Espectrofotômetro

Faculdade de BiomedicinaDisciplina de Instrumentação Laboratorial

Exemplo de laudo de glicemia:

Glicemia valor de referência190 mg/dL 70 a 99 mg/dL

Onda de luz

T = transmitância Po = quantidade de luz monocromática incidente

A = Absorbância P = quantidade de luz monocromática transmitida

Lei de Lambert-Beer

Componentes do Espectrofotômetro

• Fonte de luz estável• Filtro que permite a passagem de um

comprimento de onda específico• Cubeta de leitura da amostra• Fotodetector• Processador• Tela de leitura das medidas

Componentes

Fonte de luz

• Tungstênio: fornece luz no espectro visível• Deutério: fornece luz na faixa de UV.• Xenônio: forncece luz no espectro visível e UV.

FiltrosPré-amostra

O filtro está posicionado entre a fonte de luz a e amostra.

Pós-amostraO filtro ou prisma está posicionado entre a amostra e o fotodetector.

Prisma

Cubetas de leituraDevem ser de material transparente para os comprimentos de onda utilizados.

Para o espectro UV (que lê comprimentos de onda < 350 nm) as cubetas devem ser feitas de sílica ou quartzo. Para os comprimentos de ondas visíveis pode ser de material plástico ou vidro.

Normalmente tem 1 cm de largura (path length).

Devem ser muito bem limpas e secas após o uso.

Cubetas para leitura

Cubetas

Fotodetector• Fotomultiplicador

Fótons da onda eletromagnética do comprimento de onda estudado excitam os elétrons da última camada dos metais presentes no fotomultiplicador, criando uma corrente elétrica que pode ser amplificada e quantificada.

Fotomultiplicador

Espetrofotômetro

Espectrofotômetro

Espectrofotômetro cobas modular (Roche)

GeneQuant para amostras de DNA e RNA

Espectrofotômetro Nanodrop para amostras de DNA e RNA

Gráfico de uma análise espectrofotométrica de DNA

Quantificação de DNA ou RNA

Por definição, uma unidade de absorbância a 260 nm equivale a uma concentração de 50 ug de DNA por mL.

Para RNA uma unidade de absorbância em 260nm equivale a uma concentração de 40 ug/mL