cri du chat: dalla delezione citogenetica a quella molecolare dal mondo...

Cri du Chat: dalla delezione citogenetica a quella molecolare Michela Malacarne E.O. Ospedali Galliera S.C. Laboratorio di Genetica Umana Genova

San Casciano in Val di Pesa Novembre 2014 17° Raduno Nazionale Famiglie ABC Associazione Bambini Cri du chat

CORRELAZIONE

GENOTIPO FENOTIPO

1971 CARIOTIPO Bande Q

5

1971 CARIOTIPO Bande Q

Regione critica (CdCCR) Niebuhr E et al., Hum Genet. 1978 Jun 9;42(2):143-56 “Cytologic observations in 35 individuals with a 5p- karyotype.”

5p15

•  35 CdC

•  21F/14M

DELEZIONI -  27 apparentemente terminali -  4 interstiziali -  4 da traslocazione sbilanciata

DIAGNOSI mediante cariotipo bande Q

1992 Ibridazione in situ non isotopica (FISH)

CARIOTIPO (citogentica standard) circa 5-8Mb

FISH (citogenetica molecolare) circa 150Kb

Sonda marcata con fluorocromo

ibridazione

Sonda di DNA specifica per una regione

cromosomica

IBRIDAZIONE IN SITU

Sonda marcata con fluorocromo

DENATURAZIONE IBRIDAZIONE RILEVAZIONE → →

DNA target

Separazione della doppia elica del DNA di sonda e target mediante calore

Sonda e DNA bersaglio vengono posti in contatto e questa si lega ad un sito specifico/ complementare

Mediante microscopio a fluorescenza si localizza la posizione della sonda legata al DNA di interesse

RISULTATO FISH

Y921-F7 5p14

Y748-C1 5p12 Y748-C1 5p12 Y816-F10 5p13 Y816-F10 5p13

breakpoint

RP11-661C8 5p15:33 RP11-661C8 5p15:33 RP11-661C8 5p15:33 Y767-E1 5p15.3 Y767-E1 5p15.3 Y767-E1 5p15.3

Y938-G6 5p15.2 Y938-G6 5p15.2 Y747-B11 5p15.2 Y747-B11 5p15.2 Y853-H12 5p15.1 Y853-H12 5p15.1

Y748-A4 5p14 Y748-A4 5p14 Y748-A4 5p14

Y774-B3 5p15.3 Y774-B3 5p15.3 breakpoint

Y951-E9 5p14 Y951-E9 5p14 Y951-E9 5p14 breakpoint

FISH Del5p15.33p13 Del5p15.3p14

Mappa fenotipica Overhauser J et al., Hum Mol Genet. 1994 Feb;3(2):247-52 “Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region of the cri-du-chat syndrome”.

2Mb

• 49 del5p • 136 sonde FISH/5p

Mappa fenotipica Overhauser J et al., Hum Mol Genet. 1994 Feb;3(2):247-52 “Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region of the cri-du-chat syndrome”.

5.9 Mb

Mappa fenotipica Overhauser J et al., Hum Mol Genet. 1994 Feb;3(2):247-52 “Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region of the cri-du-chat syndrome”.

5p15.3

5p15.2

Gersh M et al., J. Am J Hum Genet. 1995 Jun;56(6):1404-10 “Evidence for a distinct region causing a cat-like cry in patients with 5p deletions”

Cat-like Cry Region

5p15.3

5p15.3

5p15.2

5p15.1

5p14

Ritardo del linguaggio e caratteristiche facciali peculiari Church DM et al., Am J Hum Genet. 1995 May;56(5):1162-72 “Molecular definition of deletions of different segments of distal 5p that result in distinct phenotypic features”

Speech delay (DAT1)

Cat-like cry Childhood facial dysmorphism and moderate ID Adult facial dysmorphism and severe ID

• 17 del5p con SCdC atipica o asintomatici

Cat-like cry CdCCR

(microcephaly, MR, dysmorphism)

Mild ID

No symptons

Mild-severe ID, microcephaly

Mappa fenotipica

Correlazione delezione – ID Marinescu RC et al., Am J Med Genet. 1999 Sep 3;86(1):66-70 “No relationship between the size of the deletion and the level of developmental delay in cri du chat syndrome”

• 50 CdC con delezione terminale • FISH: YAC, BAC, cosmidi • Vineland composite/communication (capacita’ comunicative, motorie, socializzazione, abilita’ nelle attivita’ quotidiane)

No correlazione tra grandezza delezione e gravita’ ID

Cerruti-Mainardi PC et al.,J Med Genet. 2001 Mar;38(3):151-8 “Clinical and molecular characterisation of 80 patients with 5p deletion:genotype-phenotype correlation”

Dysmorphisms

Microcephaly

Skills

Correlazione delezione – ID

FISH Marinescu RC et al., Clin Genet. 1999 Oct;56(4):282-8 “FISH analysis of terminal deletions in patients diagnosed with cri-du-chat syndrome”

• 110 CdC: cariotipo con delezione terminale de novo

• 6% NO delezione terminale (7/110) : ü 1 traslocazione sbilanciata [t(5;10)]

ü  4 delezioni interstiziali ü 2 no delezione (cosmidi)

• 98% (108/110) delezione vista al cariotipo ma definizione corretta con FISH

+

DIAGNOSI mediante cariotipo bande Q + FISH

SEMA5A

SEMA5A • 10% di CDCCR (5p15.2) (Overhauser, 1994 - Gersh, 1995)

• >200Kb • famiglia delle TROMBOSPONDINE (classe V) • Omologo su cr.15 del topo • Proteina transmembrana

• Espressione nel cervello di topo (zona ventricolare della corteccia e gangli della base)

In vertebrati e invertebrati, SEGNALE REPULSIVO per: • guida nella migrazione dei precursori neuronali dalla zona ventricolare • guida nellla direzione di crescita degli assoni

Simmons AD et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998 Jan 26;242(3):685-91 “Molecular cloning and mapping of human semaphorin F from the cri-du-chat candidate interval”

+SEMAF +SEMAF

(Ove

rhau

ser/G

ersh

) (C

hurc

h)

CTNND2

• 25% di 5p15.2 (CDCCR1 – Church, 1995) • >640Kb • Armadillo repeat family • Proteina intracitoplasmatica dei complessi di giunzione • Interazione con presenilina-1, N-caderina

• Espressione: -precoce in precursori dei neuroni e neuroni della zona ventricolare della corteccia, ippocampo, bulbi olfattivi -dendriti dopo migrazione

• Ruolo: -formazione e mantenimento struttura e funzione dei dendriti

Medina M et al., Genomics. 2000 Jan 15;63(2):157-64 “Hemizigosity of delta-catenin (CTNND2) is associated with severe mental retardation in cri –du-chat syndrome”

Delezione CTNND2: RM grave in CdC

Matter C et al., Neuron. 2009 Nov 12;64(3):320-7 “Delta-catenin is required for the maintenance of neural structure and function in mature cortex in vivo”

Estrazione DNA

Estrazione DNA

Campione Controllo

Sonda Marcatura

DNA

Sonda Marcatura

DNA

Scanner

Software per analisi immagini

2000 ARRAY - CGH

Ibridazione Ibridazione

2000  ARRAY – CGH t(5;19)

Array-CGH mapping (speech – cry – face)

• 94 CdC (82 del. terminali, 12 del. Interstiziali)

• BAC array (5p specific, whole genome)

Cry (1,5Mb)

Face (2,4Mb)

Speech (3,2Mb)

Zhang X et al., Am J Hum Genet. 2005 Feb;76(2):312-26 “High resolution mapping of genotype-phenotype relationships in cri du chat syndrome using array comparative genomic hybridization”

1  

Array-CGH mapping (speech – cry – face)

33Mb

11Mb

Zhang X et al., 2005

3.2Mb 1.5Mb 2.4Mb

Cat-like cry – candidate gene Wu Q et al., Eur J Hum Genet. 2005 Apr;13(4):475-85 “Determination of the critical region? For the cat-like cry of Cri-du-chat syndrome and analysis of candidate genes by quantitative PCR”

Pianto CdC: difetti laringe + difetti neurologici

UBE2QL1 (FLJ25076 – 5p15.31): -ubiquitin-conjugating enzime (UBC-E2) -degradazione proteine -invertebrati e vertebrati -alti livelli di espressione in zona toracica e scalpo

640Kb

Diagnosi mediante Array-CGH

Gravita’ ID proporzionale a dimensione delezione? • 15 CdC: ID grave rispetto a delezione e fenotipo complesso

Zhang X et al., 2005

CNV in altre zone del genoma

Necessita’ di analisi “whole genome” per fenotipi complessi ?

Fenotipi complessi

• 24 CdC con fenotipo complesso :-22 delezioni terminali -2 delezioni interstiziali

• Array-CGH (44K Agilent)

Lab ID Probe Start End Band Result Size Mb 275/08 A_14_P113829 11820693 11820752 5p15.2 -/+ 12

A_14_P109445 12038141 12038200 5p15.2 +/+ 295/08 A_14_P119762 15696061 15696120 5p15.1 -/+ 15,8

A_14_P100143 15794709 15794768 5p15.1 +/+ 303/08 A_14_126740 16207595 16207654 5p15.1 -/+ 16,5

A_14_126856 16504599 16504658 5p15.1 +/+ 306/08 A_14_P126698 16719123 16719182 5p15.1 -/+ 16,8

A_14_P131696 16832642 16832701 5p15.1 +/+ 267/08 A_14_P200736 17344437 17344496 5p15.1 -/+ 17,7

A_14_P110311 17766484 17766543 5p15.1 +/+ 249/08 A_14_P110311 17766484 17766543 5p15.1 -/+ 18,1

A_14_P127446 18134678 18134737 5p15.1 +/+ 297/08 A_14_P101692 1515936 1515995 5p15.33 +/+ 18,6

A_14_P136699 1536518 1536572 5p15.33 -/+ A_14_P127859 19991458 19991517 5p14.3 -/+

A_14_P101747 20142768 20142827 5p14.3 +/+ 278/08 A_14_P138430 2807528 2807577 5p15.33 +/+ 20,6

A_14_P124689 2945220 2945279 5p15.33 -/+ A_14_P132243 23153696 23153755 5p14.3 -/+

A_14_P129554 23419181 23419240 5p14.3 +/+ 269/08 A_14_P134968 22727449 22727508 5p14.3 -/+ 22,9

A_14_P119871 22889350 22889409 5p14.3 +/+ 281/08 A_14_P200722 23559985 23560043 5p14.2 -/+ 24

A_14_P103553 24037372 24037431 5p14.2 +/+ 309/08 A_14_P201844 24224207 24224266 5p14.2 -/+ 24,4

A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 +/+ 284/08 A_14_P201844 24224207 24224266 5p14.2 -/+ 24,4

A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 +/+ 255/08 A_14_P201844 24224207 24224266 5p14.2 -/+ 24,4

A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 +/+ 261/08 A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 -/+ 24,5

A_14_P108371 24541015 24541074 5p14.2 +/+ 292/08 A_14_P123255 24680502 24680561 5p14.2 -/+ 25,1

A_14_P127802 25139934 25139993 5p14.2 +/+ 289/08 A_14_P136027 25710449 25710508 5p14.1 -/+ 26,1

A_14_P126855 26103823 26103882 5p14.1 +/+ 247/08 A_14_P138753 27866713 27866772 5p14.1 -/+ 28,4

A_14_P138753 28429673 28429732 5p14.1 +/+ 252/08 A_14_P109209 29643229 29643288 5p13.3 -/+ 29,9

A_14_P128000 29938708 29938767 5p13.3 +/+ 264/08 A_14_P128000 29938708 29938767 5p13.3 -/+ 30,2

A_14_P125148 30184899 30184958 5p13.3 +/+ 272/08 A_14_P126621 31520769 31520828 5p13.3 -/+ 31,6

A_14_P108810 31571583 31571642 5p13.3 +/+ 300/08 A_14_P108810 31571583 31571642 5p13.3 -/+ 31,6

A_14_P138712 31586121 31586180 5p13.3 +/+ 287/08 A_14_P136644 32266165 32266222 5p13.3 -/+ 32,3

A_14_P133059 32277940 32277999 5p13.3 +/+ 259/08 A_14_P200135 34079335 34079393 5p13.3 -/+ 34,4

A_14_P123756 34361110 34361169 5p13.3 +/+ 257/08 A_14_P200970 36644850 36644909 5p13.2 -/+ 36,6

A_14_P109135 36645053 36645112 5p13.2 +/+

NGS?

BIOLOGI MOLECOLARI CITOGENETISTI

Array-CGH

SEQUENZIAMENTO

GENE

GENE sequenze di 4 NUCLEOTIDI A,C,G,T che si alternano CODICE TRADUZIONE PROTEINA

SEQUENZIAMENTO SANGER analizzo un gene alla volta

ACGT

2010 Next Generation Sequencing fino a tutto il genoma

NGS

POSSIAMO SEQUENZIARE:

-  pannelli genici di malattie note

Cardiomiopatia ipertrofica (19 geni)

Encefalopatie epilettiche (21 geni)

- esoma

- genoma

NGS e CdC

•  Fenotipi atipici complessi

•  Pannello genico 5p

•  Esoma

•  Esoma + filtro bioinformatico

NGS

ESOMA CROMOSOMA X:

-1.805 geni

- 1.200 OMIM

RISULTATO:

- 250 varianti 3 varianti per soggetto

1964 2014

CAMPIONI BIOLOGICI RACCOLTI: 115 DNA

75 PBL (linfociti separati)

73 LCL (linee linfoblastoidi)

54 LIL-2 (linfociti T attivati con IL-2)

3 Liquidi amniotici (amniociti)

Famiglie Maura Masini Paola Cerruti Mainardi Andrea Guala

Franca Dagna Bricarelli Mauro Pierluigi Simona Cavani Domenico Coviello Chiara Viaggi Guido Zerega

Chiara Baldo Valeria Viotti