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DIAGNÓSTICO PRENATAL NOINVASIVO

MÓDULO 3: DIAGNÓSTICO PRENATAL

TÍTULO DE EXPERTO UNIVERSITARIO EN MEDICINA GENÉTICA Y GENÓMICA 2019

Material didáctico: Módulo 3-Clase 2

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DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO

Material didáctico: Módulo 3 - Clase 2

MÓDULO 3: DIAGNÓSTICO PRENATAL

ASIGNATURA 3.2- DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO.

Dra. Patricia Gómez

1. ACTUALIZACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO.......................1

2. CRIBADO PRENATAL NO INVASIVO............................................................................................3

3. RECOMENDACIONES ACTUALES PARA EL USO CLÍNICO............................................................ 5

3.1 Introducción....................................................................................................................... 5

3.2 Recomendaciones actuales................................................................................................ 7

ANEXO I. PREGUNTAS................................................................................................................... 9

Título de Experto Universitario en Medicina Genética y Genómica 2019 Página 0



1. ACTUALIZACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO

En el siglo XXI, en las sociedades desarrolladas nos planteamos la vida de manera que tenemos que tener unos estudios, luego una pareja, un trabajo, etc. Cuando ya estamos establecidos el último paso es tener un hijo, que esperamos que sea sano y feliz. Como consecuencia de todo esto se retrasa la maternidad, los bebés son altamente deseados, se generan grandes expectativas entorno a ellos y existe muy poca tolerancia a cualquier tipo de desviación. Uno de los defectos más prevalentes es la trisomía del cromosoma 21, que como sabemos está asociado con la edad materna, la edad paterna también influye en otras anomalías. En diagnóstico prenatal es muy importante tener toda la información sobre los riesgos y las alternativas antes de actuar.

En nuestra sociedad actual hay muy pocas pandemias infecciosas y los antibióticos y vacunas son muy eficaces. Esto hace que los defectos congénitos cobren una gran importancia, convirtiéndose en la primera causa de morbimortalidad. El nivel de desarrollo de un país se puede medir por las tasas de prevención.

Los defectos congénitos son alteraciones que afectan al desarrollo del embrión o del feto y que se manifiestan a lo largo del embarazo, en el nacimiento o durante los primeros meses de vida. Un 3-4% de niños presentan defectos congénitos en el momento del nacimiento. De estos, un 10-15% presentan anomalías cromosómicas, un 2-10% tienen enfermedades monogénicas, un 20-25% sufren una enfermedad multifactotial, un 8-12% han sufrido exposición prenatal a teratógenos y en el 40-60% de los casos las causas son desconocidas (diapositiva 8). Si a esto le sumamos los casos que se identifican durante los primeros añosde vida, la frecuencia puede llegar al 7%.

En la diapositiva 9 se muestra un estudio en el que se ve que de todos los defectos congénitos de causa cromosómica, el 53% corresponden a la trisomía del cromosoma 21 (síndrome de Down), el 16% es de origen desconocido, el 13% corresponde a la trisomía del cromosoma 18, el 5% a la trisomía del cromosoma 13 y el resto a anomalías de los cromosomas sexuales. El síndrome de Down es el más prevalente, y se estudia de forma rutinaria junto con las trisomías de los cromosomas 13, 18, X e Y.

DIAPOSITIVAS 4-9

El diagnóstico prenatal es un conjunto de acciones clínicas que tiene como fin diagnosticar antes del parto cualquier anomalía congénita. Sus objetivos son:

1) Detectar precozmente una patología tratable pre o post-natalmente.2) Identificar una patología grave para interrupción voluntaria del embarazo (IVE).3) Preparar a los progenitores para las necesidades del niño, una vez nacido.




En la actualidad se hacen diversos controles durante todo el embarazo:

- en las semanas 9-13, se lleva a cabo un cribado bioquímico. Se evalúan los valores de B-HCG y PAPPA. Dependiendo de si el valor de estas hormonas está aumentado o disminuido con respecto a la mediana poblacional, se puede sospechar una anomalía del cromosoma 21, 18 o 13.

- en las semanas 11-13, se hace una ecografía donde se mide la translucencia nucal, si esta se encuentra alterada, puede indicar una alteración cardíaca o de una aneuploidía. En los fetos con un riesgo intermedio se miden también otros marcadores como la presencia o ausencia del hueso nasal, ductus venoso y la insuficiencia tricuspídea. Si se detecta alguna alteración en estos marcadores se clasifica como de alto riesgo.

- las dos pruebas anteriores junto con la edad materna constituyen el cribado combinado del primer trimestre. Y las dos pruebas anteriores junto con el test prenatal no invasivo, son pruebas no invasivas, que no comportan ningún riesgo ni para la madre ni para el feto.

- si está indicado, en el primer trimestre se puede hacer una prueba invasiva diagnóstica que es el análisis de las vellosidades coriales. Esta prueba se hace en las semanas 10-13 a partir de células de la placenta, y permite conocer el riesgo de aneuploidía. Al ser una técnica invasiva conlleva un riesgo de pérdida fetal de 1-2%.

- en la semanas 15-20 se lleva a cabo otro cribado bioquímico. En el que se evalúa los niveles de Alfa-FP, Estriol e inhibina A.

- entorno a la semana 20 se hace la ecografía morfiológica llevada a cabo por especialistas. Se visualizan todos los órganos para ver si hay alguna malformación.

- en el segundo trimestre si está indicado se puede hacer una prueba invasiva que es la amniocentesis. Se realiza en las semanas 15-20, analizando las células del líquido amniótico. En este caso el riesgo de pérdida fetal es de 1%.

- en el tercer trimestre se realiza una ecografía entorno a la semana 30. Aquí se mira el estado de la placenta, la cantidad de líquido amniótico, si hay alguna malformación tardía, además de la posición del feto y del cordón umbilical para preveer el parto.

El objetivo del cribado prenatal principalmente es identificar embarazos con riesgo de síndrome de Down y otras aneuploidías. La tasa de detección es del 85%, con un 0.5-9% defalsos negativos y un 5-10% de falsos positivos. Se hace entorno a la semana 12 de embarazo, y se calcula mediante la combinación del cribado bioquímico, la ecografía de la semana 12 y la edad materna. En España se ha establecido un límite de 1/270 a partir del cual se considera que el riesgo es alto. Cuando se supera, se llevan a cabo pruebas invasivas que son las que determinarán el diagnóstico prenatal. Sabemos que las pruebas invasivas suponen un riesgo de pérdida fetal que se estima en 1/250, por eso solo se pueden aplicar en los casos en que el beneficio sea mayor que el riesgo. Por esta razón se han buscado técnicas no invasivas que supongan un mínimo riesgo para el feto, con altas tasas de detección, bajas tasas de falsos positivos y que se puedan utilizar de forma extensiva para toda la población.




DIAPOSITIVAS 10-13

2. CRIBADO PRENATAL NO INVASIVO

Se sabía que hay células fetales en la sangre materna y ahora se sabe que también hay ADNfetal libre. A medida que el embrión va evolucionando hay tejidos que se van eliminando, y el ADN de estas células llega al torrente sanguíneo materno. En 1990 ya se aislaron eritrocitos fetales de la sangre materna. El objetivo final es poder aislar el ADN fetal de unamuestra de sangre de la madre para el cribado de aneuploidías. Ahora ya casi no se utilizanlas células fetales porque la proporción es de 1 célula fetal por cada millón de células maternas, y las técnicas para aislar estas células con inconsistentes y de bajo rendimiento. Lo que se utiliza es el ADN fetal libre en sangre materna que tiene las siguientes características:

- hay un 3-10% de este ADN en plasma y en suero materno.- su proporción es mayor que el número de células fetales en sangre materna.- procede principalmente de células del trofoblasto de la placenta.- puede detectarse a partir de la semana 5 de embarazo y va aumentando en el transcurso del embarazo (3% en estadios tempranos y 6-10% al término).- desaparece extremadamente rápido tras el nacimiento. La vida media de este ADN es de 16.3 minutos, siendo indetectable en 2 horas.- es directamente proporcional a la edad gestacional e inversamente proporcional al peso de la madre.Como se ve en la diapositiva 20, a medida que progresa el embarazo la fracción de ADN fetal en sangre materna va aumentando, mientras que a medida que aumenta el peso de la madre esta fracción fetal va disminuyendo. Esto se debe a un efecto dilucional, porque cuanto mayor es el peso de la madre, hay una mayor cantidad de ADN materno que hace que el ADN fetal se encuentre más diluido.

Al principio el cribado fetal no invasivo se usaba para la determinación del sexo fetal, mediante la detección del gen SRY por PCR a tiempo real. Este tipo de análisis está indicado para embarazadas portadoras de alguna patolología asociada al cromosoma X. Si en este caso se analiza el sexo y es femenino se evita tener que hacer una técnica invasiva, porque sabemos que el feto tiene un 50% de posibilidades de ser portador, pero no será afecto. En cambio si el sexo es masculino, se plantearía una técnica invasiva porque la probabilidad de ser afecto es del 50%.

Esta técnica también se ha utilizado para la detección de mutaciones puntuales de origen paterno.

Para la detección de aneuploidías se intentó utilizar la PCR a tiempo real, pero la sensibilidad no es suficiente. Con las técnicas de secuenciación masiva se ha podido empezar a hacer el cribado prenatal de aneuploidías en sangre materna.




DIAPOSITIVAS 15-21

Hoy en día con la secuenciación masiva podemos secuenciar millones de fragmentos a la vez, cada vez con mayor sensibilidad y menor coste. En el 2011 Nikolaides y Lo publicaron un artículo en el que habían utilizado las técnicas de secuenciación masiva para detectar la trisomía del cromosoma 21 en la sangre materna. En 2013 publicaron el resultado de varios estudios que habían hecho para detectar las principales aneuploidías en sangre materna, en los que obtenían una tasa de detección del 100%. Ahora sabemos que las tasasde detección no son tan altas.

Para el análisis se utilizan dos técnicas basadas en NGS:

- Secuenciación dirigida: se seleccionan fragmentos específicos por PCR. Se pueden seleccionar regiones no polimórficas a lo largo de todo el cromosoma (Ariosa) o SNPs polimórficos (Natera).

- Secuenciación completa (Sequenom, Verinata, BGI): se secuencian todos los fragmentosobtenidos.

En la diapositiva 27 se muestra un esquema de como se hace el análisis del cribado prenatal no invasivo. La mayoría de tecnologías utilizan la secuenciación Shotgun de todo el genoma y después se cuentan las secuencias que hay de más respecto al total de secuencias del genoma. Ariosa y Natera utilizan la secuenciación dirigida. Solo secuencian las regiones de los cromosomas que nos interesan (cromosomas 21, 18 ,13, X e Y). Las dos técnicas se están equiparando en cuestión de precios, porque secuenciar todo es cada vez más barato.

En la secuenciación dirigida se eligen los fragmentos que queremos analizar, en este caso los de los cromosomas 21, 18, 13, X e Y. Hay una técnica basada en SNPs, que por una parteanaliza los SNPs de la madre y por otra los SNPs de la madre y el feto juntos. Después la fracción fetal se calcula restando los SNPs maternos, así solo nos quedarán los del feto (diapositiva 29). Esto permite el genotipado, se ven bien las alteraciones en el número de copias para detectar trisomías. Los SNPs informativos son los que son diferentes en la madre y en el feto, y por tanto nos permiten diferenciar el ADN materno del fetal (diapositiva 29).

En la secuenciación completa se secuencian todos los fragmentos de ADN obtenidos de la sangre materna. No hace falta fragmentar porque el ADN fetal ya son fragmentos pequeños. A partir de aquí se llevaba a cabo el método de contaje. Mediante procesos bioinformáticos se comparan los fragmentos que hay para cada cromosoma de la muestra con lo esperado en una población normal. Si el resultado de la ecuación de la diapositiva 31 es 1, lo que se ha encontrado es lo esperable, mientras que si el resultado es mayor o menor de 1, es que probablemente existe una aneuplooidía. Por otro lado se calcula la fracción fetal mediante marcadores con metilación diferencial entre la madre y el feto. Por




ejemplo, si obtenemos una fracción fetal del 5%, quiere decir que de 100 moléculas de ADN obtenidas de la sangre materna solo 5 serán del feto. Si analizamos el cromosoma 21, en un feto sano encontraríamos 200 moléculas, de las que 10 serían del feto y 190 de la madre. En un feto con aneuploidía se encontrarían 205 moléculas, de las que 190 serían dela madre y 15 del feto

DIAPOSITIVAS 22-31

En la diapositiva 32 se muestra un ejemplo de un informe de un test prenatal no invasivo. En primer lugar hay un resumen de los resultados más importantes. En este caso el feto es masculino, de bajo riesgo y con una fracción fetal del 15%. Como aquí se ha llevado a cabo la técnica de contaje los resultados son compatibles con que el feto tenga dos copias de cada uno de los cromosomas estudiados.

La fracción fetal es un parámetro importante, porque es lo que nos garantiza que lo que estamos analizando es el ADN del feto y no el de la madre. En un principio no todos los laboratorios informaban de la fracción fetal, actualmente es un requisito para todos los informes. En el estudio de la diapositiva 33 se enviaron muestras de mujeres no embarazadas a diferentes laboratorios que llevaban a cabo NIPT y se vio que solo los laboratorios que informaban de la fracción fetal dijeron que esta no era suficiente para poder informar del resultado. El resto de laboratorios dieron un resultado normal, sin alteraciones cromosómicas de sexo femenino.

Ahora existen guías de práctica clínica sobre como se tienen que hacer los análisis y los informes.

DIAPOSITIVAS 32 Y 33

3. RECOMENDACIONES INTERNACIONALES PARA EL USO CLÍNICO

3.1 Introducción

En la diapositiva 35 se muestran las recomendaciones del Colegio Americano de Ginecología y Obstetricia para el cribado prenatal hasta el 2007. Con este esquema se llegaba a una tasa de detección del 95%, con una tasa de falsos positivos del 5%. A nivel de cribado es aceptable, teniendo en cuenta el bajo coste de las ecografías y los estudios bioquímicos, es fácil de interpretar y se puede aplicar a toda la población.En mayo de 2016 salieron unas nuevas recomendaciones (diapositiva 37). Con las técnicas de análisis de ADN libre circulante se obtienen unas tasas de detección superiores al 99%




y unas tasas de falsos positivos inferiores al 0,5%. La única limitación es su coste. Pero teniendo en cuenta que el número de falsos positivos es menor también disminuyen el número de pruebas invasivas que se tendrían que hacer.En el artículo de la diapositiva 38 se muestra como en la población de Estados Unidos el cribado prenatal no invasivo es coste-eficaz, porque comparado con el cribado combinado del primer trimestre:

- Identifica un 15% más de casos de trisomía- Reduce el uso de procedimientos invasivos en un 88%- Reduce las pérdidas fetales de gestaciones no afectadas en un 94%- Permite ahorrar entre 453-550$ por test

Las conclusiones son

- Aunque el uso del NIPT es beneficioso, independientemente del riesgo y edad, se recomienda su introducción paulatina siguiendo un modelo de contingencia. Se tiene que ser experto en la técnica para que salga bien.- La implementación del NIPT en poblaciones de riesgo incrementado proporciona grandes beneficios.- A corto plazo, el NIPT como test de primera elección incrementaría los costes.- A medio plazo, el NIPT como test de 1ª elección reduce los costes.

En Europa: - en Reino Unido, Suiza, Francia se puede utilizar el NIPT y el sistema sanitario devuelve parte del coste a la usuaria.- en Dinamarca, Suecia, Italia, Portugal y Finlandia la sanidad pública lo financia para la población de medio-alto riesgo.- en Bélgica, Holanda y Rumanía se está evaluando como test de primera línea.- en España, Alemania, Noruega, etc. está en evaluación. El problema de España es que tenemos 17 sistemas de salud diferentes, uno para cada Comunidad Autónoma. En Aragón y Asturias se usa de manera extensiva, en Galicia y Madrid se lleva a cabo en pacientes con alto riesgo, etc. Es una cuestión de costes, cuanto más pequeña es la población más factible es la implementación.

El enfoque del diagnóstico prenatal ha cambiado. Antes se utilizaba para condiciones letales o asociadas a alteraciones graves (encefalía, espina bífida, etc.), condiciones en las que un amplio número de individuos optarían por una interrupción legal del embarazo (síndrome de Down, etc.) y condiciones que comprometen el bienestar fetal y materno (preeclampsia, etc.). Ahora, además de todo lo anterior, podemos aplicarlo en condiciones en las que una detección precoz nos puede llevar a un mejor manejo clínico prenatal o neonatal y mejorar los resultados (ejemplo: deleción 22q11, que produce cardiopatía y problemas en el metabolismo del calcio. Se puede tratar a nivel fetal.)

DIAPOSITIVAS 35-42




3.2 Recomendaciones actuales

Desde que se empezó a utilizar el test prenatal no invasivo, han ido surgiendo distintas guías clínicas para la utilización de estas nuevas técnicas (diapositiva 43). En 2016 el Colegio Americano de Medicina Genética y Genómica publicó sus recomendaciones

Consideraciones:

- el NIPT reemplazará en breve el cribado convencional de las trisomías 21, 18 y 13 para cualquier edad materna, y de manera precoz (semana 9-10).- en el uso del NIPT para el cribado de alteraciones de los cromosomas sexuales y de microdeleciones o microduplicaciones, la sensibilidad es alta pero la especificidad es baja. Aunque actualmente es la mejor opción que tenemos. El médico tiene que informar al paciente que aunque no se detecte nada en esta prueba, no significa que no lo tenga.- el asesoramiento genético pre y post test es esencial.- el paciente tiene que ser capaz de tomar decisiones, y para ello tiene que estar bien informado.El laboratorio que quiera tener unos criterios de calidad tiene que seguir estas consideraciones, pero si no se siguen no pasa nada. En España tenemos la Ley de Investigación Biomédica, que nos dice que para cualquier estudio genético con utilidad clínica se tiene que dar asesoramiento pre y post test.

Recomendaciones generales

- el NIPT es la opción de cribado que proporciona la mayor sensibilidad para la detección de las aneuploidías más frecuentes (Down, Edwards, Patau).

- ante un resultado de NIPS positivo siempre debe proporcionarse un test diagnóstico.

- los laboratorios deben proporcionar información sobre: tasa de detección especificidad valores predictivos positivo y negativo

Esto es importante porque hay que elegir la mejor técnica en cada caso, si hay un fallo, la responsabilidad es de quien ha elegido la técnica. Normalmente los hospitales eligen la opción más económica, y la responsabilidad la asume el profesional que firma el informe.

- no se recomienda el cribado de otras aneuploidías distintas de la 13, 18 y 21. No se buscan otras, porque si las encontramos no sabremos que determinación tomar. Las demástrisomías normalmente no son compatibles con la vida y se da una pérdida natural del fetodurante el primer trimestre. Si se detectan causarán una angustia innecesaria en la madre.

Recomendaciones para los cromosomas sexuales

- Evitar el análisis del sexo fetal sin indicación clínica. En China o India este dato se está utilizando para hacer una interrupción del embarazo por cuestión de sexo. El médico tiene que ver el uso que se va a hacer de esta información, pero en España estos test se pueden comprar por internet.




- El análisis de los cromosomas sexuales es una opción secundaria. Lo prioritario son las trisomías 21, 13 y 18, pero no hay otra forma de detectar las cromosopatías sexuales. Además hay que tener en cuenta que la mayoría de alteraciones de los cromosomas sexuales se presentan en forma de mosaico y mediante NIPT no se podrán detectar, por tanto si el resultado es negativo, no podemos asegurar que no estén. También hay que contar con que si se detectan resultados positivos no se puede saber el grado de afectaciónque va a tener el bebé.

- Informar del riesgo mayor de falsos positivos al analizar los cromosomas sexuales.

- Ante un resultado de NIPS positivo debe proporcionarse un test diagnóstico.

- Los laboratorios deben proporcionar información sobre la técnica utilizada: tasa de detección especificidad valores predictivo positivo y negativo

DIAPOSITIVAS 43-46

Recomendaciones para las microdeleciones y microduplicaciones

- Informar de que se trata de un test de cribado.

- Informar del riesgo mayor de falsos positivos y falsos negativos que en la detección de las aneuploidías frecuentes.

- Informar de que los resultados pueden causar incertidumbre en el manejo clínico, ya que la penetrancia y la expresividad son variables.

- Ante un resultado de NIPS positivo debe proporcionarse un test diagnóstico.

- Los laboratorios deben proporcionar información sobre la tasa de detección, especificidad, y valores predictivos positivo y negativo.

- No se recomienda el análisis de CNVs en todo el genoma. Se pueden detectar microdeleciones que son solo variantes polimórficas.

El cariotipo permite ver variaciones de hasta 10 Mb, pero las microdeleciones están por debajo de este límite. Las microdeleciones suelen estar asociadas a formas sindrómicas, que suelen ser más graves cuanto mayor sea el fragmento delecionado. Cuantos más valores de secuenciación para cuantificar, más sensibilidad y especificidad se conseguirá.

En la diapositiva 48 se muestra la incidencia de las microdeleciones por cada 100.000 nacidos vivos. Vemos que la deleción 22q11 es más importante que las trisomías 18 y 13. En Estados Unidos se va a incorporar la detección de esta microdeleción en breve. En




España la discusión está en que esta microdeleción puede dar formas graves y leves, si se detecta no se puede asesorar a la pareja de forma eficiente.

A la hora de informar:

- hay que indicar de manera visible la fracción fetal obtenida.

- en el caso de no resultados se debe indicar los motivos. Si es debido a una baja fracción fetal, no hay que informar de manera contundente, además no se recomienda tomar nueva muestra. Hay factores maternos como la obesidad, trasplantes, etc. que afectan a la cantidad de fracción fetal.

- cuando en la cuantificación estadística no se obtiene un dato fiable y no podemos obtenerresultados, tenemos que informar e indicar los motivos.

- En los tests basados en SNPs nos podemos encontrar que no hay resultados debido a la homocigosidad, tenemos que informar de la probabilidad de que haya una disomía uniparental o de que se haya dado consanguinidad.

Otras recomendaciones generales

- ante resultados positivos referir a genetistas cualificados.

- informar sobre la validez del test ante embarazos múltiples o por donación de ovocitos. No todos los tests son igual de efectivos para embarazos múltiples.

- proporcionar alternativas a pacientes con trasplantes de órganos o de médula ósea, que pueden alterar los resultados.

DIAPOSITIVAS 47-50

ANEXO I. PREGUNTAS

P. La extracción de ADN fetal, ¿es una extracción normal o es un procedimiento específico?

R. Es un procedimiento estándar, pero son técnicas que han desarrollado las casas comerciales, cuyo prestigio depende de la eficiencia del test. Estas casas comerciales vigilan que todo el procedimiento se lleve a cabo según sus estándares de calidad. Hay que tener precauciones a nivel de contaminación con el ADN de la madre, que es un 50% idéntico al del feto. Lo que se analiza es el suero porque lo que se está buscando es ADN libre, no celular. El ADN libre en sangre también se puede utilizar para la detección precoz de tumores. En los dos casos se obtiene muy poco ADN, pero en las técnicas de NGS solo necesitan 10 ng. Ahora se utilizan unos tubos especiales para la toma de muestra, que en elmomento en que se introduce la sangre capturan todas las células. De esta manera el ADN




circulante se conserva mejor y de forma más homogénea. Hay muchas tecnologías paralelas que hace que este análisis sea eficiente.


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