MALATTIE GENOMICHE: MALATTIE GENOMICHE: MECCANISMI MOLECOLARI MECCANISMI MOLECOLARI E CONSEGUENZE E CONSEGUENZE FENOTIPICHEFENOTIPICHE

Dott.ssa Francesca AmatiDott.ssa Francesca AmatiSezione di GeneticaSezione di Genetica

Dip. Biopatologia e Diagnostica per ImmaginiDip. Biopatologia e Diagnostica per ImmaginiUniversità Tor Vergata RomaUniversità Tor Vergata Roma

Malattie genomicheMalattie genomiche(Genomic disorders)(Genomic disorders)

Questa definizione è stata coniata da Questa definizione è stata coniata da Lupski (Trends Genet, 1998) per Lupski (Trends Genet, 1998) per

descrivere la perdita o l’acquisto di descrivere la perdita o l’acquisto di una specifica regione cromosomica una specifica regione cromosomica che si associa tipicamente ad una che si associa tipicamente ad una

sindrome genetica.sindrome genetica.

Malattie genomiche (genomic Malattie genomiche (genomic disorders)disorders)

un gruppo di malattie genetiche un gruppo di malattie genetiche umane causate da riarrangiamenti umane causate da riarrangiamenti del genomadel genoma

questi riarrangiamenti coinvolgono questi riarrangiamenti coinvolgono segmenti di DNA di dimensioni segmenti di DNA di dimensioni variabili da poche Kb a parecchie Mbvariabili da poche Kb a parecchie Mb

All’interno di questi segmenti si All’interno di questi segmenti si trovano geni dosaggio-sensibilitrovano geni dosaggio-sensibili

Meccanismi molecolariMeccanismi molecolari

Tutte le malattie genomiche sono causate Tutte le malattie genomiche sono causate da un comune meccanismo molecolare:da un comune meccanismo molecolare:

- ricombinazione omologa non-allelica - ricombinazione omologa non-allelica (NAHR) tra regioni ripetute (segmental (NAHR) tra regioni ripetute (segmental duplications o low-copy repeats LCRs) duplications o low-copy repeats LCRs) fiancheggianti un segmento genomico fiancheggianti un segmento genomico unico.unico.- - più raramente la causa è una giunzione terminale non più raramente la causa è una giunzione terminale non omologa (NHEJ)omologa (NHEJ)

Shaw, C. J. et al. Hum. Mol. Genet. 2004

Meccanismi molecolariMeccanismi molecolari(Non-homologous end-joining )(Non-allelic homologous recombination )

Modelli di ricombinazione intercromosomica (1)

Modello di ricombinazione intercromosomica (2)

LCR (low copy repeats) o LCR (low copy repeats) o duplicazioni segmentaliduplicazioni segmentali

Sono regioni di DNA caratterizzate da Sono regioni di DNA caratterizzate da sequenze ripetute (sequenze sequenze ripetute (sequenze esoniche, pseudogeni, ecc)esoniche, pseudogeni, ecc)

Le sequenze ripetute all’interno di Le sequenze ripetute all’interno di ogni LCR possono avere uno stesso ogni LCR possono avere uno stesso orientamento (LCR dirette) oppure un orientamento (LCR dirette) oppure un orientamento invertito (LCR inverse)orientamento invertito (LCR inverse)

Malattie genomiche: Malattie genomiche: meccanismi molecolarimeccanismi molecolari

Le regioni cromosomiche coinvolte nei Le regioni cromosomiche coinvolte nei riarrangiamenti hanno delle riarrangiamenti hanno delle caratteristiche comuni che influenzano caratteristiche comuni che influenzano la ricombinazione (NAHR).la ricombinazione (NAHR).

- Infatti la ricombinazione tra LCR Infatti la ricombinazione tra LCR direttedirette causa delezioni o duplicazionicausa delezioni o duplicazioni

- La ricombinazione tra LCR La ricombinazione tra LCR inverseinverse causa causa inversioniinversioni

LCRLCR

Tutte le LCR che sono coinvolte nella patogenesi Tutte le LCR che sono coinvolte nella patogenesi delle malattie genomiche condividono una notevola delle malattie genomiche condividono una notevola identità della sequenza nucleotidica (95-98%)identità della sequenza nucleotidica (95-98%)

Inoltre studi molecolari dettagliati dimostrano che i Inoltre studi molecolari dettagliati dimostrano che i breakpoint di ricombinazione sono posizionati in breakpoint di ricombinazione sono posizionati in tratti delle LCR che hanno assoluta identità di tratti delle LCR che hanno assoluta identità di sequenza nucleotidicasequenza nucleotidica

Sono generate da duplicazioni segmentali del Sono generate da duplicazioni segmentali del genomagenoma trasposizione di un frammento genomico trasposizione di un frammento genomico da una posizione ad un’altrada una posizione ad un’altra

LCR costituiscono circa il 5% di tutto LCR costituiscono circa il 5% di tutto il genoma umano (dati dal Progetto il genoma umano (dati dal Progetto Genoma)Genoma)

E’ probabile che nel futuro si identifichino altre associazioni tra malattie umane e

riarrangiamenti genomici

LCRLCR

Evoluzione del genoma dei Evoluzione del genoma dei mammiferimammiferi

Vari studi dimostrano che nei mammiferi Vari studi dimostrano che nei mammiferi inferiori (es: topo) non sono presenti LCRsinferiori (es: topo) non sono presenti LCRs

Le LCRs umane si sono evolute recentemente, e in particolare, dopo la speciazione dei primati

Duplicazioni segmentali nel Duplicazioni segmentali nel genoma umanogenoma umano

ChromosomeChromosome Intra-Intra-

chromosomachromosomal (%)l (%)

Inter-Inter-

chromosomachromosomal (%)l (%)

ALL (%)ALL (%)

1515 33 6.96.9 6.96.9

1616 4.54.5 2.02.0 5.85.8

2222 6.16.1 2.62.6 7.57.5

YY 12.112.1 1616 27.427.4

Malattie genomicheMalattie genomiche

I riarrangiamenti genomici associati I riarrangiamenti genomici associati alle malattie genomiche sono:alle malattie genomiche sono:

- DelezioniDelezioni- DuplicazioniDuplicazioni- InversioniInversioni

Malattie genomicheMalattie genomiche

Le malattie genomiche sono Le malattie genomiche sono relativamente frequenti:relativamente frequenti:

~~1x10 1x10 -4-4

NBNB

Frequenza di mutazioni de novo per Frequenza di mutazioni de novo per caratteri autosomici dominanti è caratteri autosomici dominanti è ~~1x10 1x10 -3-3

Malattie genomicheMalattie genomiche

Le malattie genomiche sono causate da Le malattie genomiche sono causate da riarrangiamenti di segmenti cromosomici riarrangiamenti di segmenti cromosomici che hanno delle caratteristiche che hanno delle caratteristiche “architettoniche” specifiche “architettoniche” specifiche → quindi non → quindi non esistono delle differenze tra le varie esistono delle differenze tra le varie popolazionipopolazioni

Come invece è stato osservato per alcune Come invece è stato osservato per alcune malattie monogeniche come l’anemia malattie monogeniche come l’anemia falciforme o la fibrosi cisticafalciforme o la fibrosi cistica

Malattie genomicheMalattie genomiche

Malattie genomiche sono caratterizzate da Malattie genomiche sono caratterizzate da un’ampia serie di fenotipi clinici un’ampia serie di fenotipi clinici

Questi fenotipi sono causati dalla Questi fenotipi sono causati dalla aploinsufficienza di uno o più geni contenuti aploinsufficienza di uno o più geni contenuti all’interno delle regioni riarrangiateall’interno delle regioni riarrangiate

Duplicazioni segmentali coinvolte nella patogenesi di Duplicazioni segmentali coinvolte nella patogenesi di malattie genomichemalattie genomiche

Duplicazioni segmentali che causano le malattie Duplicazioni segmentali che causano le malattie genomichegenomiche

Duplicazioni segmentali che causano le malattie Duplicazioni segmentali che causano le malattie genomichegenomiche

Genomic DisorderGenomic DisorderCharcot-Marie Tooth disease type 1A (CMTIA)Hereditary Neuropathy with Pressure Palsies (HNPP)Smith Magenis Syndrome (SMS)Duplication 17p11.2Neurofibromatosis-1 (NF-1)Prader-Willi Syndrome (PWS)Angelman Syndrome (AS)Inverted duplication 15 [inv dup(15)]

Williams-Beuren Syndrome (WBS)Digeorge and Velocardiofacial Syndromes (DGS/VCFS)Cat eye Syndrome (CES)

X-linked IchthyosisHemophilia AHunter syndromeSpinal Muscular AtrophyOR-associated 8p rearrangements

AZFa MicrodeletionAZfc Microdeletion

RearrangementRearrangementInterstitial Duplication

Deletion

DeletionInterstitial DuplicationDeletionDeletionDeletionSupernumerary Marker ChromosomeDeletionDeletion

Supernumerary Marker ChromosomeDeletionInversionInversion/DeletionDeletionInversions, deletion.duplicationsDeletionDeletion

LocationLocation17p12

17p12

17p11.217p11.217q11.215q11-q1315q11-q1315q11-q13

7q11.2322q11.2

22q11.2

Xp22Xq28Xq285q13.28p23

Yq11.2Yq11.2

Repeat Size (% Repeat Size (% identity)identity)24 kb (98.7%)

24 kb (98.7%)

~250 kb (98%)~250 kb (98%)85 kb >500 kb>500 kb>500 kb

~350 kb (98%)50-450 kb (97-98%)

300-450 kb (97-98%)

20 kb9.5 kb (99.9%)20 kb (>90%)500 kb~400 kb (95-97%)

~10 kb~230 kb (99.9%)

Tecniche di analisi dei Tecniche di analisi dei riarrangiamenti cromosomiciriarrangiamenti cromosomici

Tecniche di citogenetica classica permettono la Tecniche di citogenetica classica permettono la visualizzazione di anomalie segmentali che coinvolgono da 2-visualizzazione di anomalie segmentali che coinvolgono da 2-10 Mb di DNA duplicato o deleto.10 Mb di DNA duplicato o deleto.

L’introduzione della citogenetica molecolare (FISH) ha L’introduzione della citogenetica molecolare (FISH) ha permesso di riconoscere su cromosomi in metafase e su permesso di riconoscere su cromosomi in metafase e su nuclei in interfase microdelezioni e/o microduplicazioni (1-3 nuclei in interfase microdelezioni e/o microduplicazioni (1-3 Mb).Mb).

La più recente tecnica dell’array CGH è già ampiamente La più recente tecnica dell’array CGH è già ampiamente usata per analisi di riarrangaimenti cromosomici in tumori usata per analisi di riarrangaimenti cromosomici in tumori solidi, ritardi mentali, riarrangaimenti subtelomerici, e solidi, ritardi mentali, riarrangaimenti subtelomerici, e anomalie cromosomiche costituzionali. anomalie cromosomiche costituzionali.

La tecnica MLPA (multiple ligation-dependent probe La tecnica MLPA (multiple ligation-dependent probe amplification) permette la quantificazione relativa di amplification) permette la quantificazione relativa di differenti segmenti di DNA genomico (fino a 45 differenti segmenti di DNA genomico (fino a 45 contemporaneamente) basandosi su una singola reazione di contemporaneamente) basandosi su una singola reazione di PCR quantitativa. PCR quantitativa.

Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

FISH (Fluorescence FISH (Fluorescence In Situ In Situ Hybridization)Hybridization)

sonde locus-specifiche

sonde painting

sonde alfoidi

Sonde alfoidi

Sonde paintig

Sonde locus-specifiche

Ibridazione in situ fluorescente (FISH)

SINDROME DI DIGEORGE

aCGH aCGH (array-based Comparative (array-based Comparative

Genomic Hybridization)Genomic Hybridization)

(Modificato da Davies et al., 2005)

GENES, CHROMOSOMES & CANCER 20:399–407 (1997)

Immagini ottenute da analisi con software BluFuse for Microarrays 3.3 (5164) (BluGnome Ltd, Cambridge)

Analisi di aCGHAnalisi di aCGHAnalisi di aCGHAnalisi di aCGH