INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

LABORATORIO DE BIOLOGIA DE PROCARIONTES

Práctica N° 9.- Cuantificación de Bacteriófagos.

Equipo 3° y 8°:

Sección 2.-

Castro De Aquino Dana Vianey Escobar González Roberto Eduardo Franco Roberto Juárez Maldonado Rafael

Fecha: 30 de Octubre de 2013

OBJETIVOS

Utilizar la técnica más común y relativamente más sencilla, para demostrar y cultivar bacteriófagos presentes en aguas residuales.

Determinar el número de placas líticas y calcular el título del bacteriófago.

RESULTADOS

Tabla 1.- Número de Placas líticas formadas por los fagos y el porcentaje de aislamiento que se obtuvo de estos en la sección 2.

Equipo # de placas Dilución UFP/ ml % de placas

1 >10000 10-4 > 109 100%2 59 10-5 5.9 x 107 100%3 >1000000 10-6 >1 x 1013 100%4 86 10-5 8.6 x 107 100%5 - - - 100%6 28 10-5 2.8 x 107 95%7 65 10-5 6.5 x 107 100%8 43 10-2 4.3 x 104 100%

DISCUSIÓN

Los bacteriófagos son parásitos intracelulares obligados que se multiplican al interior de las bacterias, provocando su lisis. La determinación de fagos, es observada gracias a la formación de placas líticas. Cuando se siembra un número suficiente de bacterias sobre la superficie de una caja de agar nutritivo, éstos forman una capa uniforme después de algunas horas de incubación. Si se introducen fagos, éstos pueden entrar al ciclo lítico. Al liberarse nuevos fagos, estos infectan a las bacterias vecinas, de tal manera que después de varios ciclos, pueden verse pequeños aclaramientos o placas sobre la superficie de la capa bacteriana, Dado que el número de placas es directamente proporcional al número de fagos, este método es de utilidad para la detección y cuantificación de fagos obtenidos en cada uno de los equipos. Existe diferentes títulos de fago, esto debido a que en un ecosistema bacteriano pueden coexistir tanto bacterias susceptibles a la infección como aquellas que no lo son (resistentes).

El título de la preparación viral se calcula contando el número de placas que produce una determinada dilución de la muestra, y haciendo las correcciones necesarias para llegar a la cantidad de virus en la muestra original. Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis, y se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). El título se expresa como "UFP/ml" o "UFP/g", según corresponda.

En la determinación de la presencia de Fagos el porcentaje de aislamiento resulto del 100% casi en todos los equipos, con excepción del equipo 6, que obtuvo un valor del 95%.

La mayor cantidad de placas líticas se observó en los equipos 1 y 3, mientras que en los equipos y 8 se obtuvieron los valores más bajos, el equipo 5 obtuvo alguna placa lítica, posiblemente por errores humanos al realizar las diluciones o al poner la muestra biológica en el agar, ya que se encontraba caliente y pudieron haberse quemado, con lo cual se inhibió su crecimiento.

Las diluciones en donde se llevó a cabo la cuantificación fueron en su mayoría mayor a 10−4,

aunque el equipo 8 utilizo los resultados arrojados por la dilución 10−2, ya que no obtuvo formación de placas líticas en ninguna otra dilución.

CONCLUSIÓN

La demostración de la presencia de bacteriófagos de aguas residuales específicos para Escherichia coli logró ser positiva en todos los equipos.

CUESTIONARIO

1.- Mencionar que es una placa lítica Este método consiste en infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo del mismo

en fase semisólida. De esta manera, cuando un virus infecta una célula, su progenie sólo puede migrar a las células inmediatamente vecinas, y no a las alejadas, ya que el medio semisólido limita su movilidad. Coloreando las células se observarán zonas no teñidas (placas de lisis), correspondientes a las células destruidas por la partícula infecciosa inoculada y las nuevas partículas que ella produjo, si la coloración se realiza con un colorante vital (rojo neutro), que no mata las células teñidas ni al virus, es posible tomar material de una placa, que contendrá la progenie viral correspondiente a un único virus infectante, constituyendo, por lo tanto, un clon.

2.- ¿Para qué inoculó un caldo nutritivo con una suspensión de E. coli adicionada de aguas residuales?

La mayoría de los parásitos, son específicos en relación con sus hospederos que parasitan. Algunos virus son específicos de bacterias y se denominan virus bacterianos, bacteriófagos o fagos. La mayoría de las bacterias son susceptibles a ataque por bacteriófagos. En los hábitats donde viven las bacterias podemos encontrar ahí a sus bacteriófagos específicos, y en caso de E. coli se espera obtener al bacteriófago a partir del agua residual.

3. Para conocer el título del fago que tenía en el cultivo de Escherichia coli en caldo nutritivo ¿es necesario conocer el número de bacterias que coloco en cada caja?

No, simplemente contando los pequeños aclaramientos o placas sobre la superficie de la capa bacteriana es como se va obtener el resultado. El número de placas será directamente proporcional a UFP/ ml.

4.- Explique brevemente en que consiste el ciclo lítico y en que el ciclo lisogénico de un virus.

En el Ciclo lítico el virus penetra a una célula o bacteria y produce copias que acaban liberándose al exterior. Este ciclo puede dividirse en cinco fases: Fase de fijación: en la cual una proteína del virus se une específicamente a una proteína, receptora de la membrana plasmática, del huésped que infecta. Fase de penetración: el virus, una vez fijado a la membrana plasmática del huésped, penetra en su interior. Puede ocurrir que no penetre el virus completo, sino que lo haga solamente su ácido nucleico con algunas proteínas o bien solo el material genético. Existen diferentes mecanismos de penetración: penetración directa, endocitosis fusión de membranas, y combinación de los mecanismos anteriores. Fase de biosíntesis: una vez que el DNA del bacteriófago llega hasta el citoplasma de la célula huésped ocurre la biosíntesis del ácido nucleico y de la proteína viral. La síntesis de proteínas del huésped es detenida por la degradación del DNA del huésped inducida por el virus, las proteínas virales que interfieren en la transcripción o la represión de la traducción. Durante varios minutos después de la infección no se encuentran fagos completos en la célula huésped, solo se detectan componentes dispersos de DNA y proteínas. El periodo de multiplicación viral durante el cual no hay viriones infecciosos completos se denomina periodo de eclipse.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Díaz, M. G. 2009.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológicos: Morfología y estructura bacteriana. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso, Centro de Formación Profesional Instituto Villaverde.

Ramírez, R. M et. al. 2006. Microbiología General, 5ªedición, Facultad de Química, UNAM. México