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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TRÊS MÉTODOS DE BACILOSCOPIA DE
ESCARRO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE
PULMONAR
PATRÍCIA ENEDINA DE LIMA QUINCÓ
MANAUS
2012
i
PATRÍCIA ENEDINA DE LIMA QUINCÓ
AVALIAÇÃO DA ACURÁCIA DE TRÊS MÉTODOS DE BACILOSCOPIA DE
ESCARRO PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE
PULMONAR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos
Co-orientadora: Profª Dra. Samira Bührer-Sékula
MANAUS 2012
Ficha Catalográfica
Q7a Quincó, Patrícia Enedina de Lima. Avaliação da acurácia de três métodos de baciloscopia de
escarro para diagnóstico laboratorial da tuberculose pulmonar /. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2012.
ix: 110 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2012. Orientador: Profº. Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos. Co-orientadora: Prof.ª Dra. Samira Bührer-Sékula
1.Baciloscopia. 2.Centrifugação 3.Filtração I. Título.
CDU: 614.4
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N. Silva - UEA
iii
RESUMO
A Tuberculose (TB) uma doença curável, ainda é um dos principais problemas de saúde pública. A baciloscopia direta de escarro é ferramenta de diagnóstico fundamental principalmente onde testes mais sensíveis não estão disponíveis. A sensibilidade da baciloscopia direta fica em torno de 50%, decrescendo em suspeitos de TB infectados pelo HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). O objetivo do estudo foi avaliar acurácia de três métodos de baciloscopia para o diagnóstico laboratorial da TB pulmonar. Comparamos a acurácia dos métodos baciloscópicos (baciloscopia com e sem tratamento do escarro com NALC seguido por centrifugação, baciloscopia em Membranas de Filtração de Policarbonato - MFP) com a cultura em meio Ogawa Kudoh como padrão ouro. Os escarros foram obtidos de 508 suspeitos de tuberculose pulmonar, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado e Policlínica Cardoso Fontes. Maioria HIV positivos. Comparando com a cultura o MFP foi o método de baciloscopia mais sensível. Em pacientes infectados pelo HIV a sensibilidade do MFP foi significativamente maior que após centrifugação do escarro tratado com NALC e sem NALC (61,9%, 47,6% e 45,2% p=0,001) respectivamente. Em pacientes não infectados pelo HIV o método MFP foi significativamente maior que com e sem NALC (81,8%, 63,6% e 57,5%, p=0,001). Nos dois grupos de estudo, HIV infectados ou não, não houve diferenças significativas entre as especificidades dos três métodos estudados. O incremento oferecido pela segunda amostra de escarro foi de 13%, 11% e 4% nas baciloscopias após centrifugação com e sem NALC e em MFP, respectivamente. A concordância entre as baciloscopias e a cultura foi boa (k>0.6<0.8), mas em HIV infectados foi regular (k>0.4<0.6). Análise microscópica de escarro tratado com NALC, comparado com sem NALC não aumentou a sensibilidade da baciloscopia. De modo geral a sensibilidade do MFP foi superior em comparação com os outros dois métodos estudados, sem perda de especificidade. Palavras-chaves: Baciloscopia. Centrifugação. Filtração.
iv
ABSTRACT
Tuberculosis (TB), a curable disease, still a major public health problem. Bacilloscopy test is yet important awaiting the development of more sensitive tests. The sensitivity of bacilloscopy test is around 50%, decreasing in suspected TB patient co-infected with HIV (Human Immunodeficiency). The objective of the study was to evaluate, the accuracy of three methods of sputum bacilloscopy for the diagnosis laboratorial of lung TB. We compared the accuracy of sputum baciloscopy methods (Sputa treated or untreated with NALC; Sputa filtered on Polycarbonate Membrane Filtration) to the culture in Ogawa-Kudoh medium as the gold standard method. The sputa were obtained from 508 patients with suspected pulmonary TB attending in Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado and Policlinica Cardoso Fontes. Most of the patients were HIV positive. Compared with gold standard culture, the MFP was the microscopy method more sensitive. In TB-HIV infected patients, sensitivity for MFP was significantly higher than after centrifugation of sputa treated with and without NALC (61.9%. 45.6% and 45.2%; p = 0.001) respectively. Similarly, in TB patients without HIV, the MFP smear sensitivity was significantly higher (81.8%, 63.6% and 57.5%; p = 0.001) respectively. In both study group, TB patients with or without HIV, no significant differences between the specificities of the three methods were observed. Handling of the second sputum sample similarly by centrifugation with or without NALC and MFP showed an increase of positivity by 13%, 11% and 4% respectively. The correlation between bacilloscopy and culture was good (k>0.6<0.8), but in TB-HIV infected was moderate (k>0.4<0.6). Microscopy evalution of sputum treated with NALC compared to sputum without NALC did not show any increase sensitivity. Altogether, the sensitivity of the MFP method is higher compared to the others studied without loss of specificity.
Keywords: Bacilloscopy. Centrifugation. Filtration.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos meu orientador, aos pacientes do estudo,
aos professores do programa pelo conhecimento passado durante as disciplinas. Ao
professor Marcus Vinícius G. Lacerda pela contribuição no estudo, pelos ótimos
conselhos, e por estar sempre disposto a discutir ciência, a professora Maria Paula
Gomes Mourão pelas sugestões apresentadas na aula de qualificação e pelas
palavras de incentivo.
Agradeço a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, a
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado Amazonas – FAPEAM pelo
financiamento, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPQ), ao Instituto de Ciência Tecnologia em Tuberculose (INCT-TB). Aos
funcionários e aos alunos do Programa de Iniciação Científica - PAIC da Gerência de
Bacteriologia da FMT-HVD. Ao apoio, carinho e incentivo da professora Rossiclea
Lins Montes.
A Dra. Irineide Antunes diretora da Policlínica Cardoso Fontes e a Dra.
Marluce Garrido coordenadora do Programa de Controle da Tuberculose do
Amazonas. Agradeço, aos pesquisadores Reynaldo Dietze e Moisés Palaci do
Núcleo de Doença Infecciosas da Universidade Federal do Espírito Santo.
Ao amigo Walber Brandão pela grande contribuição nos testes laboratoriais e
pelo apoio incondicional. Ao amigo Diego Rayan por ter me incentivado a não
desistir. A amiga Helena Coelho por ter estado presente nos momentos de alegria e
aflições durantes as disciplinas e por compartilhar seus conhecimentos.
Ao Dr. Tomàs Maria Pérez Porcuna pelo grande apoio, incentivo, por acreditar
no meu trabalho e pelos sábios conselhos sobre ciência e sobre a vida. A Dra.
Samira Bührer pelo árduo trabalho nesta dissertação e por mostra-se presente no
momento mais difícil desta trajetória. A minha mãe e amiga Esmeralda Ribeiro pela
compreensão, palavras de conforto e por ter estado sempre ao meu lado.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa mundial com distribuição do número estimado de casos incidentes de tuberculose em 2010...............................
2
Figura 2: Distribuição da taxa de Incidência de tuberculose por unidades federais no Brasil em 2011.......................................
3
Figura 3: Imagem do Mycobacterium tuberculosis visualizado no microscópio eletrônico.............................................................
5
Figura 4: Ilustração do granuloma...........................................................
8
Figura 5: Imagem da aplicação do teste tuberculínico............................
10
Figura 6: Fluxograma da Técnica de execução do Quantiferon-TB e TSPOT.....................................................................................
11
Figura 7: Imagem do escarro com presença de BAAR..........................
12
Figura 8: Imagem do meio de cultura Ogawa Kudoh (OK) com colônias de Mycobacterium tuberculosis.................................
15
Figura 9: Imagem da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado...................................................................................
20
Figura 10: Fluxograma da metodologia dos testes realizados no estudo
23
Figura 11: Fluxograma do processamento do escarro ...........................
26
Figura 12: Imagem do suporte de filtros usado na filtração do escarro....
27
Figura 13: Imagem com a sequência da montagem do pré- filtro e do suporte de filtros.......................................................................
27
Figura 14: Imagem da montagem do sistema de filtração........................
28
Figura 15: Imagem com representação da coloração de membranas......
29
Figura 16: Fluxograma dos procedimentos laboratoriais.........................
30
vii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(Acquired Immunodeficiency Syndrome)
AMTD Teste Amplificado Direto (Amplifield Direct Test)
APC Célula Apresentadora de antígeno
a.C antes de Cristo
BAAR Bacilos Álcool-Ácidos Resistentes
BCG Bacilo Calmette-Guérin
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CFP 10 Cols. º C
(Cultura Filtrada de Proteína) Colaboradores Graus Celsius
DP Desvios Padrão
ELISA Ensaio Imuno-Enzimático (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
FMT-HVD Fundação de Medicina Dr. Heitor Vieira Dourado
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Vírus)
IDH Índice de Desenvolvimento Humano
IFN- Interferon-Gamma
IGRA Ensaio de Liberação de Interferon Gamma (Interferon Gamma Release Assay)
LAM Lipoarabinomanana
LJ Löwenstein Jensen
MFP MGIT
Membrana de Filtração de Policarbonato Tubo Indicador de Crescimento Micobacteriano
viii
MODS mL
Detecção e Susceptibilidade por Observação Microscópica (Microscopic-Observation Drug Susceptibility Mililitro
M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
mm Milímetros
mmHg Milímetros de Mercúrio
µm Micromilímetros
μL Microlitros
NALC- NaOH N-acetil-L-cisteína com Hidróxido de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
NaOCl Hipoclorito de Sódio
OMS Organização Mundial de Saúde
OK Ogawa Kudoh
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
(Polymerase Chain Reaction) PPD Derivado Protéico Purificado
(Purified Protein Derivative)
TAAN TB
Teste de Amplificação de Ácidos Nucléico Tuberculose
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UT Unidade Tuberculínica
UFC Unidade Formadora de Colônias
x g Força Centrífuga
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................... 1
1.1 Situação Epidemiológica da Tuberculose (TB).......................... 1
1.1.1 TB - Situação Mundial................................................................ 1
1.1.2 TB - Situação no Brasil............................................................... 2
1.1.3 TB - Situação no Amazonas....................................................... 3
1.2 O Complexo Mycobacterium tuberculosis.................................. 4
1.3 Características Gerais do Mycobacterium tuberculosis............. 5
1.4 Transmissão e Patogenia........................................................... 6
1.5 Instrumentos Diagnósticos para a Tuberculose Pulmonar......... 8
1.5.1 Teste Tuberculínico.................................................................... 9
1.5.2 Ensaios de liberação de Interferon – Gamma........................... 10
1.5.3 Baciloscopia............................................................................... 12
1.5.4 Cultivo de Micobactérias............................................................ 14
1.5.5 Testes Baseados na Amplificação de Ácido nucléico................ 16
2. OBJETIVOS............................................................................... 19
2.1 Geral.......................................................................................... 19
2.2 Específicos........................................................................... 19
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................... 20
3.1 Tipo do Estudo........................................................................... 20
3.2 Local do Estudo.......................................................................... 20
3.3 Tipo da amostra......................................................................... 21
3.4 Critérios de Elegibilidade............................................................ 21
3.5 Critérios de Inclusão................................................................... 21
3.6 Critérios de Exclusão á Posteriori............................................. 22
3.7 Coleta dos Dados....................................................................... 22
3.8 Coleta das Amostras de Escarro................................................ 22
3.9 Procedimentos Laboratoriais...................................................... 23
3.9.1 Baciloscopia após Centrifugação sem NALC ........................... 23
3.9.2 Cultura........................................................................................ 24
3.9.3 Digestão e Descontaminação do Escarro.................................. 25
3.9.4 Baciloscopia Concentrada por Centrifugação com NALC ......... 25
3.9.5 Baciloscopia em MFP................................................................. 26
3.9.5.1 Processamento do Escarro........................................................ 26
x
3.9.5.2 Montagem do Sistema de Filtros................................................ 26
3.9.5.3 Filtração dos Escarros Processados.......................................... 28
3.10 Leitura Cega dos Resultados..................................................... 31
3.11 Análise Estatística...................................................................... 31
3.12 Aspectos Éticos do Estudo......................................................... 32
4. RESULTADOS........................................................................... 33
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................... 49
6. ANEXOS.................................................................................... 59
ANEXO A – Ficha de Registro do Participante........................ 60
ANEXO B – Ficha de Registro da Baciloscopia........................ 62
ANEXO C – Ficha para Leitura da Baciloscopia....................... 65
ANEXO D – Parecer do CEP da FMT-HVD.............................. 67
ANEXO E – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido...... 69
ANEXO F – Procedimento Operacional Padrão – POP............. 74
1
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa com evolução crônica
tendo como agente etiológico a bactéria denominada Mycobacterium tuberculosis
comumente chamado de bacilo de Koch, isolado e identificado pelo cientista
alemão Robert Koch em 1882 (1). A TB é uma das mais antigas doenças
transmissíveis do mundo que ainda acomete a humanidade, uma das primeiras
evidências da doença foi observada em Tebas (Egito) em 44 múmias bem
preservadas que datam de 3.700 a 1.000 a.C. (2).
A TB permanece como um problema de saúde pública, apesar de ser uma
doença totalmente curável (2). O diagnóstico ainda é um dos maiores problemas
referentes à doença, as ferramentas de diagnóstico disponíveis são insuficientes
para o diagnóstico da doença. As ferramentas com baixo custo são poucos
sensíveis, especialmente para detectar a doença em crianças e pacientes
infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e as que possuem
elevada sensibilidade são demoradas ou possuem elevado custo para serem
amplamente utilizadas em laboratórios de saúde pública de países com recursos
limitados (3,4).
1.1 Situação Epidemiológica da Tuberculose (TB)
1.1.1 TB - Situação Mundial
O Mycobacterium tuberculosis é considerado um patógeno humano bem
adaptado e de sucesso, devido sua capacidade de penetração dentro dos tecidos
do hospedeiro (5) e segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde
(OMS) mais de dois bilhões de pessoas têm teste cutâneo positivo para a
infecção sendo que uma em cada 10 pessoas infectadas ficará doente no
decorrer da sua vida (6).
Em 2010 ocorreram 12 milhões de casos prevalentes e 8,8 milhões de
casos incidentes de TB (Figura 1). A maior parte dos casos incidentes ocorreu na
Ásia (59%) e África (26%) e as menores proporções ocorreram no Leste da
2
Região do Mediterrâneo (7%), na Região Europeia (5%) e na Região das
Américas (3%) (7). Os cinco países com os maiores números de casos incidentes
foram a Índia (2,0 – 2,5 milhões), China (0,9 – 1,2 milhões), África do Sul (0,40 –
0,59 milhões), Indonésia (0,37 – 0,54 milhões) e o Paquistão (0,33 – 0,48
milhões). No mesmo ano ocorreram cerca de 1,4 milhões de óbitos, sendo que
destes 1,1 milhões ocorreram entre os casos de TB que eram HIV negativo e 350
mil óbitos ocorreram entre os casos que eram HIV positivo (7).
Figura 1: Mapa mundial com a distribuição dos casos incidentes de TB em 2010.
Fonte: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/
1.1.2 TB - Situação no Brasil
O Brasil é o 17º país dentre os 22 países responsáveis por 82% do total de
casos de TB no mundo. A TB no Brasil é a 4ª causa de morte por doenças
infecciosas e a 1ª causa de mortes de pacientes com Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Em 2011 foram notificados 70 mil casos
novos, apresentando uma taxa de incidência de 36,0 por cada 100 mil habitantes
(Figura 2) (8).
3
Em 2011 os estados do Amazonas e Rio de Janeiro apresentaram as
maiores taxas de incidência do país, enquanto Goiás (13,6) e Distrito Federal
(11,1) apresentaram as menores (Figura 2). Em 2010 a taxa de mortalidade no
Brasil foi de 2,4 óbitos para cada grupo de 100.000 habitantes. Os estados do Rio
de Janeiro (5,6) e de Pernambuco (4,0) apresentaram as maiores taxa de
mortalidade do país, enquanto Goiás (0,8) e Distrito Federal (0,5) apresentaram
as menores (8,9).
Figura 2: Distribuição da taxa de incidência de TB por unidades federais no Brasil em
2011.
Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/apresentacaodiamundial.pdf
1.1.3 TB - Situação no Amazonas
O estado do Amazonas apresentou a maior taxa de incidência do país em
2011(9). No mesmo ano no Amazonas ocorreram 2.216 casos novos de TB,
sendo o segundo estado com o maior número de casos novos entre os estados
da Região Norte (10). A taxa de mortalidade no Amazonas em 2010 foi de 3,2
óbitos por cada grupo de 100 mil habitantes, apresentando dentre os estados da
região norte a maior taxa de mortalidade (11).
4
A capital do estado do Amazonas Manaus foi a 4ª capital com a maior taxa
de incidência do país em 2011 (8). Manaus concentra 50% da população do
estado e 68% dos casos notificados sendo estes distribuídos de forma desigual
nos bairros, observando-se uma alta concentração de casos positivos em bairros
deficientes dos aparatos urbanísticos e preferencialmente com Índice de
Desenvolvimento Humano (IDH) mais baixos (13,12).
1.2 O Complexo Mycobacterium tuberculosis
As micobactérias pertencem à ordem dos Actinomycetales, família das
Mycobacteriaceae e ao gênero Mycobacterium. As espécies do complexo
Mycobacterium tuberculosis (M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M.microti, M.
caprae, M. pinnipedii, M. canetti e M. tuberculosis), pertencem ao gênero
Mycobacterium, apresentam características genotípicas restritas apenas ao
complexo e diferenças fenotípicas, de patogenicidade e epidemiológicas (14,15).
O M. bovis causa TB em vários mamíferos, incluindo bovinos e seres
humanos, foi uma das principais causas da TB humana antes da pasteurização
do leite. O M. bovis - BCG é um derivado atenuado do M. bovis sendo utilizado
na vacina Bacilo Calmette-Guérin (BCG) (16). Anteriormente denominado de M.
tuberculosis Muris, o M. microti é um patógeno de ratazanas e raramente causa
doença em humanos (17). Isolado de leões marinhos e focas, o M. pinnipedii
também é patogênico em coelhos e possivelmente em gados (18).
O M. caprae foi isolado de caprinos e não está restrito somente a este
hospedeiro por ter sido também isolado de gado, javali e suínos, sua ocorrência
foi relatada na França, Áustria e Alemanha (19). Descrito pela primeira vez por
George Canetti em 1969 o M. canetti foi isolado de um paciente nascido na
Somália (20,21). O M. africanum é associado à TB em humanos na África, onde
provoca mais casos que o M. tuberculosis que é o principal responsável pela TB
em seres humanos (22).
5
1.3 Características Gerais do Mycobacterium tuberculosis
O M. tuberculosis é um bacilo delgado ligeiramente encurvado, medindo
1,0 a 4,0 µm de comprimento e 0,3 a 0,6 µm de diâmetro (Figura 3). É um
microorganismo intracelular facultativo, sem flagelos, aeróbio estrito, apresenta
como principal característica o crescimento lento de colónias esbranquiçadas
com aspecto rugoso em meio de cultura sólido, duplicando sua população em 18
a 48 horas dependendo da oferta de nutrientes e oxigênio (15,23).
Figura 3: Imagem do M. tuberculosis visualizado no microscópio eletrônico. Fonte: http://njms.umdnj.edu/departments/medicine/divisions/infectious_disease
A parede celular micobacteriana possui alto teor de lipídeos que consiste
em ácidos graxos de cadeias longas, com 60 a 90 átomos de carbono
denominados ácidos micólicos (24). A notável capacidade de sobrevivência do M.
tuberculosis no hospedeiro infectado está relacionada à presença dos ácidos
micólicos na parede celular, evidenciado pelo fato das drogas isoniazida e
etionamida ao inibirem a biossíntese dos ácidos micólicos resulta em lise celular
(24, 25).
Outra propriedade relacionada aos ácidos micólicos é a resistência à
descoloração com álcool ácido. A parede celular micobacteriana retém o corante
fucsina e uma vez corada, resiste à descoloração, por isso o M. tuberculosis é
designado de Bacilo Álcool Ácido Resistente (BAAR) (23,26). Na parede celular
6
das micobactérias os ácidos micólicos estão ligados covalentemente ao
arabinogalactana, que se liga ao peptideoglicano (27).
A arabinogalactana é uma macromolécula estrutural que funciona como
um andaime molecular ligando o peptideoglicano aos ácidos micólicos, formando
uma alta impermeabilidade e camadas hidrofóbicas em torno da célula (28). O
trealose 6,6-dimicolato é um glicolipídeo da parede micobacteriana conhecido
como fator corda, sendo um componente essencial da parede micobacteriana
que permite a sobrevivência da micobactéria dentro das células hospedeiras, por
produzir a formação de granuloma pulmonar in vivo (29,30).
O lipoarabinomanana (LAM) é um componente da parede celular do
Mycobacterium tuberculosis que está envolvido na inibição da maturação do
fagossoma. A inativação de genes envolvidos na biossíntese de LAM pode levar
a cepas atenuadas de M. tuberculosis podendo ser útil para o desenvolvimento
de novas vacinas (31,32).
1.4 Transmissão e Patogenia
A transmissão do M. tuberculosis ocorre de pessoa para pessoa, através
do ar, por núcleo de gotículas, partículas de 1-5 mm de diâmetros que contém 1 a
2 bacilos no seu interior, eliminadas pela tosse, espirro e fala de pessoas com
doença tuberculosa (33,34). Quatro fatores influenciam na probabilidade de
transmissão do M. tuberculosis: 1) o número de bacilos que estão sendo
expelidos no ar; 2) concentração de bacilos no ar por volume de espaço e grau
de ventilação; 3) a duração do tempo que a pessoa exposta respira o ar
contaminado e 4) estado imunológico do indivíduo exposto (33).
A infecção do hospedeiro pelo M. tuberculosis é iniciada após inalação de
gotículas contendo bacilos e pode ter três desfechos: 1) controle na porta de
entrada graças à imunidade inata, e apesar do indivíduo ser exposto não
apresenta nenhuma evidência imunodiagnóstica da infecção; 2) infecção latente
e 3) doença ativa (34-36).
7
O bacilo é completamente eliminado em apenas 10% das pessoas, nos
90% o organismo controla, mas não elimina o patógeno, isso é chamado de
infecção latente (37). Dos indivíduos com infecção latente, apenas um pequeno
número (5%) irá desenvolver a doença ativa ao longo de sua vida. O restante dos
infectados permanece livre de desenvolver a doença, a menos que haja
diminuição da eficiência da resposta imunológica, seja por certas doenças
associadas à imunossupressão, ou uso de drogas imunossupressoras (37,38).
O M. tuberculosis evoluiu para evitar a sua destruição por mecanismos da
imunidade inata e adaptativa (39). O local inicial da infecção é geralmente o
pulmão, onde o bacilo é fagocitado por células apresentadoras de antígenos
(APCs), como os macrófagos alveolares e células dendríticas. Este processo
pode destruir apenas alguns bacilos, outros sobrevivem e podem replicar no
interior dos macrófagos alveolares (38).
Os macrófagos podem transportar os bacilos dos pulmões através do
sistema linfático para linfa, onde poderá ser transportado através do sangue e
tecido linfático para outras partes do corpo, dando origem a TB extrapulmonar
(38). Certos órgãos e tecidos são notavelmente resistentes à multiplicação dos
bacilos, porém a multiplicação do bacilo na medula óssea, fígado e baço é
excepcional (33).
Na TB pulmonar, a ativação contínua dos linfócitos T induz a formação do
granuloma. O bacilo é contido no granuloma e pode persistir por décadas nas
lesões em uma forma latente, sem desencadear a doença. O granuloma fornece
uma barreira à propagação da infecção e representa um equilíbrio entre o M.
tuberculosis e o sistema imunológico do hospedeiro (40,41).
No centro do granuloma residem os macrófagos não ativados contendo
bacilos (Figura 4). Acredita-se que os macrófagos ativados pelos linfócitos T, que
potencializam a capacidade de destruição dos macrófagos através da produção
de citocinas como interferon-gama (IFN-), residem na periferia do granuloma
(42,43). Os linfócitos T tornam-se indispensáveis para a formação de granulomas
estáveis, por isso em caso de imunodeficiência, onde a função dos linfócitos T é
8
comprometida, pode levar ao aparecimento da doença ativa (42,43).
Figura 4: Ilustração do granuloma. Reproduzida de Jean Pieters 2008 (43).
1.5 Instrumentos Diagnósticos para Tuberculose Pulmonar
As principais medidas para conter a transmissão e conseqüentemente,
controlar a doença, são o diagnóstico precoce e o tratamento eficaz (44). O
diagnóstico da TB pulmonar é realizado pela combinação de sinais e sintomas
clínicos, achados radiológicos, exames bacteriológicos, patológicos, teste
tuberculínico e testes moleculares (45).
As manifestações clínicas da doença são muitas vezes inespecíficas e
enganosas e estão ausentes em 5% dos doentes, limitando o seu uso para fins
de diagnóstico (46). Cerca de 85% dos doentes com TB apresentam padrões
radiológicos como cavitação e consolidação parenquimatosa, que estão
associados à maior probabilidade de baciloscopia positiva (47). A apresentação
radiológica da TB em pacientes infectados pelo HIV pode ser atípica e a clínica
não ajuda no diagnóstico de TB pulmonar em infectados pelo HIV com
baciloscopia negativa (48-51).
9
A radiografia de tórax, apesar de ser considerado um método simples e
não invasivo, não confirma a doença, visto que lesões pulmonares semelhantes
às causadas pelo M. tuberculosis podem ocorrer em outras doenças (52). A
tomografia computadorizada do tórax é um método radiológico de alta resolução,
é mais sensível do que a radiografia de tórax, apresenta alto custo e deve ser
realizada nos casos de pacientes com baciloscopia negativa (53).
O teste tuberculínico é o instrumento padrão utilizado no diagnóstico da
infecção latente. Um teste tuberculínico positivo evidencia apenas a infecção por
micobactérias, não sendo suficiente para o diagnóstico da doença (54). A
confirmação diagnóstica da TB pulmonar é dada pela cultura por permitir
identificar o M. tuberculosis (54,55). Apesar de encurtarem o tempo requerido
para identificar o membro do complexo M. tuberculosis que causou a doença, as
técnicas moleculares não substituem a cultura e não podem ser utilizadas como
ferramenta para o monitoramento terapêutico (56).
Em situações onde o diagnóstico através da identificação da bactéria pela
baciloscopia ou cultura não é possível, o diagnóstico é baseado em critérios
clínicos, epidemiológicos e em achados radiológicos (55). Nesses casos, a
decisão de tratar pode ser difícil, visto que diagnosticar TB, quando na realidade
a doença é outra, irá atrasar o tratamento correto, enquanto que o subdiagnóstico
conduzirá a doença, a maior gravidade (57).
1.5.1Teste Tuberculínico
Descrito pela primeira vez em 1891 por Robert Koch, o teste tuberculínico
é baseado na reação celular desenvolvida após aplicação intradérmica do
derivado protéico purificado (“Purified Protein Derivative” PPD) do M. tuberculosis
na parte anterior do antebraço, na dose de 0,1mL (58).
A leitura do teste é realizada de 48–72 horas após aplicação do PPD
(Figura 5). Com base no tamanho da área endurecida no local da aplicação o
indivíduo é classificado como: 1)“não reator”, se o tamanho da área estiver entre
0 e 4mm; 2) reator fraco, se estiver entre 5 e 9mm e 3) reator forte se o diâmetro
10
for igual ou superior a 10mm. Em pacientes infectados pelo HIV, a enduracão
menor ou igual a 5 mm reflete infecção latente, para qual deve ser iniciada
quimioprofilaxia (59).
Figura 5: Imagem da aplicação do teste tuberculínico. Ambulatório da FMT- HVD.
Apesar de ser amplamente utilizado para detectar infecção latente, o teste
tuberculínico apresenta importantes limitações. A sensibilidade do teste é limitada
em pacientes infectados pelo HIV (60,61), tanto a vacinação com a BCG quanto a
exposição por micobactérias ambientais podem causar resultado falso positivo,
pois o PPD contém antígenos compartilhados entre o M. bovis, M. bovis (BCG) e
micobactérias ambientais (62-64).
1.5.2 Ensaios de Liberação de Interferon- Gamma (IFN-)
Por terem potencial para superar algumas limitações do teste
tuberculínico, os ensaios de liberação de interferon gama (interferon gamma
release assay, IGRA) constituem uma alternativa para identificar infecção latente
(65-67). O QuantiFERON-TB® (Cellestis Limited, Carnegie, Austrália) e o T-
SPOT-TB® (Oxford Immunotec, Oxford, Inglaterra), são testes comercialmente
disponíveis que medem a produção de IFN- por células T em resposta aos
antígenos ESAT-6 e CFP 10 presentes exclusivamente no M. tuberculosis (68).
Embora os dois testes sejam baseados na quantificação da produção de
IFN- por células T, suas características operacionais são diferentes. No T-SPOT-
11
TB® é utilizado células mononucleares periféricas e a quantificação da produção
do IFN- é realizada através do ensaio conhecido em inglês como “enzyme linked
immunospot” (ELISPOT) (68,69). No QuantiFERON-TB® Gold é utilizado sangue
total e ensaio imuno-enzimático (ELISA) para quantificar a produção de IFN-
(Figura 6) (69).
Figura 6: Fluxograma da execução do QUANTIFERON-TB e do T- SPOT.TB.
Reproduzida de Madhukar Pai 2004 e cols. (69).
A especificidade dos IGRAs é superior a especificidade do teste
tuberculínico e a mesma não é afetada pela vacinação com a BCG (70,71). Os
IGRAs são mais sensíveis do que o teste tuberculínico, entretanto o SPOT® TB
demostra ser mais sensível que o Quantiferon®-TB Gold (72,73). Os IGRAs não
são capazes de indicar doença tuberculosa e não possuem alta precisão para
12
prever o desenvolvimento da doença (72,74). Apesar de reduzirem o número de
pessoas que iniciam o tratamento preventivo, os IGRAs não são marcadores
fiáveis para monitorizar o efeito terapêutico (74,75).
A maioria dos estudos sobre os IGRAs têm sido realizados em países de
alta renda e não há dados suficientes sobre o desempenho dos testes em países
de baixa e média renda. Quando comparados com o teste tuberculínico, os
IGRAs são mais caros e a execução é mais complexa. A substituição do teste
tuberculínico por IGRAs como uma intervenção de saúde pública em países com
recursos limitados ainda não é recomendado pela OMS (76).
1.5.3 Baciloscopia
A baciloscopia direta consiste na pesquisa de BAAR em um esfregaço de
amostra clínica, que pode ser corado pelo método Ziehl-Nielsen e visualizado em
de microscópio de campo claro (microscopia convencional) (Figura 7) ou pode
ser corado com auramina e visualizado em microscópico de florescência. É um
método rápido, de baixo custo, possui uma boa especificidade, mas baixa
sensibilidade que é ainda menor em infectados pelo HIV e em crianças (3,4).
Figura 7: Imagem do escarro com BAAR. Fonte: Bacteriologia da FMT-HVD.
BAAR
13
Apesar de suas limitações a baciloscopia continua sendo uma ferramenta
amplamente utilizada no diagnóstico da tuberculose pulmonar e extrapulmonar,
principalmente em países com recursos limitados. Vários métodos para melhorar
a sensibilidade da baciloscopia foram desenvolvidos e estão sendo estudados,
entre eles está o exame de baciloscopia utilizando microscopia de fluorescência
(77).
A microscopia de fluorescência é 10% mais sensível que a microscopia
convencional com especificidade semelhante, no entanto em pacientes
infectados pelo HIV a especificidade da microscopia de fluorescência é menor
(77,78). É um método mais caro que a microscopia convencional por requerer
profissionais treinados e um microscópio de fluorescência, limitando o seu uso
mais amplo em laboratórios de saúde pública (77-79).
Recentes avanços na microscopia de fluorescência, incluindo microscopia
de fluorescência LED (diodos emissores de luz), microscópicos de fluorescência
portáteis e a bateria, têm ajudado a tornar a microscopia de fluorescência mais
amplamente disponível por serem tecnologias que reduziram o custo da
microscopia de fluorescência convencional. Essas tecnologias ainda não
substituíram o método convencional, pois são necessários estudos para avaliar
as vantagens, viabilidade e confiabilidade em condições de rotina (80-82).
Métodos de processamento do escarro químicos combinados com físicos,
estão sendo estudados visando melhorar o desempenho da baciloscopia como, o
processamento do escarro com N-Acetil-L-Cisteína com Hidróxido de
sódio(NALC - NaOH) seguido por centrifugação e processamento com hipoclorito
de sódio seguido por centrifugação ou sedimentação (83-85).
Em uma revisão sistemática de 83 estudos Steingart e cols. (85), relataram
que os métodos de processamento químicos combinados com centrifugação ou
sedimentação são mais sensíveis do que a baciloscopia direta com
especificidade semelhante. No entanto não se sabe qual a contribuição separada
desses métodos no aumento da sensibilidade da baciloscopia. Tais métodos
possuem como desvantagem a necessidade do uso de centrífuga e reagentes
14
caros aumentando substancialmente a complexidade da execução e custo da
baciloscopia em comparação com método direto (86).
Em 1981 Smithwick & Stratigos desenvolveram o método de baciloscopia
após concentração da amostra de escarro em membranas de filtração de
policarbonato (MFP). A técnica consiste na digestão do escarro com hipoclorito
de sódio seguido da adição de etanol e passagem do escarro por membrana de
policarbonato de 25 mm de diâmetro com poros de 1,0 μm, sob pressão negativa.
Obtiveram com o método um incremento 24,4% na sensibilidade em relação à
baciloscopia direta e 18,0% em relação aos esfregaços preparados após digestão
e descontaminação com NALC-NaOH (87).
Fennelly e cols. modificaram o método de baciloscopia em MFP com
objetivo de aumentar a sensibilidade da baciloscopia. Foi usado membranas de
13 mm e foi reduzido o tamanho dos poros da membrana de 1,0 μm para 0,4 μm.
O método foi avaliado em 335 suspeitos de TB e a sensibilidade obtida foi
superior a encontrada nos estudo Smithwick & Stratigos elevando a sensibilidade
da baciloscopia para níveis próximos aos da cultura (88).
Apesar do método de baciloscopia após concentração da amostra de
escarro em MFP modificado melhorar a sensibilidade da baciloscopia direta e ter
baixo custo (3 reais por teste), o mesmo não foi avaliado em população com
características epidemiológicas de alta prevalência da tuberculose isolada e
associada ao HIV (88).
1.5.4 Cultivo de Micobactérias
O exame de cultura é considerado padrão ouro para o diagnóstico da TB e
ao contrário da baciloscopia, permite a identificação do bacilo e realização de
testes de sensibilidade aos fármacos antituberculose. A cultura é realizada após
tratamento do escarro seguido da semeadura em meios sólidos como Ogawa
Kudoh (OK) (Figura 8) ou Löwenstein-Jensen e em meio líquido como
Middlebrook 7H9 (89).
15
Figura 8: Imagem do meio de cultura OK com colônias de Mycobacterium tuberculosis.
Gerência de Bacteriologia da FMT-HVD
A cultura é mais sensível que a baciloscopia, sendo capaz de detectar 10 a
100 bacilos/mL de escarro enquanto que para obtenção de um resultado positivo
na baciloscopia são necessários pelo menos 5.000-10.000 bacilos/mL (90,91).
Quando comparado com a baciloscopia, a cultura requer mais equipamentos
laboratoriais, além de ser demorada fornecendo resultados somente após 4 a 8
semanas (92). Esse atraso de diagnóstico é letal para pacientes co-infectados
pelo HIV, evidenciado em estudos de autópsia que revelam a TB, muitas vezes
não diagnosticada antemortem, como a principal causa de óbito de infectados
pelo HIV (93-95).
Sistemas de cultura líquida tais como, BACTEC MGIT 960® (Becton
Dickinson), e MGIT® (Tubo Indicador de Crescimento de Micobactérias, Becton
Dickinson) fornecem resultados mais rápidos é são mais sensíveis do que meios
sólidos de cultura (96-98). A utilização de um meio de cultura sólido combinado
com um meio de cultura líquido melhora a detecção das micobactérias, mas tais
sistemas de cultura líquida têm como desvantagem o alto custo do equipamento,
do insumo e aumento do risco de contágio durante a manipulação (99,100).
O teste de detecção e susceptibilidade por observação microscópica
(MODS) é utilizado para detecção de micobactérias e para detectar resistência a
drogas antituberculose. O teste utiliza a inoculação de amostras de escarro
16
descontaminado em placas contendo o meio líquido enriquecido Midllebrook 7H9,
seguido do uso do microscópio de luz invertida para detecção de crescimento
bacteriano (101,102).
O MODS em relação a outros meios líquidos de cultura oferece uma
detecção mais rápida, sendo mais sensível que a cultura em meio sólido para
detectar micobactérias. O teste possui baixo custo, é sensível e especifico para
detectar TB isolada e associada ao HIV, mas requer laboratório com elevado
grau de biossegurança, em razão do uso de meio líquido em placas que aumenta
o risco de contagio durante a execução do teste (103-105).
1.5.5 Testes Baseados na Amplificação de Ácido Nucléico
A reação em cadeia da polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) é
a técnica mais estudada de amplificação de ácido nucléico visando à detecção
direta do M. tuberculosis em espécimes clínicos sem a necessidade prévia de
cultura, tendo como vantagem redução do tempo de detecção do M. tuberculosis
(106). Há testes in-house, baseados em protocolos desenvolvidos em
laboratórios de pesquisa e kits comerciais de PCR e ambos possuem alta
sensibilidade e especificidade (107).
O Teste Amplificado Direto - AMTD® (Gen-Probe) e Amplicor® (Roche
Molecular Systems) são testes de amplificação de ácidos nucléico (TAANs)
disponíveis comercialmente. Quando comparados com a cultura são mais rápidos
e possuem alta sensibilidade e especificidade em amostras de escarro com
baciloscopia positiva, mas sensibilidade variável em amostras biológicas de
origem extrapulmonar (108,109). Os TAANs comerciais demostram baixa
sensibilidade em paciente com baciloscopia negativa, não substituem os testes
convencionais para o diagnóstico da TB e devem sem interpretados em conjunto
com dados clínicos do paciente (109-111).
A técnica de PCR tem mostrado ser o método mais efetivo quando a
combinação de achados clínicos, radiológicos e microbiológicos não estabelece o
diagnóstico (112). A qualidade do escarro e a escolha do DNA alvo e dos primers
17
dentro da sequência do DNA influenciam no desempenho do PCR o que pode
levar a uma grande variabilidade nos resultados e a sua utilização na rotina de
laboratórios com recursos limitados é difícil por exigir equipamentos adicionais e
técnicos laboratoriais especializados em biologia molecular (113,114).
O teste molecular Xpert® MTB/RIF (Cepheid), é utilizado na detecção
simultaneamente do M. tuberculosis e resistência à rifampicina sem necessitar
de recursos humanos e laboratórios especializados em biologia molecular (115).
O teste integra processamento do escarro com NaOH e isopropanol e PCR em
cartucho descartável contendo todos os reagentes necessários para reação, é
sensível para detectar M. tuberculosis fornecendo resultados em menos de 2
horas (116).
O Xpert® MTB/RIF é mais sensível do que a baciloscopia e possui maior
sensibilidade em pacientes com baciloscopia positiva do que em pacientes com
baciloscopia negativa (117). Dentre as desvantagens do teste estão, o custo
elevado do kit (cartucho e reagente), quando comparado com a baciloscopia e
cultura, a necessidade de calibração anual do equipamento, de fonte de energia
elétrica estável e de testes adicionais para confirmar resistência à rifampicina
(117,118).
A cultura de escarro em meio sólido, apesar de ser demorada e não
detectar todos os casos de tuberculose é o método utilizado para confirmação
etiológica desses casos. Métodos mais sensíveis, como cultura líquida e técnicas
moleculares, que reduzem o tempo de identificação de espécie, são mais
onerosos para utilização em rotina de laboratórios de saúde pública.
A limitação do método de baciloscopia direta de escarro reside na sua
baixa sensibilidade e incapacidade de discriminar a espécie de micobactéria
presente na amostra analisada. Apesar disso, a baciloscopia mantém-se útil no
diagnóstico laboratorial da TB pulmonar e na monitorização da resposta à
terapêutica, sendo em algumas regiões, a única ferramenta laboratorial
disponível para detectar a presença do bacilo.
18
São poucos os estudos sobre a contribuição de métodos físicos e químicos
na sensibilidade da baciloscopia e sobre a baciloscopia após concentração do
escarro em MFP em população com alta prevalência de tuberculose, associada
ou não ao HIV. Além disso, estudos de acurácia de métodos baciloscópicos são
importantes para ajudar a definir o melhor método para o diagnóstico laboratorial
da tuberculose pulmonar permitindo medidas terapêuticas precoces e
consequentemente uma melhora no prognóstico dos pacientes afetados pela TB,
diminuindo a morbidade e mortalidade da doença e auxiliando no controle da
endemia.
Em virtude da baixa sensibilidade da baciloscopia, da cultura em meio
sólido ser demorada e dos métodos moleculares e sistemas de cultura líquida
não estarem amplamente disponíveis na rotina de laboratórios de saúde pública,
há necessidade do desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico ou de
estudos que contribuam para melhoria das ferramentas existentes. O presente
projeto é um estudo para avaliar a acurácia de três métodos de baciloscopia de
escarro (após tratamento do escarro com NALC seguindo por centrifugação, após
centrifugação sem NALC e baciloscopia em MFP) para o diagnóstico laboratorial
da tuberculose pulmonar.
19
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar a acurácia de três métodos de baciloscopia para o diagnóstico
laboratorial da tuberculose pulmonar.
2.2 Específicos
2.2.1 Estimar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor
preditivo negativo da baciloscopia após centrifugação com NALC, após
centrifugação sem NALC e da baciloscopia após concentração do escarro em
membranas de filtração de policarbonato (MFP).
2.2.2 Comparar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor
preditivo negativo da baciloscopia realizada através dos diferentes métodos.
20
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Tipo do Estudo
Trata-se de um estudo para avaliação da acurácia (sensibilidade e
especificidade) de três métodos de baciloscopia para o diagnóstico da
tuberculose pulmonar, considerando como padrão ouro para o diagnóstico o
isolamento do Mycobacterium tuberculosis em cultivo.
3.2 Local do Estudo
O estudo foi realizado com pacientes de duas instituições: Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), onde também foram
realizados os testes laboratoriais do estudo (Figura 9), e Policlínica Cardoso
Fontes. As amostras de escarro foram fornecidas por pacientes atendidos e
internados na FMT-HVD e atendidos na Policlínica Cardoso Fontes no período de
Setembro de 2011 a Janeiro de 2012.
Figura 9: Imagem da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
21
A Policlínica Cardoso Fontes é referência estadual para o controle da TB e
atende as especialidades de saúde como Pneumologia, Cardiologia, Pediatria e
Gastroentereologia. A FMT-HVD foi fundada em 1970 e desempenha três
funções básicas: prestar assistência à saúde; contribuir para a formação dos
recursos humanos nas áreas de doenças tropicais; e desenvolver pesquisa
científica.
A FMT-HVD conta com uma Unidade Ambulatorial com 14 consultórios
médicos, Unidade de Internação Hospitalar Dr. Nelson Antunes, Laboratório de
Análises Clínicas automatizado e as Gerências de Pesquisas, dentre as quais a
gerência de bacteriologia que possui laboratórios especializados para o
diagnóstico de rotina e pesquisa em TB. A Gerência de Bacteriologia possui uma
estrutura laboratorial com uma sala para recebimento de materiais biológicos e
digitação de exames, sala de coleta, sala de microscopia, sala específica para
diagnóstico de meningite, sala de semeadura, sala de preparo de meios de
cultura, sala de esterilização e duas salas para diagnóstico de TB, que contam
com duas cabines de segurança biológica, uma centrífuga com refrigeração e
quatro estufas bacteriológicas.
3.3 Tipo da Amostra
Foi utilizada amostragem não probabilística de conveniência.
3.4 Critérios de Elegibilidade
Foram elegíveis para participar do estudo, pacientes de ambos os
gêneros, com suspeita clínica e radiológica de TB, encaminhados ao serviço da
FMT-HVD e da Policlínica Cardoso Fontes para investigação diagnóstica no
período de Setembro de 2011 a Janeiro de 2012.
3.5 Critérios de Inclusão
A inclusão dos pacientes com suspeita clínica e radiológica de TB ocorreu
de forma consecutiva à medida que compareceram na FMT-HVD e na Policlínica
22
Cardoso Fontes para investigação diagnóstica. Foram incluídos no estudo
pacientes que ainda não estavam em tratamento para TB e que, após leitura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TCLE (ANEXO E) e depois de
devidos esclarecimentos sobre o estudo concordaram em participar mediante
assinatura do TCLE. Uma cópia do TCLE foi entregue a cada paciente incluído no
estudo.
3.6 Critérios de Exclusão á Posteriori
Não foram mantidos no estudo pacientes com volume de escarro inferior a
1,5 ml por não ser suficiente para a realização de todos os testes e pacientes
com exame de cultura contaminado por impossibilitar a comparação do mesmo
com as baciloscopias.
3.7 Coleta dos Dados
A coleta de dados foi realizada de forma prospectiva e executada pelo
autor principal do trabalho. Cada paciente incluído no estudo teve uma ficha de
registro criado no WORD 2007 contendo os dados pessoais, informações clínica,
epidemiológicas e resultados de exames (ANEXO A). O preenchimento da ficha
de registro foi baseada em informações dadas pelo paciente e em prontuários
médicos. Os dados coletados foram armazenados em um banco de dados, criado
no EXCEL 2007.
3.8 Coleta das Amostras de Escarro
Para cada paciente foi solicitado duas amostras de escarro pela manhã em
dois dias consecutivos. As amostras foram coletadas em frascos estéreis
descartáveis de plástico, com tampa de rosca, com capacidade de 35 mL a 50
mL e altura mínima de 40 mm. Depois da entrega da amostra de escarro pelo
paciente, a amostra foi encaminhada imediatamente ao laboratório da Gerência
da Bacteriologia e armazenada em refrigeração a 4º C, sendo processada no
mesmo dia.
23
3.9 Procedimentos Laboratoriais
Todos os procedimentos laboratoriais do estudo (Figura 10) foram
realizados na Gerência de Bacteriologia da FMT-HVD sob condições de
biossegurança. Para manipular os espécimes respiratórios foram seguidos os
Procedimentos Operacionais Padrão (POP) (ANEXO F) preparados a partir do
Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose e outras
Micobactérias do Ministério da Saúde (119) e dos estudos de Fennelly e cols.
(88).
Figura 10: Fluxograma da metodologia realizada no estudo
3.9.1 Baciloscopia após Centrifugação sem NALC
Utilizamos os resultados das baciloscopias após centrifugação sem NALC
realizados na rotina da FMT-HVD. Em uma centrífuga refrigerada os escarros
foram centrifugados a 3.000 x g por 15 minutos. Após centrifugação o
sobrenadante de cada escarro foi desprezado e o sedimento foi ressuspenso em
0,3 mL de água destilada estéril e foi usado para realização dos esfregaços. Os
esfregaços foram fixados sobre a chama do bico de Bunsen e corados pelo
método Ziehl-Neelsen (ZN) conforme descrito no ANEXO F.
24
As lâminas foram observadas ao microscópio de campo claro com
objetiva de imersão (100x), foi pesquisado a presença de BAAR em 100 campos
e os resultados foram interpretados conforme a escala semi-quantitativa descrita
no Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da Tuberculose do Ministério da
Saúde (119).
Relatou-se a quantidade de BAAR encontrado: quando encontrados 1 a 9
BAAR em 100 campos.
Positivo (+): quando encontrados 10 a 99 BAAR em 100 campos.
Positivo (++): quando encontrado em média 1 a 10 bacilos por campo,
nos primeiros 50 campos observados.
Positivo (+++): quando encontrado em média de 10 BAAR por campo,
nos primeiros 20 campos observados.
Resultado negativo: quando não foram encontrados BAAR em 100
campos.
3.9.2 Cultura
Os escarros concentrados por centrifugação foram descontaminados pelo
método de Ogawa Kudoh (OK) e após descontaminação foram semeados
diretamente no meio de cultura OK. Para descontaminar os escarros, foi
introduzido um swab estéril em cada escarro e após serem embebidos nos
escarros, os swabs foram colocados em tubos contendo solução de NaOH 4%
por 2 minutos.
Após o término de 2 minutos, os swabs foram passados imediatamente na
superfície dos meios OK, utilizando movimentos rotatórios e em zigue-zague. Os
meios de cultura foram colocados em estufa bacteriológica a 36 ± 1ºC. Os tubos
semeados foram lidos após 48 horas de incubação e posteriormente de 7 em 7
dias até completar 8 semanas.
Nos tubos onde houve crescimento de Unidade Formadora de Colônias
(UFC) foi confirmado a presença de BAAR pela microscopia. Se houve somente
a presença de outros microorganismos que não fossem BAAR, o resultado da
25
cultura foi emitido como contaminada, se não houve crescimento após 8
semanas o resultado foi emitido como cultura negativa e se confirmada a
presença de BAAR, os resultados foram informados da seguinte maneira:
Cultura Positiva = Menos de 20 colônias
Cultura Positiva (+) = 20 a 100 colônias
Cultura Positiva (++) = Mais de 100 colônias separadas
Cultura Positiva (+++) = Colônias confluentes (tapete)
As micobactérias foram identificadas usando os critérios de morfologia e
pigmentação das colônias, microscopia, teste da niacina, teste de inibição de
crescimento em meio com ácido p-nitrobenzóico (PNB) e teste de inibição de
crescimento em meio com hidrazida do ácido tiofeno 2-carboxílico.
3.9.3 Digestão e Descontaminação do Escarro
Os escarros foram digeridos e descontaminados com NALC diluído em
uma solução de NaOH 5%-Citrato de sódio 2,9% em um volume correspondente
a 10% do volume de cada escarro, a temperatura de 20ºC por 15 minutos. Após
processo de digestão e descontaminação as amostras foram divididas em duas
alíquotas. Alíquota 1 (mínimo 0,5 mL) foi destinada à realização de baciloscopia
com NALC concentrada por centrifugação e a Alíquota 2: (mínimo 0,5 mL) foi
destinada à realização da baciloscopia em MFP.
3.9.4 Baciloscopia após Centrifugação com NALC
Em cada tubo de centrífuga contendo escarro digerido foi adicionado
solução tampão fosfato pH 6,8 e em seguida em uma centrífuga refrigerada os
escarros foram centrifugados a 3.000 x g por 15 minutos. Após centrifugação o
sobrenadante de cada escarro foi desprezado e o sedimento foi ressuspenso em
0,3 mL de água destilada estéril e foi usado para realização dos esfregaços. Os
esfregaços foram fixados sobre a chama do bico de Bunsen e corados pelo
método de Ziehl-Neelsen conforme descrito no ANEXO F. As leituras das lâminas
e a interpretação dos resultados foram descritos conforme no item 4.9.1.
26
3.9.5 Baciloscopia em MFP
3.9.5.1 Processamento do Escarro
Em cada tubo de centrífuga contendo escarro digerido, foram adicionados
2 mL de Hipoclorito de sódio (NaOCl 5%), volume referente a duas vezes o
volume inicial de cada escarro. Em seguida os escarros foram homogeneizados e
mantidos á temperatura ambiente por 15 minutos. Após o término dos 15 minutos
foi adicionado etanol95%/triton1% no volume referente ao mesmo volume de
cada mistura (1mL da amostra + 2 mL de NaOCl 5%). As misturas finais (amostra
+ NaOCl 5%+ etanol95%/triton1%) foram homogeneizadas por 15 segundos e
mantidas à temperatura ambiente até o momento do procedimento de filtração
dos escarros (Figura 11).
Figura 11: Fluxograma do processamento do escarro.
3.9.5.2 Montagem do Sistema de Filtração
O sistema possui os seguintes componentes: 1) Coletor de vácuo em aço
inoxidável com 10 pontos de filtração e válvulas de fechamento manual; 2)
Suporte de filtros (Figura 12A), formado pelo pré-filtro com membrana de nylon
25 mm com poros de 30 μm e pelo filtro com membrana de filtração de
policarbonato (MFP) branca de 13 mm com poros de 0.8μm (Millipore) e 3)
27
Bomba de vácuo para a aplicação de pressão negativa (5 mmHg). Para
montagem do filtro, foi inserido as peças na seguinte ordem: anel fino, base de
metal, membrana de policarbonato branca (Osmonics) de 13 mm, com poros de
0,8 µm, anel grosso e anel preto na extremidade da peça inferior do filtro
(Figuras 12B).
Figura 12: Imagem do suporte de filtros. (12A) Sistema de filtros montado. (12B) Peças
do filtro.
Para montar o pré-filtro (Figura 13A), foi inserido as peças na seguinte
ordem: base de polipropileno, membrana de nylon 25 mm com poros de 30 µm e
anel fino (Figura13B,13C,13D). Após montagem do pré-filtro (Figura 13E), o
mesmo foi encaixado sobre o filtro para formar o suporte de filtros (Figura 13F).
Figura 13: Imagem com a sequência de montagem do pré-filtro e do suporte de filtros.
(13A) Peças do pré-filtro. (13B,13C e 13D) Encaixe das peças. (13E) Pré-filtro montado.
(13F) Encaixe do filtro com o pré-filtro formando o suporte de filtros.
28
3.9.5.3 Filtração dos Escarros Processados
Sobre o tubo contendo os escarros processados foi enroscado o suporte
de filtros (Figura14A). O conjunto inteiro (tubo e suporte de filtros) foi inserido nos
pontos de sucção (Figura 14B), em seguida os escarros foram filtrados através
das MFP utilizando bomba de vácuo para a aplicação da pressão.
Figura 14: Imagem com a sequência montagem do sistema de filtração. (14A) Encaixe
do suporte de filtros ao tubo contendo o escarro. (14B) Inserção do conjunto inteiro
(tubo e suporte de filtros) nos pontos de sucção do equipamento.
Após passagem dos escarros pelas MFP, as válvulas do equipamento
foram fechadas e foram removidos os pré-filtros, o anel grosso do filtro e o anel
fino de cada filtro (Figura 15A e 15B). Os filtros foram aquecidos por 10 minutos
em uma manta aquecedora, após aquecimento os filtros foram novamente
inseridos no ponto de sucção. As MFP foram coradas nos filtros (Figura15C) pelo
método Kinyoun conforme descrito no ANEXO F. Depois de coradas as
membranas foram transferidas para lâminas previamente identificadas.
29
Figura 15: Imagem com a representação da coloração das membranas. (15A e 15B).
Remoção do pré-filtro e do anel grosso. (15C) Adição do corante. (15D) Membrana
corada.
Depois de secas foi adicionado, uma gota de citifluor nas bordas outra no
centro e uma lamínula sobre cada membrana (Figura 15D). A leitura das lâminas
e a interpretação dos resultados foram realizados conforme descrito no item
4.9.1. A leitura foi realizada em até 24hs após preparo da lâmina, uma vez que a
coloração se perde com o passar do tempo.
30
Figura 16: Fluxograma dos procedimentos laboratoriais
31
3.10 Leitura Cega dos Resultados
As lâminas foram lidas por três microscopistas distintos, de maneira cega,
ou seja, o pesquisador responsável pela leitura das lâminas da baciloscopias em
MFP não teve acesso ao resultado da leitura das lâminas da baciloscopia após
centrifugação com NALC, da baciloscopia após centrifugação sem NALC, cultura
e vice – versa.
Com o objetivo de cobrir as identificações geradas pelo sistema da FMT-
HVD, as lâminas da baciloscopia em MFP e da baciloscopia após centrifugação
com NALC receberam uma etiqueta numerada de acordo com a quantidade de
amostra processada no dia, ou seja, se foi processado 10 amostras então as
lâminas foram enumeradas de 1 à 10. As reais identificações das lâminas
respectivos códigos foram anotados em um caderno. As lâminas da baciloscopia
sem NALC receberam identificações geradas pelo sistema da FMT-HVD.
3.11 Análise Estatística
Os dados transferidos para o banco de dados foram tabulados em uma
tabela 2x2 com os resultados das baciloscopias e das respectivas culturas. A
sensibilidade e especificidade das baciloscopias foram estimadas com um
intervalo de confiança de 95%, e foi determinada sempre pela primeira amostra
de escarro com o resultado da cultura finalizada como positivo e negativo.
Utilizamos a segunda amostra de escarro para analisar o incremento oferecido
pela mesma.
Os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor
preditivo negativo dos métodos realizados no estudo foram calculados através da
análise dos resultados comparados á cultura com o auxílio do programa
estatístico EpiInfo (version 3.5.3). A concordância entre os métodos de
baciloscopias em relação à cultura foi avaliada através do índice Kappa. Os
valores do índice Kappa obtidos foram interpretados conforme a escala de
valores com suas respectivas interpretações mostrada na tabela 1.
32
Tabela 1: Escala de concordância Kappa
Fonte: Adaptado de Landis & Koch, Biometrics, 1977
3.12 Aspectos Éticos
O presente estudo faz parte do projeto ”Aperfeiçoamento e Avaliação do
Sistema de Concentração por Filtração de Amostras de Escarro para o
Diagnóstico da Tuberculose.“ aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
(CEP) da FMT-HVD, Protocolo n. 1845/2011 de 09/09/11 (ANEXO D).
33
4. RESULTADOS
O resultado e discussão desta pesquisa estão apresentados na forma de
artigo apresentado a seguir segundo as normas de publicação do Journal of
Clinical Microbiology (JCM).
34
Aumento da sensibilidade no diagnóstico de tuberculose em pacientes HIV
através da baciloscopia após concentração do escarro por filtração em
membrana de policarbonato
Baciloscopia de escarro em pacientes HIV
Patrícia Quincó1#, Samira Bührer-Sékula23, Walber Brandão2, Rossiclea Monte2,
Silvia Leopoldina2, Moises Palaci4, Reynaldo Dietze4, Marcelo Cordeiro dos
Santos12.
1. Universidade do Estado do Amazonas/Pós-Graduação em Medicina Tropical,
Manaus, Amazonas, Brasil.
2. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus,
Amazonas, Brasil.
3. Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública.Goiânia, Goiás, Brasil.
4. Núcleo de Doenças Infecciosas, Universidade Federal do Espírito Santo,
Vitória, ES, Brasil.
Autor correspondente (#):
Marcelo Cordeiro dos Santos
Email: marcelocordeiro.br@gmail
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Pós-Graduação em
Medicina Tropical.
Avenida Pedro Teixeira, 25, Dom Pedro, Manaus, Amazonas, Brasil.
Telefone: 55 92 2127 3507
35
RESUMO
A baciloscopia direta de escarro é ferramenta de diagnóstico fundamental
principalmente onde testes mais sensíveis não estão disponíveis. A sensibilidade
do método fica em torno de 50%, decrescendo em suspeitos de TB infectados
pelo HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). Tivemos por objetivo avaliar
acurácia de três métodos de baciloscopia para o diagnóstico laboratorial da TB
pulmonar. Comparamos acurácia de três métodos (baciloscopia com e sem
tratamento do escarro com NALC seguido por centrifugação e após filtração do
escarro através de membrana de policarbonato - FMP) com cultura em meio
Ogawa Kudoh como padrão ouro. Os escarros foram obtidos de 508 suspeitos de
TB pulmonar, da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado e
Policlínica Cardoso Fontes. Maioria HIV positivos. Comparando com cultura o
FMP foi o método de baciloscopia mais sensível. Em HIV infectados a
sensibilidade do FMP foi significativamente maior que após centrifugação do
escarro tratado com NALC e sem NALC (61,9%, 47,6% e 45,2% p=0,001)
respectivamente. Em não infectados pelo HIV o método FMP foi
significativamente maior que com e sem NALC (81,8%, 63,6% e 57,5%,
p=0,001). Nos dois grupos, não houve diferenças significativas entre as
especificidades dos métodos estudados. O incremento oferecido pelo segundo
escarro foi de 13%, 11% e 4% nas baciloscopias após centrifugação com e sem
NALC e em FMP. A concordância dos métodos com a cultura foi boa (k>0.6<0.8),
mas em HIV infectados foi regular (k>0.4<0.6). Análise microscópica do escarro
tratado com NALC, comparado sem NALC, não aumentou a sensibilidade da
baciloscopia. De modo geral a sensibilidade do FMP foi superior em comparação
com os outros dois métodos estudados, sem perda de especificidade.
Palavras-chaves: Baciloscopia. Centrifugação. Filtração.
36
INTRODUÇÃO
Em 2010 ocorreram 8,8 milhões de casos novos de tuberculose (TB) no
mundo, desse total, 1,1 milhões eram pacientes infectados pelo vírus da
imunodeficiência humana (HIV) (1). Pacientes co-infectados por TB/HIV apresentam
taxas de mortalidade mais elevadas do que pacientes com TB não infectados (2, 3).
Estudos de autópsia confirmam que TB é uma das principais causas de morte de
infectados pelo HIV (4, 5), ressaltando a importância do diagnóstico e do tratamento
precoce da doença na redução da mortalidade e da transmissão (4, 6).
Diagnósticar TB em infectados pelo HIV é um desafio, onde a clínica e os
achados radiográficos são muitas vezes atípicos (7, 8) e nos casos de baciloscopia
negativa não ajudam no diagnóstico da TB pulmonar (9). A baciloscopia de escarro,
amplamente utilizada e importante ferramenta em cenários onde a cultura não está
disponivel, apresenta baixa sensibilidade decrescendo em suspeitos de TB
infectados pelo HIV (10-12).
A baciloscopia após filtração do escarro através de membrana de
policarbonato (FMP) mostrou ser mais sensível e específica do que as baciloscopias
direta e após centrifugação (13, 14). Avaliamos este método em população de
suspeitos sendo com a maioria HIV positivos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Desenho e local. Estudo prospectivo e cego realizado no período de setembro
de 2011 a janeiro de 2012, em Manaus, Amazonas, Brasil com pacientes do hospital
da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) e do centro
de referência regional para TB, Policlínica Cardoso Fontes.
37
Recrutamento. Foram elegíveis para participar do estudo pacientes com
suspeita clínica, radiológica de TB. A inclusão dos pacientes no estudo ocorreu de
forma consecutiva à medida que compareceram nos serviços acima citados. A coleta
dos dados clínicos e demográficos da população do estudo foi realizadade de forma
prospectiva e foi baseada em informações dos prontuários médicos.
Coleta das amostras. Dos 508 pacientes recrutados foram solicitadas duas
amostras de escarro em dois dias consecutivos. A 2ª amostra de escarro foi
fornecida por 227 pacientes.
Baciloscopia após centrifugação. Os esfregaços foram preparados após
centrifugação a 3000gx a 4ºC por 15 min. e corados pelo método Ziehl-Neelsen (ZN)
(Figura 1).
Baciloscopia após centrifugação com NALC. Amostras de escarro, com
volume igual ou superior a 1,5 ml, foram digeridas com NALC diluído em uma
solução de NaOH 5%-Citrato de sódio 2,9% em um volume correspondente a 10%
do escarro, a temperatura de 20ºC por 15 min. A aliquota foi dividida em duas, na
primeira aliquota foi adicionado tampão fosfato pH 6,8 e após centrifugação a 3000
gx a 4ºC durante 15 min. foi realizado esfregaço do sedimento e corado pelo método
ZN.
Características do sistema de filtração. O sistema possui os seguintes
componentes: 1) Sistema de vácuo em aço inoxidável com 10 pontos de filtração e
válvulas de fechamento manual; 2) Sistema de filtros, formado pelo pré-filtro com
membrana de nylon 25 mm com poros de 30 μm e pelo filtro com membrana de
policarbonato branca de 13 mm com poros de 0.8μm (Millipore) e 3) Bomba de
vácuo para a aplicação de pressão negativa (5 mmHg).
38
Baciloscopia pelo método FMP. Na segunda alíquota, digerida e
descontaminada, foi adicionado hipoclorito de sódio (NaOCl 5%) no volume
referente a duas vezes o volume da alíquota. Em seguida a amostra foi
homogeneizada por 15 min. Foi adicionado etanol 95%/triton1% em quantidade igual
ao volume da mistura e homogeneizada por 15 segundos. Após passagem dos
escarros pelos sistemas de filtros, as válvulas foram fechadas e as membranas
foram coradas pelo método Kinyoun. As membranas foram transferidas para lâminas
de microscopia e foi colocado uma lamínula em cima de cada lâmina para leitura
microscópica.
Leitura e interpretação das microscopias. As lâminas foram observadas ao
microscópio de campo claro com objetiva de imersão (100X) para pesquisa de
Bacilo Álcool-Ácido Resistente (BAAR) em 100 campos e interpretado conforme a
escala semi-quantitativa descrita no Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e outras Micobactérias do Ministerio da Saúde (15).
Cultura em meio Ogawa Kudoh (OK) – padrão ouro. Os escarros foram
descontaminados pelo método de OK(15, 16) e semeados no meio de cultura. As
culturas foram colocadas em estufa bacteriológica a 37°C e lidas até completar 8
semanas. Os resultados das culturas foram relatados como: negativo, sem
crescimento ou positivo, quando houve o crescimento de Unidade Formadora de
Colônias com presença de BAAR confirmada pela microscopia.
Identificação dos isolados de Micobactérias: Isolados de M. tuberculosis foram
identificados usando os critérios de morfologia e pigmentação das colônias,
microscopia, teste da niacina, teste de inibição de crescimento em meio com ácido
p-nitrobenzóico (PNB) e teste de inibição de crescimento em meio com hidrazida do
ácido tiofeno 2-carboxílico.
39
Análise estatística. A sensibilidade, especificidade e os valores preditivos dos
testes foram estimados com um intervalo de confiança de 95%, e foi determinada
pela primeira amostra de escarro com o resultado da cultura finalizado como positivo
e negativo. Para verificação da concordância entre métodos diagnósticos utilizou-se
o índice de Kappa. Os dados foram analisados com EpiInfo (version 3.5.3).
Aspectos éticos. Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Protocolo n. 1845/2011, de 09/09/11.
Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE).
RESULTADOS
População e amostras do estudo: Foram elegíveis para participar do estudo 508
pacientes com suspeita clínica e radiológica de TB (Figura 2). Dos 76 pacientes
excluídos da análise, 3,5%(18/508) tiveram a cultura contaminada, 9,6% (49/508) o
sistema não filtrou os escarros e 1,8% (9/508) forneceram amostra com volume
inferior a 1,5 ml.
As características dos 432 participantes do estudo estão resumidas na Tabela 1. A
média de idade foi de 38,9 anos, 64% (276/432) eram do sexo masculino, 85%
(369/432) eram pacientes ambulatórias e 60% (261/432) eram pacientes infectados
pelo HIV. Setenta e cinco pacientes tiveram cultura positiva na primeira amostra de
escarro, desses 56% (42/75) eram infectados pelo HIV. Pacientes HIV positivo com
cultura positiva apresentaram menor contagem de CD4 do que pacientes com
cultura negativa (média 67 versus 214, p<0.001).
Concordância dos métodos de baciloscopia com padrão ouro: A tabela 2
apresenta as concordâncias entre a cultura de escarro e as baciloscopias realizadas
com os diferentes métodos. Observamos uma concordância boa com todos os
40
métodos sendo que apenas no grupo de pacientes HIV positivo a concordância entre
cultura e as baciloscopias após centrifugação com e sem NALC foi regular, k=0.55 e
k=0,578 respectivamente.
Desempenho dos métodos de baciloscopia: A sensibilidade obtida no método de
baciloscopia em FMP foi maior do que a sensibilidade das baciloscopias após
centrifugação quando tratadas ou não com NALC, (70.6% versus 54.6%, p=0.001) e
(70.6% versus 50.6%, p=0.001), respectivamente. Observamos que no grupo de
pacientes HIV positivo e negativos a maior sensibilidade foi do FMP, 61,9% e 81,8%
respectivamente. Não foi observada diferenças estatisticamente significante entre a
sensibilidade das baciloscopias após centrifugação com e sem NALC, (p>0.246)
(Tabela 3). Em HIV infectados e não infectados não houve diferenças significantes
entre as especificidades dos métodos de baciloscopia estudados (p=<1.00 e
p=<0.13 respectivamente).
Incremento da segunda amostra: Analisamos 227 pacientes que coletaram duas
amostras de escarro, desses 47 tiveram cultura positivas. Para calcular o incremento
da segunda amostra o numerador foram todos pacientes cujo primeiro escarro não
foi positivo, mas o segundo foi positivo e o denominador foi o número total de
pacientes diagnosticados com a doença. A segunda amostra de escarro apresentou
incremento de 11% (5/47) na baciloscopia após centrifugação sem NALC, 13%
(6/47) na baciloscopia após centrifugação com NALC e 4% (2/47) em FMP. Das 47
culturas apenas 3 pacientes eram HIV negativos portanto não estratificamos por
grupos para analisar o incremento.
41
DISCUSSÃO
A baciloscopia em pacientes HIV positivo é menos sensível e métodos rápidos que
auxiliem no diagnóstico podem mudar o prognóstico dos pacientes com co-infecção
TB/HIV. O método de baciloscopia em FMP na população de HIV positivos e HIV
negativos foi mais sensível, 61,9% e 81,8% respectivamente que as outras
baciloscopias estudadas. A sensibilidade de 81,8% nos HIV negativos foi
semelhante aos 80% e 89% relatadas por Smithwick & Stratigos (20) e Fennelly et
al. (8) respectivamente. Além disto, observamos que a sensibilidade no grupo HIV
positivo obtida com método FMP (61.9%) foi superior às de 47,6% e 45,2% das
baciloscopias após centrifugação com e sem NALC, respectivamente.
Quando comparamos a sensibilidade da baciloscopia após centrifugação sem NALC
com a da baciloscopia com NALC, não foi observada diferenças estatisticamente
significante tanto no grupo de pacientes HIV positivo quanto no grupo de HIV
negativo. Esses achados não foram previamente relatados (17).
A especificidade da baciloscopia após centrifugação com NALC e sem NALC foi
igual, tanto em pacientes HIV infectados quanto em pacientes não infectados. O
valor da especificidade da baciloscopia após centrifugação com NALC no grupo HIV
infectados e no grupo de não infectados (99% e 99.3%) respectivamente, são
consistentes com os resultados de outros estudos (17-19).
Em pacientes infectados pelo HIV, a sensibilidade da baciloscopia após
centrifugação combinada com NALC (47,6%) foi menor que a sensibilidade de 52%
encontrada em estudo que incluiu pacientes hospitalizados(18), 61.8% em estudo
que utilizou como critério de elegibilidade a contagem de CD4>200 células /mm³(20)
e 72% encontrada em um estudo que utilizou microscopia de fluorescência (21), mas
42
foi similar a sensibilidade (44%) encontrada em estudo com 166 suspeitos de TB em
um laboratório de referência na África(22) que incluiu pacientes de ambulatório
como em nosso estudo. As diferenças nas metodologias utilizadas talvez explique as
diferenças observadas.
Quando analisamos todo o grupo, a concordância de todas as baciloscopia (FMP,
após centrifugação com e sem NALC), com a cultura foi boa (Kappa=0.73, 0.64 e
0.60). Embora classificada como boa concordância ressalta-se que a baciloscopia
em FMP poderia ter apresentado um desempenho melhor, não fossem as amostras
positivas para 9 culturas negativas. Pesquisamos no Sistema Nacional de
Informação de Notificações de Agravos e buscamos dados laboratoriais adicionais
destes 9 pacientes. Dos nove, 3 também foram positivos nas baciloscopias após
centrifugação com e sem NALC, sendo que 2 eram pacientes HIV positivos que
foram a óbito por sepse e um foi diagnosticado com TB pulmonar através da clínica
e da 3ª cultura de escarro, e encontra-se em tratamento. Dos 6 pacientes que
tiveram apenas a baciloscopia em FMP positiva, 4 foram diagnosticados com TB
pulmonar com base em dados clínicos e em achados radiológicos e tiveram cura
como desfecho, dois foram diagnosticado através da 3ª cultura de escarro, um com
TB pulmonar e extrapulmonar e outro com TB pulmonar. Esses achados sugerem
que as duas culturas de escarro realizados neste estudo não foi sensível o suficiente
para detectar esses nove casos.
No grupo de HIV infectados a concordância das baciloscopias após centrifugação
com e sem NALC foi regular (Kappa=0.57 e 0.55), coerente com o grupo estudado
para o qual a sensibilidade das baciloscopias é em geral mais baixa.
43
Devido a alta sensibilidade do método de baciloscopia em FMP na primeira amostra,
os resultados sugerem que a realização do método em FMP na segunda amostra de
escarro poderia ser dispensada, no entanto neste estudo, o número de pacientes
com cultura positiva que coletaram a segunda amostra foi restrito.
Uma das limitações do estudo foi a não utilização de meios líquidos para cultura que
poderiam ter influenciado na sensibilidade e especificidade dos resultados obtidos.
Apesar dos microscopistas serem experientes e a leitura das microscopias ter sido
“cega” não foi realizado controle de qualidade nas leituras das baciloscopias após
centrifugação sem NALC e em FMP. Leitura posterior no caso da FMP não é
possível, pois observamos perda na coloração dos bacilos após 24hs.
O método de baciloscopia em FMP, apesar de ter baixo custo (3 reais por teste), é
trabalhoso, pois a higienização do sistema de filtração é manual e demorada (50
minutos), além disto, a dificuldade técnica apresentada com 10% (49) das amostras
de escarro não sendo filtradas demonstra a necessidade de aperfeiçoar o sistema
antes mesmo de avaliá-lo na rotina laboratorial de locais com alta prevalência da
doença isolada e associada ao HIV visto que não avaliamos o mesmo em condições
de rotina.
Conclusão
O tratamento do escarro com NALC não incrementou a sensibilidade da
baciloscopia após centrifugação indicando que o método com a menor complexidade
acelera o processo de diagnóstico.
A sensibilidade do método FMP no grupo HIV positivo foi superior a todas as
outras técnicas utilizadas sem perda da especificidade podendo ser uma
44
metodologia útil no diagnóstico deste grupo de risco, diminuindo a morbidade e
melhorando o prognóstico dos pacientes.
Referências
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45
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46
FIGURA 1. Esquema do processamento das amostras de escarros
FIGURA 2. População e amostras do estudo
47
TABELA 1: Características demográficas e clínicas
Características Total (N=432)
Cultura positiva (N=83)
Cultura negativa (n=349)
Idade, anos Mediana (IQR) Média (DP)
37.0 (18-86)
38.9 (14.2)
32.0 (18-76) 34.7 (12.3)
38.0(18.0-86)
39.8 (14.9)
Sexo Feminino Masculino
156 (36%) 276 (64%)
26 (31%) 57 (69%)
130 (37%) 219 (63%)
Local da seleção FMT-HVD Cardoso Fontes
338 (78%) 94 (22%)
60 (72%) 23 (28%)
278 (80%) 71 (20%)
Procedência Ambulatório Enfermaria
369 (85%) 63 (15%)
61 (73%) 22 (27%)
308 (88%) 41 (12%)
Infecção pelo HIV Sim Não
261 (60%) 171 (40%)
43 (52%)
40 (48%)
218 (62%) 131 (38%)
Contagem de CD4 (células/mm³) Mediana (IQR) Média (DP)
178(11-870)
193 (153)
45 (11-315)
67 (56)
189 (16-870)
214 (154)
Tipo de caso suspeito Novo caso suspeito Suspeito de TB após abandono de tratamento Recidiva de TB após cura
419 (97%)
3 (1%)
10 (2%)
80 (96%)
3 (4%)
339 (97%)
3 (1%)
7 (2%)
Abreviações :IQR, Variação Interquartil; DP, Desvios Padrão; HIV, Vírus da Imunodeficiência Humana; TB, Tuberculose.
TABELA 2: Concordância entre métodos de baciloscopia em relação ao cultivo nos diferentes
grupos analisados
Centrifugada Centrifugada - NALC FMP
Cultura POS NEG POS NEG POS NEG
Total POS 38 37 41 34 53 22 432 NEG 3 354 3 354 9 348
Concordância 90,7% 91,4% 92,8% Kappa 0,606 0,643 0,732
HIV Positivo POS 19 23 20 22 26 16 N=261 NEG 2 217 2 217 3 216
Concordância 90,4% 90,8% 92,7% Kappa 0,555 0,578 0,697
HIV Negativo POS 19 14 21 12 27 6 N=171 NEG 1 137 1 137 6 132
Concordância 91,2% 92,3% 92,9% Kappa 0,668 0,720 0,774
48
TABELA 3: Parâmetros de desempenho dos métodos de baciloscopia comparados com cultura
Baciloscopia
Todos Pacientes
(N=432)
Pacientes HIV +
(N=261)
Pacientes HIV-
(N=171)
Centrifugada % (CI 95%) Sensibilidade Especificidade VPP VPN
50.6 (38.6-62.6) 99.1 (98.0-100) 92.6(83.4-100) 90.5(87.5-93.5)
45.2(28.9-61.4)
99(97.3-100) 90.4(75.5-100) 89.6(85.4-93.8)
57.5(39.2-75.9) 99.3(97.7-100) 95.00(82.9-100) 91.7(87.2-96.1)
Centrifugada com NALC % (CI 95%) Sensibilidade Especificidade VPP VPN
54.6(42.7-66.6) 99.1(98.0-100) 93.1(84.6-100) 91.2(88.2-94.1)
47.6(31.3-63.9)
99(97.3-100) 90.9(76.6-100) 90.0(85.8-94.2)
63.6(45.7-81.5) 99.3(97.7-100) 95.4(84.4-100) 92.8(88.6-97.0)
FMP % (CI 95%) Sensibilidade Especificidade VPP VPN
70.6(59.7-81.6) 97.4(95.7-99.2) 85.4(75.9-95.0) 94.0(91.5-96.6)
61.9(46.0-77.7) 98.5(96.5-100) 89.6(76.8-100) 92.5(88.7-96.2)
81.8(67.1-96.4) 96.7(93.7-99.8) 84.3(70.2-98.5) 96.1(92.8-99.5)
Abreviações: Cl, Intervalo de confiança; VPP, Valor Preditivo Positivo; VPN, Valor Preditivo Negativo; HIV, Vírus da Imunodeficiência Humana.*A sensibilidade e especificidade foi estimado pela análise da primeira amostra de escarro de cada paciente com o resultado da cultura finalizada como positiva ou negativa
49
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59
ANEXOS
60
ANEXO A
FICHA DE REGISTRO DO PARTICIPANTE
61
Local da seleção:
Dados clínicos, demográficos e laboratoriais
Nome: ............................................................................. Prontuário:................................
Data de Nascimento: ..../...../..... Idade: ......... Gênero: M F Procedência am enf
Endereço: ......................................................................................... Tel:............................
Bairro: ...................................... Município: ..............................................................
Telefone: ................................
Tipo de caso suspeito: ( ) Novo caso ( ) Suspeito de TB após abandono de tratamento ( )Recidiva de
após cura.
Iniciou tratamento para tuberculose: ( ) Não ( ) Não se sabe ( ) Sim
Sorologia para HIV:
Posit.
Neg.
Recusa
Não realizado
S/ Informação____________________________
Contagem de céluas CD4 + e carga viral quando do diagnóstico da Tuberculose: Contagem de CD4 realizado?
Sim
Não
Sem informação
62
ANEXO B
FICHA DE REGISTRO DA BACILOSCOPIA
63
Registro de Resultados da Baciloscopia em MPF e Cultura
Identificação no projeto:__________
Escarro 1
A. Informações sobre o escarro
Número da amostra:____________ Data da coleta: __/__/_____
Aspecto Físico: Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito
B. Resultado da baciloscopia após filtração
Não realizada Realizada → Data da leitura:___/___/_______
Resultado: Negativo Positivo Positivo + Positivo ++ Positivo +++
Cultura: Positiva Negativa Contaminada Sem exame Sem informação
Escarro 2
C. Informações sobre o escarro
Número da amostra:____________ Data da coleta: __/__/_____
Aspecto Físico: Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito
D. Resultado da baciloscopia após Filtração
Não realizada Realizada → Data da leitura:___/___/_______
Resultado: Negativo Positivo Positivo + Positivo ++ Positivo +++
Cultura: Positiva Negativa Contaminada Sem exame Sem informação
64
Registro de Resultados da Baciloscopia após centrifugação com NALC
Identificação no projeto:__________
Escarro 1
E. Informações sobre o escarro
Número da amostra:____________ Data da coleta: __/__/_____
Aspecto Físico: Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito
F. Resultado da baciloscopia após filtração
Não realizada Realizada → Data da leitura:___/___/_______
Resultado: Negativo Positivo Positivo + Positivo ++ Positivo +++
Escarro 2
G. Informações sobre o escarro
Número da amostra:____________ Data da coleta: __/__/_____
Aspecto Físico: Saliva Mucopurulento Sanguinolento Liquefeito
H. Resultado da baciloscopia após Filtração
Não realizada Realizada → Data da leitura:___/___/_______
Resultado: Negativo Positivo Positivo + Positivo ++ Positivo +++
65
ANEXO C
FICHA PARA LEITURA DA BACILOSCOPIA
66
Ficha para leitura da baciloscopia
67
ANEXO D
PARECER DO CEP DA FMT-HVD
68
69
ANEXO E
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
70
TERMO DE CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA (TCLE)
TÍTULO DO ESTUDO: Aperfeiçoamento e avaliação do sistema de concentração por
filtração de amostras de escarro para diagnóstico da tuberculose.
Patrocínio: FUNDAÇÃO DE APOIO A PESQUISA DO ESTADO DO AMAZONAS-FAPEAM
Nome do Voluntário:_________________________________________________________
Introdução:
Você está sendo convidado à participar de um projeto de pesquisa. Os pesquisadores
responsáveis por este estudo são Silvia Leopoldina Oliveira e Patrícia Enedina de Lima
Quincó. Este termo de consentimento irá informá-lo sobre este estudo e ajudá-lo a decidir se
gostaria de participar do mesmo. A SUA PARTICIPAÇÃO NESTE ESTUDO É VOLUNTÁRIA. Você
tem o direito de recusar ou se retirar do estudo a qualquer momento sem que isto implique
em riscos para seu tratamento médico. Se você concordar em participar do estudo, você
deverá assinar este documento e receber uma cópia do mesmo. Você está sendo convidado a
participar deste estudo porque os médicos sabem ou respeitam que você esteja com
tuberculose (TB).
PORQUE ESTE ESTUDO ESTÁ SENDO REALIZADO?
Este estudo está sendo realizado para determinar se um novo tipo de exame de escarro
(sistema de concentração por filtração de escarro) é melhor do que o método tradicional
utilizado no diagnóstico da tuberculose.
COMO SERÁ SUA PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO?
Se você concordar em participar deste estudo, o escarro que sobrar após a realização dos seus
exames de baciloscopia e cultura serão destinados para testar uma nova técnica chamada
(sistema de concentração por filtração de escarro).
O QUE SERÁ FEITO COM AS AMOSTRAS DE ESCARRO?
A sua amostra de escarro será encaminhada para Laboratório da Gerência de Baciloscopia e
será examinada através do método convencional (baciloscopia direta) e também cultivada em
meio de cultura que contém nutrientes para o crescimento do bacilo da tuberculose de acordo
com o requisitado pelo seu médico. A amostra de escarro que sobrar será utilizada para testar
a nova técnica chamada (sistema de concentração por filtração de escarro). Nós acreditamos
que este novo método pode melhorar ainda mais o diagnóstico da tuberculose.
SE MEU TESTE FOR POSITIVO O MEU MÉDICO RECEBERÁ O EXAME ?
71
Como ainda não temos certeza que este novo método é melhor que o método tradicional
(baciloscopia e cultura) iremos considerar para diagnóstico da sua doença somente os
resultados do método tradicional.
QUAL O SEU TEMPO DE PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO?
Sua participação nesse estudo será inferior a uma semana.
QUEM PODERÁ PARTICIPAR E QUEM NÃO PODERÁ PARTICIPAR DESTE ESTUDO?
Poderão participar deste estudo pessoas de todas as faixas etárias com suspeita de TB.
Pacientes menores de 18 anos que aceitarem participar do estudo, só serão incluídos se os
responsáveis concordarem em assinar o TCLE. Não poderão participar deste estudo,
voluntários que não forem capazes de produzir escarro.
EXISTEM RISCOS AO PARTICIPAR DESTE ESTUDO?
Há risco mínimo na sua participação no estudo. Pode haver um leve incômodo no ato de tossir.
QUAIS SÃO OS BENEFÍCIOS?
É possível que você não tenha nenhum benefício direto ao participar deste estudo, no entanto,
se este novo teste for melhor que o convencional ele poderá substituir o teste antigo e desta
forma melhorar o diagnóstico da doença. Neste caso, este novo método poderá permitir que
mais pessoas possam ser diagnosticadas e tratadas mais rapidamente, e também ajudar a
prevenir a disseminação da doença.
HAVERÁ ALGUMA DESPESA PARA PARTICIPAR DESTE ESTUDO?
Você não terá despesas para participar do estudo. O diagnóstico e tratamento da tuberculose
serão gratuitos e subsidiados pelos respectivos Programas Estaduais e Municipais de Controle
da Tuberculose.
HAVERÁ ALGUM TIPO DE PAGAMENTO?
A sua participação neste estudo é voluntária, você não receberá nenhum tipo de pagamento
pela sua participação no mesmo.
QUAIS SÃO SUAS ALTERNATIVAS CASO NÃO QUEIRA PARTICIPAR DO ESTUDO?
Caso não queira participar do estudo não haverá nenhum prejuízo, inclusive da assistência à
sua saúde e todos seus exames requisitados pelo médico serão realizados.
HAVERÁ CONFIDENCIALIDADE DE SUAS INFORMAÇÕES?
Todas as suas informações serão mantidas confidenciais. Você terá um número de
registro e seu nome não será usado. Se as descobertas desse estudo forem publicadas seu
nome ou sua identificação não serão divulgados. Sua identidade permanecerá confidencial. Ao
72
participar deste estudo, serão coletadas informações pessoais, mas você tem o direito de se
recursar-se a responder às perguntas. Estes dados serão registrados pelos pesquisadores e
médicos que irão arquivá-los. As informações serão guardadas após o término do estudo por 6
anos como recomenda a legislação do país.
QUAIS SÃO OS SEUS DIREITOS?
A sua participação neste estudo é voluntária. Você tem o direito de recusar ou de se retirar do
estudo a qualquer momento sem prejuízo a assistência à sua saúde nesta instituição.
AFIRMAÇÕES DO PACIENTE
Fui esclarecido sobre os objetivos da pesquisa, os procedimentos, riscos e benefícios SIM.......
NÃO .......
Fui esclarecido sobre a liberdade de desistir de participar a qualquer momento, sem que isso
traga prejúizos ao meu atendimento e tratamento. SIM....... NÃO .......
Fui esclarecido de que não haverá remuneração financeira. SIM....... NÃO ...
QUEM VOCÊ PODERÁ CONTACTAR CASO TENHA DÚVIDA?
Se você tiver alguma dúvida sobre seu direito como voluntário na pesquisa, você poderá entrar
em contato com:
Coordenadora do Projeto: Dra. Silvia Leopoldina Santos de Souza Almeida / Tel: (92) 3228-
4833/9104 - 6031 / e-mail [email protected] / Endereço: Rua A19,250 Bairro Planalto
Executora dos testes: Patrícia Enedina de Lima Quincó / Tel: (92) 9200-2959 / e-mail: patrícia-
[email protected] / Endereço: Conj. Versalles Rua 30 Quadra A40, Bairro Planalto
Coordenador do Comitê de Ética e Pesquisa da FMT-HVD: Dr. Francisco Nailson Santos Pinto/
Tel: 8121-0591 / e-mail: [email protected]
Comitê de Ética e Pesquisa da FMT-HVD :Endereço : AV. Pedro Teixeira, 25 – Bairro D. Pedro I
/Tel: (92) 2127-3572
TERMO DE CONSENTIMENTO:
Eu recebi uma cópia deste termo de consentimento e sei que uma cópia ficará guardada no
meu arquivo do estudo. Eu entendo que posso deixar o estudo a qualquer momento que
quiser ou que o médico do estudo pode me pedir para deixar o estudo se ele entender que
esta decisão é melhor para os meus interesses.
73
Eu entendo que se eu colocar minha impressão digital no espaço abaixo, eu estou
concordando em participar do estudo e a realizar todos os procedimentos dos mesmos
estabelecidos neste documento.
Eu expliquei os objetivos deste estudo para o voluntário. Tenho plena convicção que ele/ela
entendeu os objetivos, riscos e benefícios da sua participação no estudo.
Local:________________________ Data:____________/___________/____________
Impressão dactiloscópica Assinatura do Voluntário Nome do Voluntário -impresso
Assinatura do responsável legal Nome do responsável legal
Assinatura da testemunha
Impressão dactiloscópica
Nome da testemunha
Assinatura do investigador Nome do investigador
74
ANEXO F
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
75
Descrever e fornecer informações para uma apropriada coleta de amostras de
escarros destinadas a realização dos exames de baciloscopias e a cultura.
1. Pote para coleta de escarro
2. Papel toalha ou papel higiênico;
3. Luvas;
4. Fita gomada ou etiquetas para identificar o pote da amostra;
5. Pincel permanente para identificar a etiqueta ou a fita gomada.
1. Utilizar luvas, máscaras, aventais e calçados fechados para realização de todos
os procedimentos.
2. Instruir claramente o paciente sobre o procedimento de coleta de escarro.
3. O paciente deve coletar o escarro da antibioticoterapia.
4. A amostra de escarro deve ser coletada em local aberto ao ar livre ou em sala
bem arejada.
5. O escarro deve ser coletado em pote de plástico transparente, de boca larga com
tampa de rosca, fornecido pela Unidade de Saúde FMT-HVD e Policlínica Cardoso
Fontes.
PROCEDIMENTO PARA COLETA DE ESCARRO ESPONTÂNEO
POP - 01
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Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD) e Policlínica Cardoso Fontes.
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Setor de entrega de amostras de escarro
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia) Dra. Irineide Assumpção Antunes (Diretora da Policlínica Cardoso Fontes)
A. OBJETIVOS
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. CONDIÇÕES GERAIS
76
6. O profissional do laboratório ao receber o pote com a amostra de escarro do
paciente deve usar luvas e fazer a assepsia do pote com hipoclorito de sódio a 1%
para evitar contaminação de si próprio e a contaminação da requisição médica que
acompanha o material.
7. Identificar claramente a amostra coletada utilizando o pincel permanente.
1. Coletar duas amostras de escarro de cada paciente.
2. A primeira amostra é coletada durante a primeira consulta e a segunda é coletada
na manhã seguinte, assim que o paciente despertar.
3. Orientações para coleta da 1ª amostra de escarro
3.1. Fornecer ao paciente orientação e simulação da técnica de coleta utilizando para
isso o pote, e indicando a quantidade adequada a ser coletada( mínimo 1,5 mL).
3.2. Entregar ao paciente o pote para coleta devidamente identificado, junto com um
papel toalha ou papel higiênico. A identificação deve ser feita no corpo do pote.
3.3. Indicar ao paciente o local onde ele efetuará coleta.
3.4. Orientar o paciente a lavar a boca fazendo bochechos com bastante água. Não
precisa estar de jejum.
3.5 No local indicado para realização do procedimento o paciente deve abrir o pote e
forçar a tosse do seguinte modo:
i. Inspirar profundamente, isto é, puxar o ar pelo nariz e ficar com a boca fechada
soltar o ar lentamente pela boca, fazer isso duas vezes.
ii. Inspirar profundamente mais uma vez, prender a respiração por alguns
instantes e solte o ar com força e rapidamente pela boca.
iii. Inspire profundamente mais uma vez, prenda a respiração por alguns instantes
e, em seguida, force a tosse para poder liberar o escarro que está dentro do
pulmão. Escarre diretamente dentro do pote e não deixe o escarro escorrer por
fora do pote.
iv. Repita as orientações (2) e (3) por mais duas vezes, até conseguir uma
quantidade maior de amostra.
D. PROCEDIMENTO
POP - 01 Página 2 de 3
77
v. Orientar o paciente a tampar o pote após a coleta rosqueando-o firmemente.
Após o procedimento o paciente deve lavar as mãos com água e sabão.
vi. Orientar o paciente a carregar o pote sempre com a tampa voltada para cima.
4. Orientações para coleta da 2ª amostra de escarro:
4.1. Orientar o paciente a beber no mínimo 8 copos de líquidos (água ou refrescos) no
dia anterior á coleta.
4.2. Orientar o paciente a dormir sem travesseiro no dia anterior a coleta. Isso também
facilita a saída do escarro do pulmão.
4.3 Orientar o paciente (no dia da coleta e assim que despertar) a lavar a boca fazendo
bochechos com bastante água e, em jejum, forçar a tosse e escarrar dentro do pote,
seguido às mesmas orientações da coleta da primeira amostra.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
E. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 01 Página 3 de 3
78
A baciloscopia ou exame microscópico é a pesquisa de Bacilo Álcool-Ácido Resistente
(BAAR) em um esfregaço de amostra clínica, preparado e corado com metodologia
padronizada.
Descrever o procedimento para realização do exame de baciloscopia.
1. Solução de Álcool a 70%;
2. Solução Fenol a 5%;
3. Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha);
4. Palito de madeira;
5. Lápis de grafite;
6. Lâminas de vidro para microscopia com borda fosca;
7. Recipiente com tampa contendo pedaços de gaze;
8. Recipiente para descarte de materiais contaminados;
9. Cabine de Segurança Biológica (CSB).
10. Cronômetro.
11. Álcool etílico comercial.
12. Fucsina Fenicada a 0,3%.
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA BACILOSCOPIA APÓS
CENTRIFUGAÇÃO
POP - 02
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Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DESCRIÇÃO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
B. OBJETIVO
79
13. Solução Descorante de Álcool-Ácido a 3%.
14. Azul de Metileno a 0,3%.
16. Funil de vidro haste curta de 50 a 80 mm de diâmetro para filtrar corantes.
17. Algodão hidrófilo e suporte para corar lâmina
18. Óleo de imersão
19. Microscópico de Campo claro
20. Centrifuga
1. Realizar os procedimentos utilizando luvas descartáveis, máscaras N95, aventais
de mangas longas, com punhos sanfonados.
2. Abrir um pote de cada vez e com cuidado para evitar a formação de aerossóis.
1. Preparo do esfregaço
1.1 Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes do seu uso;
1.2 Desligar luz UV e descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida
em Solução de Álcool a 70%
1.3 Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
respingos;
1.4 Colocar todo material necessário para baciloscopia dentro da cabine e devem
ficar atrás da área em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de
circulação de ar da CSB;
1.5 Manter o papel-toalha e o frasco com Solução de Fenol a 5% na cabine para
utilização em caso de respingos.
1.6 Escrever, com grafite, na borda fosca da lâmina o mesmo número colocado no
corpo do pote de escarro.
1.7 Retirar lentamente a tampa da amostra para evitar a formação de aerossóis e
colocar suavemente virada para cima.
D. CONDIÇÕES GERAIS
E. PROCEDIMENTO
POP - 02 Página 2 de 6
80
1.8 Transferir a amostra para o tubo de centrífuga de 50 ml, deixando escorrer
suavemente o escarro pela parede interna do tubo.
1.9 Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos.
1.10 Após a parada total da centrífuga, esperar 5 minutos para abrir.
1.11 Retirar as tubos fechados da centrífuga e colocar na CBS.
1.12 Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrífuga em um recipiente.
1.13 Ressuspender o sedimento com 0,3 ml de Água destilada estéril
1.14 Identificar as lâminas com o número de registro da amostra
1.15 Preparar o esfregaço da baciloscopia concentrada utilizando o sedimento
1.16 Colocar a lâmina com o esfregaço voltado para cima, para secar em temperatura
ambiente
1.17 Fechar bem os tubos das amostras já processadas e armazenar a temperatura
de 2 e 8ºC, até a realização da cultura.
1.18 Limpar a CSB com gaze estéril embebida em Solução de Álcool a 70%.
1.19 Deixar a CSB e a lâmpada UV ligadas por 10 a 15 minutos, antes de desligá-la.
2. Fixação do esfregaço
Depois de secas, fixar as lâminas, uma de cada vez, no bico de Bunsen. Com o
esfregaço voltado para cima passar rapidamente, por três vezes, sobre a chama do
bico de Bunsen como auxílio de uma pinça anatômica.
3. Coloração dos esfregaços - Método de Ziehl-Neelsen 3.1 Colocar as lâminas com o esfregaço voltado para cima, sem encostar umas nas
outras no suporte para corar.
3.2 Filtrar a Fucsina Fenicada a 0,3% para dentro de um frasco depois filtre o Azul de
Metileno a 0,3% em outro frasco.
3.3 Cobrir com a Fucsina filtrada, todo o esfregaço das lâminas.
3.4 Enrolar um chumaço de algodão na ponta da haste de metal. Umedecer o algodão
com álcool etílico.
3.5 Colocar fogo no algodão umedecido com álcool etílico.
POP - 02 Página 3 de 6
81
3.6 Passar a chama lentamente por debaixo das lâminas até que ocorra a emissão de
vapores visíveis, essa operação deve durar 5 minutos, a contar da primeira emissão
de vapores. Retirar imediatamente a chama para evitar que a Fucsina ferva
3.7 Inclinar as lâminas para derramar a Fucsina na pia.
3.8 Abrir devagar a torneira até obter um filete de água corrente para lavar as lâminas.
Deixar o filete de água cair em cima de cada lâmina, para que escorra óleo de imersão
suavemente sobre o esfregaço até eliminar todo o corante. Lavar também o lado
oposto ao esfregaço.
3.9 Cobrir completamente cada lâmina com a Solução Descorante de Álcool-Ácido a
3%, e esperar 1 minuto.
3.10 Inclinar as lâminas para derramar a solução descorante na pia.
3.11 Deixar o filete de água corrente cair em cima do número de cada lâmina, para
que escorra suavemente sobre o esfregaço e eliminar o Álcool-Ácido.
3.12 Verificar se os esfregaços ficaram descorados. Considera-se descorado o
esfregaço que apresentar coloração esbranquiçada ou levemente rosada.
3.13 Cobrir o esfregaço com o Azul de Metileno já filtrado e esperar 30 segundos.
3.14 Inclinar cada lâmina com o auxílio da pinça anatômica para derramar o Azul de
Metileno na pia.
3.15 Deixar cair um filete de água corrente em cima da lâmina, até eliminar todo o Azul
de Metileno a0,3%. Lavar também o lado oposto ao esfregaço para eliminar o Azul de
Metileno a 0,3% depositado ali.
3.16 Colocar cada uma das lâminas em pé, para secar
4. Leitura das lâminas
4.1 Limpar a lente de imersão do microscópico antes de iniciar a leitura e após leitura
de cada esfregaço.
4.2 Pingar uma gota de óleo de imersão no centro da lâmina, sem tocar no esfregaço
com o conta-gotas para evitar transferir material de uma lâmina para outra.
4.3 Colocar a lâmina no charriot do microscópio. Girar o canhão do microscópio até
que a lente objetiva de 10x esteja sobre a lâmina, focar a imagem com os botões
macro e micrômetro
4.4 Trocar a objetiva de 10x pela objetiva de imersão (100x) imergindo-a no óleo.
4.5 Aproximar a objetiva de 100x lentamente para não quebrar a lâmina.
4.6 Ajustar o foco com o botão micrométrico até que a imagem fique nítida.
POP - 02 Página 4 de 6
82
4.7 Ler 20 campos e somar os resultados e calcular a média.
4.8 Analisar a média obtida para os resultados nos 20 primeiros campos observados,
considerando as seguintes possibilidades.
i. Se a média for de mais de 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa amostra é
positiva +++.
ii. Se a média for inferior a 10 BAAR por campo ou não contiver BAAR, continuar a
leitura até completar 50 campos.
4.9 Fazer a leitura e até completar 50 campos e somar os resultados dos 50 campos e
calcular a média.
4.10 Analisar a média obtida para os resultados dos 50 campos observados,
considerando as seguintes possibilidades:
i. Se a média obtida for de 1 a 10 BAAR por campo, encerrar a leitura. Essa amostra é
positiva ++.
ii. Se a média obtida for inferior a 1 BAAR por campo ou não contiver BAAR, continuar
a leitura até completar 100 campos.
4.11 Fazer a leitura e anotar os resultados até completar 100 campos somar e analisar
os resultados considerando as seguintes possibilidades:
i. Se for encontrado um total de 10 a 99 BAAR nos 100 campos examinados, encerrar
a leitura. Essa amostra é positiva +.
ii. Se for encontrado um total de 1 a 9 BAAR nos 100 campos examinados, relatar o
número exato de BAAR encontrados.
iii. Se não forem encontrados BAAR, nos 100 campos observados, essa amostra é
negativa.
4.12 Os critérios para leitura e interpretação dos resultados estão resumidos no
quadro 1 em anexo.
QUADRO 1: Critérios para Leitura da Baciloscopia Fonte: Manual Nacional de Vigilância
Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactérias, do Ministério da Saúde, 2008.
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83
4.13 Limpar as lâminas depois de lidas pressionando levemente o esfregaço com
papel absorvente, cuidando para não remover o esfregaço.
4.14 Juntar as lâminas e identificar com data da leitura para colocar na caixa porta
lâminas.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
.
F. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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84
Cultura é o exame laboratorial que permite a multiplicação e o isolamento de bacilos
álcool-ácido resistentes (BAAR) a partir da semeadura de amostra clínica, em meios
de cultura específicos para micobactérias.
Descrever o procedimento para realização do exame de cultura de escarro no meio
sólido Ogawa Kudoh.
1. Pipetador automático ou manual;
2. Tubos de ensaio estéril para colocar 3 ml de Solução de NaOH a 4%;
3. Estante para os tubos de ensaio estéril 20 x 150 mm;
4. Estufa bacteriológica a 36 ± 1ºC;
5. Cronômetro;
6. Solução de NaOH a 4%;
7. Solução de Álcool a 70%;
8. Solução de Fenol a 5%;
9. Papel absorvente (papel de filtro ou papel-toalha) para forrar a bancada;
10. Swab estéril: palito de madeira com algodão hidrófilo enrolado na ponta;
esterilizado em autoclave ou forno de Pasteur que atinja temperatura de 200ºC.
11. Meios de cultura Ogawa Kudoh.
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA CULTURA
POP - 03
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Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DESCRIÇÃO
B. OBJETIVO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
85
12. Recipiente para descarte de materiais contaminados
1. Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes do seu uso.
2. Desligar luz UV e descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida em
Solução de Álcool a 70%.
3. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
Respingos.
4. Colocar todo material necessário para cultura dentro da cabine e devem ficar atrás
da área em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de circulação de ar
da CSB.
5. Manter o papel-toalha e o frasco com Solução de Fenol a 5% na cabine para
utilização em caso de respingos.
5. Descontaminar o escarro pelo método de Ogawa Kudoh.
5.1 Colocar 3 ml de Solução de NaOH a 4% em cada tubo estéril já identificado,
utilizando pipeta.
5.2 Abrir lentamente o tubo de centrifuga com a amostra a ser processada.
5.3 Introduzir o swab no tubo contendo escarro..
5.4 Inserir o swab impregnado com a amostra no tubo contendo Solução de NaOH a
4%, sem encostar na parede, e deixar em repouso até 2 minutos (máximo).
6. Após o término dos 2 minutos e, passar o swab sobre a superfície do tubo com meio
Ogawa Kudoh.
7. Descartar o swab no recipiente para descarte de materiais contaminados.
8. Fechar os tubos de meio de cultura sem rosquear a tampa até o fim e colocar na
estufa bacteriológica a temperatura de 37ºC..
9. Limpar a CSB, ao do preparo dos esfregaços, com gaze estéril embebida em
Solução de Álcool a 70%.
10. Deixar a CSB e a lâmpada UV ligadas por 10 a 15 minutos, antes de desligá-la.
D. PROCEDIMENTO
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86
11. Leitura e interpretação dos resultados
11.1 Realizar a leitura dos tubos de cultura semeados após 48 horas de incubação e
posteriormente de 7 em 7 dias até completar 8 semanas.
11.2 Nos tubos em que não são visualizadas colônias incubar novamente e realizar as
leituras nas próximas semanas até completar 8 semanas.
11.3 Nos tubos em que são visualizadas colônias realizar a baciloscopia para
confirmar a presença de BAAR (Bacilos Álcool-Ácidos Resistentes).
i. Se confirmada a presença de BAAR consultar a escala semiquantitativa em anexo
para interpretação dos resultados, levando em conta o número de colônias
visualizadas.
ii. Se houver a presença de outros microorganismos que não sejam BAAR (Bacilo
Álcool-Ácido Resistente) descrever resultado como cultura contaminada.
12. Escala semiquantitativa:
Cultura Positiva - Menos de 20 colônias, relatar a quantidade.
Cultura positiva (+) - De 20 a 100 colônias.
Cultura Positiva (++) - Mais de 100 colônias separadas.
Cultura Positiva (+++) - Colônias confluentes (tapete)
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
E. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 03 Página 3 de 3
87
Consiste na realização do esfregaço após centrifugação e tratamento do escarro com
N-acetil-L-cisteína e Hidróxido de sódio (NALC-NaOH).
Descrever o procedimento para realização do exame de baciloscopia após tratamento
do escarro com NALC-NaOH seguido por centrifugação.
1. Cabine de Segurança Biológica (CSB);
2. Centrífuga com rotor para tubos de 50 ml;
3. Tubos de centrífuga de polipropileno, estéreis, descartáveis, com fundo cônico;
4. Microscópico de Campo claro;
5. Pipetador automático ou manual;
6. Cronômetro;
7. Solução Depurante (Solução de NaOH a 4%, Solução de Citrato de sódio a
2,9%, NALC);
8. Solução Tampão Fosfato pH 6,8;
9. Álcool etílico comercial;
10. Fucsina Fenicada a 0,3%;
11. Solução Descorante de Álcool-Ácido a 3%.
12. Azul de Metileno a 0,3%.13. Funil de vidro haste curta de 50 a 80 mm de diâmetro
para filtrar corantes.
16. Água destilada estéril.
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA BACILOSCOPIA APÓS
CENTRIFUGAÇÃO COM NALC
POP - 04
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Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DEFINIÇÃO
B. OBJETIVO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
88
17. Solução de Álcool a 70%.
18. Solução de Fenol a 5%.
19. Recipiente para descarte de materiais contaminados
20. Recipiente com tampa contendo pedaços de gaze;
21. Lâminas de vidro para microscopia com borda fosca.
1. Ligar a CSB e a luz UV 10 a 15 minutos antes do seu uso.
2. Desligar luz UV e descontaminar a superfície interior com gaze estéril embebida
em Solução de Álcool a 70%.
3. Forrar a bancada com papel-toalha ou outro que tenha capacidade de absorver
respingos.
4. Colocar todo material necessário para baciloscopia dentro da cabine e devem ficar
atrás da área em que se desenvolve o trabalho e nunca sobre as grades de
circulação de ar da CSB.
5. Manter o papel-toalha e o frasco com Solução de Fenol a 5% na cabine para
utilização em caso de respingos.
6. Identificar o número de registro da amostra nos tubos de centrífuga.
7. Transferir a amostra para o tubo de centrífuga de 50 ml, deixando escorrer
suavemente o escarro pela parede interna do tubo.
8. Adicionar com pipeta estéril a cada um dos tubos de centrífuga a Solução
Depurante (NALC-NaOH), na quantidade correspondente 10% da amostra. Usar uma
pipeta para cada amostra.
9. Fechar bem os tubos de centrífuga e inverter cuidadosamente o tubo para misturar
bem, evitando a agitação forte que resulta em oxidação e inativação da NALC.
10. Deixar os tubos de centrífuga em repouso por 15 minutos à temperatura
ambiente, para fluidificação/descontaminação.
11. Completar até o volume de 50 ml com Solução Tampão Fosfato pH 6,8.
12. Centrifugar a 3.000 x g por 15 minutos.
13. Após a parada total da centrífuga, esperar 5 minutos para abrir
14. Retirar as tubos fechados da centrífuga e colocar na CBS.
15. Desprezar o sobrenadante de cada tubo de centrífuga em um recipiente.
16. Ressuspender o sedimento com 0,3 ml de Água destilada estéril.
D. PROCEDIMENTO
POP - 04 Página 2 de 3
89
17. Identificar as lâminas com o número de registro da amostra.
18. Preparar o esfregaço da baciloscopia concentrada depositando duas gotas do
sedimento na lâmina.
19. Corar conforme descrito no item 3 do POP 02.
20. Ler as lâminas conforme descrito no item 4 do POP 02.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
E. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 04 Página 3 de 3
90
A técnica de baciloscopia após concentração de escarro por filtração consiste na
digestão, descontaminação e fluidificação do espécime de escarro com a solução de
NALC-NaOH, hipoclorito de sódio e etanol/triton X-100 1%, e passagem da mistura por
uma membrana de policarbonato de 13mm, com poros de 0,8µm, sob pressão
negativa exercida por uma bomba a vácuo de pulso contínuo.
Descrever o procedimento para realização do exame de baciloscopia após
concentração da amostra de escarro por filtração.
1. Materiais para montagem do suporte de filtro
1.1 Pré-filtro e filtro;
1.2 Anel fino e grosso para o filtro;
1.3 Anel para do pré-filtro;
1.4 Bases de metal para o filtro;
1.5 Bases de polipropileno para o pré-filtro;
1.6 Membranas de nylon de 25 mm com poros de 30 µm;
1.7 Membranas de policarbonato brancas (Osmonics) de 13 mm com poros de 0,8 µm;
1.8 Pinça;
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA BACILOSCOPIA APÓS
CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA POR FILTRAÇÃO
POP - 05
Página 1 de 7
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. DEFINIÇÃO
B. OBJETIVO
C. RECURSOS NECESSÁRIOS
91
2. Materiais para processamento do escarro
2.1 CSB, classe II;
2.2.Pipetador automático ou manual;
2.3 Agitador tipo vórtex;
2.4 Tubos de centrífuga de 50 mL;
2.5 Pipetas graduadas de 10 mL e 25 mL estéreis;
2.6 Pipetas graduadas de 2 mL estéreis ou Ponteiras de 1000 µL;
2.7 Solução de NALC/NaOH;
2.8 Solução de NaOCL 5%;
2.9 Solução de etanol 95%/Triton 1% (MIX).
3. Materiais para filtração do escarro
3.1 CSB, classe II;
3.2 Bomba de vácuo;
3.3 Equipamento de filtração;
3.4 Tubos de centrífuga de 50 mL contendo as amostras processadas;
3.5 Pipetas pequenas ou ponteiras de 200µL para uso do citifluor;
3.6 Suporte de filtros montados;
3.7 Pinças;
3.8 Agulha de biópsia;
3.9 Tabela de identificação das amostras;
3.10 Recipiente com solução de NaOCl 5% para descarte das peças utilizadas.
4. Materiais para coloração das membranas e montagem das lâminas
4.1 Lâminas de vidro para microscopia;
4.2 Lamínulas;
4.3 Citifluor;
4.4 Carbol Fucsina (Kinyoun);
4.5 Álcool ácido;
4.6 Água destilada filtrada;
1. Montagem do suporte de filtros
1.1 Montar na seguinte ordem: filtro e pré-filtro.
D. PROCEDIMENTO
POP - 05 Página 2 de 7
92
1.2 Montagem do filtro
1.2.1 Inserir o anel preto na extremidade inferior do filtro
1.2.2 Inserir no filtro com o auxílio da pinça, as seguintes peças, em ordem: anel fino ,
base de metal, membrana de policarbonato com seu lado brilhante voltado para cima,
anel branco ou preto.
1.3 Montagem do pré-filtro
1.3.1 Encaixar a base de polipropileno com a protuberância voltada para baixo.
1.3.2 Colocar a membrana de nylon com auxílio da pinça sobre a base de
polipropileno.
1.3.3 Posicionar o anel em cima da membrana com a pinça.
1.4 Montagem do suporte de filtros
1.4.1 Encaixar o pré-filtro sobre o filtro. Não aperte muito
2. Processamento do escarro
2.1 Identificar os tubos de centrífuga de 50 mL com o numero da amostra.
2.2 Transferir as amostras de escarro para os respectivos tubos, deixando escorrer
suavemente o escarro pela parede interna do tubo.
2.3 Caso a amostra contenha mais do que 1,0 mL, identifique outro tubo de centrífuga
com o mesmo número da amostra.
2.4 Calcular para cada amostra um volume de NALC- NaOH correspondente a 10% ao
da amostra. Anotar os valores nas tampas dos tubos de centrífuga contendo a
amostra.
2.5 Com uma pipeta de 2mL, adicionar a cada tubo, a solução de NALC-NaOH em um
volume correspondente ao anotado na tampa da respectiva amostra.
2.6 Fechar os tubos e homogeneizar as amostras em um agitador do tipo vórtex por
pelo menos 15 segundos.
2.7 Deixar agir por 15 minutos (com homogeneizações de 15 segundos a cada 5
minutos).
2.8 Transferir 1,0 mL das amostras digeridas para novos tubos de 50 mL previamente
identificados com os respectivos números das amostras.
POP - 05 Página 3 de 7
93
2.9 Com o auxílio de uma pipeta de 10 mL, adicionar 2 mL (volume referente a duas
vezes o volume inicial da amostra) de NaOCL 5% ao tubo contendo 1,0 mL de
amostra digerida.
2.10 Deixar agir por 15 minutos (com homogeneizações por 15 segundos a cada 5
minutos).
2.11 Adicionar 3 mL (volume referente ao mesmo volume da mistura de amostra
digerida e solução de NaOCl) da solução de etanol/Triton 1% (MIX) ao tubo.
Homogeneizar em um agitador do tipo vórtex por 15 segundos.
3. Filtração do escarro
3.1 Com o coletor de vácuo no interior da CSB, inserir a mangueira da bomba de
vácuo no terminal de ar do equipamento.
3.2 Verificar se todas as válvulas estão fechadas (posição horizontal).
3.3 Enroscar o suporte de filtros sobre o tubo de centrífuga contendo as amostras
processadas.
3.4 Inverter a peça com o tubo e inserir nos pontos de filtração.
3.5 Enroscar o conjunto inteiro (suporte de filtros e tubos com amostras) até sentir que
o anel encostou-se ao ponto de sucção. Não aperte muito.
3.6 Desenroscar o tubo, tampá-lo e descartar no recipiente para descarte de materiais
contaminados.
3.7 Repetir os procedimentos acima citados para todas as amostras.
3.8 Na tabela de identificação das amostras, anotar para cada número de 1-10, o
correspondente número da amostra que será filtrada;
3.9 Ligar a bomba a vácuo e ajustar a pressão negativa para - 5 mmHg;
3.10 Abrir todas as válvulas (Posição vertical);
3.11 Após a passagem de todo o volume da amostra pelo pré-filtro, contar 15
segundos e fechar a torneirinha e desligar a bomba á vácuo.
3.12 Desenroscar e desmontar o pré-filtro. Descartar as membranas em recipiente
para descarte de materiais contaminados e transferir as peças para o recipiente
contendo a solução descontaminante de NaOCL 5%;
3.13 Caso encontre líquido sobre a membrana, abra lentamente a válvula até que o
mesmo seja completamente sugado, fechando imediatamente a válvula.
3.14 Retirar o filtro do ponto de filtração do equipamento
POP - 05 Página 4 de 7
94
3.15 Remover e transferir o anel grosso do filtro para o recipiente contendo a solução
descontaminante de NaOCL 5%.
3.16 Com o auxílio de uma agulha de biópsia, retirar a membrana com pinça e
transferi-la para lâmina de vidro previamente identificada, com o seu lado brilhante
voltado para cima (Figura 1);
3.17 Aquecer as lâminas na chapa a 80° C por 10 minutos;
.
4. Colorar as membranas pelo método de Kinyoun
4.1 Adicionar carbol fucsina sobre as membranas.
4.2 Aguardar 5 minutos.
4.3 Remover o excesso de corante com o auxílio da pinça, tomando o cuidado para
não deixar a membrana cair.
4.4 Lavar com água.
4.5 Adicionar álcool ácido sobre as membranas e aguardar por 2 minutos.
4.6 Remover o álcool ácido com água.
4.7 Transferir a membrana para a lâmina previamente identificada.
4.8 Esperar a lâmina secar.
4.8 Adicionar com o auxílio de uma pequena pipeta uma gotícula de citifluor em uma
das bordas da membrana e outra gotícula no centro.
4.9 Cobrir com uma lamínula tomando o cuidado de evitar a formação de bolhas de ar
sobre a membrana.
4.10 Realizar a leitura microscópica conforme já descrito no item 4 do POP 02
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
Morais, G. C. V. Padronização e avaliação da acurácia do exame de baciloscopia
em membrana de policarbonato após concentração pelo sistema BacFil para o
diagnóstico da tuberculose pulmonar. 2009. Dissertação (Mestrado em Doenças
Infecciosas) - Universidade Federal do Espírito Santo, UFES, Vitória, 2009.
E. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
POP - 05 Página 5 de 7
95
Fennelly KP, Morais CG, Hadad DJ, Vinhas S, Dietze R, Palaci M. The small
membrane filter method of microscopy to diagnose pulmonary tuberculosis. J Clin
Microbiol. 2012;50(6):2096-9.
F. ANEXO
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Figura 1: Suporte de filtros montado
Figura 2: Peças do filtro
Figura 3: Peças do pré-filtro
Figura 4: Suporte encaixado no tubo
escarro
96
POP - 05 Página 7 de 7
Figura 4: Sistema de filtração montado
97
Descrever o procedimento para preparar as soluções usadas no processo de filtração
do escarro.
1. Para preparo das soluções
1.1 Agitador magnético;
1.2 Balança analítica;
1.3 Autoclave;
1.4 Água destilada;
1.5 Recipiente para pesagem;
1.6 Frascos de 500 mL com tampa de rosca;
1.7 Béquer;
1.8 Espátula;
1.9 Tubo de polipropileno com tampa de rosca de 50 mL;
1.10 Pipetas graduadas estéreis;
1.11 Bastão de vidro
1.12 Frasco de vidro de 250 mL para preparo da solução;
1.13 Frasco âmbar para guardar a solução.
1.15 Hidróxido de sódio;
1.16 Triton X-100 – 10% etanol PA.
1.17 NaOCL 10%;
1.16 NALC
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DE SOLUÇÕES USADAS NA
FILTRAÇÃO DO ESCARRO
POP - 06
Página 1 de 4
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Preparo de Soluções e Meios
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVOS
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
98
1. Preparo da solução depurante (solução de NaOH 5%, Citrato de sódio 2,9 %,
NALC).
1.1 Preparar a solução de NaOH 5%
1.1.2 Pesar e medir os reagentes de acordo com o volume final a ser preparado, como
mostrado no quadro abaixo:
VOLUMES FINAIS
Reagentes 500 mL 1000 mL 2000mL
NaOH 25g 50g 100g
Água destilada 500 mL 1000mL 2000mL
1.1.3 Colocar água destilada em um béquer.
1.1.4 Acrescentar NaOH aos poucos.
1.1.5 Com o auxilio de um bastão de vidro homogeneizar até dissolução completa do
NaOH.
1.2 Preparo do Citrato de sódio 2,9%
1.2.1 Pesar e medir os reagentes de acordo com o volume final a ser preparado, como
mostrado no quadro abaixo:
VOLUMES FINAIS
Reagentes 500 mL 1000 mL 2000mL
Citrato de sódio 14,5g 29g 58g
Água destilada 500 mL 1000mL 2000mL
1.2.3 Colocar água destilada em um béquer e acrescentar citrato de sódio aos poucos.
1.2.4 Com o auxilio de um bastão de vidro homogeneizar até completa dissolução
1.2.5 Preparo da solução de NaOH 5%/citrato de sódio 2,9%
1.2.5.1 Misturar em volumes iguais as soluções de NaOH 5% e de citrato de sódio
1.2.5.2 Distribuir em frascos de 500 mL com tampa de rosca.
C. PROCEDIMENTO
POP - 06 Página 2 de 4
99
1.2.5.3 Identificar os frascos com o nome e a concentração da solução, data do
preparo, data de validade e nome do responsável pelo preparo.
1.2.5.4 Autoclavar a 127ºC/15 min.
1.2.5.5 Esperar esfriar e guarda a solução sob refrigeração.
1.3 Preparar a solução de depurante (NaOH 5%, Citrato de sódio 2,9 %, NALC).
1.3.1 Pesar e medir os reagentes de acordo com o volume final a ser preparado, como
mostrado no quadro abaixo:
VOLUMES FINAIS
Reagentes 5 mL 10 mL 15 mL
NALC 0,25g 0,50g 0,75g
NaOH 5%/Citrato de sódio 1,45% 5 mL 10 mL 15 mL
1.3.2 Pesar o NALC e transferir para o tubo de centrifuga de 50 mL.
1.3.3 Na CSB, adicionar ao NALC a solução de NaOH 5%/Citrato de sódio 2,9%.
1.3.4 Fechar bem o tubo e inverter cuidadosamente até dissolução completa do NALC.
1.3.5 Evitar a agitação forte que resulta em oxidação e inativação do NALC.
1.3.6 Após a adição de NALC, a solução depurante deverá ser usada em 24 horas.
2. Preparo da solução de NaOCl 5%
2.1 Preparar a solução de NaOCl 5% à partir de outra solução a 10%.
2.1.2 Preparar a solução somente no dia do uso.
2.1.3 Medir com uma pipeta 25 mL água destilada e transferir para um tubo de 50 mL.
2.1.4 Acrescentar 25 mL de NaOCl 10% e homogeneizar.
2.15 Identificar o tubo com o nome da solução e reservar à temperatura ambiente até
momento do uso.
3. Preparo da solução de Etanol95%/Triton 1% (mix)
3.1 Preparar 100 mL de uma solução de Triton X-100 a 1% a partir de uma solução-
estoque a 10%
3.1 Adicionar 90 mL de água destilada filtrada no frasco de vidro;
3.2 Acrescentar 10 mL de Triton X-100 – 10%.
POP - 06 Página 3 de 4
100
3.3 Homogeneizar com a pipeta por aproximadamente 5X ou até completa
homogeneização da solução;
3.4 Transferir a solução de triton 1% para o frasco âmbar.
3.5 Identificar o frasco âmbar com o nome da solução e data;
3.6 Adicionar 40 mL de Etanol PA em um tubo de centrífugo previamente identificado
com o nome da solução;
3.7 Acrescentar 10 mL da solução Triton 1%. Homogeneizar;
3.8 Identificar o tubo com o nome da solução
3.9 Cobrir o tubo com papel alumínio e armazenar à temperatura ambiente.
Fennelly KP, Morais CG, Hadad DJ, Vinhas S, Dietze R, Palaci M. The small
membrane filter method of microscopy to diagnose pulmonary tuberculosis. J Clin
Microbiol. 2012;50(6):2096-9.
Morais, G. C. V. Padronização e avaliação da acurácia do exame de baciloscopia
em membrana de policarbonato após concentração pelo sistema BacFil para o
diagnóstico da tuberculose pulmonar. 2009. Dissertação (Mestrado em Doenças
Infecciosas) - Universidade Federal do Espírito Santo, UFES, Vitória, 2009.
;
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D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
101
Descrever o procedimento para limpeza das peças do sistema de filtração.
1. Esponja macia;
2. Papel absorvente ou pano seco;
3. Detergente neutro;
4. Água da torneira;
5. Água destilada;
6. Solução de NaOCl 5%.
1. Limpeza do sistema de filtro e do anel
1.1 Deixar o sistema de filtro e o anel por 30 minutos em um recipiente contendo com
solução de NaOCl 5%.
1.2 Descartar a solução na pia.
1.3 Enxaguar as peças por 3 vezes com água da torneira para retirada do excesso de
NaOCl que fica sobre a superfície das peças.
1.4 Lavar as peças com detergente neutro
1.5 Enxaguar mais 3 vezes com água da torneira;
1.6 Deixar de molhos por 20 minutos em água destilada;
1.7 Descartar a água do recipiente e colocar as peças para secarem.
PROCEDIMENTO PARA LIMPEZA DO SISTEMA DE FILTRAÇÃO
POP - 07
Página 1 de 2
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Esterilização
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVOS
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
102
2. Limpeza do coletor de vácuo
2.1 Acrescentar a solução de NaOCl 5% em todos os pontos de sucção do
equipamento e esperar 30 minutos.
2.2 Remover a tampa de rosca e eliminar na pia o material filtrado.
2.3 Enxaguar o interior do equipamento com água.
2.4 Esfregar a superfície externa do equipamento com detergente neutro e uma
esponja e enxaguar com água da torneira
2.5 Colocar água destilada no interior do equipamento, tampar e deixar de molho por
cerca de 10 minutos;
2.6 Desprezar a água e retirar o excesso de umidade da superfície com papel
absorvente ou pano seco;
2.7 Colocar o equipamento na vertical, com a extremidade aberta voltada para baixo
para secagem interna.
POP - 07 Página 2 de 2
103
Descrever o procedimento para o preparo da solução de fenol 5% e álcool 70%
1. Para o preparo da solução de fenol 5%
1.1 Cristal de fenol;
1.2 Água destilada;
1.3 Balão;
1.4 Frasco âmbar.
1.5 Banho maria
2. Para o preparo da solução de álcool a 70%
2.1 Álcool etílico comercial 95% 700 ml;
2.2 Água destilada qsp 1.000 ml.
1. Preparação da Solução de Fenol a 5%
1.1 Colocar o fenol em um balão de 1.000 ml.
1.2 Adicionar 700 ml da água destilada aos poucos no balão sobre o fenol.
1.3 Colocar o balão para aquecer em banho Maria até o fenol dissolver completamente
1.4 Retirar do banho maria e acrescentar água destilada até completar 1.000 ml.
1.5 Deixar esfriar em temperatura ambiente
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DO FENOL 5% E ÁLCOOL 70%
POP - 08
Página 1 de 2
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVO
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
104
1.6 Colocar a solução de fenol a 5% em um frasco âmbar de 1.000ml hermeticamente
fechado, rotulado com o nome da solução, data da preparação e validade.
1.7 Armazenar essa solução em temperatura ambiente.
2. Preparação da Solução de Álcool a 70%
2.1 Colocar o álcool etílico em um balão de 1.000 ml.
2.2 Adicionar Água destilada aos poucos no balão sobre o álcool etílico até completar
1000 ml.
2.3 Colocar a solução da álcool etílico em um frasco bem vedado já rotulado com o
nome do corante, data da preparação e de validade.
2.4 Armazenar ao abrigo da luz e a temperatura ambiente
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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105
Descrever o procedimento para o preparo da solução de NaOH 4% utilizado na
descontaminação do escarro para realização da cultura
1. Hidróxido de sódio (NaOH). 2. Água destilada.
3. Autoclave.
4. Bastão de vidro.
5. Frasco autoclavável
1. Dissolver 4g de Hidróxido de sódio em 100mL de água destilada no frasco
autoclavável
2. Misturar utilizando o bastão de vidro
3. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DA SOLUÇÃO DE NaOH 4%
POP - 09
Página 1 de 1
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Preparo de Soluções e Meios
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVO
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
106
Descrever o procedimento para preparo do tampão fosfato
Preparação da S o pH 6,8 – Método NALC-NaOH (h) Preparação da Solução A
1. Fosfato dissódico (Na2HPO4);
2. Fosfato monopotássico (KH2PO4);
3. Água destilada;
4. Autoclave;
5. Frasco autoclavável;
6. Medidor de pH;
7. Balão volumétrico;
1. Dissolver em um balão volumétrico 9,47g de fosfato dissódico em 1000mL de água
destilada.
2. Em outro balão volumétrico dissolver 9,07g de fosfato monopotássico em 1000mL
de água destilada.
3. Misturar 50 ml de (Solução A) e 50 ml de (Solução B) em um frasco autoclavável
4. verificar o pH, que deverá ser 6,8.
5. Se precisar ajustar o pH, use a solução (Solução A) para aumentar e a solução
(Solução B) para diminuir.
6. Autoclavar a 121ºC por 15 minutos.
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO
POP - 10
Página 1 de 2
Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Sala de Preparo de Soluções e Meios
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
C. PROCEDIMENTO
A. OBJETIVO
107
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
POP - 10 Página de 2 de 2
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
108
Descrever o procedimento para o preparo de corantes utilizados no método de
coloração de Ziehl-Neelsen.
1. Para preparação do Álcool Ácido a 3%
1.1 Etílico comercial;
1.2 Ácido clorídrico concentrado;
1.3 Balão volumétrico;
1.4 Frasco de 1.000.
2. Para preparação do Azul de Metileno a 0,3%
2.1 Azul de Metileno 3 g;
2.2 Água destilada qsp 1.000 mL;
2.3 Balão volumétrico de 1.000 mL;
2.4 Frasco âmbar;
2.5 Funil.
3. Para preparação da Fucsina Fenicada a 0,3%
3.1 Álcool etílico 95% PA;
3.2 Fucsina Básica;
3.3 Balão volumétrico;
3.4 Cristal de fenol;
3.5 Água destilada;
3.6 Banho Maria.
PROCEDIMENTO PARA PREPARO DE CORANTES
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Versão 1
Instituição: Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado do (FMT- HVD)
Unidade: Subunidade:
Gerência de Bacteriologia Laboratório de Tuberculose
Aprovado por: Dra. Rossicléia Lins Monte (Gerente do laboratório de bacteriologia)
A. OBJETIVO
B. RECURSOS NECESSÁRIOS
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1. Preparação da Fucsina Fenicada a 0,3%
1.1 Preparar a solução de Fucsina Básica e uma solução de fenol aquoso.
1.1.1 Colocar 3g de Fucsina em um balão de 1.000 mL.
1.1.2 Adicionar aos poucos 100 mL de álcool etílico no balão sobre a Fucsina.
1.1.3 Agitar o balão suavemente até a completa dissolução da Fucsina. 3 gramas é a
quantidade indicada na fórmula, desde que a Fucsina tenha no mínimo 88% de
concentração de corante.
1.1.4 Calcular o fator de correção se a concentração for menor, e multiplica-lo por 3
gramas, para encontrar a quantidade de Fucsina necessária.
1.1.4.1 Fórmula do fator de correção = 1 dividido pelo equivalente decimal da
concentração do corante = percentual de concentração do corante dividido por 100.
1.2 Preparar a solução B.
1.2.1 Colocar 50g de fenol em um balão de 1.000 mL.
1.2.2 Adicionar 700 ml da água destilada aos poucos no balão sobre o fenol.
1.2.3 Colocar o balão para aquecer em banho maria até o fenol dissolver
completamente.
1.2.4 Retirar do banho maria e acrescentar água destilada até completar 1.000 mL.
1.2.5 Deixar esfriar em temperatura ambiente.
1.3 Colocar 900 mL da solução B no balão contendo a solução A e agitar.
1.3.1 Tampar a boca do balão com papel alumínio e deixar repousar por 24 horas.
1.3.2 Filtrar, em funil com papel de filtro, diretamente em frasco âmbar de 1000 ml já
rotulado com o nome do corante, data da preparação, de validade, e a frase “Filtrar
antes de usar“.
1.3.3 Armazenar esse corante, ao abrigo da luz e a temperatura ambiente.
2. Preparação da solução descorante de Álcool Ácido a 3%
2.1 Colocar 970 mL de álcool-etílico comercial, em um balão de 1.000 mL.
2.2 Adicionar 30 mL de ácido clorídrico, lentamente, deixando escorrer pelas paredes
do balão que contém o álcool etílico.
2.3 Agitar o balão suavemente.
2.4 Colocar o álcool-ácido em um frasco de1.000 mL rotulado com nome do
descorante, data da preparação, e de validade.
C. PROCEDIMENTO
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2.5 Armazenar essa solução em temperatura ambiente.
3. Preparação de Azul de Metileno a 0,3%
3.1 Colocar 3g de azul de metileno em um balão volumétrico de 1.000 mL
3.2 Adicionar a 100 mL da Água destilada ao Azul de Metileno.
3.3 Agitar o balão suavemente até a completa dissolução.
3.4 Adicionar o restante da água e agite bem.
3.5 Filtrar diretamente em um frasco âmbar de 1000 mL já rotulado com nome do
corante, data de preparação e validade, e a frase “Filtre antes de usar“.
3.6 Armazenar a solução de Azul de Metileno ao abrigo da luz e à temperatura
ambiente.
3.7 Três gramas é a quantidade indicada na fórmula, desde que o Azul de Metileno
tenha no mínimo 82% de concentração de corante. Se a concentração for menor, é
preciso calcular o fator de correção e depois multiplicá-lo por 3 gramas.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e Outras Micobactérias. Brasília, 2008.
D. PREFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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