Università degli Studi dell’Aquila

Dipartimento MeSVA

Sezione di Scienze Biologiche e Biotecnologiche

………………………………….

…………………………………….

Laboratorio di Istologia

Allestimento di un preparato istologico

L'istologia è la disciplina scientifica che studia la struttura microscopica dei tessuti

vegetali e animali e delle cellule che li compongono, sia da un punto di vista morfologico che

funzionale. Un tessuto è un insieme di cellule più o meno differenziate, specializzate per lo

svolgimento della stessa funzione e che presentano morfologia e struttura simili. Lo studio

istologico di tessuti animali (normali o patologici) riveste un’importanza di primo piano anche

nell’indagine diagnostica, consentendo in molti casi di individuare una malattia (per esempio nel

campo dei tumori), ma anche di valutare l’estensione del processo patologico e di controllarne

l’evoluzione nel tempo. Una tecnica molto diffusa nell’indagine diagnostica, utilizzata in

alternativa o anche in associazione alle comuni colorazioni istologiche, è l’immunoistochimica che

permette l’individuazione altamente specifica di determinati antigeni tissutali o di particolari

marker, all’interno di un dato contesto morfologico.

Strumento essenziale per l'istologia è il microscopio ottico, che permette l'osservazione diretta dei

tessuti che si vogliono studiare. Per poter essere esaminato al microscopio ottico, tuttavia, il

campione deve essere trasformato in una sezione di spessore adeguato; ciò può essere ottenuto

sottoponendo il materiale biologico ad una serie di fasi di preparazione che prevedono la

stabilizzazione (fissazione), la disidratazione, l’inclusione dei pezzi in esame e il sezionamento dei

campioni inclusi. Le sezioni ottenute possono essere sottoposte a colorazioni istologiche standard,

per semplici indagini morfologiche, o a reazioni istochimiche o di immunoistochimica, per indagini

più specifiche.

Una delle metodiche di inclusione più diffuse è quella che prevede l’utilizzo della paraffina, una

miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida a temperature di circa 50-60 °C e che solidifica a

temperatura ambiente. La tabella seguente riassume schematicamente l’intero procedimento.

Passaggio

Scopo Durata

1. Fissazione nei fissativi semplici o composti (formalina, Bouin, Carnoy ecc.)

Stabilizzazione del preparato e conservazione della morfologia e della composizione chimica dei tessuti

1-12 ore (dipende dal fissativo e dalle dimensioni del pezzo)

2. Disidratazione nella serie ascendente degli alcoli (dal 70% al 100%)

Sostituzione dell’acqua dei tessuti con un agente miscibile con i solventi della paraffina

1-12 ore

3. Diafanizzazione in benzene, xilene o toluene

Impregnazione dei tessuti con un solvente della paraffina

1-6 ore

4. Inclusione in paraffina La paraffina penetra in tutti gli spazi 30 min–6 ore

intercellulari e nelle cellule, rendendo i tessuti più compatti e resistenti al taglio

5. Taglio con il microtomo

Permette di ottenere sezioni dello spessore

desiderato (generalmente di 5-10 m)

Variabile (dipende dal numero di sezioni da ottenere)

6. Dissoluzione del mezzo includente e idratazione

Rimozione della paraffina e idratazione delle sezioni, per permettere le successive fasi di colorazione o, eventualmente, procedere con le tecniche di istochimica o di immunoistochimica.

40-60 min

7. Colorazione Contrasta i diversi costituenti del campione permettendone la visualizzazione

1-2 ore

8. Disidratazione nella serie ascendente degli alcoli (dal 70% al 100%)

Sostituzione dell’acqua delle sezioni con un agente miscibile con i solventi della paraffina per la chiusura permanente del preparato

20-30 min

9. Chiusura permanente con balsamo o resine sintetiche (con indice di rifrazione simile a quello del vetro)

Mantiene il preparato inalterato nel tempo, ottimizzando l’osservazione e la registrazione fotografica

Variabile (dipende dal numero di vetrini)

Le tecniche di colorazione sono numerosissime, ciascuna mirata ad ottenere la evidenziazione di

qualche particolarità. Alcuni coloranti possono essere specifici per certe componenti o, perfino,

evidenziare la presenza di enzimi sfruttandone l’attività catalitica (colorazione istochimica).

In questa esperienza verranno eseguite due tipi di colorazioni di comune impiego, utilizzate sia per

tessuti animali che vegetali: la doppia colorazione ematossilina-eosina e la colorazione con blu di

toluidina.

L’ematossilina è un colorante basico che pertanto colora preferenzialmente strutture acide come il

nucleo ricco di DNA, o anche regioni citoplasmatiche ricche di RNA. Conferisce una colorazione

blu-viola. L’eosina, un colorante acido di colore rosso-rosa, colora preferenzialmente il citoplasma.

L’associazione di questi due coloranti conferisce al tessuto un buon contrasto tra nuclei e

citoplasmi ed è in assoluto la metodica più utilizzata per le osservazioni sulla morfologia dei tessuti

animali.

Il blu di toluidina è un colorante cationico che si lega a gruppi carichi negativamente. Una

soluzione acquosa di questo colorante è blu, ma si formano complessi di colori diversi quando il

colorante si lega a gruppi carichi negativamente di diverse macromolecole cellulari. Per esempio,

nei preparati vegetali a fresco è rosso/fucsia quando reagisce con le sostanze pectiche della

parete; verde o blu chiaro quando reagisce con sostanze polifenoliche come la lignina; blu‐verde

quando reagisce con gli acidi nucleici; porpora quando reagisce con le cellule del floema.

Con opportuni accorgimenti, le sezioni in paraffina possono essere utilizzate anche per tecniche di

immunoistochimica, una tecnica che nasce dall’unione di tecniche immunologiche ed

istochimiche, di notevole sensibilità per l’individuazione di specifici componenti cellulari o tissutali.

Tale metodica fa uso di anticorpi che agiscono selettivamente contro un determinato componente

cellulare o tissutale (antigene). Esistono metodiche dirette e indirette. Nelle metodiche dirette si

utilizza un unico anticorpo, diretto contro l’antigene da ricercare, legato ad una molecola che ne

permette la visualizzazione. Nelle metodiche indirette si utilizzano due anticorpi: il primo diretto

contro l’antigene da ricercare e non marcato, il secondo in grado di legarsi al primo e coniugato

con una molecola che ne permette la visualizzazione. Le metodiche più comunemente impiegate

condividono l’impiego di enzimi che agiscono su un substrato e che generano un prodotto di

reazione in grado, a sua volta, di modificare una sostanza colorata (cromogeno) consentendo in

questo modo la visualizzazione della reazione stessa.

L’esercitazione prevede l’impiego di una tecnica indiretta, che utilizza un anticorpo secondario

coniugato con l’enzima perossidasi che, in presenza di un substrato specifico, produce un

precipitato di colore rosso che può essere facilmente identificato al microscopio ottico.

PROTOCOLLO PER LA COLORAZIONE CON BLU DI TOLUIDINA (tessuti animali e vegetali)

Sparaffinatura

- BioClear … … … … … … … 10’ - BioClear …… … … … … … 5’ - Alcol 100° … … … … … … 10’ - Alcol 95° … … … … … … 5’ - Alcol 90° … … … … … … 5’ - Alcol 80° … … … … … … 5’ - H2O distillata … … … … 5’

Colorazione

- Blu di Toluidina … … … … 5’ - H2O distillata … … … … … 1’ - H2O distillata … … … … … 1’

Disidratazione

- Alcol 70° … … … … … … … 1’ - Alcol 80° … … … … … … … 1’ - Alcol 95° … … … … … … … 1’ - Alcol Assol. … … … … … … 3’ - Alcol Assol. … … … … … … 3’ - Bio-Clear … … … … … … ... 5’

Montaggio in resina sintetica (EUKITT)

(lasciare asciugare in termostato a 40°C per un giorno).

PROTOCOLLO PER LA COLORAZIONE CON EMATOSSILINA-EOSINA (tessuti animali)

(Ematossilina = Emallume acido di Mayer)

Sparaffinatura

- BioClear … … … … … … … … 10’ - BioClear …… … … … … … … 5’ - Alcol 100° … … … … … … … 10’ - Alcol 95° … … … … … … … 5’ - Alcol 90° … … … … … … … 5’ - Alcol 80° … … … … … … … 5’ - H2O distillata … … … … … 5’

Colorazione

- Emallume Acido di Mayer … 5’ - H2O di fonte … … … … … … 5’ - H2O distillata … … lavaggio rapido - Eosina 0.5 % in H2O … … … 2’

- H2O distillata per lavaggio

Disidratazione

- Alcol 70° … … … … … … … … 1’ - Alcol 80° … … … … … … … … 1’ - Alcol 95° … … … … … … … … 1’ - Alcol Assol. … … … … … … … 3’ - Alcol Assol. … … … … … … … 1’ - Bio-Clear … … … … … … ... … 5’

Montaggio in resina sintetica (EUKITT)

(lasciare asciugare in termostato a 40°C per un giorno).

RISULTATO: nuclei blu scuro, citoplasma rosa con sfumature più o meno intense: fibre muscolari rosa scuro tendente al rosso, globuli rossi arancio-rosso.

PROTOCOLLO PER L’IMMUNOISTOCHIMICA (tessuti animali)

(Localizzazione del recettore per le asialoglicoproteine)

1. Sparaffinatura e idratazione delle sezioni come da protocollo

- BioClear … … … … … … … … 10’ - BioClear …… … … … … … … 5’ - Alcol 100° … … … … … … … 10’ - Alcol 95° … … … … … … … 5’ - Alcol 90° … … … … … … … 5’ - Alcol 80° … … … … … … … 5’ - H2O distillata … … … … … 5’

2. Estinzione della perossidasi endogena

- 0.3% H2O2 in PBS (30 min al buio)

3. Lavaggio in PBS (10 min)

4. Blocco dei siti aspecifici con BSA 4% in PBS

5. Incubazione con anticorpo primario (1 h a temperatura ambiente)

6. Lavaggio in PBS (20 min)

7. Incubazione con anticorpo secondario marcato con perosssidasi (1 h a temperatura ambiente)

8. Lavaggio in PBS (20 min)

9. Sviluppo della reazione colorimetrica

10. Controcolorazione con ematossilina

- Emallume Acido di Mayer … 5’ - H2O di fonte … … … … … … … 5’ - H2O distillata … … lavaggio rapido

11. Disidratazione

- Alcol 70° … … … … … … … … … 1’ - Alcol 80° … … … … … … … … ... 1’ - Alcol 95° … … … … … … … … … 1’ - Alcol Assol. … … … … … … … …3’ - Alcol Assol. … … … … … … … …3’ - Bio-Clear … … … … … … ... … … 5’

12. Chiusura dei preparati in resina sintetica

Materiale e reagenti occorrenti

Campioni biologici animali o vegetali, anche da archivio Paraffina (50°C) Basi e anelli per inclusione Fornetto (50-60 °C) Piastra termostata 37-40°C Vetrini portaoggetto e coprioggetto Pinzette da istologia Microtomo Lame per microtomo Pennelli Vaschette per la colorazione Pasteur di vetro o bacchette di vetro Carta da banco Vassoi porta vetrini Istofix (fissativo a base di formalina tamponata)

Tampone fosfato salino (PBS) BioClear Etanolo 96° Etanolo 100° Eosina Y Ematossilina Eukitt Acqua distillata Albumina glicerinata Anticorpo primario diretto contro …. Anticorpo secondario coniugato con perossidasi Substrato per la perossidasi H2O2 Albumina del siero bovino (BSA)