• Dr. J. Galon

• Matthieu CAMUS

INSERM U255Dirigée par : Pr. H. FridmanCentre des CordeliersParis VI

Outils Bioinformatiquespour l‘Analyse du

Microenvironnement Tumoral

Lymphocytes T Régulateurs,Lymphocytes B, NK, Macrophages …Lymphocytes T Régulateurs,Lymphocytes B, NK, Macrophages …

Cellules présentatrices d’AntigènesCellules présentatrices d’Antigènes

Lymphocytes TEffecteurs

Lymphocytes TEffecteurs

Cytokines

Facteurs de croissance

Chemokines

Immunologie des TumeursImmunologie des Tumeurs

Cellule Dendritique

Micro-Environnement Tumoral

-> analyses à Large-échelle pour l’étude des cellules infiltrantes

Stroma

Background

Tumeur

FACS Phenotype Data (n=820)

FACS Functional Data (n=980)

DNA MicroArrays (n=12000)

CIPHERGEN CollaborationSELDI-TOF (proteomic)

Colon cancer : Approaches

parameters patients

10

950

12000

10ALPHELIS CollaborationTissue MicroArrays (TMA)(1 marqueur cellulaire, deux régions)

APPLIED CollaborationTaqman PCR LDA (n=48)

• Base de données (autorisation/authentification/CNIL)

• Gestion des données cliniques

• Gestion des données biologiques et expérimentales

• Modules de connections aux appareils de laboratoire

• Requêtes multicritères (listing, analyse)

• Connections aux autres bases (MARS, publiques)

• Connections aux logiciels d’analyse (Genesis, PathwayExporer)

• Modules d’analyses et statistiques

14.12.2005By B. Mlecnik & R. Molidor

V1.5.2

(+ 20 versions)

-> 1221 patients inclus

-> plus de 500 000 paramètres

Clinical info

Materialinfo

(autorisation/authentification/CNIL)

Connection

PhAnS

FAnS

Pathways OntologyPubmedMARS

Databases

ClueGO

Knowledge Explorer

ARACNe mapper

QueryPathway Explorer

Software

Genesis

Stats

DATA

TME

v.1.5.2 14/12/2005

Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents)

Acquisition (cytomètre)

Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db)

Analyses Statistiques (StatView, Excel)

Clustering Marqueurs/Patients (Genesis)

Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents)

Acquisition (cytomètre)

Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db)

Analyses Statistiques (StatView, Excel)

Clustering Marqueurs/Patients (Genesis)

Exemple: Analyses FACSExemple: Analyses FACS

CD3

CD8

SSC

CD3

Analyses FACSAnalyses FACS

(%)(MFI)

(forme)

PhAnS2

Flow cytometry

TME

PHENOTYPIC ANALYSIS

Tri et stockage des données FACSTri et stockage des données FACS

416 paramètres

Global representation of clustered marker expression values (% and MFI)

616 parameters

39 patients

100

104

0

1

%

MFI

Genesis software

-2 +2

Patients (C) Non-tumoral

Principal Componant Analysis(PCA)

Patients (A) colon cancer

Patients (B) colon cancer

Healthy donnors

Healthy donnors (in vitro stimulation)

Représentation et analyse des données FACSReprésentation et analyse des données FACS

Vers de nouvelles approches d’analyse globale

1) Nouvelles méthodes de visualisation de groupes fonctionnels

• Intégration aux voies de signalisation (PathwayExplorer)• Intégration aux données d’ontologie (ClueGO)

2) Analyse des réseaux d’interactions

• Analyse de reconstruction de réseau cellulaire (ARACNe)• Analyse des interactions positive et négatives indirectes

3) Intégration automatique de la connaissance aux données

• Cartographie de la bibliographie (KnowledgeExplorer)

(15 millions d’articles scientifiques) • Analyse en réseau de prédiction

Analyses BioinformatiquesAnalyses Bioinformatiques

ARACNe (algorithm for the reconstruction of accurate cellular networks) Nat Genet. 2005 (4):382-90. Reverse engineering of regulatory networks in human B cells.

Basso K, Margolin AA, Stolovitzky G, Klein U, Dalla-Favera R, Califano A.

Cancer Colorectal

4ème cause de décès dans le monde(environ 500.000 décès par an)

Un des cancers les plus fréquents

Incidence Accrue (+40% ces 20 dernières années)

Background

Le rôle de l’infiltrat immunitaire dans le contrôle

des étapes précoces de l’invasion métastatique (VELIPI)

est peu connu chez l’homme

et pourrait avoir un impact important

sur le devenir clinique des patients.

VELIPI :venous emboli (VE)lymphatic invasion (LI)perineural invasion (PI)

Observations PréliminairesAnalyses univariées de survie sur la population de patients

(n = 959):

VELIPI est un puissant facteur pronostic (p<10-9)

0 25 75 125 175 225

Survival (months)

0

20

40

60

80

100O

vera

ll S

urv

ival (%

)

[VELIPI ]=yes

[VELIPI ]=no

Première QuestionPremière Question

Quelles sont les différences quantitatives et qualitatives

de l’infiltrat immunitaire entre les patients présentant

des signes précoces d’invasion métastatique (VELIPI+)

par rapport aux patients VELIPI-?

Analyses de coupes de tissus

Analyses FACS

Analyses PCR (Applied-Biosystems).

TUMEUR

Les patients VELIPI- presentent une fréquence accrue

d’infiltrat immunitaire fort par rapport aux patients VELIPI+.

Coupes de Tissus

n=377

FACS : Cellules TotalesFACS : Cellules Totales

0

5

10

15

20

25

CD3+ CD14+ CD19+ CD56+CD3-

CD3+CD56+

CD45+CD1a+

P<0.05

VELIPI +

VELIPI -

*

% p

ositi

ve c

ells

Diminution significative de l’infiltrat lymphocytaire T chez les patients VELIPI+.

n=39

Taqman LDA

Reponse Immunitaire Adaptadive

Les patients VELIPI-/récidive- présentent

des réponses immunitaires adaptative plus fortes

Sp

ec

ific

ge

ne

/18

S

RN

A (

%)

IFN-g

0

200

400

600

+ + - -

+ - + -

VELIPI

Relapse

CD8a

0

100

200

300

+ + - -

+ - + - + - + -

+ + - -

GZM-B

0

200

400

600

GNLY

0

200

400

600

800

+ + - -

+ - + -

p<0.05

n = 75

Conclusions 1Conclusions 1

Corrélation entre les réponses immunitaires adaptatives

conduites par les lymphocytes T CD8 effecteurs

et

les patients VELIPI- qui ne subiront pas de rechute.

Diminution significative de l’infiltrat (lymphocytes T)

chez les patients VELIPI+ par rapport aux patients

VELIPI-.

Seconde questionSeconde question

Les lymphocytes T effecteurs et effecteurs-mémoires

sont-ils directement impliqués dans le contrôle des

évènement métastatiques précoces?

Analyses FACS

Analyses des Tissue MicroArrays (TMA)

VELIPI - VELIPI +

p<0.05

Marqueurs d’expression significativement differencielle (p<0.05)Entre les patients VELIPI- et VELIPI+

FACSFACS

CD45RO

Mémoire

2 zones représentative du centre de la tumeur sont forées à partir de blocs de tissus inclus en paraffine

Les carottes sont déposées dons un bloc récepteur, ensuite découpépour effectuer des analyses immunohistochimiques (IHC).

Tissue MicroArrays (TMA)

CD45RO

=> 6640 IHC

CD45RO

Analyse de spots de tissus tumoraux par Immunohistochimie

(Spot Browser®, ALPHELYS)

Tissue MicroArrays (TMA)

Tissue

CD45RO

TMA (n=415)

0 40 80 120 160

Survival (months)

CD45RO-hi

CD45RO-lo

p<0.0001

% S

urv

iva

l

0

20

40

60

80

100

Différences significatives de survie des patientsen fonction de la densité (hi/lo)

des lymphocytes T CD45RO+ mémoires infliltrés.

Conclusions 2Conclusions 2

Cette étude à large-échelle

indique un role positif des

lymphocytes T effecteurs-mémoires

dans le contrôle local de l’invasion métastatique

et le devenir clinique des patients.

Conclusions Finales

• Réseau Multidisciplinaire, approches, techniques,

et bioinformatique : fonctionnel et efficace

• Validation du concept et de sa faisabilité

La nature et la densité de l’infiltrat immunitaire influencent les processus

métastatiques précoces et le devenir cliniquedes patients atteint de cancers colorectaux.

fonctionnalité des lymphocytes infiltrant les tumeurs

(activation, proliferation et migration)

PerspectivesPerspectives

Quelle est l’importance de la

coordination de la réponse immunitaire

sur le pronostic clinique?

1)

2)

Equipe (INSERM U255, Cordeliers)

• Jérôme GALON, (CR)• Franck PAGES, (MCU-PH)

• Anne COSTES, (Assistante-Ingénieur)• Aurélia RODI, (Technicienne)• Matthieu CAMUS, (4ième année thèse)• Amos KIRILOVSKY, (1ière année thèse)• Marie TOSOLINI, (1ière année thèse)• Pauline BERGER, (Stage Technicienne)• Nicolas GOUGELET, (Stage Technicien)

• Wolf-Hervé FRIDMAN (PU-PH)

Bioinformatic Laboratory (Graz)

• Robert MOLIDOR, (PostDoc)• Bernhard MLECNIK, (Thèse)• Thomas RAMSAUER, (Master)• Fatima SANCHEZ-CABO (PostDoc)

• Zlatko TRAJANOSKI (PU)

Departement de Chirurgie Digestive(HEGP)

• Anne BERGER (PU-PH)• Paul-Henri CUGNENC (PU-PH)

Collaborations Industries

• Applied-Biosystems (TaqMan-LDA)• Ciphergen (SELDI-TOF protéomic)• Alphelys (TMA)• SISPIA (Informatics)

Merci!Merci!

jerome.galon@u255.bhdc.jussieu.fr

jerome.galon@u255.bhdc.jussieu.fr