasduzione del

segnale tra SBD ed NBD sembra quindi dipendere da riarrangiamenti

integrati del linker ed almeno due siti di contatto allrsquointerno di SBD A

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

29

capo sono stati compiuti progressi anche sul meccanismo attraverso il

quale i cambiamenti strutturali derivanti dal legame e dallrsquoidrolisi di

ATP vengono trasmessi allrsquointerno di NBD Una rete di legami a

idrogeno trasmette il segnale conformazionale allrsquointerno dellrsquoNBD di

DnaK batteriche a partire da un residuo di glutammato nel centro

catalitico e convergenti su una superficie esposta universalmente

arginina conservata che fa parte della regione che forma lrsquointerfaccia

drsquointerdominio [34] In una posizione centrale allrsquointerno di questa rete

crsquoegrave un residuo di prolina altamente conservato che sembra stabilire la

barriera ad alta energia tra lADP e le zone legate ad ATP della DnaK

costituendo cosigrave un interruttore molecolare che utilizza larginina

superficiale esposta come un relegrave per controllare lapertura e la chiusura

della SBD Una considerazione interessante egrave che lrsquointerruttore opera

attraverso unrsquoisomerizzazione cis-trans del legame peptidico della

prolina

DIVERSITArsquo DEI FATTORI DI SCAMBIO Hsp70-

NUCLEOTIDE

Diverse nuove scoperte consentono di farsi unrsquoidea sui diversi

meccanismi con cui i cofattori regolano le Hsp70 I fattori NEF sono

fondamentali per il ciclo funzionale delle Hsp70 percheacute favoriscono la

liberazione di ADP e il legame con ATP che attiva il distacco del

substrato legato I NEF piugrave noti sono i GrpE che facilitano la

dissociazione nucleotidica da DnaK la famiglia eterogenea di proteine

BAG che sono NEF per le Hsp70 citosoliche negli eucarioti Lrsquoattivitagrave

dei NEF egrave stata dimostrata anche per una famiglia di proteine con

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

30

funzioni cellulari poco conosciute tra cui la Fes1p citosolica di S

cerevisiae il suo ortologo umano Hsp70 legante la proteina 1

(HspBP1) e la proteina ER luminale di S cerevisiae Sls1p A capo la

disponibilitagrave di strutture cristalline per i tre NEF-GrpE Bag-1 e

HspBP1 complessati con frammenti di NBD dei loro partner Hsp70

fornisce una dimostrazione impressionante della diversitagrave di meccanismi

della reazione di scambio I tre NEF non sono solo strutturalmente

indipendenti ma impiegano diversi modi di azione (Figura xy) Sebbene

GrpE e Bag-1 provochino entrambi una rotazione verso lrsquoesterno di 14deg

di uno dei sottodomini NBD (IIB) che interrompe il sito dei legami dei

nucleotidi le due proteine usano diverse strategie GrpE lega la parte

posteriore di NBD e raggiunge in profonditagrave la fessura legante i

nucleotidi costringendo lrsquoapertura del sottodominio IIB Al contrario

BAG-1 si lega dallrsquoalto ad entrambi i lati della fessura centrale in

modo da determinare lrsquoapertura del sottodominio IIB La struttura del

complesso tra HspBP1 e NBD di Hsc70 dimostra che questo NEF si

compone di quattro pieghe α-elicoidali in modo simile ad un armadillo

Le pieghe simili a quelle di un armadillo formano una struttura curva

[35] che avvolge il sottodominio IIB di lato presumibilmente con

conseguente ingombro sterico con il sottodominio IB HspBP1 puograve

indurre una distorsione dei due lobi del relativo NBD che rompe la tasca

di legame nucleotidica Queste strutture sono una bella dimostrazione di

convergenza funzionale di proteine non correlate a catalizzare la

reazione di scambio nucleotidica di Hsp70

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

31

LEGAMI Hsp70-Hsp70

Curiosamente il laboratorio di Stirling ha osservato che un membro

della famiglia delle Hsp170 puograve fungere da NEF di una Hsp70 [36] In

particolare Lhs1p lrsquoHsp170 del lume del RE di S cervisiae agisce

come un NEF per lrsquoHsp70 luminale Kar2p Al contrario Kar2p stimola

lrsquoidrolisi di ATP di Lhs1p (Figura xy) La conseguenza funzionale di

questa attivazione reciproca resta sfuggente Un ulteriore collegamento

Hsp70-Hsp70 egrave di recente stato descritto nel citoplasma di lievito tra il

cheprone Hsp110 Sse1p e Ssa o Ssb associata al ribosoma [37] che

sono entrambi membri di famiglie citosoliche di Hsp70 I complessi

eterodimerici Sse1p-Ssa e Sse1p-Ssb12 coinvolgono virtualmente

lrsquointero pool citosolico di Sse1p suggerendo che la maggior parte se

non tutte delle funzioni cellulari di Sse si trovano allrsquointerno di

complessi con queste Hsp70 Queste interazioni regolano i cicli di

nucleotidi di Hsp70 coinvolti come Sse1p che egrave un potente fattore di

scambio nucleotidico sia per Ssa1p che Ssbp1 [15] Unrsquoosservazione

importante egrave che lattivitagrave di NEF di Sse1p permette un passaggio diretto

di substrato da Ssa1p o Ssb12p su Sse1p per ulteriore assistenza nel

folding Inoltre esiste unrsquointerazione tra i due ribosomi associati delle

Hsp70 SSB ed SSZ i quali interagiscono tra loro attraverso una terza

proteina una proteina J chiamata Zuotina Ssb fisicamente si associa

con catene nascenti a livello del ribosoma di lievito e sembra essere

coinvolto con i primi eventi di folding e forse nel processo stesso di

traduzione Ersquo nota ormai da tempo la sua interazione con la Zuotina

Lattivazione di questa associazione egrave determinata da Ssz che come

sappiamo si associa a zuotina in modo stabile cosa insolita per le

interazioni delle Hsp70 con proteine J [38] Eppure Ssz a differenza di

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

32

Ssb non si associa con le catene polipeptidiche nascenti infatti i suoi

SBD C-terminali possono essere eliminati senza compromettere la sua

attivitagrave in vivo [39] Ersquo stato riportato [40] che sebbene Ssz possano

legarsi a nucleotidi sono carenti quasi completamente dellrsquoattivitagrave di

idrolisi di ATP Inoltre le mutazioni nellrsquoNBD di Ssz che si prevede

possano interferire con il legame lrsquoidrolisi di ATP non pregiudicano

lrsquoattivitagrave in vivo di Ssz Coerentemente con questo in vitro la zuotina

stimola lattivitagrave ATPasica solo di Ssb e non di Ssz Cosigrave sembra che

Ssz sia una Hsp70 spogliata delle sue funzioni ad eccezione dei legami

con zuotina la zuotina da parte sua egrave il primo esempio di una proteina

J che si deve associare fisicamente con una Hsp70 Ssz al fine di

stimolare lrsquoATPasi di unrsquoaltra Hsp70 Ssb Questo meacutenage a trois spiega

bene i dati genetici che dimostrano che i mutanti privi di Ssb Zuo1 o

Ssz1 hanno fenotipi simili Le interazioni sono apparentemente non

limitate alle cellule di lievito comrsquoegrave stato recentemente dimostrato che

la proteina J MPP11 e la Hsp70L1 formano un complesso ribosoma-

associato in cellule di mammifero [41] con MPP11 che collabora con

Hsc70 citosolico [42] Tuttavia su come e percheacute questo insolito

meccanismo di attivazione di SsbHsc70 opera restano ancora domande

aperte Piugrave in generale lo studio di questi meccanismi saragrave interessante

per svelare limportanza biologica delle interazioni Hsp70-Hsp70

AAA+ ATPasi E AZIONE COORDINATA DA ATP

Gli anelli dei chaperoni le cui unitagrave strutturali sono composte da moduli

AAA+ ATPasi sono coinvolti con lrsquoATP in processi di degradazione

disaggregazione e attraversamento delle membrane delle proteine [43]

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

33

Ad esempio nella preparazione della degradazione proteasomica un

anello esamerico AAA+ ATPasi alla base della particella 19S del

proteasoma svolge proteine e le trasloca nel core cilindrico proteolitico

20S Allo stesso modo i complessi omomerici di ClpX batterico e ClpA

svolgono e traslocano i substrati nella serina cilindrica proteolitico ClpP

Nella disaggregazione proteica il chaperone ClpB dei batteri e Hsp104

nel citosol di lievito agiscono in assenza di qualsiasi partner proteolitico

per analizzare separatamente gli aggregati proteici In tutte queste

attivitagrave p97 tira su proteine durante la retrotranslocazione dal RE come

una delle sue diverse azioni mentre il fattore drsquoassemblaggio N-

etilmaleimide-sensibile (NSF) tira a parte i complessi proteici SNARE

per consentire ai componenti dello stesso SNARE di partecipare alla

fusione della vescicola Un recente lavoro ha cominciato a chiarire il

meccanismo mediante il quale lenergia di idrolisi dellATP puograve essere

tradotta da queste macchine in esercizio di forza meccanica necessaria

per il processo di unfolding I loop allinterno del canale centrale degli

anelli AAA+ che legano le proteine del substrato possono essere una

parte in movimento di queste macchine Studi strutturali e funzionali

suggeriscono che i loop traslocano segmenti di proteine legata

assialmente lungo il canale in risposta allrsquoidrolisi dellrsquoATP esercitando

una forza di trazione meccanica Questa trazione egrave associata a

spiegamento (unfolding) percheacute la proteina substrato egrave costretta ad

entrare in uno stretto canale che altrimenti non puograve essere superato Nel

caso di ClpA la misura del canale egrave di circa 12 Aring di diametro un foro

che non puograve ospitare una struttura secondaria ad α-elica Cicli ripetuti

dellrsquoazione tirante quindi in definitiva svelano la struttura di una

proteina a partire dal punto che egrave stato rilevato inizialmente [44] In

parallelo studi su mutazioni e crosslinking di substrati con ClpA hanno

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

34

individuato loop nel suo canale centrale a livello di entrambi i suoi

domini D1 e D2 che mediano il legame con il substrato Ersquo inoltre

interessante p97 Gli studi a raggi X mostrano soltanto una stretta

apertura del canale a livello del dominio D1 in tutti gli stati esaminati

che appare troppo piccolo per il passaggio polipeptidico sollevando la

questione di come p97 possa agire sui suoi substrati (Figura 6)

Figura 6 Modello cristallografico di un esamero di p97

Per esempio questo canale egrave aperto dal legame col substrato o da

proteine adattatrici al p97 Oppure sono i substrati obbligati sia ad

entrare che ad uscire attraverso lapertura D2 di questo cilindro

efficacemente colta e dislocata dal loop D2 Oppure i substrati non

devono mai entrare nel canale p97 in modo che i movimenti osservati

dal loop D2 non sono utilizzati per svolgere il lavoro Una parte

lavoratrice alternativa potrebbero essere i domini N-terminali che sono

piccoli domini α-β flessibili collegati al dominio D1 vicino alla parte

superiore del cilindro Questi domini sono in grado di legare le proteine

adattatrici che offrono particolari substrati Sembra possibile che il

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

35

movimento ATP-diretto di questi domini associato ai relativi adattatori

p97 p47 o Npl4Ufd1 potrebbe compiere un lavoro meccanico su

proteine substrato Questo potrebbe attenuare un ingombro sterico di

proteine adatte allrsquoubiquitinazione nel canale durante la

retrotranslocazione (o in alternativa di dover deubiquitinare e

reubiquitinare substrati) In contrasto con questo meccanismo putativo

anche se ClpX e ClpA riconoscono alcuni dei loro substrati tramite

adattatori o attraverso i loro stessi domini N loro utilizzano sicuramente

il loro canale hardware Inoltre nel caso di altri substrati inizialmente

forniti tramite adattatori o prima legati tramite i domini N i loop dei

canali sono necessari per la successiva azione di unfolding [45]

LrsquoAZIONE DELLrsquoATP

La questione di come si idrolizzi lrsquoATP intorno ad un anello esamerico

al fine di determinare il processo di unfolding egrave stato da poco

affrontato Unrsquoazione non concertata sembra essere coinvolta Ad

esempio nel caso di unrsquoidrolisi difettosa (Walker B mutante) dellrsquoanello

Clpx in cui lrsquoATP lega solo a 3 o 4 subunitagrave alla volta suggerisce che

ogni subunitagrave potrebbe occupare almeno tre diversi stati durante il ciclo

di reazione dellrsquoATP [46] Quando le varie combinazioni di moduli

wild-type e mutanti di ClpX AAA+ sono state introdotte negli anelli

mettendo sei sequenze codificanti in tandem (piazzando un linker fuori

dagli anelli tra subunitagrave vicine) una singola subunitagrave competente di

ATP potrebbe consentire lrsquounfolding e la degradazione ClpP-mediata di

un substrato strutturato [47] anche se soltanto ad un tasso del 2 di

quella del ClpX wild-type [48] Curiosamente laggiunta di una seconda

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

36

subunitagrave wild-type nel lato opposto dellrsquoanello incrementa il tasso fino

al 30 del wild-type Ciograve indica che luso di piugrave di una subunitagrave egrave

significativamente favorito ma se tale azione sia concordata o

sequenziale resta da vedere Tuttavia dato che molti arrangiamenti

differenti erano funzionali una progressione geometrica rigorosa sembra

essere esclusa Egrave stato proposto un modello ldquoprobabilisticordquo che

attiverebbe lrsquoidrolisi in una subunitagrave in base allo stato di subunitagrave

adiacenti o lrsquointerazione della subunitagrave col substrato Al momento non

vi sono prove che il substrato inneschi da solo lrsquoidrolisi nella subunitagrave a

cui si lega ma egrave presumibilmente lidrolisi dellATP allinterno di

subunitagrave che hanno legato il substrato che svolge il lavoro meccanico

Chiaramente il modello probabilistico egrave in grado di ospitare un

substrato che egrave asimmetricamente avvolto lungo il canale centrale di

queste macchine [49] anche se una versione non precisa di un

meccanismo sequenziale di cambio-legame come quello impiegato da

F1-ATPasi non sembra escluso

HEAT SHOCK PROTEIN 90 NELLE MALATTIE

NEURODEGENERATIVE

RUOLI DI Hsp90 NELLA NEURODEGENERAZIONE

Hsp90 egrave un chaperone molecolare con importanti ruoli nel

mantenimento della stabilitagrave funzionale e viabilitagrave delle cellule sotto una

pressione di trasformazione [50] Per i disordini neurodegenerativi

associati ad aggregazione di proteine il razionale egrave stato che lrsquoinibizione

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

37

di Hsp90 attiva lrsquoheat shock factor-1 (HSF-1) a indurre la produzione di

Hsp70 e Hsp40 cosigrave come di altri chaperoni che a loro volta

promuovono la degradazione e la disaggregazione di proteine [51-53]

Comunque studi recenti hanno rivelato un ruolo addizionale per Hsp90

nella neurodegenerazione vale a dire che Hsp90 mantiene la stabilitagrave

funzionale della capacitagrave aberrante delle proteine neuronali quindi

permettendo e sostenendo lrsquoaccumulo di aggregati tossici [54]

HSF-1 egrave il maestro regolatore della risposta da shock termico

Esposte a condizioni di stress le cellule normalmente rispondono

mediante lrsquoattivazione della risposta da shock termico (HSR)

accompagnata da un incremento della sintesi di proteine heat-shock

citoprotettive (Hsp) che ne frenano la citotossicitagrave come quella causata

da proteine mal ripiegate e denaturate [51-53] La parte piugrave importante

di questa transizione avviene a livello transcrizionale Nei mammiferi lo

stress da proteine dannose egrave regolato dallrsquoattivazione di HSF-1 che si

lega a sequenze regolatrici dellrsquoestremitagrave superiore nei promotori dei

geni heat-shock che codificano di conseguenza per proteine heat-

shock (Hsp) [55] Lrsquoattivazione di HSF-1 avviene attraverso una via

multi-step che prevede la formazione di un monomero-trimero di

transizione lrsquoaccumulo nucleare e estese modificazioni post-

translazionali (Figura 7A) La funzione di HSF-1 egrave regolata da Hsp90

[56] Vale a dire che in condizioni di stress Hsp90 si lega ad HSF-1 e

mantiene il fattore di trascrizione allo stato monomerico Lo stress lo

shock termico o lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal complesso con

Hsp90 e ciograve si traduce nella sua trimerizzazione (Figura 7B)

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

38

attivazione e translocazione al nucleo dove si avvia una risposta da

shock termico manifestata nella produzione di Hsps come i cheperoni

Hsp70 ed il loro attivatore Hsp40 (Figura 7AC) Ersquo stato osservato che

i nueroni nello stato differenziato sia nei sistemi in vivo che in vitro

sono resistenti allrsquoinduzione di Hsp a seguito di un convenzionale shock

termico [52] In contrasto lrsquoinduzione farmacologica di Hsp70 su

attivazione di HSF-1 egrave stata documentata ed inoltre egrave stato dimostrato

che egrave protettiva nei neuroni contro la tossicitagrave causata da molteplici tipi

di insulti

Figura 7 (A) rappresentazione schematica della regolazione di HSF-1 da parte delle Hsp90

e sua attivazione da parte degli inibitori delle Hsp90 (B) Il trattamento delle cellule con

shock termico o con un inibitore di Hsp90 porta alla trimerizzazione di HSF-1 (C) La

somministrazione sistemica di un inibitore dello scaffold purifico delle Hsp90 PU-Z8 a

topi AD transgenici porta a induzione di Hsp70 nel cervello

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

39

Hsp90 reindirizza la formazione di aggregati neuronali e protegge

contro aggregati tossici

Frequentemente le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da un

aumento della funzione tossica di proteine mal ripiegate qui la tossicitagrave

egrave possibile che risulti da uno squilibrio tra la normale capacitagrave di

chaperoni e la produzione di specie di proteine pericolose Lrsquoespressione

incrementata di chaperoni puograve sopprimere la neurotossicitagrave di queste

molecole suggerendo possibili strategie terapeutiche Effettivamente

diversi studi hanno riportato una riduzione della tossicitagrave cellulare su

espressione di Hsp70 e Hsp40 in modelli di malattie neurodegenerative

Le malattie da poliglutamina (poliQ) consistono in nove malattie

neurodegenerative nelle quali un espansione di un tratto poliQ porta a

mal ripiegamento e successiva deposizione di aggregati di proteine nei

neuroni [57] Tra queste crsquoegrave la malattia di Huntington (HD) lrsquoatrofia

muscolare bulbare e spinale (SBMA) lrsquoatrofia Dentatorubral-

pallidoluysian (DRPLA) e varie atassie (SCA1-3) NellrsquoHD la forma

mutante di huntington (htt) con glutammina espansa ripete forme

nucleari e aggregati citoplasmatici Muchowski et al hanno trovato che

Hsp70 e il suo cochaperone Hsp40 sopprimono lrsquoassemblaggio di htt in

oligomeri sferici ed anulari di poliglutamina e di conseguenza

attenuano la formazione di fibrille detergenti insolubili amiloide-simili

[58] Allo stesso modo in un modello di HD nel lievito lrsquoespressione di

Hsp70 e Hsp40 riduce la tossicitagrave associata con lrsquoespressione di htt

mutanti impedendo la sua interazione aberrante con un essenziale fattore

di trascrizione contenente poliQ [59] Studi in modelli di HD di topo

suggeriscono che nei neuroni la protezione da parte di Hsp70 contro

effetti tossici di proteine htt mal ripiegate egrave determinata da meccanismi

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

40

indipendenti di deposizione di aggregati fibrillari cioegrave legando

monomeri eo oligomeri a basso peso molecolare SDS-solubili che sono

probabilmente off-pathway per la formazione di fibrille ma possono

essere potenzialmente patogeni [60] Nei modelli di mammiferi di

atassia spino cerebellare di tipo 1 dei mammiferi lrsquoespressione di Hsp70

permette protezione contro neurodegenerazione indotta da poliQ [61]

Lrsquoinduzione farmacologica di proteine heat-shock nellrsquoatrofia muscolare

spinale e bulbare (SBMA) di topi transgenici sopprime lrsquoaccumulo

nucleare di recettori androgeni proteici (AR) patogeni portando ad un

miglioramento di fenotipi neuromuscolari dipendenti da poliglutamina

[62]

Ersquo stato riportato che nella sclerosi laterale amiotrofica (ALS) il

riluzolo farmaco approvato dallrsquoFDA agisce in parte attraverso

lrsquoattivazione di HSF-1 e lrsquoamplificazione di HSR Nella superossido

dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo di ALS lrsquoaumento dei livelli

di Hsp70 indotto da un altro agente lrsquoarimoclomolo ha protetto i

motoneuroni sia nella degenerazione dei motoneuroni indotta da lesione

acuta noncheacute nei progressivi modelli di degenerazione dei motoneuroni

Riluzolo

Arimoclomol

41

Nei vari modelli cellulari della malattia di Alzheimer (AD) vi egrave un

incremento dei livelli di Hsp70 promossa dalla solubilitagrave e dal legame ai

microtubuli delle proteine tau [63] Hsp70 ha anche inibito la

propensione di aggregazione di Aβ [64] e ridotto la tossicitagrave di Aβ su

culture neuronali [65] Inoltre la proteina precursore dellrsquoamiloide

(APP) eo il suo Aβ amiloide derivato sono bersagli di chaperoni

mediati da clearence [66-67] Nella Drosophila melanogaster e nei

modelli di lievito della malattia di Parkinson (PD) lrsquoespressione diretta

di Hsp70 o la modulazione farmacologica di Hsp ha impedito la perdita

di neuroni causata da alfa-sinucleina [68-69] Huang et al hanno

riportato che questi effetti di Hsp70 si manifestano con lrsquoinibizione della

formazione di fibrille di alfa-sinucleina prevenendo la formazione di

alfa-sinucleina prefibrillare [70] Usando delezioni mutanti di alfa-

sinucleina Luk et al hanno indicato che le interazioni tra il dominio

legante il substrato Hsp70 e la regione del core idrofobico dellrsquoalfa-

sinucleina mediano lrsquoinibizione dellrsquoassemblaggio e che questo

processo di assemblaggio egrave inibito prima della fase di allungamento

[71] Nel complesso in diversi modelli di malattia neurodegenerativa la

sovra espressione di Hsp70 ha migliorato la gravitagrave della malattia di

fenotipi diversi senza incidere visibilmente sulla formazione di

aggregati suggerendo che i chaperoni non impediscono lrsquoaggregazione

di per seacute bensigrave reindirizzano gli aggregati preferibilmente in depositi

amorfi quindi sequestrando specie potenzialmente tossiche dalla

maggior parte della soluzione

42

Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione

farmacologica di Hsp90

Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal

complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e

lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata

nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un

inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei

modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della

corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei

livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il

trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con

struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-

dipendente [72]

PU24FCI

KU32

43

Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI

CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici

(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e

mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un

inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture

SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ

GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione

di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in

maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito

lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un

modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno

segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha

protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha

protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-

4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il

pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale

prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il

contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina

idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale

egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato

della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave

stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie

poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la

formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello

di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un

modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di

chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla

neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo

44

arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da

HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90

egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie

neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un

mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di

proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del

processo neurodegenerativo

Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine

neuronali aberranti

In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un

ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale

della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)

La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata

dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore

androgeno (AR) [57]

Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni

nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo

nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni

residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che

mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura

8A) [76]

45

Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali

aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione

o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del

proteasoma

Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il

mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di

SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-

AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha

46

portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal

macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati

disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da

destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione

dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di

SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave

rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati

[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori

hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo

sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa

(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni

Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]

Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo

egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali

sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al

hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina

(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi

familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un

complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data

da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto

47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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42

Lrsquoespressione di Hsp70 e di altre Hsp egrave indotta dallrsquoinibizione

farmacologica di Hsp90

Come riportato sopra lrsquoinibizione di Hsp90 rilascia HSF-1 dal

complesso con Hsp90 con susseguente produzione di Hsp (Figura 7) e

lrsquoinduzione di Hsp70 da parte di inibitori di Hsp90 egrave ben documentata

nei modelli di malattie neurodegenerative La geldanamicina (GM) un

inibitore di Hsp90 induce un aumento dose dipendente di Hsp70 nei

modelli di cellule di AD (Alzhaimer) cosigrave come nei neuroni della

corteccia primaria del ratto e riduce la quantitagrave di tau insolubili e dei

livelli basali di acido okadaico indotto da tau fosforilazione [63] Il

trattamento di neuroni primari corticali con lrsquoinibitore di Hsp90 con

struttura purinica il PU24FCI ha portato ad un aumento di Hsp70 dose-

dipendente [72]

PU24FCI

KU32

43

Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI

CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici

(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e

mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un

inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture

SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ

GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione

di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in

maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito

lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un

modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno

segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha

protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha

protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-

4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il

pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale

prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il

contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina

idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale

egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato

della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave

stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie

poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la

formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello

di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un

modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di

chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla

neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo

44

arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da

HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90

egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie

neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un

mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di

proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del

processo neurodegenerativo

Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine

neuronali aberranti

In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un

ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale

della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)

La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata

dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore

androgeno (AR) [57]

Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni

nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo

nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni

residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che

mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura

8A) [76]

45

Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali

aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione

o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del

proteasoma

Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il

mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di

SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-

AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha

46

portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal

macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati

disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da

destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione

dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di

SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave

rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati

[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori

hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo

sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa

(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni

Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]

Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo

egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali

sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al

hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina

(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi

familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un

complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data

da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto

47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential

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62

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28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed

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29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

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Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by

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Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms

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Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

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64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

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49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

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74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

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79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

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Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

43

Allo stesso modo la somministrazione di due derivati di PU24FCI

CNS-permeabili il PU-DZ8 [72] ed il EC102 [73] a topi tau transgenici

(htau e JNPL3) ha determinato induzione di Hsp70 nel cervello e

mantenuto gli effetti per 24 ore dopo la somministrazione KU32 un

inibitore di Hsp90 di diversa natura chimica ha indotto Hsp70 in culture

SH-SY5Y di neuroblastoma e la ha protetta da tossicitagrave indotta da Aβ

GM ha attivato una risposta da shock termico ed inibito lrsquoaggregazione

di htt in un modello di coltura cellulare di HD ed ha indotto Hsp70 in

maniera tempo e concentrazione-dipendente ed ha impedito

lrsquoaggregazione di alfa-sinucleina e protetto contro la tossicitagrave in un

modello di aggregazione cellulare di alfa-sinucleina Auluck et al hanno

segnalato che il trattamento di un modello volante di PD con GM ha

protetto completamente contro tossicitagrave per alfa-sinucleina [74] GM ha

protetto anche contro la neurotossicitagrave dopaminergica indotta da 1-metil-

4-fenil-1236-tetraidropiridina (MPTP) in un modello di topo di PD Il

pretrattamento con GM mediante iniezione ventricolare intracerebrale

prima del trattamento con MPTP ha indotto le Hsp70 ed incrementato il

contenuto residuale di dopamina e lrsquoimmuno reattivitagrave della tirosina

idrolasi nel corpo striato [75] Lrsquoinduzione di Hsp70 nel midollo spinale

egrave stata osservata in seguito ad iniezione intraperitoneale di un derivato

della GM il 17-AAG in un modello di SBMA topo [76] Il 17-AAG egrave

stato anche efficace contro la nuerodegenerazione in altre malattie

poliQ Vale a dire ha soppresso la degenerazione dellrsquoocchio e la

formazione di inclusioni del corpo e salvato dalla letalitagrave in un modello

di SCA di Drosophila Ha inoltre soppresso la neurodegenerazione in un

modello volante di HD La riduzione di HSF-1 ha abolito lrsquoinduzione di

chaperoni molecolari e gli effeti terapeutici di 17-AAG sulla

neurodegenerazione poliQ indotta nei modelli di Drosophila facendo

44

arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da

HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90

egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie

neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un

mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di

proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del

processo neurodegenerativo

Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine

neuronali aberranti

In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un

ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale

della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)

La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata

dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore

androgeno (AR) [57]

Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni

nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo

nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni

residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che

mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura

8A) [76]

45

Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali

aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione

o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del

proteasoma

Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il

mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di

SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-

AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha

46

portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal

macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati

disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da

destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione

dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di

SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave

rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati

[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori

hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo

sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa

(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni

Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]

Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo

egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali

sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al

hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina

(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi

familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un

complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data

da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto

47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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44

arguire che lrsquoeffetto terapeutico di 17-AAG egrave essenzialmente mediato da

HSF-1 [77] Riassumendo lrsquoattivazione di HSF-1 da inibitori di Hsp90

egrave stata notata specificamente in modelli in vivo ed in vitro di malattie

neurodegenerative suggerendo che lrsquoinibizione di Hsp90 puograve essere un

mezzo per modulare i livelli di Hsp in cervelli malati con lrsquoobbiettivo di

proteggere contro le proteine tossiche che si presentano nel corso del

processo neurodegenerativo

Lrsquoinibizione di Hsp90 riduce lrsquoattivitagrave e lrsquoespressione di proteine

neuronali aberranti

In aggiunta alla regolazione di HSF-1 evidenze recenti suggeriscono un

ruolo addizionale per Hsp90 nel mantenimento della stabilitagrave funzionale

della capacitagrave aberrante di proteine neuronali (Figura 8A)

La SBMA egrave una malattia ereditaria dei motoneuroni causata

dallrsquoaccrescimento di un tratto di poliglutamina allrsquointerno del recettore

androgeno (AR) [57]

Le caratteristiche patologiche di SBMA sono perdita dei motoneuroni

nel midollo spinale e nel tronco cerebrale diffusione dellrsquoaccumulo

nucleare inclusioni nucleari di mutanti AR (mAR) nei motoneuroni

residui e in alcuni organi viscerali Waza et al hanno dimostrato che

mAR presente in SBMA egrave una delle proteine regolate da Hsp90 (Figura

8A) [76]

45

Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali

aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione

o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del

proteasoma

Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il

mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di

SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-

AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha

46

portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal

macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati

disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da

destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione

dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di

SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave

rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati

[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori

hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo

sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa

(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni

Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]

Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo

egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali

sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al

hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina

(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi

familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un

complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data

da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto

47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential

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26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient

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1963

62

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calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa

N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally

misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299

1394ndash1397

28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed

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29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

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nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body

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Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms

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38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC

Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

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64

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637

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allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

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Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

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phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658

74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

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induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

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76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

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77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

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trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

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79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

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67

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88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

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tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

45

Figura 8 Le Hsp90 riparano le proteine neuronali aberranti (A) Proteine neuronali

aberranti regolate da Hsp90 (B) Lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90porta allrsquoinattivazione

o degradazione delle proteine regulate da Hsp90 probabilmente attraverso la via del

proteasoma

Le Hsp90 formano un complesso molecolare con mAR per il

mantenimento della sua stabilitagrave funzionale Sia in modelli cellulari di

SBMA che in topi transgenici lrsquoinibizione di Hsp90 da parte di 17-

AAG il derivato 17 allilammino-17-demetossi della geldanamicina ha

46

portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal

macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati

disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da

destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione

dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di

SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave

rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati

[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori

hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo

sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa

(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni

Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]

Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo

egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali

sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al

hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina

(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi

familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un

complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data

da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto

47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

46

portato ad una preferenziale degradazione di mAR principalmente dal

macchinario proteasomico Questi effetti di 17-AAG sono stati

disaccoppiati dallrsquoinduzione di Hsp70 e sono risultati da

destabilizzazione diretta di mAR e dalla sua successiva degradazione

dovuta a inibizione di Hsp90 In un modello di topo transgenico di

SBMA 17-AAG ha migliorato le difficoltagrave motorie senza tossicitagrave

rilevante ed ha ridotto la quantitagrave di mAR monomerici ed aggregati

[76] Risultati simili sono stati riportati da Thomas et al questi autori

hanno scoperto che lrsquoinibizione farmacologica di Hsp90 blocca lo

sviluppo di aggregati di recettori androgeni di glutamina espansa

(AR112Q) in fibroblasti embrionali di topi HSF-1 (--) dove i chaperoni

Hsp70 ed Hsp40 non sono stati indotti [78]

Il morbo di Parkinson (PD) il piugrave comune disordine neurodegenerativo

egrave caratterizzato da una complessitagrave di eventi patogenici alcuni dei quali

sono stati recentemente associati allrsquoHsp90 (Figura 8 A ) Wang et al

hanno recentemente dimostrato che si ripete la chinasi 2 ricca in leucina

(LRRK2) le forme mutate di questa chinasi sono prevalenti sia in casi

familiari sia apparentemente in casi sporadici di PD formando un

complesso in vivo con Hsp90 Lrsquoinibizione della funzione di Hsp90 data

da un inibitore di questa Hsp a struttura purinica PU-H71 ha distrutto

47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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47

lrsquoassociazione di Hsp90 con LRRK2 ed ha portato allrsquoeliminazione della

stessa LRRK2 attraverso il proteasoma PU-H71 ha limitato la tossicitagrave

dei mutanti LRRK2 per i neuroni ed ha salvato il ritardo della crescita

neuronale difetto causato dalla mutazione di LRRK2 G2019S nei

neuroni La mutazione della chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) che

codifica per una serinatreonina chinasi putativa mitocondriale porta a

PARK6 una forma autosomica recessiva del morbo di Parkinson

familiare Lrsquoereditagrave recessiva di questa forma di morbo di Parkinson

suggerisce che la perdita della funzione di PINK1 egrave strettamente

associata con la sua patogenesi Moriwaki et al hanno riportato che

Hsp90 lega PINK1 per promuovere la sua stabilitagrave Nelle cellule trattate

con lrsquoinibitore di Hsp90 GM i livelli di PINK1 vengono enormemente

diminuiti attraverso la via ubiquitina-proteasoma [79] Lrsquoalfa-sinucleina

egrave una proteina intrinsecamente non organizzata che puograve formare fibrille

ed egrave anche coinvolta nella neurodegenerazione PD Falsone et al hanno

recentemente riportato che Hsp90 influenza il legame delle vescicole di

alfa-sinucleina e la formazione di fibrille amiloidi due processi che

sono strettamente accoppiati per il ripiegamento dellrsquoalfa-sinucleina

[80] Vale a dire che Hsp90 lega lrsquoalfa-sinucleina ed abolisce

lrsquointerazione di questo polipeptide con le piccole vescicole unilamellari

Hsp90 promuove anche la formazione di fibrille in una maniera ATP-

dipendente attraverso intermedi oligomerici [80] Un altro collegamento

tra Hsp90 ed alfa-sinucleina egrave stato previsto da Kabuta et al [81] Lrsquoalfa-

sinucleina egrave degradata almeno in parte da autofagia mediata da

chaperoni (CMA) Gli autori suggeriscono che lrsquointerazione aberrante di

mutanti di ubiquitina idrolasi L1 C-terminale (UCH-L1) con il

macchinario CMA almeno in parte riconduce alla patogenesi di PD

associata con 193M UCH-L1 e lrsquoaumento della quantitagrave di alfa-

48

sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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sinucleina [81] Nelle tauopatie malattie neurodegenerative

caratterizzate da anomalie della proteina tau la trasformazione egrave

caratterizzata da anomalie nelle proteine tau portando ad un accumulo di

tau aggregata ed iperfosforilata [82] Ersquo stato suggerito che nellrsquoAD

lrsquoiperfosforilazione di tau egrave un processo patogeno causato da

unrsquoattivazione aberrante di chinasi specifiche in particolare la proteina

chinasi ciclina-dipendente (CDK5) e la glicogeno sintasi chinasi-3 beta

(GSK3β) portando ad una fosforilazione di tau su siti patogeni [83] Si

era pensato che tau iperfosforilate in AD fossero mal ripiegate subissero

netta dissociazione da microtubuli e da aggregati tossici tau In un

gruppo di tauopatie chiamate ldquodemenza frontotemporale e

Parkinsonismo legato al cromosoma 17 (FTDP-17)rdquo la trasformazione egrave

causata da mutazioni specifiche in isoforme umane tau sul cromosoma

17 che risultano e sono caratterizzate dallrsquoaccumulo di aggregati tau

[84] Luo et al hanno riportato che la stabilitagrave di p35 e p25 proteine

neuronali che attivano CDK5 attraverso la formazione di un complesso

portando alla fosforilazione di tau aberranti e questo tipo di proteina

mutante tau ma non tipo wild sono state mantenute in tauopatie da

Hsp90 (Figura 8A) [72] Lrsquoinibizione di Hsp90 sia nelle cellule sia nei

modelli di tauopatie di topo ha portato alla riduzione dellrsquoattivitagrave

patogena di queste proteine e risulta in unrsquoeliminazione dose e tempo-

dipendente di aggregati tau [72] Quando somministrato 5 giorni alla

settimana per 30 giorni per topo transgenici JNPL3 PU-DZ8 porta ad

una riduzione e fosforilazione significativa nellrsquoespressione mutante di

tau senza tossicitagrave per i topi [72] Secondariamente Dickey et al hanno

dimostrato che lrsquoEC102 inibitore di Hsp90 ha promosso una

diminuzione selettiva in specie tau in un modello di topo transgenico di

AD indipendente dellrsquoattivazione HSF-1 (Figura 8A) [73] Entrambe le

49

relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

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METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

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MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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relazioni identificano la via proteasomica come responsabile per la

degradazione delle specie tau aberranti in seguito ad inibizione Hsp90

[72-73] Un legame tra Hsp90 e GSK3β egrave stato riportato da Dou et al

(Figura 8A) [85] Vale a dire che la stabilitagrave e la funzione di GSK3β egrave

stata trovata per essere mantenuta da Hsp90 e lrsquoinibizione di Hsp90 da

GM e PU24FCI porta ad una riduzione nel livello di proteina di GSK3β

effetto associato con una diminuzione in fosforilazione tau a siti putativi

GSK3β [85] Inoltre Tortosa et al hanno riportato che il legame di

Hsp90 a tau facilita un cambio conformazionale in tau che potrebbe

portare alla sua fosforilazione da GSK3 e la sua aggregazione in

strutture filamentose [86] Collettivamente i dati sopra riportati

indicano che a livello fenotipico Hsp90 sembra fungere da tampone

biochimico per i numerosi processi aberranti che facilitano lrsquoevoluzione

di fenotipi neurodegenerativi (Figura 8A) Lrsquoinibizione di Hsp90 da

parte di piccole molecole risulta nella destabilizzazione dei complessi

proteine aberrantiHsp90 portando principalmente alla degradazione di

queste proteine da una via mediata da proteasoma (Figura 8B)

Complessivamente tutti questi dati indicano che nelle malattie

neurodegenerative lrsquoinibizione di Hsp90 puograve offrire un doppio

approccio terapetuico Da un lato i suoi benefici possono derivare

dallrsquoinduzione di Hsp70 e altri chaperoni in grado di reindirizzare la

formazione di aggregati neuronali e in grado di una protezione

potenziale contro la tossicitagrave di proteine proponendo lrsquoinibizione di

Hsp90 come un intervento farmacologico per aumentare

terapeuticamente lrsquoespressione di chaperoni molecolari per curare

malattie neurodegenerative in cui lrsquoaggregazione svolge un ruolo

centrale nella patogenesi (Figura 7) Drsquoaltra parte lrsquoinibizione di Hsp90

puograve migliorare lrsquoiperfosforilazione delle proteine e lrsquoaggregazione

50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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50

successiva da parte della riduzione dellrsquoattivitagrave di proteine aberranti

neuronali (Figura 8) Lrsquoutilitagrave degli inibitori dellrsquoHsp90 come agenti

clinici nelle malattie neurodegenerative potrebbe dipendere dal fatto

che i loro effetti si verificano a concentrazioni di farmaco che non sono

tossiche e se i farmaci possono essere somministrati cronicamente in

modo tale da poter raggiungere in maniera sicura queste concentrazioni

nel cervello Vari studi su diversi modelli cellulari hanno dato risultati

promettenti per questa classe di composti nel trattamento di un ampio

spettro di malattie neurodegenerative ma devono essere confermati in

modelli animali con lrsquoobiettivo di testare lrsquoefficacia degli inibitori di

Hsp90 nelle neuropatologie e la loro sicurezza dopo somministrazione a

lungo termine Lo sviluppo di inibitori delle Hsp90 con strutture diverse

da quella di GM come agenti anticancro sta raggiungendo una fase

esplosiva dove vari agenti sono in valutazione clinica [87] Questo ora

rimane lrsquoobbiettivo della chimica farmaceutica per fornire inibitori

dellrsquoHsp90 CNSpermeabili con un buon indice terapeutico per

mantenere la promessa di questi agenti nel trattamento di malattie

neurodegenerative

51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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51

SCOPERTA DEL 2-4-DIIDROSSI-5-

ISOPRPILENFENILE 5-4-METILPIPERAZINA-1-

METILE 1-3-DIIROISOINDOLO METANONE

(AT13387) UN NUOVO INIBITORE DEL CHAPERONE

MOLECOLARE Hsp90 CON DRUG DESIGN BASATO

SULLA FRAMMENTAZIONE

Hsp90 appartiene alla famiglia di chaperoni molecolari prodotti in

risposta ad una serie di stress cellulari [88] Essa egrave coinvolta

nellrsquoattivazione e nel mantenimento di un ampio numero di proteine

regolatorie e di segnale che agiscono come uno scaffold per consentire il

ripiegamento di queste proteine nei loro stati funzionali corretti Oltre ai

loro ruoli nella normale funzione cellulare molte di queste proteine

client sono anche direttamente implicate nella progressione del cancro

cosigrave che questa inibizione delle Hsp90 potrebbe simultaneamente agire

su molti percorsi oncogenici

Il dominio N-terminale dellrsquoHsp90 contiene una regione che lega il

nucleotide in grado di ospitare sia lrsquoadenosina trifosfato (ATP) che

lrsquoadenosina difosfato (ADP) e questo egrave il bersaglio dei piugrave avanzati

composti clinici [89] Il legame e la successiva idrolisi dellrsquoATP

attraverso la sua attivitagrave ATP-asica egrave il passo chiave nellrsquoattivazione del

processo di Hsp90 [90] A causa della sua espressione ubiquitaria sono

emerse perplessitagrave circa la specificitagrave degli inibitori di Hsp90 per i

tumori in quanto Hsp90 risulta essere espressa anche nelle cellule

normali [91] Comunque esperimenti in vitro con geldanamicina

(unrsquoansamicina) hanno dimostrato che questo antibiotico possiede una

maggiore affinitagrave di legame per le Hsp90 derivate da tumore piuttosto

che da linee cellulari normali [92] Inoltre la geldanamicina mostra una

piugrave potente attivitagrave citotossica nelle cellule tumorali rispetto alle cellule

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

52

normali ed egrave sequestrata a concentrazioni maggiori allrsquointerno di tumori

xenotrapiantati nei topi Questo egrave stato successivamente confermato

dalla sua attivitagrave clinica [93] Esistono anche alcune evidenze che la

proteina ldquoclientrdquo legata al complesso cochaperone Hsp90 egrave piugrave

suscettibile allrsquoubiquitinazione ed allrsquoessere bersaglio per la

degradazione del proteasoma Questi dati nel loro insieme indicano la

potenziale utilitagrave degli inibitori di Hsp90 Infatti un certo numero di

composti attualmente sono in fase di sviluppo clinico [88] Questi

composti sono sia di origine naturale [94] che sintetica derivati dal drug

design basato sulla struttura [95]

OH

HO

NO

1

In un recente lavoro egrave stato descritto un potente inibitore (1) [96] che egrave

stato scelto come lead per un successivo lavoro di ottimizzazione della

struttura [88] Usando lo screening del frammento e successivamente

del design della struttura guidata sono state identificate una serie di 24-

diidrossi-benzammidi con unrsquoalta affinitagrave per il sito ATPasico dellrsquo

Hsp90 Sono stati presi in considerazione due approcci nel tentativo di

ottimizzare il composto 1 Il primo egrave stato diretto a bloccare siti preposti

del metabolismo attraverso il ldquocappingrdquo lrsquoingombro sterico o

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

53

modificando le proprietagrave elettroniche della 24-diidrossibenzammide

Questo approccio pur mantenendo generalmente lrsquoattivitagrave verso le

Hsp90 non modula significativamente il profilo PK di 1 Il secondo

approccio era quello di alterare le proprietagrave fisiche generali della

molecola nel tentativo di cambiare le sue caratteristiche di distribuzione

La sostituzione del sistema ciclico dellrsquoisoindolina con un gruppo basico

ha dato composti come 2 e 3 i quali sebbene abbiano unrsquoelevata

clearence plasmatica esibiscono alti livelli tumorali modulazione di

potenti biomarcatori ed efficacia in modelli di cancro nel topo

OH

HO

NO

R

2 R= 5-(N-metil-4-piperazinil)

OH

HO

NO

OR

( ) n

3 n=1 R = NMe 2

Sono stati sintetizzati una serie di analoghi basici strettamente correlati

ai composti 2 e 3 e alcuni di questi composti sono stati valutati in fase

preclinica I parametri chiave che sono stati analizzati durante questa

fase del progetto sono stati la modulazione del bersaglio in vivo dose

umana prevista selettivitagraveeffetti di off-target solubilitagrave stabilitagrave

formulazione e sintesi Seguendo questo processo il composto 4 egrave stato

selezionato come candidato per lo sviluppo preclinico 4 ha una potente

affinitagrave per Hsp90 (Kd = 05 nM) attraverso il legame nel sito ATP-

asico nella zona N-terminale di Hsp90 (Figura 9)

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I

et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly

machines Cell 2004 119 9ndash18

47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A

ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

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93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

54

Figura 9 Struttura cristallina proteina-ligando del composto 4 legato nel sito ATPasi di

Hsp90

Questa affinitagrave per lrsquoenzima si traduce in un buona attivitagrave nei confronti

di una serie di linee cellulari di tumori umani e in unrsquoattivitagrave citostatica

statisticamente significativa in modelli anticancro di topo

OH

HO

NO

X N N

4 X = CH2

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

55

Il composto 4 ha un profilo preciso contro le isoforme maggiori di

citocromo P450 (inibizione minore o uguale del 40 a 10 μM per 1A2

2D6 3A4 2C9 2C19) bassa affinitagrave hERG scarso legame con le

proteine a basso peso molecolare (85 nel plasma umano) ed unrsquoalta

solubilitagrave termodinamica acquosa come i sali metanlosforici i cloridrati

gli L-lattati La sua trattabilitagrave sintetica lo rende facilmente suscettibile

alla sintesi in larga scala Sulla base di questo e di ulteriori dati il

composto 4 (AT13387) come L-lattato egrave stato selezionato per lo

sviluppo clinico

INDIVIDUAZIONE DELLrsquoHsp90 SINTESI DEL

NUOVO ACIDO RESORCILICO MACROLATTONE

INIBITORI DELLrsquoHsp90

Heat shock protein 90 (Hsp90 ndash proteina dello shock termico 90) una

delle piugrave abbondanti proteine nelle cellule eucariote egrave un chaperone

ATP dipendente che gioca un ruolo centrale regolando la

stabilizzazione lrsquoattivazione e la degradazione di una gamma di proteine

[97] Queste proteine ldquoclientirdquo includono proteine riconosciute come

sovra-espresse o mutanti oncogeniche come C-RAF B-RAF ERBB2

AKT telomerasi ed il gene p53 Alcune di queste proteine sono

associate con le sei caratteristiche dei tumori [98-99] e perciograve Hsp90 egrave

emersa come un bersaglio molto attraente per i nuovi agenti terapeutici

contro il cancro Il progresso in questrsquoarea egrave stato ampiamente

revisionato neglrsquoultimi cinque anni Specifici inibitori delle Hsp90 sono

ora entrati negli studi clinici Un lavoro interessante sugli inibitori di

Hsp90 egrave stato fatto con due prodotti naturali il radicicol e la

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

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protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

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65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J

Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

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66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

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69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat

shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

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70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

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66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

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71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

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maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

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Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

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74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-

39969

76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

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111088-1095

77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

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67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

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88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

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Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

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91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

56

geldanamicina che si legano entrambi alla tasca di legame dellrsquoATP

nel dominio N-terminale delle proteine [100 ab]

Radicicol

La struttura che si lega con le proteine sia del radicicol che della

geldanamicina egrave stata studiata attraverso cristallografia a raggi X [101] e

in soluzione con spettroscopia NMR [102]

Se radicicol fu originariamente isolato da funghi Monocillum Nordinii

piugrave di 50 anni fa e successivamente da Nectria Radicicola e dalla pianta

associata al fungo Chaetomium Chiversii [97] ha attirato lrsquointeresse di

chimici sintetici ed egrave stato il soggetto di tre sintesi totali [103

abcdeg] Ersquo uno dei piugrave potenti inibitori di Hsp90 in vitro mentre ha

una scarsa attivitagrave in vivo ed egrave un membro della piugrave vasta classe di

prodotti naturali conosciuti come lattoni dellrsquoacido resorcilico molti dei

quali presentano una potente attivitagrave biologica La perdita dellrsquoattivitagrave in

vivo di radicicol egrave presumibilmente il risultato del suo epossido reattivo

e della porzione dienonica anche se il suo derivato ossimico potrebbe

avere una piccola attivitagrave in vivo [104] In una ricerca su altri analoghi

biologicamente attivi Danishefsky e collaboratori hanno sviluppato una

nuova serie di inibitori basati sul ciclopropanradicicol [105] compreso

il triazol-ciclopropanradicicol descritto recentemente [106]

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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64

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78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46

83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr

Top Med Chem 2002 4395-415

84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies

Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250

85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of

the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding

of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

Pharmacol 2008 8370-374

88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

2010 Aug 2653(16)5956-69

89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

trials J Med Chem 2010 53 3ndash17

90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

294

91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

57

Triazol-ciclopropanradicicol NP261

Ersquo stato riportato uno studio sulla struttura del legame del radicicol

legato nella tasca dellrsquoATP nel dominio N-terminale di Hsp90 di lievito

(Figura 10) [97] Nella stessa pubblicazione egrave stat riportata lrsquoattivitagrave

biologica di alcuni analoghi del radicicol e di una serie di nuovi

macrolattoni resorcilici con anelli e conformazioni diverse

Figura 10 Interazioni di legame del radicicol con Hsp90 di lievito

Uno di questi analoghi NP261 non solo ha mostrato di essere un

importante inibitore di Hsp90 che si lega al dominio N-terminale della

proteina che egrave deplezione delle proteine clienti con up-regulation di

Hsp70 ma il suo legame con le proteine avviene in maniera del tutto

58

simile a quella del prodotto naturale strutturalmente piugrave complesso

(Figura 11)

Figura 11 Interazioni di legame di NP261 un lattone a 14 membri con Hsp90 di lievito

In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

lrsquoestere salicilico e gruppi i fenolici il carbossilato della catena laterale

di Asp79 il gruppo ammidico della catena principale della Gly83

lrsquoossidrile della catena laterale di Thr171 il carbossile della catena

principale di Leu34 e conservate molecole di acqua (figure ab e aab)

Sebbene la struttura del radicicol mostri chiaramente il coinvolgimento

dellrsquoossigeno epossidico nel legame a idrogeno con il gruppo ε-

amminico della catena laterale di Lys44 la perdita relativamente

minima del doppio dellrsquoattivitagrave in vitro dellrsquoanalogo NP261 suggerisce

che questa interazione sebbene utile non egrave essenziale [97] Da questo

studio egrave stato possibile ottenere utili informazioni per la progettazione e

per la sintesi di nuovi macrlolattoni resorcilici nei quali la presenza di

eteroatomi potrebbero essere importanti per un potenziale legame con la

59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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64

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In questo modo entrambi i composti adottano una simile conformazione

ripiegata con le stesse interazioni di legame a idrogeno che coinvolgono

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Lebret RW Watson JM Fitzpatrick Heat shock proteins their role

in urological tumours J Urolog 169 2003 338ndash346

5) [6] C Sarto P Binz P Morcarelli Heat shock proteins in human

cancer Electrophoresis 21 2000 1218ndash1226

6) [12] C Didelot D Lanneau M Brunet A Joly A De Thonel G

Chiosis C Garrido Anti-cancer therapeutic approaches based on

intracellular and extracellular heat shock proteins Curr Med Chem

14 2007 2839ndash2847

7) E Schmitt M Gehrmann M Brunet G Multhoff C Garrido

Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins

repercussions in cancer therapy J Leukoc Biol 81 2007 15ndash27

8) KW Lanks Temperature-dependent oligomerization of HSP85 in

vitro J Cell Physiol 140 1989 601ndash607

9) P Kopecek K Altmannova E Weigl Stress proteins nomenclature

division and functions Biomed Papers 145 2001 39ndash47

10) H Sakamoto T Mashima K Yamamoto T Tsuruo Modulation of

heat-shock protein 27 (HSP27) anti-apoptotic activity by

methylglyoxal modification J Biol Chem 277 2002 45770ndash45775

11) JW van Heijst HW Niessen RJ Musters VW van Hinsbergh K

Hoekman CG Schalkwijk Argpyrimidine-modified heat shock

protein 27 in human non-small cell lung cancer a possible mechanism

for evasion of apoptosis Cancer Lett 241 2006 309ndash319

61

12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson

CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of

substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555

13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y

Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201

14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the

roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in

eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751

15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular

Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006

Elsevier Inc

16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton

Structural and functional link between the mitochondrial network and

the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27

17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early

secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802

18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis

Science 1975 189347-358

19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and

stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65

20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein

response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789

21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456

22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno

K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-

sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456

23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P

On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic

reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784

24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of

endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010

14719-25

25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential

checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165

41ndash52

26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient

restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash

1963

62

27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P

Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the

calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa

N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally

misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299

1394ndash1397

28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed

bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719

29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is

UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31

24ndash25

30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner

S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and

risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810

31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL

Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein

particles Nature 2005 437 257ndash261

32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the

ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001

292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and

Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by

nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body

formation Mol Cell 2005 17 351ndash365

33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg

AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences

and release them during degradation of polyglutamine-containing

proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104

34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M

Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms

protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect

on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614

35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of

interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005

20 513ndash524

36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in

the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular

chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling

J Mol Biol 1999 286 915ndash932

63

37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70

chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367

38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC

Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate

mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash

379

39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated

activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101

40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast

Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and

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V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different

cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol

Chem 2005 280 41252ndash41261

41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow

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associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs

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Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the

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peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208

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Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-

protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504

44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P

Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones

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complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069

45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human

Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are

ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034

46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM

Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I

et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly

machines Cell 2004 119 9ndash18

47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A

ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela

Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524

51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy

to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004

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52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System

Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158

53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by

molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22

54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F

Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in

neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against

disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W

Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to

Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7

55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and

developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88

56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of

heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90

complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998

94471-480

57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein

misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528

58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK

Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of

polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci

USA 2000 977841-7846

59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies

with the length of the polyglutamine expansion and the expression of

chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ

Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009

299104-9114

61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau

protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

Chem 2006 28133182-33191

65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J

Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

Chem Lett 2007 171984-1990

66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868

69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat

shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril

66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

364323-336

71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516

73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J

Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658

74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-

39969

76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005

111088-1095

77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

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83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

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84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies

Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250

85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of

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of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

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59

catena laterale di Lys44 in modo tale da incrementare la potenza degli

inibitori

60

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misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299

1394ndash1397

28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed

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29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

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32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the

ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001

292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and

Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by

nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body

formation Mol Cell 2005 17 351ndash365

33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg

AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences

and release them during degradation of polyglutamine-containing

proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104

34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M

Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms

protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect

on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614

35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of

interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005

20 513ndash524

36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in

the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular

chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling

J Mol Biol 1999 286 915ndash932

63

37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70

chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367

38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC

Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate

mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash

379

39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated

activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101

40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast

Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and

Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese

V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different

cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol

Chem 2005 280 41252ndash41261

41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow

T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-

associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs

Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767

42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y

Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the

ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative

peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208

43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The

Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-

protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504

44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P

Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones

MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated

complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069

45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human

Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are

ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034

46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM

Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I

et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly

machines Cell 2004 119 9ndash18

47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A

ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela

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51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy

to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004

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52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System

Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158

53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by

molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22

54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F

Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in

neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against

disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W

Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to

Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7

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56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of

heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90

complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998

94471-480

57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein

misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528

58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK

Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of

polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci

USA 2000 977841-7846

59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies

with the length of the polyglutamine expansion and the expression of

chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ

Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009

299104-9114

61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau

protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

Chem 2006 28133182-33191

65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J

Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

Chem Lett 2007 171984-1990

66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

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68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868

69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat

shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

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67

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49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

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allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

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shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril

66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

364323-336

71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516

73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J

Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658

74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-

39969

76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005

111088-1095

77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46

83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr

Top Med Chem 2002 4395-415

84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies

Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250

85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of

the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding

of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

Pharmacol 2008 8370-374

88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

2010 Aug 2653(16)5956-69

89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

trials J Med Chem 2010 53 3ndash17

90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

294

91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

61

12) SB Qian H McDonough F Boellmann DM Cyr C Patterson

CHIP-mediated stress recovery by sequential ubiquitination of

substrates and HSP70 Nature 440 2006 551ndash555

13) M Sherman G Multhoff Heat shock proteins in cancer Ann N Y

Acad Sci 1113 (2007) 192ndash201

14) Z Li J Dai H Zheng B Liu M Caudill An integrated view of the

roles and mechanisms of heat shock protein gp96ndashpeptide complex in

eliciting immune response Front Biosci 7 2002 d731ndashd751

15) Bernd Bukau Jonathan Weissman and Arthur Horwich Molecular

Chaperones and Protein Quality Control Cell 125 May 5 2006 copy2006

Elsevier Inc

16) Giorgi C D De Stefani A Bononi R Rizzuto and P Pinton

Structural and functional link between the mitochondrial network and

the endoplasmic reticulum Int J Biochem Cell Biol 2009 411817-27

17) Dancourt J and C Barlowe Protein sorting receptors in the early

secretory pathway Annu Rev Biochem 2010 79777-802

18) Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis

Science 1975 189347-358

19) Ma Y Hendershot LM ER chaperone functions during normal and

stress conditions J Chem neuroanat 2004 28(1-2)51-65

20) Schroder M and Kaufman RJ The mammalian unfolded protein

response Annu Rev Biochem 2005 74 739ndash789

21) Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456

22) Kimata Y Oikawa D Shimizu Y Ishiwata-Kimata Y and Kohno

K A role for BiP as an adjustor for the endoplasmic reticulum stress-

sensing protein Ire1 J Cell Biol 2004 167 445ndash456

23) Credle JJ Finer-Moore JS Papa FR Stroud RM and Walter P

On the mechanism of sensing unfolded protein in the endoplasmic

reticulum Proc Natl Acad Sci 2005 USA 102 18773ndash18784

24) Hoseki J R Ushioda and K Nagata Mechanism and components of

endoplasmic reticulum-associated degradation J Biochem 2010

14719-25

25) Vashist S and Ng DT Misfolded proteins are sorted by a sequential

checkpoint mechanism of ER quality control J Cell Biol 2004 165

41ndash52

26) Vabulas RM and Hartl FU Protein synthesis upon acute nutrient

restriction relies n proteasome function Science 2005 310 1960ndash

1963

62

27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P

Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the

calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa

N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally

misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299

1394ndash1397

28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed

bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719

29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is

UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31

24ndash25

30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner

S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and

risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810

31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL

Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein

particles Nature 2005 437 257ndash261

32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the

ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001

292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and

Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by

nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body

formation Mol Cell 2005 17 351ndash365

33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg

AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences

and release them during degradation of polyglutamine-containing

proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104

34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M

Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms

protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect

on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614

35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of

interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005

20 513ndash524

36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in

the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular

chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling

J Mol Biol 1999 286 915ndash932

63

37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70

chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367

38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC

Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate

mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash

379

39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated

activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101

40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast

Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and

Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese

V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different

cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol

Chem 2005 280 41252ndash41261

41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow

T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-

associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs

Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767

42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y

Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the

ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative

peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208

43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The

Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-

protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504

44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P

Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones

MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated

complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069

45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human

Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are

ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034

46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM

Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I

et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly

machines Cell 2004 119 9ndash18

47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A

ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela

Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524

51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy

to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004

17299-306

52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System

Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158

53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by

molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22

54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F

Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in

neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against

disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W

Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to

Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7

55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and

developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88

56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of

heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90

complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998

94471-480

57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein

misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528

58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK

Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of

polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci

USA 2000 977841-7846

59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies

with the length of the polyglutamine expansion and the expression of

chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ

Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009

299104-9114

61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau

protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

Chem 2006 28133182-33191

65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J

Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

Chem Lett 2007 171984-1990

66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868

69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat

shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril

66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

364323-336

71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516

73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J

Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658

74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-

39969

76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005

111088-1095

77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46

83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr

Top Med Chem 2002 4395-415

84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies

Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250

85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of

the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding

of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

Pharmacol 2008 8370-374

88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

2010 Aug 2653(16)5956-69

89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

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90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

294

91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

62

27) a Molinari M Calanca V Galli C Lucca P and Paganetti P

Role of EDEM in the release of misfolded glycoproteins from the

calnexin cycle Science 2003 299 1397ndash1400 b Oda Y Hosokawa

N Wada I and Nagata K EDEM as an acceptor of terminally

misfolded glycoproteins released from calnexin Science 2003 299

1394ndash1397

28) Cormier JH Pearse BR and Hebert DN Yos9p a sweettoothed

bouncer of the secretory pathway Mol Cell 2005 19 717ndash719

29) a Romisch K Endoplasmic reticulum-associated degradation Annu

Rev Cell Dev Biol 2005 21 435ndash456 b Romisch K Cdc48p is

UBX-linked to ER ubiquitin ligases Trends Biochem Sci 2006 31

24ndash25

30) Arrasate M Mitra S Schweitzer ES Segal MR and Finkbeiner

S Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and

risk of neuronal death Nature 2004 431 805ndash810

31) Silveira JR Raymond GJ Hughson AG Race RE Sim VL

Hayes SF and Caughey B The most infectious prion protein

particles Nature 2005 437 257ndash261

32) a Bence N Sampat R and Kopito RR Impairment of the

ubiquitin-proteasome system by protein aggregation Science 2001

292 1552ndash1555 b Bennett EJ Bence NF Jayakumar R and

Kopito RR Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by

nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body

formation Mol Cell 2005 17 351ndash365

33) Venkatraman P Wetzel R Tanaka M Nukina N and Goldberg

AL Eukaryotic proteasomes cannot digest polyglutamine sequences

and release them during degradation of polyglutamine-containing

proteins Mol Cell 2004 14 95ndash104

34) Bjoslashrkoslashy G Lamark T Brech A Outzen H Perander M

Oslashvervatn A Stenmark H and Johansen T p62SQSTM1 forms

protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect

on huntingtin-induced cell death J Cell Biol 2005 171 603ndash614

35) Jiang J Prasad K Lafer EM and Sousa R Structural basis of

interdomain communication in the Hsc70 chaperone Mol Cell 2005

20 513ndash524

36) Montgomery DL Morimoto RI and Gierasch LM Mutations in

the substrate binding domain of the Escherichia coli 70 kDa molecular

chaperone DnaK which alter substrate affinity or interdomain coupling

J Mol Biol 1999 286 915ndash932

63

37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70

chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367

38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC

Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate

mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash

379

39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated

activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101

40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast

Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and

Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese

V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different

cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol

Chem 2005 280 41252ndash41261

41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow

T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-

associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs

Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767

42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y

Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the

ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative

peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208

43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The

Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-

protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504

44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P

Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones

MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated

complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069

45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human

Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are

ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034

46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM

Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I

et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly

machines Cell 2004 119 9ndash18

47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A

ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela

Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524

51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy

to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004

17299-306

52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System

Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158

53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by

molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22

54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F

Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in

neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against

disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W

Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to

Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7

55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and

developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88

56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of

heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90

complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998

94471-480

57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein

misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528

58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK

Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of

polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci

USA 2000 977841-7846

59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies

with the length of the polyglutamine expansion and the expression of

chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ

Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009

299104-9114

61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau

protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

Chem 2006 28133182-33191

65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J

Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

Chem Lett 2007 171984-1990

66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868

69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat

shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril

66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

364323-336

71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516

73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J

Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658

74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-

39969

76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005

111088-1095

77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46

83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr

Top Med Chem 2002 4395-415

84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies

Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250

85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of

the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding

of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

Pharmacol 2008 8370-374

88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

2010 Aug 2653(16)5956-69

89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

trials J Med Chem 2010 53 3ndash17

90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

294

91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

63

37) Vogel M Bukau B and Mayer MP Allosteric regulation of Hsp70

chaperones by a proline switch Mol Cell 2006 21 359ndash367

38) Shomura Y Dragovic Z Chang HC Tzvetkov N Young JC

Brodsky JL Guerriero V Hartl FU and Bracher A Regulation

of Hsp70 function by HspBP1 structural analysis reveals an alternate

mechanism for Hsp70 nucleotide exchange Mol Cell 2005 17 367ndash

379

39) Steel GJ Fullerton DM Tyson JR and Stirling CJ Coordinated

activation of Hsp70 chaperones Science 2004 303 98ndash101

40) a Shaner L Wegele H Buchner J and Morano KA The yeast

Hsp110 Sse1 functionally interacts with the Hsp70 chaperones Ssa and

Ssb J Biol Chem 2005280 41262ndash41269 b Yam AY Albanese

V Lin HT and Frydman J Hsp110 cooperates with different

cytosolic HSP70 systems in a pathway for de novo folding J Biol

Chem 2005 280 41252ndash41261

41) Gautschi M Lilie H Funfschilling U Mun A Ross S Lithgow

T Rucknagel P and Rospert S (2001) RAC a stable ribosome-

associated complex in yeast formed by the DnaK-DnaJ homologs

Ssz1p and zuotin Proc Natl Acad Sci USA 98 3762ndash3767

42) Hundley H Eisenman H Walter W Evans T Hotokezaka Y

Wiedmann M and Craig E (2002) The in vivo function of the

ribosome-associated Hsp70 Ssz1 does not require its putative

peptidebinding domain Proc Natl Acad Sci USA 99 4203ndash4208

43) Huang P Gautschi M Walter W Rospert S and Craig EA The

Hsp70 Ssz1 modulates the function of the ribosome-associated J-

protein Zuo1 Nat Struct Mol Biol 2005 12 497ndash504

44) Otto H Conz C Maier P Wolfle T Suzuki CK Jeno P

Rucknagel P Stahl J and Rospert S (2005) The chaperones

MPP11 and Hsp70L1 form the mammalian ribosome-associated

complex Proc Natl Acad Sci USA 102 10064ndash10069

45) Hundley H Walter W Bairstow S and Craig EA Human

Mpp11J protein ribosome-tethered molecular chaperones are

ubiquitous Science 2005 308 1032ndash1034

46) Sauer RT Bolon DN Burton BM Burton RE Flynn JM

Grant RA Hersch GL Joshi SA Kenniston JA Levchenko I

et al Sculpting the proteome with AAA+ proteases and disassembly

machines Cell 2004 119 9ndash18

47) Lee C Schwartz MP Prakash S Iwakura M and Matouschek A

ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela

Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524

51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy

to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004

17299-306

52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System

Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158

53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by

molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22

54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F

Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in

neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against

disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W

Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to

Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7

55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and

developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88

56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of

heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90

complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998

94471-480

57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein

misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528

58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK

Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of

polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci

USA 2000 977841-7846

59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies

with the length of the polyglutamine expansion and the expression of

chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ

Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009

299104-9114

61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau

protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

Chem 2006 28133182-33191

65) Ansar S Burlison JA Hadden MK Yu XM Desino KE Bean J

Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

Chem Lett 2007 171984-1990

66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868

69) Flower TR Chesnokova LS Froelich CA Dixon C Witt SN Heat

shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril

66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

364323-336

71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

tauopathies Proc Natl Acad Sci USA 2007 1049511-9516

73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J

Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

phosphorylated tau client proteins J Clin Invest 2007 117648-658

74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

disease in Drosophila Nat Med 2002 81185-1186

75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

dopaminergic neurotoxicity in mice J Biol Chem 2005 28039962-

39969

76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nat Med 2005

111088-1095

77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

AP Pharmacologic and genetic inhibition of hsp90-dependent

trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46

83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr

Top Med Chem 2002 4395-415

84) Goedert M Jakes R Mutations causing neurodegenerative tauopathies

Biochim Biophys Acta 2005 1739240-250

85) Dou F Chang X Ma D Hsp90 Maintains the Stability and Function of

the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

86) Tortosa E Santa-Maria I Moreno F Lim F Perez M Avila J Binding

of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

Pharmacol 2008 8370-374

88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

2010 Aug 2653(16)5956-69

89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

trials J Med Chem 2010 53 3ndash17

90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

294

91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

64

unraveling them from the degradation signal Mol Cell 2001 7 627ndash

637

48) Hinnerwisch J Fenton WA Farr GW Furtak K and Horwich

AL Loops in the central channel of ClpA chaperone mediate protein

binding unfolding and translocation Cell 2005 121 1029ndash1041

49) Hersch GL Burton RE Bolon DN Baker TA and Sauer RT

Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase

allosteric control of a protein machine Cell 2005 121 1017ndash1027

50) Wenjie Luo Weilin Sun Tony Taldone Anna Rodina and Gabriela

Chiosis Molecular Neurodegeneration 2010 524

51) Klettner A The induction of heat shock proteins as a potential strategy

to treat neurodegenerative disorders Drug News Perspect 2004

17299-306

52) Brown I Heat Shock Proteins and Protection of the Nervous System

Ann N Y Acad Sci 2007 1113147-158

53) Muchowski PJ Wacker JL Modulation of neurodegeneration by

molecular chaperones Nat Rev Neurosci 2005 611-22

54) a 7 Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Tanaka F

Doyu M Sobue G Modulation of Hsp90 function in

neurodegenerative disorders a molecular-targeted therapy against

disease-causing protein J Mol Med 2006 84635-646 b Luo W

Rodina A Chiosis G Heat shock protein 90 translation from cancer to

Alzheimers disease treatment BMC Neurosci 2008 9(Suppl2)S7

55) Anckar J Sistonen L Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and

developmental pathways Adv Exp Med Biol 2007 59478-88

56) Zou J Guo Y Guettouche T Smith DF Voellmy R Repression of

heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90 (HSP90

complex) that forms a stress-sensitive complex with HSF1 Cell 1998

94471-480

57) Williams AJ Paulson HL Polyglutamine neurodegeneration protein

misfolding revisited Trends Neurosci 2008 31521-528

58) Muchowski PJ Schaffar G Sittler A Wanker EE Hayer-Hartl MK

Hartl FU Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of

polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils Proc Natl Acad Sci

USA 2000 977841-7846

59) Krobitsch S Lindquist S Aggregation of huntingtin in yeast varies

with the length of the polyglutamine expansion and the expression of

chaperone proteins Proc Natl Acad Sci USA 2000 971589-1594

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

Giorgini F Roberson ED Lindquist S Masliah E Muchowski PJ

Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

aggregates in a mouse model of Huntingtons disease J Neurosci 2009

299104-9114

61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

alleviates polyglutamine-mediated motor neuron disease Proc Natl

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inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

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Neckers L Audus KL Michaelis ML Blagg BS A non-toxic Hsp90

inhibitor protects neurons from Aβ-induced toxicity Bioorg Med

Chem Lett 2007 171984-1990

66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

interact with beta-APP in a proteasome-dependent manner and

influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

model for Parkinsons disease Science 2002 295865-868

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shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

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66

formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

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71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

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72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

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induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

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Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

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Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

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trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

induction Hum Mol Genet 2006 151876-1883

79) Moriwaki Y Kim YJ Ido Y Misawa H Kawashima K Endo S

Takahashi R L347P PINK1 mutant that fails to bind to Hsp90Cdc37

chaperones is rapidly degraded in a proteasome-dependent manner

Neurosci Res 2008 6143-48

80) Falsone SF Kungl AJ Rek A Cappai R Zangger K The molecular

chaperone Hsp90 modulates intermediate steps of amyloid assembly of

the Parkinson-related protein alpha-synuclein J Biol Chem 2009

28431190-31199

67

81) Kabuta T Furuta A Aoki S Furuta K Wada K Aberrant interaction

between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

lysosomal receptor for chaperone-mediated autophagy Biol Chem

2008 28323731-23738

82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

foldopathies Biochim Biophys Acta 2005 1739298-310 46

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the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

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of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

Pharmacol 2008 8370-374

88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

2010 Aug 2653(16)5956-69

89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

trials J Med Chem 2010 53 3ndash17

90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

294

91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

L C Burrows F J A high-affinity conformation of Hsp90 confers

tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

93) Le Brazidec J-Y Kamal A Busch D Thao L Zhang L

Timony G Grecko R Trent K Lough R Salazar T Khan S

Burrows F Boehm M F Synthesis and biological evaluation of a

65

60) Wacker JL Huang SY Steele AD Aron R Lotz GP Nguyen Q

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Loss of Hsp70 exacerbates pathogenesis but not levels of fibrillar

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61) Cummings CJ Mancini MA Antalffy B De Franco DB Orr HT

Zoghbi HY Chaperone suppression of aggregation and altered

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Nat Genet 1998 19148-154

62) Katsuno M Sang C Adachi H Minamiyama M Waza M Tanaka F

Doyu M Sobue G Pharmacological induction of heat-shock proteins

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Acad Sci USA 2005 1021606-1680

63) Dou F Netzer WJ Tanemura K Li F Hartl FU Takashima A Gouras

GK Greengard P Xu H Chaperones increase association of tau

protein with microtubules Proc Natl Acad Sci USA 2003 100721-

726

64) Evans CG Wisen S Gestwicki JE Heat shock proteins 70 and 90

inhibit early stages of amyloid β-(1-42) aggregation in vitro J Biol

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66) Kumar P Ambasta RK Veereshwarayya V Rosen KM Kosik KS

Band H Mestril R Patterson C Querfurth HW CHIP and HSPs

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influence Abeta metabolism Hum Mol Genet 2007 16848-864

67) Kouchi Z Sorimachi H Suzuki K Ishiura S Proteasome inhibitors

induce the association of Alzheimers amyloid precursor protein with

Hsc73 Biochem Biophys Res Commun 1999 254804-810

68) Auluck PK Chan HY Trojanowski JQ Lee VM Bonini NM

Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila

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shock prevents alpha-synuclein-induced apoptosis in a yeast model of

Parkinsons disease J Mol Biol 2005 3511081-1100

70) Huang C Cheng H Hao S Zhou H Zhang X Gao J Sun QH Hu H

Wang CC Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril

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formation via interactions with diverse intermediates J Mol Biol 2006

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71) Luk KC Mills IP Trojanowski JQ Lee VM Interactions between

Hsp70 and the hydrophobic core of alpha-synuclein inhibit fibril

assembly Biochemistry 2008 4712614-1225

72) Luo W Dou F Rodina A Chip S Kim J Zhao Q Moulick K Aguirre

J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in

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73) Dickey CA Kamal A Lundgren K Klosak N Bailey RM Dunmore J

Ash P Shoraka S Zlatkovic J Eckman CB et al The high-affinity

HSP90-CHIP complex recognizes and selectively degrades

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74) Auluck PK Bonini NM Pharmacological prevention of Parkinson

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75) Shen HY He JC Wang Y Huang QY Chen JF Geldanamycin

induces heat shock protein 70 and protects against MPTP-induced

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76) Waza M Adachi H Katsuno M Minamiyama M Sang C Tanaka F

Inukai A Doyu M Sobue G 17-AAG an Hsp90 inhibitor ameliorates

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77) Fujikake N Nagai Y Popiel HA Okamoto Y Yamaguchi M Toda T

Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

multiple molecular chaperones J Biol Chem 2008 28326188-26197

78) Thomas M Harrell JM Morishima Y Peng HM Pratt WB Lieberman

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trafficking reduces aggregation and promotes degradation of the

expanded glutamine androgen receptor without stress protein

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67

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between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

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82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

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83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

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of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

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J Wu N Greengard P Chiosis G Roles of heat shock protein 90 in

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Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress

polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of

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67

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82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

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90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

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between Parkinson diseaseassociated mutant UCH-L1 and the

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82) Kosik KS Shimura H Phosphorylated tau and the neurodegenerative

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83) Lau LF Schachter JB Seymour PA Sanner MA Tau protein

phosphorylation as a therapeutic target in Alzheimers disease Curr

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the Tau Phosphorylating Kinase GSK3β Int J Mol Sci 2007 851-60

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of Hsp90 to Tau Promotes a Conformational Change and Aggregation

of Tau Protein J Alzheimers Dis 2009 17319-325

87) Taldone T Gozman A Maharaj R Chiosis G Targeting Hsp90 small

molecule inhibitors and their clinical development Curr Opin

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88) Woodhead AJ Angove H Carr MG Chessari G Congreve M Coyle

JE Cosme J Graham B Day PJ Downham R Fazal L Feltell R

Figueroa E Frederickson M Lewis J McMenamin R Murray CW

OBrien MA Parra L Patel S Phillips T Rees DC Rich S Smith DM

Trewartha G Vinkovic M Williams B Woolford AJ J Med Chem

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89) Biamonte M A Van de Water R Arndt J W Scannevin R H

Perret D Lee W-C Heat shock protein 90 inhibitors in clinical

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90) Pearl L H Prodromou C Structure and mechanism of the Hsp90

molecular chaperone machinery Annu Rev Biochem 2006 75 271ndash

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91) Chiosis G Neckers L Tumor selectivity of Hsp90 inhibitors the

explanation remains elusive Chem Biol 2006 1 279ndash284

92) Kamal A Thao L Sensintaffar J Zhang L Boehm M F Fritz

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tumour selectivity on Hsp90 inhibitors Nature 2003 425 407ndash410

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104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T

Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445

105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G

Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318

Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D

Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc

2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett

2004 1325

106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677

70

RINGRAZIAMENTI

Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e

lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia

relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi

nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo

anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora

Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di

svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui

Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e

compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei

potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole

superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola

indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele

Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel

quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe

onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria

Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso

lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria

Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un

ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di

difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei

amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la

lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry

Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip

71

hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia

senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove

sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi

e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente

inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui

studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente

nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento

piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare

stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire

riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose

piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel

dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi

rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico

ciao Papagrave

69

96) Murray C W Callaghan O Chessari G Congreve M Cowan S

Coyle J E Downham R Figueroa E Frederickson M Graham

B McMenamin R OrsquoBrien M A Patel S Phillips T R

Williams G Woodhead A J Woolford A J-A Fragment-based

drug discovery applied to Hsp90 Discovery of two lead series with

high ligand efficiency J Med Chem DOI 101021jm100059d

97) James E H Day Swee Y Sharp Martin G Rowlands Wynne

Aherne Paul Workman and Christopher J Moody Chem Eur J

2010 16 2758 ndash 2763

98) L H Pearl C Prodromou P Workman Biochem J 2008 410 439

99) P Workman Cancer Lett 2004 206 149

100) a C Prodromou S M Roe R O_Brien J E Ladbury P W Piper

L H Pearl Cell 1997 90 65 b M M U Ali S M Roe C K

Vaughan P Meyer B Panaretou P W Piper C Prodromou L H

Pearl Nature 2006 440 1013

101) S M Roe C Prodromou R O_Brien J E Ladbury P W Piper L

H Pearl J Med Chem 1999 42 260

102) A Dehner J Furrer K Richter I Schuster J Buchner H Kessler

ChemBioChem 2003 4 870

103) a M Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 773 b M

Lampilas R Lett Tetrahedron Lett 1992 33 777 c I Tichkowsky

R Lett Tetrahedron Lett 2002 43 3997 d I Tichkowsky R Lett

Tetrahedron Lett 2002 43 4003 e R M Garbaccio S J Stachel

D K Baeschlin S J Danishefsky J Am Chem Soc 2001 123

10903

104) T Agatsuma H Ogawa K Akasaka A Asai Y Yamashita T

Mizukami S Akinaga Y Saitoh Bioorg Med Chem 2002 10 3445

105) a K Yamamoto R M Garbaccio S J Stachel D B Solit G

Chiosis N Rosen S J Danishefsky Angew Chem 2003 115 1318

Angew Chem Int Ed 2003 42 1280 b Z Q Yang X D Geng D

Solit C A Pratilas N Rosen S J Danishefsky J Am Chem Soc

2004 126 7881 c X D Geng Z Q Yang S J Danishefsky Synlett

2004 1325

106) X G Lei S J Danishefsky Adv Synth Catal 2008 350 1677

70

RINGRAZIAMENTI

Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e

lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia

relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi

nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo

anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora

Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di

svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui

Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e

compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei

potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole

superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola

indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele

Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel

quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe

onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria

Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso

lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria

Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un

ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di

difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei

amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la

lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry

Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip

71

hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia

senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove

sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi

e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente

inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui

studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente

nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento

piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare

stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire

riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose

piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel

dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi

rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico

ciao Papagrave

70

RINGRAZIAMENTI

Ersquo difficile salutare e soprattutto menzionare tutti dopo unrsquoesperienza cosigrave bella e

lunga allo stesso tempohellipinizierei ringraziando la profssa Lapucci noncheacute mia

relatrice che mi ha seguito durante tutti i miei studi supportandomi ed aiutandomi

nello svolgimento della tesi ringrazierei i ragazzi con cui sono stato qui il primo

anno tra cui Peppe Biagio Donato Claudio ancora Derna Angelica Eleonora

Tommaso Andrea Parisi il gruppo dello Sporting che egrave stato per me motivo di

svago e sfogo durante un primo difficile periodo di approccio allrsquouniversitagrave tra cui

Fede Leo Diego Mauro Simone e Ciccio questrsquoultimo rivelatosi vero amico e

compagno insostituibile prima ma soprattutto dopo in piugrave occasioni il gruppo dei

potentini Pierpaolo Gigi Stefano legati da unrsquoamicizia fin dai tempi delle scuole

superiori i ragazzi dellrsquoErasmus Salmantino complici di unrsquoesperienza spagnola

indimenticabile Filippo Michele Eleonora Angelo Jacopo Joao Raffaele

Fausto Jaca Nuria sia in Spagna che a Pisa i ragazzi del periodo post-erasmus nel

quale ci sono Carmen Ruben Maite Ada Ciccio (nuovamente) Peppe

onnipresente negli ultimi miei tre anni qui a Pisa Vinz Papo Vitina Maria

Claudia Giovanna Lolla Pocci i ragazzi di via Gori 33 con i quali ho condiviso

lrsquoultima parte della mia carriera universitaria Vincenzo (il rasta) Maria Vittoria

Vincenzo Aurelio Valentina Fabio Pamela Simone Rocco Andrea Un

ringraziamento particolare va a Maria Grazia puntuale appiglio nei periodi di

difficoltagrave e che mi ha continuamente sostenuto Un saluto speciale va anche ai miei

amici di Potenza con i quali ho condiviso la mia infanzia e che anche attraverso la

lontananza mi sono sempre stati vicini Marcello Cafugrave Manuela Frau Henry

Marco Ragone Andrea Guerriero Max Zac e Marco Di Pietrohellip

71

hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia

senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove

sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi

e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente

inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui

studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente

nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento

piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare

stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire

riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose

piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel

dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi

rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico

ciao Papagrave

71

hellipovviamente non posso esimermi dal ringraziare enormemente la mia famiglia

senza la quale probabilmente non avrei avuto la forza per poter arrivare fin dove

sono ora in primis ringrazio mia madre che ha sempre avuto la forza di sostenermi

e credere fortemente in me senza mai far pesare nulla nella mia vita da studente

inutile dire il supporto che mio fratello mi ha dato nel periodo in cui anche lui

studiava a Pisa e che continua a darmi facendosi sentire continuamente presente

nonostante le circostanze ci tengano lontani a volte anche troppo Il ringraziamento

piugrave grande vorrei rivolgerlo ad un mio caro amico che amava tanto ridere suonare

stare con la famiglia mi ha trasmesso i suoi valori come amare rispettare gioire

riconoscere i propri limiti e che il segreto piugrave grande sta nel saper sfruttare le cose

piugrave semplici di cui non facciamo quasi piugrave caso egrave rivolto a lui che nella gioia e nel

dolore egrave sempre stato al mio fianco allietando i miei momenti con un gesto che mi

rasserenava immensamente il sorriso Il mio saluto egrave rivolto al mio piugrave caro amico

ciao Papagrave