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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA

MARIA APARECIDA ALVES DE OLIVEIRA

SÍTIOS DE FOSFORILAÇÃO DE TIROSINA DA PROTEÍNA CagA E GENÓTIPOS

cagE DO H. PYLORI EM PACIENTES COM GASTRITE E ÚLCERA PÉPTICA

FORTALEZA

2014




Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em cirurgia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará

como requisito parcial para obtenção do grau

de Doutor em Ciências Médico-Cirurgicas.

Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa

Campelo Braga

FORTALEZA

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

O48s Oliveira, Maria Aparecida Alves de. Sítios de fosforilação de tirosina da proteína cagA e genótipos cagE do H. Pylori em

pacientes com gastrite e úlcera péptica / Maria Aparecida Alves de Oliveira. – 2014. 75 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de

Pós-graduação em Cirurgia, Doutorado em Ciências Médico-Cirúrgicas, Fortaleza, 2014. Orientação: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga. 1. Helicobacter pylori. 2. Gastrite. 3. Úlcera Péptica. I. Título.

CDD 616.99433




Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em cirurgia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará

como requisito parcial para obtenção do grau

de Doutor em Ciências Médico-Cirúrgicas.

Aprovada em ______/_______/_________.

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________

Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_______________________________________________

Profa. Dra. Márcia Maria de Negreiros Pinto Rocha

Universidade de Fortaleza (UNIFOR)

_______________________________________________

Profa. Dra Helena Alves de Carvalho Sampaio

Universidade Estadual do Ceará (UECE)

________________________________________________

Profa. Dra. Marta Maria das Chagas Medeiros


________________________________________________

Profa. Dra. Regina Fátima Gonçalves Feitosa


A Deus, por sempre me fortalecer na

caminhada da vida.

Aos meus pais e marido por me incentivarem

nessa jornada acadêmica.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga, Professora titular do

Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade

concedida, por sua orientação constante, pelo incentivo e competência com que exerce a

vida acadêmica.

Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos, professor titular do

Departamento de Cirurgia e coordenador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da

Universidade Federal do Ceará (UFC), por sua dedicação à Pós-Graduação.

À Profa. Dra. Dulciene Maria Magalhães Queiroz pela solicitude em receber

nossas amostras para realização da técnica molecular de sequenciamento do DNA e pelo

apoio e estimulo incansável ao nosso grupo de pesquisa.

À Profa. Dra. Márcia Maria de Negreiros Pinto Rocha, Professora da

Universidade de Fortaleza (UNIFOR), pela presteza em avaliar este estudo e contribuir para

o seu aperfeiçoamento.

À Profa. Dra. Helena Alves de Carvalho Sampaio, Professora da Universidade

Estadual do Ceará, pela presteza em avaliar este estudo e contribuir para o seu

aperfeiçoamento.

À Profa. Dra. Marta Maria das Chagas Medeiros, Professora da Universidade

Federal do Ceará, pela presteza em avaliar este estudo e contribuir para o seu

aperfeiçoamento.

À Profa. Dra. Regina Fátima Gonçalves Feitosa Professora da Universidade

Federal do Ceará, pela presteza em avaliar este estudo e contribuir para o seu

aperfeiçoamento.

Ao Sr. Cícero Igor Simões Moura Silva, farmacêutico, pós-doutorando em

cirurgia, pelo companheirismo e dedicação na conclusão deste estudo.

À Srta. Kassiane Cristine da Silva Costa Maia, farmacêutica, mestranda em

cirurgia, pelo companheirismo e parceria no laboratório.

A Srta. Bruna Deise Gurgel Maia, técnica de laboratório, pela parceria na rotina

laboratorial para a realização deste estudo.

Ao Sr. Francisco Josemar Alves de Oliveira, farmacêutico, pelo companheirismo

e dedicação na conclusão deste estudo.

À Srta. Maria Helane Rocha Batista Gonçalves, enfermeira, mestranda em

cirurgia, pela parceria no laboratório.

Às Sras. Maria Luciene Vieira de Oliveira e Magda Maria Gomes Fontenele,

secretárias do Programa de Pós-graduação em Cirurgia da UFC, pela presteza e auxílio no

desempenho das atividades letivas deste programa.

Ao Sr. Carlos Alberto Andrade Serra dos Santos, pelo amor, amizade e apoio

incondicional em todos os momentos necessários.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da UFC, pelas

disciplinas ministradas e conhecimentos partilhados para a execução do método científico.

A todos e todas que, de diversas formas, participaram, contribuíram e

viabilizaram a realização deste trabalho.

“Tudo aquilo que se compartilha, se

multiplica.”

Papa Francisco

RESUMO

Sítios de fosforilação de tirosina da proteína CagA e genótipos cagE do H. pylori em

pacientes com gastrite e úlcera péptica. Maria Aparecida Alves de Oliveira. Programa de

Pós-Graduação Stricto Sensu em Cirurgia. Universidade Federal do Ceará. Tese de

Doutorado. Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.

As cepas de H. pylori demonstram um alto nível de diversidade fenotípica e genotípica, pela

expressão de vários genes, que conferem maior patogenicidade à bactéria. A maioria dos

estudos evidenciou forte associação do gene cagE com doença ulcerosa péptica e do

aumento dos sítios de fosforilação EPIYA C com doenças gástricas mais graves. No entanto,

a associação clínica e a função dos sítios de fosforilação de tirosina da proteína CagA –

EPIYA e do gene cagE, ainda não foi completamente elucidada, existindo diferenças

geográficas. O objetivo do presente estudo foi caracterizar as cepas de H. pylori quanto à

presença dos sítios de fosforilação de tirosina da proteína CagA – EPIYA e do gene cagE

em pacientes com gastrite e úlcera péptica, e correlacionar a presença desses genótipos com

as afecções gástricas. A genotipagem das cepas de H. pylori foi realizada através da técnica

de PCR e do sequenciamento dos sítios de fosforilação EPIYA. Foram avaliados 137

pacientes dispépticos H. pylori positivo, 72 com úlcera péptica e 65 com gastrite. Das 137

cepas genotipadas 68,6% foram cagA positivas. Das cepas cagA estudadas, 96,8%

apresentaram pelo menos 1 sítio C de fosforilação EPIYA, sendo que 53,2% destas

apresentaram somente um sitio, 43,6% tinham dois ou mais sítios C e 3,2% não

apresentaram sitio C. As cepas mistas com dois padrões EPIYA estavam presentes em

23,4% das amostras estudadas. O grupo de pacientes com gastrite apresentou maior

prevalência do genótipo EPIYA ABCCC; o mesmo não foi observado no grupo de pacientes

com úlcera péptica, sendo essa associação com as afecções gástricas estudadas significante

(p= 0,001). Dos 137 pacientes estudados, 65 foram positivos para cagE (47,4%). Houve

associação inversa significativa entre o genótipo cagE e o grupo de pacientes com gastrite

(O.R=0,345; p=0,002). Houve associação significativa entre o genótipo cagE com doença

ulcerosa péptica (O.R=2,898; p=0,002) e com o subgrupo de pacientes com úlcera duodenal

(O.R=3,839; p=0,001). Esse estudo sugere que na amostra populacional estudada a presença

do genótipo EPIYA com três sítios C estava associada à gastrite e ausente nos pacientes com

ulcera péptica. Encontrou-se associação do gene cagE a úlcera duodenal.

Palavras-chave: H. pylori. Gastrite. Úlcera péptica. Gene cagA. Sítios EPIYA. Gene cagE.

ABSTRACT

Sites of tyrosine phosphorylation of CagA protein and cagE genotypes of H. pylori in

patients with gastritis and peptic ulcer. Maria Aparecida Alves de Oliveira. Post-Graduate

Program (Stricto Sensu) in Surgery. Federal University of Ceará. Doctoral Thesis. Advisor:

Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.

The H. Pylori strains demonstrate a high level of phenotypic and genotypic diversity, the

expression of various genes, which confer greater pathogenicity to the bacteria. Most studies

have found that the cagE gene is strongly associated with peptic ulcer disease and sites of

tyrosine phosphorylation of CagA protei - EPIYA, has not been fully elucidated existing

geographical differences. This study aimed to characterize the strains of H. pylori for the

sites of tyrosine phosphorylation of CagA protein EPIYA and presence of genes cagE in

patients with gastritis and peptic ulcer disease, and to correlate the presence of these

genotypes with gastric disorder. Genotyping of H. pylori strains was performed by PCR and

sequencing of phosphorylation sites EPIYA. 137 dyspeptic patients from H. pylori-positive,

72 with peptic ulcer and 65 with gastritis were evaluated. Of the 137 strains genotyped 68.6

% were cagA positive, strains cagA studied , 96.8 % had at least 1 C phosphorylation site

EPIYA , while 53.2 % of these had only one site , 43.6 % had two or more sites C and 3.2 %

had no place C. the mixed strains with two EPIYA patterns were present in 23.4 % of the

studied samples . The group of patients with gastritis showed higher prevalence of genotype

EPIYA ABCCC , the same was not observed in patients with peptic ulcer disease and this

association with gastrics disorders studied significant ( p = 0.001 ). Of the 137 patients

studied, 65 were positive for CAGE (47.4%). There was a significant inverse association

between genotype and cage group of patients with gastritis (OR = 0.345, p = 0.002). There

was a significant association between genotype cagE with peptic ulcer disease (OR = 2.898,

p = 0.002) and the subgroup of patients with duodenal ulcer (OR = 3.839, p = 0.001). This

study suggests that the population sample studied the presence of genotype Epiya three sites

C was associated with gastritis and absent in patients with peptic ulcer. We found

association of the cagE gene duodenal ulcer.

Keywords: H. pylori. Gastritis. Peptic ulcer. Gene cagA. Epiya site. Gene cagE

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

cagA – gene associado à citotoxina A do Helicobacter pylori

CagA – citotoxina A do Helicobacter pylori

Cag-PAI – Ilha de patogenicidade cag

C13

- Carbono 13

C14

- Carbono 14

EPIYA – Sequência codificadora dos aminoácidos dos sítios de fosforilação da proteína CagA

H. pylori - Helicobacter pylori

IL-2 – Interleucina-2






IL-1β – Interleucina-1 β

INF- ɣ– Interferon gama

HUWC – Hospital Universitário Walter Cantídio

dupA – gene A promotor da úlcera duodenal

oipA – gene de proteínas inflamatórias do Helicobacter pylori

hom – gene da membrana externa do Helicobacter pylori

Hom – proteína da membrana externa do Helicobacter pylori

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

rpm – rotações por minuto

SHP-2 – tirosina-fostase eucariótica 2

Th1 – Linfócito T auxiliar 1

Th2 – Linfócito T auxiliar 2

TNF-α – Fator de necrose tumoral α

vacA – gene da citotoxina vacuolizante

VacA – citotoxina vacuolizante

LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS

Figura 1 - Prevalência global da infecção pelo Helicobacter pylori ............................... 23

Figura 2 - Representação do sistema de secreção do tipo IV (cag-PAI) do H.pylori que

injeta a proteína CagA na célula epitelial gástrica .......................................................... 28

Gráfico1 - Distribuição da amostra estudada de pacientes H. pylori positivos por faixa

etária. Fortaleza- Ce, 2014 ............................................................................................... 39

Figura 3 - Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagA na amostra de

pacientes com gastrite. Fortaleza-Ce, 2014 .................................................................... 41

Figura 4 - Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagA na amostra de

pacientes com úlcera péptica. Fortaleza-Ce, 2014 .......................................................... 42

Gráfico 2 - Distribuição dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA

por idade. Fortaleza-Ce, 2014.......................................................................................... 43

Figura 5 - Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagE na amostra de

pacientes com gastrite. Fortaleza-Ce, 2014 ..................................................................... 46

Figura 6 - Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagE na amostra de

pacientes com úlcera péptica. Fortaleza-Ce, 2014 .......................................................... 46

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Primers usados na amplificação dos genes cagA e cagE ............................... 36

Tabela 2 - Distribuição dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA

em pacientes com gastrite e úlcera péptica (N=94). Fortaleza-Ce 2014 ......................... 40

Tabela 3 - Associação dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA

com as afecções gastrite e úlcera péptica (N=94). Fortaleza-Ce, 2014 ........................... 44

Tabela 4 - Relação não ajustada entre o gene cagE e as afecções gastrite e úlcera péptica

(137 pacientes). Fortaleza-Ce, 2014 ............................................................................... 45

Tabela 5 - Relação ajustada para idade e gênero entre o gene cagE e as afecções gastrite

e úlcera péptica (137 pacientes). Fortaleza-Ce, 2014......................................................45

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14

1.1 Histórico do Helicobacter pylor ............................................................................. 14

1.2 Microbiologia ........................................................................................................... 14

1.3 Diagnóstico do Helicobacter pylori ........................................................................ 15

1.4 Patogênese do Helicobacter pylori ......................................................................... 19

1.4.1 Fatores do hospedeiro e ambientais ...................................................................... 19

1.5 Epidemiologia .......................................................................................................... 21

1.6 Genes do Helicobacter pylori associados aos fatores de virulência .................... 23

1.6.1 Gene vacA .............................................................................................................. 23

1.6.2 Gene oipA ............................................................................................................... 24

1.6.3 Gene hom ............................................................................................................... 25

1.6.4 Gene dupA .............................................................................................................. 26

1.6.5 Ilha de Patogenicidade cag (cagPAI) - Genes cagA e cagE ............................... 26

1.7 Justificativa .............................................................................................................. 29

2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 31

2.1 Objetivo geral ........................................................................................................... 31

2.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 31

3 CASUÍSTICA E MÉTODOS .................................................................................... 32

3.1 Causística .................................................................................................................. 32

3.2 Desenho do estudo ................................................................................................... 33

3.3 Seleção dos pacientes ............................................................................................... 33

3.4 Métodos .................................................................................................................... 33

3.4.1 Coleta de fragmentos da mucosa gástrica na endoscopia .................................... 33

3.4.2 Extração do DNA de H. pylori em tecido de biopsia gástrica .............................. 35

3.4.3 Reação em cadeia de polimerase (PCR) ............................................................... 36

3.4.4 Genotipagem para cagA ........................................................................................ 37

3.4.5 Genotipagem para cagE ........................................................................................ 37

3.4.6 Amplificação e sequenciamento da região variável 3 ´do gene cagA .................. 37

3.4.7 Análise estatística .................................................................................................. 38

4 RESULTADOS ........................................................................................................... 39

4.1 Caracterização da amostra ..................................................................................... 39

4.2 Caracterização das cepas de H. pylori quanto aos sítios de fosforilação de

tirosina EPIYA da proteína CagA ............................................................................... 40

4.3 Distribuição dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA

por idade ......................................................................................................................... 42

4.4 Associação entre os sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA

e as afecções gástricas .................................................................................................... 43

4.5 O gene cagE e as afecções gástricas ....................................................................... 44

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 48

6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 53

REFERENCIAS ............................................................................................................ 54

APENDICES .................................................................................................................. 63

ANEXOS ........................................................................................................................ 69

DADOS BRUTOS .......................................................................................................... 71

14

1 INTRODUÇÃO

1.1 Histórico do Helicobacter pylori

O Helicobacter pylori foi isolado e cultivado pela primeira vez em 1983, pelos

pesquisadores australianos Robin Warren e Barry Marshall a partir de amostras da mucosa

gástrica de pacientes com úlcera. Em 1984, Marshall ingeriu um concentrado da bactéria

isolada, e desenvolveu uma gastrite transitória demonstrando que o H. pylori coloniza o

epitélio humano gástrico e desencadeia processo inflamatório no mesmo (MARSHALL et

al., 1985). O impacto dessa descoberta foi um dos avanços mais importantes da

gastroenterologia, tendo levado seus pesquisadores, à premiação com o Nobel de Medicina

no ano de 2005.

Patologistas europeus já haviam observado em tecido gástrico bactérias

semelhantes mesmo antes de 1906 (KRIENTIZ, 1906), sendo também descritas por outros

pesquisadores posteriormente (STEER, 1975), mas, por não terem sido isoladas, foram

ignoradas e esquecidas por várias gerações.

No primeiro momento, os micro-organismos foram classificados como

pertencentes ao gênero Campylobacter, composto por bactérias gram-negativas em forma de

bastão curvado, oxidase e catalase positivas, que utilizam flagelos polares para locomoção.

Dessa forma, foram primeiramente chamados de “gastric Campylobacter like organism”,

recebendo, posteriormente, as denominações Campylobacter pyloridis, Campylobacter

pyloricus e Campylobacter pylori (MURRAY et al., 2010).

Finalmente, a partir de 1989, após estudos ultraestruturais e de análise da

sequência de ácidos nucléicos, a bactéria recebeu a denominação Helicobacter pylori,

diferenciando-se do gênero anteriormente chamado Campylobacter para o novo gênero

Helicobacter (GOODWIN et al., 1989).

A descoberta do Helicobacter pylori revolucionou a gastroenterologia

contemporânea e possibilitou o esclarecimento sobre várias doenças gástricas como gastrite

crônica, úlcera péptica, linfoma MALT (tecido linfóide associado a mucosa) e câncer

gástrico. O manejo das doenças gastrointestinais foi notoriamente alterado após a

comprovação do papel da infecção por H. pylori.

1.2 Microbiologia

Helicobacter pylori é uma bactéria gram negativa, flagelada, espiralada,

microaerofílica, produtora de urease, catalase, oxidase, protease e fosfolipase, enzimas

15

importantes para adaptação no epitélio gástrico. A urease produzida converte uréia em

amônia e CO2. Os íons de hidrogênio presentes no meio ácido do estômago são transferidos

para amônia, gerando um ambiente neutro no ambiente pericelular e permitindo a

sobrevivência da bactéria (MOBLEY et al., 2001).

A cultura de H. pylori é realizada a 37◦C em meio contendo sangue e

suplementos tais como vitamina B12 e aminoácidos (L-glutamina e L-cisteína) e em

ambiente atmosférico contendo 5 a 15% de O2 e 5 a 10% de CO2, em presença de agentes

antimicrobianos (HOLTON et al., 1999). As colônias formadas são circulares e convexas e

não apresentam hemólise. Após a cultura, a identificação é realizada observando-se a

morfologia da colônia, coloração gram e provas bioquímicas para urease, catalase e oxidase

(NDIP et al., 2003).

1.3 Diagnóstico do Helicobacter pylori

Existem vários métodos para diagnóstico do Helicobacter pylori e estes podem

ser tanto invasivos, quanto não invasivos. Pode-se destacar dentre os métodos invasivos a

cultura direta da bactéria, o exame histopatológico e o teste rápido da urease a partir de

espécime de biópsia gástrica. Há também os métodos nos quais não se faz necessário o

exame endoscópico, sendo considerados não invasivos. Dentre eles, estão os testes

sorológicos através das técnicas de ELISA, Western Bloting e a pesquisa de antígeno fecal,

além do teste respiratório com uréia marcada com Carbono 13 ou 14 e mais recentemente, o

método não-endoscópico como o Enteroteste.

A cultura é o mais preciso de todos os métodos para identificar o H. pylori, no

entanto, o seu cultivo é difícil, exigindo um meio enriquecido adequadamente e uma

incubação prolongada durante 3 a 5 dias, em ambiente microaerofílico e controlado. A

bactéria pode ser cultivada a partir de tecido gástrico obtido endoscopicamente. Quando se

cultiva a bactéria, a coloração mais adequada é a de Gram. Mas, usualmente não se emprega

este método para diagnóstico clínico, ficando o mesmo reservado para circunstâncias

especiais, como determinação de perfis de sensibilidade a antimicrobianos por cepas

resistentes (SIAVOSHI et al., 2012).

A histologia é considerada o padrão ouro no diagnóstico direto da gastrite por

H. pylori (MALFERTHEINER et al., 2012). Atualmente, a coloração mais utilizada é a

Giemsa e a imunocoloração aumenta ainda mais a sensibilidade e especificidade da técnica

(BRADEN, 2012). No entanto, alguns fatores do hospedeiro podem afetar a precisão na

16

detecção do H. pylori na histologia. Portanto, o IV Consenso de Maastricht recomendou que

se possível, os inibidores de bomba de prótons devam ser interrompidos durante duas

semanas antes de realizar a histologia (MALFERTHEINER et al., 2012). É bem sabido que

o sangramento diminui a sensibilidade ao H. pylori em pacientes com úlcera péptica

sangrante, porém Choi et al. (2012) determinaram que a histologia é um teste bastante

confiável, independentemente da presença de sangramento.

Outro método de detecção pelo material colhido na endoscopia é o teste rápido

da urease, que se baseia na produção de urease pela bactéria para efetuação do diagnóstico

indireto da presença do H. pylori. O teste positivo é suficiente para iniciar um tratamento de

erradicação (MALFERTHEINER et al., 2012). A detecção indireta da bactéria realizada

pelo teste rápido da urease através de amostras retiradas da mucosa antral gástrica, é um

método bastante utilizado por ser relativamente barato e fornecer resultados rápidos. Este

teste é o preferido quando se indica a endoscopia diagnóstica para que se investigue a

presença de uma determinada patologia gástrica responsável pelos sintomas do paciente. No

caso de uma úlcera ativa com sangramento, a sensibilidade pode ser reduzida (CHOI et al.,

2012).

Através da sorologia, podem-se detectar, pelo ensaio imunossorbente ligado à

enzima (ELISA) e pelo Western Bloting, os anticorpos da classe IgG e IgA dirigidos a

vários antígenos bacterianos. Mesmo com o decréscimo nos níveis de anticorpos após a

erradicação bem-sucedida das bactérias, eles continuam altos até 3 anos após a cura.

Portanto, a acurácia deste método para avaliar a “cura” pós-tratamento do Helicobater

pylori, fica limitada devido a essa “cicatriz sorológica” (MALFERTHEINER et al., 2012).

Esses métodos têm grande utilidade em estudos epidemiológicos.

A pesquisa de antígenos do H. pylori nas fezes (HpSA), é mais um método não

invasivo e tem obtido valia para o diagnóstico da infecção por esta bactéria. A pesquisa de

antígenos fecais expressa vantagem porque obtêm-se o resultado em torno de uma hora.

Segundo um estudo com 102 pacientes tratados, a pesquisa de antígenos fecais do H. pylori

tem acurácia comparável ao teste respiratório, como também se mostra eficaz no controle da

erradicação (SHIMOYAMA et al., 2011). Outro estudo estabeleceu que o seu desempenho

fosse comparável ao da histologia, teste rápido da urease e teste respiratório, com uma

precisão de 93,6-95,9 % na detecção da bactéria (CHOI et al., 2012). A pesquisa de

antígenos fecais ainda tem uma boa relação custo-benefício, é fácil de ser realizada, obtêm-

se resultado rápido e não requer equipamentos ou cuidados especiais.

17

O teste respiratório baseia-se no fato de o H. pylori ser produtor de urease e

clivar a uréia em amônia e gás carbônico. Nele, o paciente ingere uma pequena quantidade

de uréia rádio-marcada com C13

ou C14

. Quando ingerida, a uréia é desdobrada pela urease

do H. pylori, presente na mucosa gástrica dos pacientes infectados, em amônia e CO2

marcado, que é rapidamente absorvido através do epitélio gástrico e atinge a circulação

sanguínea, indo até os pulmões e sendo eliminado pela expiração. O CO2 marcado, coletado

através da exalação respiratória em um balão específico, é detectado através do ar expirado

pelo paciente por espectrômetro de massa ou de cintilação líquida, conforme tenha sido

usado o C13

ou o C14

, respectivamente (BRADEN, 2012).

O teste respiratório constitui, hoje, o melhor exame para controle de tratamento

da infecção quando não se faz necessária a avaliação da mucosa. Em um estudo de base

populacional avaliou-se a utilização do teste respiratório pelos próprios pacientes em

domicilio, como parte de uma estratégia para se investigar a prevalência de H. pylori em

pacientes que utilizaram o teste pela primeira vez. Foi mostrado que o erro na coleta foi de

apenas 1,6%, indicando que esta estratégia pode ser utilizada (DAHLERUP et al., 2011). O

teste respiratório com C13

tem mostrado um nível variável de precisão na população

pediátrica. Em uma meta-análise, Leal et al. (2011) confirmaram que este teste era menos

preciso para o diagnóstico da infecção por H. pylori em crianças pequenas.

Atualmente, pode se utilizar também testes de biologia molecular para averiguar

a presença do H. pylori, como a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, pela sigla em

inglês). Essas técnicas não são ainda utilizadas na prática do diagnóstico clínico, mas são de

grande importância na pesquisa científica, uma vez que permite conhecer a virulência das

cepas bacterianas circulantes.

A reação em cadeia de polimerase (PCR) baseia-se na amplificação de

fragmento específico de DNA, a partir de uma sequência de DNA molde. A técnica requer a

utilização de “primers”, que são pequenos fragmentos de DNA, tipicamente de vinte pares

de bases, complementares a cada uma das extremidades da sequência de DNA de interesse,

onde a partir deles uma DNA polimerase (Taq-DNA polimerase), promoverá a síntese de

DNA por adição de nucleotídeos complementares. A amplificação do DNA é possível

através de etapas bem definidas de: desnaturação, anelamento e extensão, que são

executadas em um termociclador. Deste modo, uma sequência de interesse dentro de todo o

genoma de uma espécie pode ser amplificada e este pequeno fragmento se torna majoritário

na amostra de DNA, através da amplificação do mesmo. O grau de homologia do “primer”

18

complementar é que determina a especificidade do PCR. O método é mais sensível e tão

específico quanto a cultura. A utilização de “primers” específicos permite identificar os

diversos genótipos das cepas patogênicas (LAGE et al., 1995).

A PCR apresenta elevada sensibilidade e especificidade, pode ser feita

diretamente das biópsias gástrica ou duodenal, do suco gástrico, da placa dentária, da saliva,

da cultura e até mesmo das fezes. Devido sua alta sensibilidade, a PCR é muito utilizada em

estudos epidemiológicos (LEHOURS et al., 2003).

Como uma possível alternativa à endoscopia, Perez-Trallero et al. (1995)

propuseram o Enteroteste para obtenção de suco gástrico. Este teste permite obter suco

gástrico sem a necessidade de endoscopia digestiva alta sendo possível detectar H. pylori a

partir do cultivo do suco e da PCR.

Nesse teste o indivíduo ingere um cordão com uma cápsula contendo um fio no

seu interior. Após 1 hora, o fio é retirado e o suco gástrico aderido ao cordão será utilizado

para testes moleculares e cultura. Os resultados obtidos com esse método são variáveis com

sensibilidade de 75% a 100%, em países como Austrália (SAMUELS et al., 2000) e México

(TORRE et al., 2001) respectivamente e quando comparado com o exame histológico ou

cultura da biópsia. Também em Taiwan e no Peru foi relatada alta sensibilidade e

especificidade do método (WANG et al., 2003; VELAPATIÑO, et al., 2006).

O Enteroteste pode ser utilizado para avaliar sensibilidade antimicrobiana em

pacientes que não curaram a infecção, sendo enfatizada a importância do método associado

ao teste respiratório, na falência do tratamento com o objetivo de determinar a resistência

pós-terapêutica do H. pylori aos antibióticos, com pouco inconveniente para o paciente

(LEODOLDER et al., 2005).

A endoscopia é um método, desconfortável, não se tornando adequado para

estudos de comunidade e principalmente em crianças, grupo esse de fundamental

importância para o estudo do H. pylori, pois a infecção é adquirida na infância. Estudos

realizados pelo presente grupo em crianças assintomáticas de uma comunidade urbana de

Fortaleza-Ce demonstraram precisão de 94% na detecção da bactéria por PCR em amostras

gástricas obtidas por enteroteste (GONÇALVES et al., 2013).

O DNA bacteriano também pode ser sequenciado para análise de determinados

“trechos” do material genético que codificam produtos importantes para a virulência das

cepas de H. pylori. Pode-se também aplicar a técnica de hibridização reversa ou

colorimétrica para detectar produtos de amplificação do DNA (BRADEN, 2012). Aplicações

promissoras da técnica incluem a identificação de pontos de mutação responsáveis pelo

19

desenvolvimento de resistência bacteriana e a detecção de determinantes de virulência, como

os genótipos cagA, vacA, oipA, babA, iceA, hom, dupA das cepas infectantes e sua relação

com patologias gastroduodenais específicas.

1.4 Patogênese do Helicobacter pylori

Os mecanismos pelos quais a bactéria produz diferentes quadros clínicos no

estômago e no duodeno não foram totalmente esclarecidos. Fatores da bactéria, do

hospedeiro e ambiental contribuem para estabelecer evoluções clínicas diversas. Dentre os

principais mecanismos patogênicos envolvidos estão a resposta inflamatória da mucosa e a

alteração da secreção ácida gástrica do hospedeiro e os fatores de virulência do

microrganismo.

1.4.1 Fatores do Hospedeiro e Ambientais

Baseada em estudos epidemiológicos, a Organização Mundial de Saúde

classificou em 1994 o H. pylori como um carcinogéneo do tipo I em humanos. É também

aceito que a infecção crônica por H. pylori induz hipocloridria e atrofia gástrica, sendo

ambos precursores do câncer gástrico. A presença de infecção no final desta cascata não é

necessária para o desenvolvimento da neoplasia uma vez que já ocorreram danos

irreversíveis (MCNAMARA; EL-OMAR, 2008).

O H. pylori coloniza a mucosa gástrica e estabelece uma infecção em longo

prazo. Esta infecção induz primeiro uma gastrite crônica superficial que pode progredir para

gastrite crônica atrófica, metaplasia intestinal, displasia e por fim carcinoma gástrico

(FIGUEIREDO et al., 2002).

A gastrite é caracterizada por uma inflamação severa e crônica que pode durar

décadas se não for tratada. O H. pylori induz inflamação que promove o desenvolvimento de

danos na mucosa gástrica caracterizada por uma forte infiltração de granulócitos e linfócitos.

As células mononucleares e os neutrófilos liberam Espécies Reativas de Oxigênio e

Nitrogênio que, juntamente com a redução nos níveis de antioxidantes, levam ao stress com

lesão oxidativa, que é importante na modificação estrutural do DNA e no desequilíbrio do

sistema de transdução de sinais das células epiteliais gástricas, que é considerado

carcinogênico (ANDO et al., 2006).

20

Após a inflamação aguda e as alterações na permeabilidade do epitélio gástrico,

haverá uma exposição continua ao antígeno, que implicará em recrutamento de células T e

uma indução na produção de anticorpos pelas células B. Células T auxiliares imaturas (Th0)

expressão CD4 e podem se diferenciar em dois subtipos funcionais. As células Th1, que são

secretoras de IL -2 e interferon- γ (IFN –γ), e as células Th2, que secretam IL-4, IL-5 e IL-

10. Células Th1 e Th2 estimulam diferentemente a resposta das células B contras os

microrganismos invasores. Enquanto que na maioria das vezes, as células Th1 estimulam

respostas a agente patógenos intracelulares, as células Th2 apresentam resposta a patógenos

extracelulares (KANG et al., 2009).

Existem evidências de que a resposta de células T auxiliares (Th1) induzida pelo

H. pylori contribui para o desenvolvimento de tumores gástricos (ZORZETTO et al., 2012).

A indução da inflamação no microambiente do estômago encontra-se associada com a

produção de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8. Vários estudos

demonstraram que os níveis destas citocinas na mucosa são significativamente mais

elevados em pacientes infectados com H. pylori (KANG et al., 2009; WATANABE at al.,

2010; SUGANUMA et al., 2012). A IL-10 é uma das mais importantes citocinas

regulatórias, pois inibe a resposta imune induzida por células (ABDOLLAHI et al., 2011).

A infecção pelo H. pylori também está associada ao desenvolvimento da úlcera

péptica, devido à superprodução ácida derivada desta infecção, que gera uma sobrecarga

crônica e contínua nas células gástricas. Por conseguinte, a mucosa sofre um processo de

evolução metaplásica, seguida de alterações estruturais defeituosas que desembocam com o

desenvolvimento da ulceração do estômago (CARVALHO, 2000).

A úlcera duodenal, geralmente, é derivada de uma gastrite antral, que é a forma

mais comum de gastrite causada pelo H. pylori. Já indivíduos que apresentam gastrite corpal

e atrofia multifocal são mais propensos ao desenvolvimento de úlcera gástrica, atrofia

gástrica, metaplasia intestinal e, por último, do carcinoma gástrico (SUERBAUM,

MICHETTI, 2002).

A estreita relação entre a infecção pelo H. pylori e a úlcera péptica foi

demonstrada por Marshall (1994), observando que, ao fazer o tratamento de erradicação da

bactéria, ocorre um processo de cicatrização da úlcera sem a necessidade de utilizar

medicamentos supressores da secreção ácida. Esse fato é evidenciado tendo em vista que

70% a 80% dos pacientes portadores de úlcera gástrica e 95% dos portadores de úlcera

duodenal estão infectados com o H. pylori.

21

Fatores ambientais que protegem contra câncer gástrico incluem alimentação

com frutas e verduras e consumo de alimentos refrigerados. Fatores que estão relacionados

com câncer gástrico incluem elevado consumo de sal e de nitratos (GRAHAM et al.,2009).

É sabido que a H. pylori tem co-evoluido com os humanos há pelo menos 58.000 anos,

quando eles imigraram da África, sendo portanto considerada uma bactéria extremamente

heterogênea e os fatores de virulência da mesma também mudaram geograficamente (LINZ

et al., 2007).

1.5 Epidemiologia

Verifica-se que a infecção por H. pylori ocorre em todo o mundo, mas a

prevalência varia muito entre países e entre grupos populacionais dentro do mesmo país.

Essas diferenças entre os grupos étnicos são ocasionadas pelas intensidades maiores ou

menores de exposição ao agente etiológico, tanto social como relativa à dieta alimentar e aos

fatores ambientais (BARBOSA; SCHINONNI, 2011).

Evidências epidemiológicas apontam que a infecção por H. pylori também está

relacionada com a idade, sendo que a aquisição desta bactéria é mais comum na infância do

que na idade adulta (YAMAOKA, 2010). Esta teoria é claramente contextualizada em países

em desenvolvimento, sendo relatada em vários artigos científicos nos últimos anos. Estudo

efetuado recentemente em crianças no sul da Nigéria encontrou prevalência de 30,9%,

verificando que a infecção era normalmente adquirida na infância (ETUKUDO; IKPEME;

EKANEM, 2012). Por outro lado, nos países considerados desenvolvidos, verifica-se uma

maior taxa da prevalência deste microrganismo em indivíduos adultos, podendo-se concluir

que a manutenção de H. pylori, associada ao fator idade, está fortemente correlacionada com

as condições socioeconômicas, falta de água potável e a uma alta densidade de habitantes

em determinadas regiões do globo (KUSTERS et al., 2006).

No Brasil, estudo realizado em Fortaleza em crianças e adolescentes, encontrou

prevalência de 30% nas crianças aos 2 anos de idade, atingindo 74% de infectados aos 20

anos (RODRIGUES et al., 2004). Outro estudo realizado em pacientes dispépticos atendidos

no Hospital Universitário evidenciou prevalência de H. pylori em torno de 80% (MOTTA et

al., 2008). Recentemente, estudo de coorte em Fortaleza acompanhou 133 crianças e

evidenciou que a prevalência de H. pylori foi de 53,4% no início do estudo e de 64,7% oito

anos depois. Fatores de risco associados com a infecção foi número de pessoas por

residência e sexo masculino (QUEIROZ et al., 2012).

22

Atualmente, vários estudos têm mostrado que a prevalência da infecção por H.

pylori está diminuindo em adultos e crianças em países desenvolvidos e em

desenvolvimento (TONKIC et al., 2012). Isto evidencia as melhorias das condições

socioeconômicas e conduta clinica voltada para o combate dessa bactéria.

Na Europa, a prevalência de H. pylori permanece mais elevada em países da

Europa Oriental em relação a Europa Ocidental. Um estudo realizado em hospital na

Alemanha Oriental, envolvendo 2318 pacientes demonstrou uma prevalência de H. pylori de

44% e evidenciou ainda uma queda significativa na prevalência em indivíduos nascidos após

1980, período em que houve mudanças significativas nas condições socioeconômicas (WEX

et al., 2011).

Uma coorte realizada na Bélgica durante 20 anos (1988-2007) incluindo 22.615

pacientes evidenciou uma proporção global de 37,7% de pacientes H. pylori positivos e uma

queda significativa na prevalência ao decorrer dos anos (MIENDJE DEYI et al., 2011).

Estudo realizado nos EUA, envolvendo 4145 adultos de 1999 a 2000, evidenciou

uma queda significativa na prevalência de H. pylori somente no grupo de brancos não-

hispânicos, quando comparado com os dados de 1988 a 1991. Já no grupo de negros não-

hispânicos e mexicanos não houve queda, sendo a prevalência de H. pylori de 21,2%, 52% e

64%, respectivamente (GRAD YH et al., 2012). Estudo retrospectivo realizado na Argentina

(2002-2009) envolvendo 1030 crianças encontrou redução na prevalência de 41,2% entre

2002-2004 para 26% entre 2007-2009, confirmando a tendência ao decréscimo de

prevalência global (JANJETIC et al., 2011).

Apesar das taxas de infecção terem sofrido um decréscimo nas últimas décadas,

na região da Ásia-Pacífico, principalmente devido à melhoria das condições de higiene em

alguns países dessa região, uma grande proporção de indivíduos adultos permanece

infectada, apresentando índices elevados para a úlcera péptica e câncer gástrico. Nesse

último caso, a doença permanece como a segunda causa de morte por câncer no mundo, e os

casos dessa região contribuem muito para essa estatística, o que demonstra que a infecção

pelo H. pylori envolve fatores da bactéria, do hospedeiro e do ambiente (KAMANGAR et

al., 2006; FOCK et al., 2009).

Na figura 1 encontra-se representada a prevalência mundial da infecção por

Helicobacter pylori.

23

Figura 1: Prevalência global da infecção pelo Helicobacter pylori

Fonte: The Helicobacter Foundation 2014

1.6 Genes do Helicobcter pylori associados aos fatores de virulência

1.6.1 Gene vacA

O gene vacA, presente em todas as cepas do H. pylori, produz a denominada

citotoxina de vacuolização (VacA), um importante fator de virulência bacteriano que tem

sido associado ao desenvolvimento da úlcera péptica e do câncer gástrico (BLASER;

ATHERTON, 2004).

Uns dos mecanismos de sobrevivência da bactéria em meio ácido do estômago é

a presença da enzima urease e da citotoxina VacA, que induz a formação de canais seletivos

de anions nas células epiteliais, levando à liberação de ureia para a mucosa gástrica,

promovendo a não funcionalidade dos lisossomas/endossomas na célula epitelial assim

como a sua apoptose (BACKERT et al.,2011; YAMAOKA, 2012). O gene vacA e seus

produtos são considerados importantes fatores de virulência, visto que contribuem para a

produção de alcaloides pela urease, que podem induzir danos no DNA do hospedeiro e

consequentemente promover a resposta inflamatória (YAMAOKA, 2012).

A combinação em mosaico dos alelos da região s com os alelos da região m

determina a produção de citotoxinas, responsáveis pelos diferentes graus da atividade

vacuolizante da bactéria (YAMAOKA, 2010). Assim, as cepas portadoras do genótipo vacA

s1/m1 produzem uma elevada quantidade de toxina, enquanto que as estirpes s1/m2

24

produzem uma quantidade moderada e as estirpes s2/m2 produzem uma quantidade quase

nula. Estirpes s2/m1 são raramente encontradas (SUZUKI; SHIOTA; YAMAOKA, 2012).

Por sua vez, as estirpes vacA do tipo s1a parecem ser mais patogênicas que as s1b, s1c e/ou

s2, estando as primeiras relacionadas com o desenvolvimento de úlcera péptica. As cepas do

tipo m1 estão associadas a um maior risco de danos nas células epiteliais do que as do tipo

m2 (YAMAOKA, 2012)

Recentemente foi identificada uma nova região alélica no gene vacA

denominada de região intermediária (i), podendo ser dividida em i1 e i2. Todas as estirpes

s1/m1 foram associadas a i1 e todas as cepas s2/m2 foram associadas a i2, provavelmente

derivado das respetivas localizações no gene (YAMAOKA, 2010). Verifica-se que estirpes

do tipo i1 apresentam uma maior patogenicidade que as do tipo i2, aumentando o risco de

desenvolvimento de carcinoma gástrico. Mais recentemente, foi identificada também uma

quarta região alélica denominada de região de deleção (d), que se divide em d1 e d2. A

diferença entre as duas incide no facto de d1 não apresentar deleção enquanto que d2

apresenta uma deleção entre 69 e 81 pb. Assim, d1 apresenta um maior grau de

patogenicidade do que d2, aumentando o risco de atrofia da mucosa gástrica (SUZUKI,

SHIOTA, YAMAOKA, 2012).

1.6.2 Gene oipA

O gene oipA (gene de proteínas inflamatórias) codifica uma proteína de

membrana externa e é relacionado com a adesão bacteriana a mucosa gástrica e indução do

processo inflamatório, podendo levar a diferentes afecção gástricas como úlcera péptica e

câncer gástrico (FRANCO et al., 2008; YAMAOKA , 2010).

O gene oipA está localizado aproximadamente a 100Kb da Ilha de

patogenicidade cag (cag-PAI), e pode apresentar-se como o gene funcional ou não funcional.

O oipA funcional é regulado por um mecanismo de reparo "slipped strand" de acordo com o

número de dinucleotídeos CT repetidos na região 5' do gene. Em estudo de Yamaoka et al.

(2000), o gene oipA funcional apresentava 6 e 9 repetições do dinucleotídeo CT, já o oipA

não funcional apresentava 5 e 7 dinucleotídeos CT repetidos. A presença do gene oipA

funcional foi associada com o aumento da produção de IL-8 em células de linhagem de

câncer gástrico.

25

Recentemente estudo mostrou que OipA induz inflamação através de

mecanismos de fosforilação em diversas vias de sinalização celular e que têm uma forte

interação com a fosforilação induzida pela proteína CagA (TABASSAM et al., 2008).

Estudo realizado nos EUA e Colômbia em 247 pacientes com diferentes

desfechos clínicos, mostrou que o gene oipA, os genótipos cag PAI-positivo, vacA s1 e

babA foram todos relacionados ao risco de úlcera duodenal, e que oipA, isoladamente, é um

preditor determinante do desenvolvimento de úlcera duodenal a partir da inflamação gástrica

(YAMAOKA et al., 2002). Este achado foi confirmado em outro estudo, que utilizou uma

coorte de 200 pacientes randomizados, que tiveram sua resposta imunológica à infecção por

H. pylori analisada por immunoblot, para quatro proteínas da membrana exterior: OipA,

BabA, BabB e SabA (YAMAOKA et al., 2006).

Estudos mostram resultados controversos sobre associação do genótipo oipA

com outros fatores de virulência (ODENBREIT et al., 2002 , 2009) . Cepas H. pylori

mostram grande diversidade dependendo das regiões geográficas.

1.6.3 Gene hom

As moléculas de adesão da membrana externa do Helicobater (Hom) constituem

uma pequena família de proteínas que contem motifs hidrofóbicos e sinal de sequências

alternantes no terminal C (ALM et al., 2000). O gene homB e o gene muito semelhante

homA (90% de similaridade de nucleotídeos) são membros dessa família. Ambos os genes

podem estar presentes em dois locus conservados como uma cópia única ou como cópia

dupla. Portanto, as cepas de H. pylori podem ter somente um gene homA ou homB, com o

outro locus vazio (homA/- ou homB/-), duas cópias de homA (homA/homA) ou homB

(homB/homB); uma cópia única de cada gene (homA/homB) ou nenhum desses genes ( -/- ).

O estudo citado avaliou in vitro, através de um modelo de cultivo de H. pylori

com diferentes cepas para homB (nenhuma, uma ou duas cópias do gene homB) e posterior

modelo de transformação bacteriana com knockout do gene através de plasmídio suicida, o

efeito da proteína HomB e presença do gene homB sobre a adesão bacteriana em células

gástricas e produção de IL-8 (citocina envolvida no processo inflamatório associada a

recrutamento de neutrófilos). Os resultados in vitro demonstraram que a deleção de uma

cópia do gene homB diminuiu adesão bacteriana e a deleção de dois genes, nas cepas

portadoras de duas cópias do mesmo (homB/homB) diminuiu, de forma ainda mais

expressiva, a adesão bacteriana. No entanto, como não houve inibição completa da adesão,

postulou-se que outros genes estariam envolvidos também nesse processo. Além disso, a

26

deleção de uma ou duas cópias do gene homB promoveu redução ainda mais acentuada dos

níveis de IL-8 (ORLEASTRO et al., 2008).

Estudos clínicos e epidemiológicos realizados em países do Oriente e Ocidente,

a fim de determinar se a presença de homB está associada a aumento da severidade de

doenças gastrointestinais, encontraram resultados distintos, evidenciando a diversidade

geográfica de cepas de H. pylori e do impacto das mesmas do ponto de vista clínico. A

presença de homB foi significantemente associada ao desenvolvimento de doença ulcerosa

péptica em crianças e adultos jovens (< 40 anos) de Portugal (ORLEASTRO et al., 2006,

2008) e com câncer gástrico e presença de cagA nos EUA e Colômbia (JUNG et al., 2009).

Em discordância, estudo realizado na Coréia do Sul envolvendo 260 pacientes, não

demonstrou associação de homB com câncer gástrico ou úlcera e presença de cagA (KANG

et al., 2012).

Estudo realizado pelo presente grupo foi o primeiro no Brasil a avaliar os genes

homA e homB em pacientes com câncer gástrico. Não se evidenciou associação significante

entre presença do gene homB e câncer gástrico, estando este gene associado somente com

doença ulcerosa péptica (DUP). A prevalência de homB foi de 47,4% no grupo de DUP e de

21,2% em pacientes com câncer gástrico (BRAGA NETO, 2013).

1.6.4. Gene dupA

Recentemente, foi descrito o primeiro marcador de virulência de H. pylori

específico em induzir ulcera gástrica e inibir o câncer gástrico, o gene A promotor da úlcera

duodenal (dupA) (LU et al., 2005). Um estudo envolvendo amostras de pacientes do Japão,

Coréia do Sul e Colômbia demonstrou que a presença do gene dupA é mais alta em pacientes

com úlcera duodenal comparados aos com câncer gástrico (LU et al., 2002). No entanto,

tais resultados não são consenso. Vários estudos foram conduzidos no mundo a fim

confirmar a correlação entre dupA e úlcera duodenal. Estudos da Índia, China e Iraque

confirmaram essa hipótese (ARACHCHI et al., 2007, ZHANG et al., 2008, HUSSEIN et al.,

2008). No entanto, estudos do Iran, Brasil, Cingapura, Malásia e Japão não evidenciaram

correlação entre o gene dupA e doença (DOURAGHI et al., 2008, SCHIMDT et al., 2009).

1.6.5 Ilha de Patogenicidade cag (cagPAI) - Genes cagA e cagE

A Ilha de Patogenicidade cag (cag-PAI) é um componente do genoma do H.

pylori que contém 31 genes, dentre eles os genes cagA,cagE, cagT,cagL, que são homólogos

aos de outras bactérias que codificam componentes do sistema de secreção do tipo IV

27

(T4SS), que tem a função de transferir proteínas e complexos núcleo-protéicos através das

membranas. Esse sistema parece compor uma estrutura de transporte de produtos do H.

pylori através da membrana bacteriana e plasmática das células gástricas epiteliais,

permitindo que a bactéria module vias do metabolismo celular da célula hospedeira,

incluindo a expressão de proto-oncogenes (HATAKEYAMA, 2009; BACKERT; CLYNE,

2011).

O gene cagA é considerado um marcador da ilha de patogenicidade cag (cag-

PAI), possui entre 35 e 40Kb, encontrado em cerca de 60% das cepas ocidentais, enquanto

no Oriente praticamente todas as cepas são cagA positivas (HATAKEYAMA et al., 2004).

Dessa forma, após ligação às células do epitélio gástrico, as cepas do H. pylori

cagA positivas injetam a proteína CagA no citoplasma celular, através do sistema de

secreção tipo IV. A proteína CagA translocada localiza-se, então, na parte interna da

membrana plasmática, onde sofre tirosina fosforilação, através de uma das enzimas da

família quinase (MURATA- KAMIYA, 2011).

Após ser translocada para o citoplasma a CagA é tirosina-fosforilada e esta

fosforilação ocorre nos sítios EPIYA da proteína. Esta fosforilação induz uma serie de

efeitos intracelulares, incluindo a indução de mediadores inflamatórios, rearranjos no

citoesqueleto e indução de proteínas proliferativas e oncogênicas (HATAKEYAMA et al.,

2004).

A proteína CagA, injetada nas células hospedeiras, é capaz de perturbar os

sistemas de transdução de sinais e alterar as funções celulares através da interação direta

com uma proteína celular denominada tirosina-fosfatase eucariótica (SHP-2). Esta

desempenha um importante papel na transdução mitogênica, sendo também ativamente

envolvida na regulação da difusão, da migração e da adesão celular. A alteração na

regulação dessa proteína pela CagA pode induzir a proliferação anormal das células

gástricas epiteliais, podendo, ainda, ter um papel crucial no surgimento de fenótipos

celulares alterados em um estágio relativamente precoce do processo da carcinogênese

gástrica (BACKERT et al., 2010). A proteína CagA é capaz de romper as junções celulares,

provocando a perda da polaridade apical baso-lateral das células gástricas (SAADAT et al.,

2007). A Figura 2 apresenta o esquema da injeção da proteína CagA no citosol das células

epiteliais gástricas através do sistema de secreção tipo IV.

28

Figura 2: Representação do sistema de secreção do tipo IV (cag-PAI) do H.pylori que injeta a proteína CagA

na célula epitelial gástrica.

Fonte: Adaptado de Hatakeyama, 2009

A CagA possui uma sequência repetida de 5 aminoácidos (ácido glutâmico-

prolina-isoleucina-tirosina-alanina), que constitui um domínio denominado EPIYA,

encontrado na região polimórfica carboxi-terminal da proteína (MURATA- KAMIYA ,

2011). O domínio EPIYA é dividido em quatro extensões, EPIYA-A, EPIYA-B, EPIYA-C e

EPIYA-D, com base na sequência de aminoácidos que flanqueia cada um deles. De acordo

com a combinação desses domínios, as cepas produtoras de CagA foram divididas em dois

grupos, a CagA dos Países Ocidentais, que possui os domínios EPIYA-A e EPIYA-B

seguidos de uma a cinco repetições do EPIYA-C, e a CagA do Oriente, que apresenta os

domínios EPIYA-A e EPIYA-B seguidos do EPIYA-D (HATAKEYAMA , 2011).

Vários estudos clínicos têm sugerido que o número dessas repetições C,

encontra-se associado com o desenvolvimento de doenças gástricas mais graves (HIGASHI

et al., 2005; NAITO et al., 2006; BARTCHEWSKY et al., 2009), enquanto outros não

chegam a estas conclusões (ZHU et al., 2005; CHOI et al., 2007). A relação direta entre a

presença de cagA com segmento EPIYA especifico e as afecções gástricas no hospedeiro

ainda não estão bem elucidadas (XIA et al., 2009).

Estudo realizado no Brasil por Batista et al. (2011) encontrou que o número de

repetições C estava associado com o câncer gástrico e gastrite atrófica, mas não com úlcera

duodenal. Recentemente, estudo do presente grupo, avaliando o perfil de cepas EPIYA em

pacientes dispépticos com e sem história familiar de câncer gástrico em Fortaleza,

29

demonstrou que indivíduos familiares de pacientes com câncer de estômago são colonizados

por cepas de H. pylori contendo maior número EPYIA com mais repetições C

(CAVALCANTE et al., 2012).

Indivíduos infectados por cepas que expressam o gene cagA têm uma

probabilidade três vezes maior de desenvolver úlcera duodenal ou até mesmo carcinoma

gástrico do que aqueles infectados com cepas cagA negativa. Contudo, como a proteína

CagA é fortemente imunogênica, qualquer variação no seu gene pode levar a diferentes

respostas do hospedeiro, incluindo diferentes graus de resposta inflamatória (YAMAOKA,

2010). Estudo realizado no Ceará pelo presente grupo confirmou elevada prevalência do

genótipo cagA em pacientes com câncer gástrico e úlcera péptica (QUEZADO et al., 2012).

A CagA é uma das proteínas mais estudadas do H.pylori e existem fortes

evidencias de que ela funcione como uma oncoproteína. Estudos em modelos animais e de

cultura de células mostraram o importante papel da CagA na patogênese do H.pylori e

destacaram as diversas funções celulares que ela pode interferir. A geração de camundongos

transgênicos que expressaram CagA levaram a proliferação anormal das células epiteliais

gástricas e ao carcinoma. Estas mudanças não foram observadas em camundongos que

expressaram CagA resistentes à fosforilação (OHNISHI et al., 2008). Muito ainda precisa

ser entendido sobre todas as circunstâncias que contribuem para permitir que CagA inicie a

carcinogênese (MURATA- KAMIYA , 2011).

Por sua vez, gene cagE (cytotoxin associated gene E) localizado na extremidade

direita da cag-PAI codifica proteínas que compõem o sistema de secreção tipo IV

(CHRISTIE et al., 2005), e de acordo com alguns estudos é responsável pelo aumento da

secreção de IL-8 ( SU et al., 2003 ; . TOMASINI et al., 2003). Esse gene ainda não teve seu

papel completamente identificado na patogênese das doenças gastroduodenais, mas,

demonstra ser, junto ao gene cagA, um importante fator de virulência (SOZZI et al., 2005;

CHOMVARIN et al., 2008) , sendo associado,em alguns trabalhos, ao desenvolvimento da

úlcera péptica (ERZIN et al., 2006; MÓDENA et al., 2007) e câncer gástrico (ERZIN et al.,

2006; LIMA et al., 2010). Outros estudos são necessários em diferentes populações para

esclarecer o papel do gene cagE na patogênese das doenças gastrointestinais.

30

1.7 Justificativa

A prevalência da infecção pelo H. pylori e o seu potencial de virulência diferem

nas diversas regiões do planeta por conta da alta variabilidade genética de suas cepas, o que

implica também em diferenças na correlação da infecção com as principais afecções

gástricas. Os sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA e o gene cagE

mostram-se como importantes marcadores de virulência da bactéria uma vez que estão

envolvidos em mecanismos moleculares que levam ao aparecimento de afecções gástricas

mais graves. Portanto, torna-se importante a determinação dos genótipos das cepas

circulantes H. pylori na comunidade local, pois contribui diretamente para o entendimento

dos principais marcadores genéticos de virulência das cepas locais e, consequentemente,

para a elaboração de protocolos de prevenção e tratamento eficazes.

31

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Caracterizar as cepas de H. pylori quanto à presença dos sítios de fosforilação

de tirosina da proteína CagA – EPIYA e dos genes cagE em pacientes com gastrite e úlcera

péptica.

2.2 Objetivos específicos

Determinar o número de sítios de fosforilação de tirosina da proteína CagA EPIYA

do Helicobacter pylori em pacientes com gastrite e úlcera péptica.

Determinar se há associação entre os sítios de fosforilação de tirosina da proteína

CagA EPIYA com as afecções gastrite e úlcera péptica.

Determinar se há associação do gene cagE com idade e gênero dos pacientes.

Verificar a prevalência do genótipo cagE do H. pylori em pacientes com gastrite e

úlcera péptica.

Determinar se há associação dos genótipos cagE do H. pylori com as afecções

gastrite e úlcera péptica.

32

3 CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Casuística

A escolha inicial da amostra do estudo foi feita com base no registro de

pacientes atendidos no Ambulatório de Gastroenterologia do Hospital Universitário Walter

Cantídio (HUWC) da Universidade Federal do Ceará – UFC, os quais foram convidados a

participar do estudo e submetidos à consulta médica a nível ambulatorial seguindo protocolo

de investigação a partir de um questionário padronizado (Apêndice A), através de uma

anamnese detalhada e com um posterior exame físico minucioso, onde foram atendidos por

profissional médico qualificado depois de devida explanação dos objetivos do estudo e

posterior consentimento formal e por escrito (Apêndice B).

O questionário padronizado (Apêndice A) contemplou vários aspectos

relacionados à idade, procedência, condições socioeconômicas, hábitos alimentares,

tabagismo, etilismo, sintomas gastrointestinais, história familiar de câncer gástrico ou

cânceres em outros sítios, uso de antibióticos, medicamentos anti-secretores, entre outros.

Após consulta inicial foi indicada endoscopia digestiva alta diagnóstica, que foi realizada no

Serviço de Endoscopia do Hospital Universitário Walter Cantídio da Faculdade de Medicina

da Universidade Federal do Ceará – UFC.

A presença do Helicobacter pylori foi avaliada através da detecção indireta pelo

teste da urease, associado à pesquisa direta através da análise da biopsia gástrica pela técnica

de PCR através da detecção do gene ureA presente em todas as cepas do H.pylori.

Os pacientes foram instruídos a comparecer ao ambulatório para receber os

resultados dos exames, bem como início da terapêutica e acompanhamento dos casos

necessários.

Esta pesquisa contou com uma amostra conveniente de 137 pacientes

dispépticos H. pylori positivos acompanhados no Hospital Universitário Walter Cantídio

(HUWC) da Universidade Federal do Ceará – UFC portadores de gastrite e doença ulcerosa

péptica, sendo as afecções gástricas devidamente comprovadas através da análise

endoscópica, no período de março a outubro de 2013.

O estudo foi submetido à análise e aprovação pelo Comitê de Ética e Pesquisa-

COMEPE da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará-UFC (Anexo A).

33

3.2 Desenho do estudo

Estudo descritivo transversal.

3.3 Seleção dos Pacientes

Foram critérios de inclusão:

Idade mínima de 18 anos e máxima de 88 anos de ambos os sexos;

Pacientes portadores de úlcera péptica ou gastrite;

Pacientes que assinassem o termo de consentimento livre e esclarecido.

Foram critérios de exclusão:

Gravidez ou lactação;

Condições associadas a distúrbios da fisiologia gástrica, como vagotomia,

cirurgia prévia de ressecção gástrica, síndrome de Zolliger-Ellison ou estenose

pilórica;

Insuficiência Renal, Insuficiência hepática, Insuficiência Cardíaca Congestiva

ou instabilidade hemodinâmica que contra-indique a investigação endoscópica.

3.4 Métodos

3.4.1 Coleta de fragmentos da mucosa gástrica na endoscopia

Para a realização dos exames endoscópicos, os pacientes foram orientados sobre

o desenrolar do procedimento, bem como a necessidade de preparo prévio com jejum de

pelo menos 8 horas e a suspensão por 10 dias dos fármacos inibidores de bomba de prótons.

O preparo para a realização do exame foi realizado em todos os pacientes. Os

mesmos ingeriram 40 gotas de dimeticona líquida (Luftal) e tiveram a orofaringe

anestesiada com lidocaína a 10% (Xylestesin) em spray, além de sedação endovenosa com

Diazepan (1amp=10mg/2ml) e Meperidina (1amp=100mg/2ml) nos casos selecionados, a

depender da idade, sendo a dose calculada pelo peso em quilogramas.

O aparelho utilizado foi um gastrovideoendoscópio (Olympus Optical Co,

Ltd. GIF TYPE V) bem como pinças apropriadas de biópsias endoscópicas. Tanto o

endoscópio, quanto as pinças de biópsias foram devidamente limpos e desinfetados no início

34

de cada sessão e após cada exame realizado, através de limpeza manual rigorosa com

lavagem com sabão neutro e água corrente, seguida de escovação metódica com passagem

de escova apropriada através do canal de biópsia e uso de detergente enzimático

(Endozyme). Em seguida os mesmos foram devidamente desinfetados, conforme normas

da Sociedade Brasileira de Endoscopia.

Os exames foram realizados no Serviço de Endoscopia do Hospital Universitário

Walter Cantídio da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará – UFC. Os

custos relativos aos exames foram custeados via Sistema Único de Saúde-SUS, seguindo a

rotina já estabelecida pelo serviço.

Foi realizada a inspeção convencional do esôfago, estômago e duodeno, onde

biópsias do corpo e antro gástrico foram obtidas para análise histopatológica - independente

dos achados endoscópicos - com retirada de fragmentos do corpo e antro, seguindo um

protocolo de biópsias através do mapeamento dos sítios a serem biopsiados (Anexo B).

Biópsias adicionais foram realizadas naqueles pacientes com úlcera gástrica, suspeita de

câncer, pólipos, ou outros achados patológicos significantes.

A coleta dos fragmentos obedeceu ao protocolo validado do Sistema de Sydney

(DIXON et al., 1996), os locais da coleta dos espécimes foram os seguintes: (IA): 2

fragmentos da Incisura Angularis; (A1): 2 fragmentos da pequena curvatura do antro; (A2):

2 fragmentos da grande curvatura do antro; (B1) : 2 fragmentos da pequena curvatura do

corpo; (B2): 2 fragmentos da grande curvatura do corpo gástrico. Obteve, então, 10

fragmentos em frascos separados com as seguintes especificações a depender do local da

coleta IA, A1, A2, B1, B2.

Um fragmento extra foi colhido para a realização do teste da urease. Nele, o

fragmento da região antral é imerso em um tubo contendo uma solução de ureia e indicador

de pH. A análise foi efetuada imediatamente após a coleta do material e uma leitura final foi

realizada vinte e quatro horas após. O teste da urease foi considerado positivo quando houve

mudança da coloração da uréia de “amarelo” para “vermelho”. Nos casos em que a solução

permaneceu “amarela” por vinte e quatro horas após a coleta, o teste foi considerado

negativo. Quando houve dificuldade em estabelecer a mudança de coloração, o teste foi tido

como indeterminado.

O procedimento do exame endoscópico tinha duração de, aproximadamente, 20

minutos. Após a realização do mesmo, as amostras coletadas foram armazenadas,

imediatamente, a 4°C para serem transportadas até o laboratório, onde eram estocadas em

freezer -20ºC, até o seu processamento e análise.

35

Para o diagnóstico de gastrite endoscópica, foi utilizada a classificação de

Sydney, considerando os achados de edema, enantema, friabilidade, exsudato, erosões

planas e elevadas, nodosidade ou micronodularidade, hiperplasia ou atrofia de pregas,

aumento da trama vascular submucosa ou presença de sangramento intramural

(MISIEWICZ et al., 1991). O estadiamento das úlceras obedeceu à classificação de Sakita

(1973), onde A = ativa, H = em cicatrização e S = cicatrizada.

A ficha de endoscopia (Apêndice C) foi preenchida após análise endoscópica de

cada paciente e avaliava a topografia das lesões (antro/corpo gástrico), descrição das

mesmas e o diagnóstico endoscópico final (normal, gastrite do antro, gastrite do corpo,

gastrite do antro e corpo, úlcera gástrica, úlcera duodenal, atrofia antral, atrofia do corpo,

atrofia corpal e antral, metaplasia intestinal ou associação destes fatores).

3.4.2. Extração do DNA de Helicobacter pylori em tecido de biópsia gástrica

A extração do DNA do H. pylori das amostras de tecido gástrico colhidas dos

pacientes estudados, foi feita a partir da maceração dos fragmentos de biópsia gástrica. O

material genômico foi extraído das amostras seguindo o protocolo de QIAGEN®, com os

reagentes do QIAamp DNA mini kit, conforme orientação do fabricante.

Primeiramente, efetuou-se a digestão do material tecidual, que foi colocado em

minitubos de 2 mL, com 180μL de tampão ATL e 20μL de Proteinase K, e submetidos a

banho-maria a 56ºC por vinte e quatro horas.

Após a digestão, seguiu-se a lise celular, onde foram adicionados 200μL de

tampão AL, e incubou-se novamente as amostras em banho-maria, a 70ºC, por dez minutos.

Em seguida, adicionou-se 200μL de Etanol 100%.

O conteúdo da lise celular foi transferido para coluna Spin QIAamp®, para etapa

de eluições com intuito de filtrar o conteúdo celular, o primeiro filtrado foi centrifugado a

8.000 rpm por 1 minuto em tubo de microcentrífuga de 2 mL, depois foi descartado e foram

adicionados 500μL de tampão AW1 (QIAGEN®), e foi feita eluição por centrifugação a

8.000 rpm por um minuto. Em seguida, foram colocados 500μL de tampão AW2

(QIAGEN®

), com centrifugação a 14.000 rpm por três minutos.

Por último, adicionaram-se 200μL de tampão AE, centrifugando a 8.000 rpm por

um minuto e repetindo essa última lavagem para uma eficaz extração do material genético.

36

Após a extração do DNA, as amostras foram estocadas em freezer a -20ºC até o seu

processamento.

3.4.3 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

O DNA do H. pylori extraído das biópsias gástricas foi utilizado para a

amplificação dos genótipos de interesse nesse estudo, a partir das sequências de nucleotídeos

(primers) específicos, previamente descritos na literatura. A solução “Master mix” para

amplificação do DNA, continha: 12,5μL da enzima Taq-DNA polimerase GoTaq green -

Promega®; 1,0μL dos “primers” específicos para cada gene a ser estudado, partindo da

terminação 5’ para a 3’, em ambos os sentidos (senso e antisenso). Em cada microtubo,

foram acrescentados 5,0μL do DNA extraído em microtubos específicos de 200μL. As

reações ocorreram separadas para cada gene. A tabela 1 indica os primers que foram

utilizados para cada marcador.

Tabela 1: Primers usados na amplificação dos genes cagA e cagE

Primer Sequência (5' - 3') Pares de base

cagA - F GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG 349

cagA - R CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA

cagE - F TTGAAAACTTCAAGGATAGGATAGAGC 508

cagE - R GCCTAGCGTAATATCACCATTACCC

Fonte: Do autor

A amplificação do DNA extraído foi realizada em termociclador, obedecendo o

protocolo de ciclos específicos para cada gene estudado.

Após a amplificação de cada genótipo, procedeu-se à corrida eletroforética de

géis de agarose a 2%, corado com brometo de Etídio, para visualização dos marcadores

genéticos do H. pylori. Foi utilizado tampão Tris Acetato EDTA (TAE) como veículo

líquido para a corrida dos géis. A eletroforese ocorreu nas seguintes condições: 100 volts,

400 miliamperes por 40 minutos.

Os géis foram revelados em aparelho transluminador com câmara eletrônica de

ultravioleta para evidenciação dos pares de bases, estabelecendo assim, o resultado positivo

ou negativo para o marcadores genéticos estudados, a partir da presença ou ausência das

bandas de nucleotídeos pertencentes a esses genes.

37

Foi estabelecido o controle da qualidade dos géis corridos, para monitorar

possíveis contaminações, pela presença de controle positivo e controle negativo para cada

marcador genético estudado. O peso molecular dos pares de base foram aferidos por padrão

de bandas de DNA (DNA Ladder), adicionado aos géis.

3.4.4 Genotipagem para cagA

Conforme ATHERTON et al., 1995, foram realizados 42 ciclos para a

amplificação do gene cagA: 1 ciclo para desnaturação inicial de um minuto e meio a 94ºC,

39 ciclos com desnaturação a 94ºC por um minuto; anelamento a 55ºC por um minuto e

extensão a 72ºC por dois minutos, seguidos de mais um ciclo de extensão final a 72ºC por

sete minutos.

3.4.5 Genotipagem para cagE

Conforme Tomasini et al. (2003) foram realizados 37 ciclos para a amplificação

do gene cagE: 1 ciclo para desnaturação inicial de um minuto e meio a 94ºC, 35 ciclos com

desnaturação a 94ºC por um minuto; anelamento a 53ºC por quarenta e cinco segundos e

extensão a 72ºC por quarenta e cinco segundos, seguidos de mais um ciclo de extensão final

a 72ºC por sete minutos.

3.4.6. Amplificação e sequenciamento da região variável 3' do gene cagA

Para a amplificação por PCR da região variável 3' do gene cagA (que contém as

sequências EPIYA), de 20 a 100 ng de DNA foram adicionados a uma solução tampão

contendo Taq DNA Polimerase a 1% (KCl 50 mM e Tris-HCl 10 mM, pH, 8,0), MgCl2 1,5

mM, 100 uM de cada desoxinucleotídeo, 1,0 U de Taq DNA Polimerase Platinum

(Invitrogen, São Paulo, Brasil), e 10 pmol de cada iniciador, para um volume de solução

total de 20 uL. Os iniciadores utilizados foram previamente descritos por Yamaoka et al

(1999). As condições de reação foram: 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 95

° C durante 1 minuto, 50 ° C durante 1 minuto e 72 ° C durante 1 minuto, terminando com

72 ° C durante 7 minutos. A reação originou produtos de 500 a 850 pb que são: EPIYA-AB:

500 pb; EPIYA-ABC: 640 pb; EPIYA-ABCC: 740 pb e EPIYA-ABCCC: 850 pb.

O sequenciamento da região variável 3 'do gene cagA foi realizado para

confirmar os resultados do PCR. Os produtos de PCR foram purificados utilizando Wizard

38

SV Gel e PCR Clean-up System (Promega, Madison, MI) de acordo com as recomendações

do fabricante. Os produtos purificados foram sequenciados usando o kit Big Dye Terminator

versão 3.1 Cycle Sequencing, no aparelho ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

Foster City, CA). As sequências obtidas foram alinhadas com o Programa CAP3 de conjunto

de Sequências (disponível em: http://pbil.univlyon1.fr/cap3.php). Após o alinhamento, as

sequências de nucleotídeos foram transformadas em sequências de aminoácidos usando o

programa Blastx (disponível em: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e comparado com

as sequencias depositadas do GenBank do H. pylori.

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

3.4.7 Análise estatística

Foi utilizado o software SPSS for Windows, versão 16.0; SPSS Inc., Chicago,

Illinois. Os resultados foram analisados através do teste exato de Fisher, e do teste do qui-

quadrado de Pearson. O nível de significância considerado foi p < 0.05. O risco foi estimado

utilizando-se Odds Ratio (OR) e o intervalo de confiança de 95%. Modelos de regressão

logística foram construídos e ajustados para potenciais fatores de confusão, tais como gênero

e idade.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/

39

4 RESULTADOS

4.1 Caracterização da amostra

Foram avaliados 137 pacientes positivos para H. pylori, sendo 72 pacientes com

úlcera péptica (50 duodenal, 22 gástrica) e 65 com gastrite (48 de antro, 9 de corpo). Do

total, 59 eram do sexo masculino (43,1%) e 78 do sexo feminino (56,9%) e idade variou

entre 18 e 88 anos, com média de idade de 50,7 + 14,15.

No grupo dos pacientes com úlcera péptica, 34 (47,2%) eram do sexo masculino

e 38 (52,8%) do sexo feminino. A média de idade foi de 53,2 + 12,9 anos. Dos 65 pacientes

com gastrite, 25 (38,5%) eram do sexo masculino e 40 (61,5%) eram do sexo feminino. A

média de idade foi de 47,9 + 15,0 anos. Não houve diferença significante entre a idade,

gênero e as afecções gástricas estudadas (p = 0,73).

O grupo foi dividido em faixas etárias, onde 14 (10,2%), pacientes tinham de 18

a 30 anos, 29 (21,2 %) de 31 a 45 anos, 41 (29,9 %) de 46 a 55 anos, 34 (24,8%) de 56 a

65 anos e 19 (13,9 %) acima de 65 anos (Gráfico 1).

Gráfico1: Distribuição da amostra estudada de pacientes H. pylori positivos por faixa etária. Fortaleza-Ce,

2014

Fonte: Do autor

40

4.2 Caracterização das cepas de H. pylori quanto aos sítios de fosforilação de tirosina

EPIYA da proteína CagA.

Dos 137 pacientes infectados pelo H. pylori, 94 (68,6%) tinham cepas cagA-

positivas, destas 54/72 (75%) eram pacientes com úlcera péptica, 40/65 (61,5%) com

gastrite.

Na figura 3 observa-se as bandas em gel de agarose que revelam o gene cagA

em pacientes com gastrite e na figura 4 o genótipo cagA foi evidenciado nos pacientes com

úlcera péptica.

Dos 94 pacientes cagA-positivos, 91 (96,8%) apresentaram expressão de pelo

menos um sitio C de fosforilação EPIYA da proteína CagA, sendo que 3/94 (3,2%) não

apresentaram sítio C, 50/94 (53,2%) tinham um sítio C de fosforilação da proteína e 41/94

(43,6%) tinham dois ou mais sítios C.

Observou-se que os sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA

mais prevalentes foram EPIYA-ABC 48/94 (51,1%), EPIYA-ABCC 13/94 (13,8%),

EPIYA-ABCCC 07/94 (7,4%), seguidos dos genótipos EPIYA- AB 03/94 (3,2%) e EPIYA-

BC 01/94 (1,1%). Encontrou-se no presente estudo 22/94 (23,4%) cepas mistas, sendo os

genótipos mistos EPIYA-ABC/ABCC 14/94 (14,9%) e o EPIYA- ABC/ABCCC 04/94

(4,3%) os mais prevalentes na amostra estudada (Tabela 2).

Tabela 2: Distribuição dos sítios de fosforilação de

tirosina EPIYA da proteína CagA em pacientes H.

pylori positivos com gastrite e úlcera péptica. (N=94).

Fortaleza- Ce, 2014

Genótipos EPIYA n %

Sítios EPIYA 72 76,6

AB 3 3,2

BC 1 1,1

ABC 48 51,1

ABCC 13 13,8

ABCCC 7 7,4

Cepas mistas 22 23,4

ABC/ABCC 14 14,9

ABC/ABCCC 4 4,3

ABCC/ABCCC 2 2,1

ABC/ACC 1 1,1

ABC/AB 1 1,1

Fonte: Do autor

41

Figura 3: Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagA na amostra de pacientes com gastrite.

Fortaleza- Ce, 2014

Fonte: Do autor

Da esquerda para a direita tem-se:

Poço L: DNA Ladder Poço 5: cagA positivo

Poço 1: cagA positivo Poço 6: cagA positivo


Poço 3: cagA positivo Poço 8: cagA negativo

Poço 4: cagA negativo Poço 9:controle negativo

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

42

Figura 4: Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagA na amostra de pacientes com úlcera

péptica. Fortaleza- Ce, 2014

Fonte: Do autor


Poço L: DNA Ladder Poço 5: cagA positivo




Poço 4: cagA positivo Poço 9:controle negativo

4.3 Distribuição dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA por

idade

No intuito de observar a distribuição dos genótipos EPIYA nas faixas etárias, a

amostra estudada foi dividida em maiores e menores de 45 anos de idade a fim de estabelecer

a provável relação do avanço da idade com a virulência das cepas.

Observou-se que a maioria dos pacientes com genótipo EPIYA-ABC 32/48 (66,3%) e

EPIYA- AB 2/3 (66,3%) tinham mais de 45 anos de idade, fato esse não observado nos

pacientes com mais sítios EPIYA C como no padrão EPIYA- ABCC e EPIYA- ABCCC

onde a maioria tinha menos de 45 anos (Gráfico 2). Os genótipos mistos expressaram uma

quantidade maior de sítios C em pacientes com mais de 45 anos, com 08/14 (57,1%)

EPIYA- ABC/ABCC e todos os pacientes com genótipos mistos EPIYA- ABC/ABCCC e

EPIYA- ABCC/ABCCC. Não houve diferença estatística entre as faixas etárias estudadas e

os sítios de fosforilação EPIYA estudados (p = 0,83).

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

43

Gráfico 2: Distribuição dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA por idade. Fortaleza- Ce,

2014

Fonte: Do autor

4.4 Associação entre os sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA e as

afecções gastrite e úlcera péptica

Nos pacientes com gastrite observou-se que 18/40 (45%) tinham um sítio C de

fosforilação da proteína, 06/40 (15%) tinham dois sítios C e 07/40 (17,5%) tinham três sítios

de fosforilação EPIYA. Nos pacientes com úlcera péptica 3/54 (5,5%) não apresentaram

sítio C, 31/54 (57,4%) apresentou um sítio C de fosforilação da proteína, 07/54 (12,9%)

tinham dois sítios C e nenhum paciente apresentou três sítios C de fosforilação EPIYA

(Tabela 3).

As cepas mistas estavam presentes em 09/40 (22,5%) dos pacientes com gastrite

sendo que as cepas mistas mais prevalentes nesse grupo foram 5/40 (12,5%) ABC/ABCC e

3/40 (7,5%) ABC/ABCCC. Nos pacientes com úlcera péptica as cepas mistas encontravam-

se em 13/54 (24%) e o genótipo EPIYA mais prevalente foi 9/54 (16,6%) ABC/ABCC.

Houve associação significante entre o genótipo EPIYA- ABCCC e a afecção

gastrite (p=0,001). Nenhum paciente com úlcera péptica apresentou três sítios C de

fosforilação da proteína CagA, sendo a ausência do genótipo EPIYA ABCCC associada a

úlcera péptica no presente estudo (Tabela 3).

44

Tabela 3: Associação dos sítios de fosforilação de tirosina EPIYA

da proteína CagA com as afecções gastrite e úlcera péptica (N=94).

Fortaleza- Ce, 2014

Genótipo

EPIYA

Gastrite

(N=40)

Úlcera Péptica

(N=54) Valor p

n (%) n (%)

Sítios EPIYA 31(77,5) 41(75,9) 0,73

AB 0 03 (5,5) 0,13

BC 0 01 (1,8) 0,38

ABC 18 (45,0) 30 (55,5) 0,31

ABCC 06 (15,0) 07 (12,9) 0,77

ABCCC 07 (17,5) 0 0,001

Cepas mistas 09 (22,5) 13 (24) 0,85

ABC/ABCC 05 (12,5) 09 (16,6) 0,57

ABC/ABCCC 03 (7,5) 01 (1,8) 0,18

ABCC/ABCCC 01 (2,5) 01 (1,8) 0,83

ABC/ACC 0 01 (1,8) 0,38

ABC/AB 0 01 (1,8) 0,30

Fonte: Do autor

4.5 O gene cagE e as afecções gastrite e úlcera péptica

Do total de cepas dos pacientes estudados 65/137 (47,4%) expressaram o gene

cagE, sendo que 31/65 (47,7%) eram do sexo masculino, 34/65 (52,3%) do sexo feminino,

25/65 (38,5%) menores de 45 anos e 40/65 (61,5%) maiores de 45 anos. Não houve

diferença significante entre a expressão do gene cagE com o gênero (p=0,29) e a idade (p =

0,13) dos pacientes estudados.

O gene cagE estava presente em 22/65 (33,8%) nas gastrites e 43/65 (66,2%) na

úlcera péptica. A figura 5 mostra o gel de agarose com o genótipo cagE presente nos

pacientes com gastrite e a figura 6 mostram o gene cagE nos pacientes com úlcera péptica.

Houve associação significante entre o genótipo cagE e os pacientes com gastrite

(p=0,002). O gene cagE no presente estudo estava associado a doença ulcerosa péptica

(p=0,002) e ao subgrupo de pacientes com úlcera duodenal (p< 0,001), como descrito na

Tabela 4.

A relação não ajustada entre o genótipo cagE e as afecções gástricas evidenciou

associação inversa significativa entre o genótipo cagE e o grupo de pacientes com gastrite

(O.R=0,345; p=0,002). O genótipo cagE representou risco ao grupo de pacientes com

45

úlcera péptica (OR= 2,898; p= 0,002) e ao subgrupo de pacientes com úlcera duodenal

(OR= 3,839; p<0,0001) como descrito na Tabela 4.

Tabela 4: Relação não ajustada entre o gene cagE e as afecções gastrite e úlcera péptica

(137 pacientes). Fortaleza- Ce, 2014

Afecções cagE OR IC 95% P

Gastrite 22 0,345 0,172- 0,693 0,002

Úlcera péptica 43 2,898 1,444-5,818 0,002

Úlcera duodenal 34 3,839 1,834-8,035 0,001

Fonte: Do autor

Após análise multivariada, ajustando para idade e gênero, o genótipo cagE

permaneceu associado inversamente com a afecção gastrite (O.R=0,277; p=0,001) e

continuou associado com úlcera péptica (O.R = 3,609; p = 0,001) e úlcera duodenal (O.R =

4,382; p < 0,001) como demonstrada na Tabela 5.

Tabela 5: Relação ajustada para idade e gênero entre o gene cagE e as afecções gastrite

e úlcera péptica (137 pacientes). Fortaleza- Ce, 2014

Afecções OR IC 95% P

Gastrite 0,277 0,131 - 0,587 0,001

Úlcera péptica 3,609 1,702 - 7,651 0,001

Úlcera duodenal 4,382 2,026 - 9,476 <0,001

Fonte: Do autor

46

Figura 5: Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagE na amostra de pacientes com gastrite.

Fortaleza- Ce, 2014

Fonte: Do autor


Poço L: DNA Ladder Poço 5: cagE positivo

Poço 1: cagE positivo Poço 6: cagE negativo

Poço 2: cagE negativo Poço 7: cagE positivo

Poço 3: cagE negativo Poço 8: cagE negativo

Poço 4: cagE negativo Poço 9:controle negativo

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

47

Figura 6: Gel de Agarose para visualização das bandas do gene cagE na amostra de pacientes com úlcera

péptica. Fortaleza- Ce, 2014

Fonte: Do autor


Poço L: DNA Ladder Poço 5: cagE negativo

Poço 1: cagE positivo Poço 6: cagE positivo



Poço 4: cagE positivo Poço 9:controle negativo

5 DISCUSSÃO

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9

48

O presente estudo buscou esclarecer a significância clínica da presença de

marcadores de virulência do Helicobater pylori que compõem a Ilha de Patogenicidade

cagA (cagA-PAI), como o gene cagE e sítios de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína

CagA no desenvolvimento de doença ulcerosa péptica e gastrite em pacientes do Hospital

Universitário Walter Cantídio.

H. pylori tem uma elevada taxa de mutação e capacidade de recombinação, o

que garante sua vasta diversidade genética e contribui para o aparecimento de diferentes

afecções gástricas no hospedeiro infectado. Um importante fator de virulência desta bactéria

é a cagPAI que codifica múltiplos componentes do sistema de secreção de tipo IV, bem

como a proteína CagA (HATAKEYAMA, 2011).

No Ocidente, vários estudos evidenciaram que indivíduos infectados por cepas

de H. pylori cagA-positivas têm risco mais elevado de desenvolver ulcera péptica e câncer

gástrico (QUEIROZ et al.,1998; HATAKEYAMA et al.,2004; ROCHA et al.,2005). No

Oriente, no entanto, a maioria dos indivíduos são colonizados por cepas cagA-positivas

independentemente da doença (YAMAOKA et al., 1999).

Recombinações dos sítios de fosforilação EPIYA da proteína Cag podem afetar

o destino intracelular da proteína CagA nas células epiteliais gástricas. A proteína CagA

quase sempre possui segmentos EPIYA A e B que são seguidos por nenhum, um , dois ou

três segmentos C , em cepas circulantes nos países ocidentais , ou um segmento D, em cepas

de países do leste da Ásia. O EPIYA C e D são os principais locais de fosforilação da

proteína CagA formando um complexo com SHP-2 (região homóloga Src contendo

fosfatase 2), iniciando uma cascata de sinalização celular que pode levar ao aparecimento de

lesão pré-cancerosas e células neoplásicas (JONES et al. , 2010).

Estudos mostram que o EPIYA D ou repetições do sítio EPIYA C estão

associados ao aumento da atividade da fosfatase SHP -2 induzida por CagA (HIGASHI et

al., 2002; NAITO et al., 2006).

Argent et al. (2008) analisaram diferentes cepas cagA e mostraram que as cepas

ocidentais são significativamente mais propensos a sofrer duplicação do sítio C que o sítio D

prevalente na Ásia Oriental. Acredita-se que essas alterações ocorrem comumente em

populações ocidentais em que existe duplicação intragenômica ou deleção de uma região

que codifica o sítio C. Os autores sugerem que uma vez que o sítio D tem maior afinidade

para ligar-se a SHP -2, causar alterações do citoesqueleto e induzir níveis elevados de IL – 8

que o correspondente sítio C, logo não há necessidade de duplicar os sítios D, o que pode

49

justificar a maior pressão nas cepas CagA ocidental em aumentar o número de sítios C

devido sua fraca afinidade de ligação com a SHP – 2 (HIGASHI et al., 2002; AZUMA et

al., 2004).

No presente estudo observou-se predominância do padrão EPIYA-C do tipo

ocidental, não foi encontrado o genótipo EPIYA-D, semelhante ao encontrado em estudos

realizados na Colômbia (SICINSCHI et al. , 2010) , Turquia (SALIH et al. , 2010) e nos

EUA (OGORODNIK; RAFFANIELLO, 2012). O tipo EPIYA mais prevalente foi ABC em

concordância ao encontrado em estudos realizados no Iran (VAZIRI et al., 2013;

SHOKRZADEH et al , 2010); Brasil (BATISTA et al., 2011; QUEIROZ et al., 2012) e

Senegal (BREUREC et al., 2012).

Cepas com padrão EPIYA mista foram encontradas em 23,5% das amostras

estudadas, porcentagem maior que a encontrada em outros estudos na região sul do Brasil

com 13% de cepas EPIYA mista (BATISTA et al., 2011), Iran com 14% (VAZIRI et al.,

2013) e Suécia com 13% ( KARLSSON et al., 2012).

A alta frequência de cepas mistas na comunidade local com mais de um sítio de

fosforilação EPIYA C, mostra um padrão de cepas de H. pylori diferentes de outras regiões

do país e do mundo, sendo relevante a investigação do perfil de virulência dessa bactéria, a

fim de conhecer as cepas locais e contribuir para assistência de saúde de qualidade com

protocolos de prevenção e tratamento voltados para o potencial da região em desenvolver

afecções gástricas mais graves a partir da patogenicidade do H. pylori.

Os resultados deste estudo evidenciam que o genótipo EPIYA ABCCC estava

associado à gastrite e que nas cepas mistas o número de sítios EPIYA com três C

encontrava-se em maior quantidade na gastrite, quando comprado com o grupo de úlcera

péptica.

Estudo realizado no Brasil envolvendo amostra de 436 pacientes com gastrite,

úlcera péptica e câncer gástrico mostrou que as cepas que possuíam dois ou três sítios

EPIYA C estavam associadas com câncer gástrico e com a gastrite, mas não com úlcera

duodenal (BATISTA et al., 2011). Notadamente, nenhum paciente com úlcera duodenal do

presente estudo foi colonizado por três segmentos EPIYA C, como encontrado por Yamaoka

et al. (1999) e Batista et al. (2011). Acredita-se que cepas com maior número de segmentos

EPIYA C possam ser menos resistentes ao ácido (YAMAOKA et al., 1999).

Estudo realizado por Ferreira et al. (2012) envolvendo amostras de 169 pacientes

de Portugal, sendo 117 com gastrite e 52 com câncer gástrico, também evidenciou diferença

significante entre o aumento dos sitio EPIYA C e as afecções gastrite e câncer gástrico.

50

Em contraste, estudo realizado no Iran com 77 pacientes H. pylori positivo

mostrou associação do genótipo EPIYA ABCC com úlcera duodenal (VAZIRI et al., 2013).

No Iraque pesquisa com 210 pacientes com gastrite, úlcera péptica e câncer gástrico,

demonstrou que o aumento do sitio EPIYA C estava associado à úlcera gástrica quando

comparado com os pacientes com gastrite (KALAF et al., 2013).

Estudo realizado pelo presente grupo envolvendo amostras de 109 pacientes

dispépticos de Fortaleza-Ce com e sem historia familiar de câncer gástrico, evidenciou que

os pacientes com maior número de segmentos EPIYA C foram associados com aumento da

inflamação gástrica do corpo, hiperplasia e atrofia gástrica e houve diferença significante

entre os grupos em relação ao aumento do sitio C de fosforização EPIYA que estava

associado aos pacientes com historia familiar de câncer gástrico (QUEIROZ et al., 2012).

Vale ressaltar que a distribuição dos genótipos EPIYA apresenta-se de maneira diferente

entre as afecções gástricas e o presente estudo demonstrou pela primeira vez, no nordeste do

Brasil, o comportamento do sitio de fosforilação de tirosina EPIYA da proteína CagA em

pacientes com gastrite e úlcera péptica de grande prevalência na região.

Existe discordância em relação aos resultados dos estudos a respeito da

associação do número de sítios EPIYA C com as afecções gástricas. Na Colômbia a variação

dos sítios de fosforilação EPIYA C da proteína CagA não estava associada com as afecções

gástricas estudadas (ACOSTA et al.,2010). Resultados semelhantes foram relatados em

populações iranianas e iraquianas (SHOKRZADEH et al., 2010). Em contraste, estudos

mostram que o aumento dos sítios EPIYA C está associado com as afecções gástricas mais

graves, como gastrites com lesões pré-cancerosas e o câncer gástrico (YAMAOKA et al.,

1999; SICINSCHI et al., 2010; BATISTA et al., 2011).

Puls et al. (2002) sugerem que a fosforilação de tirosina EPIYA -C é suficiente,

mas não exclusiva, para ativar o processo de transpor a proteína CagA através das células

epiteliais gástricas, sendo importante avaliar em estudos posteriores detalhadamente outros

sítios além do EPIYA - C utilizados para a fosforilação das proteínas CagA. Portanto, é

importante não só estudar o padrão de fosforilação de tirosina EPIYA, mas também novas

repetições, tais como a sequência KIDQLNQ 7 - AA, que ocorre perto da região variável da

proteína CagA (EVANS et al.,1997 ) e outra sequencia de aminoácidos que circunda o sitio

EPIYA -C e EPIYA -D em cepas ocidentais e do Leste Asiático conhecida como sitio de

multimerização CagA (CM) (REN et al.,2006).

O gene cagE também compõe a ilha de patogenicidade cagA (cagPAI) e tem

se mostrado como um importante indutor de citocinas pela células epiteliais gástricas.

51

Estudo prévio mostrou que o gene cagE é o melhor marcador de integridade da cagPAI em

cepas Japonesas (IKENOUE et al., 2001). Estudo realizado na Inglaterra observou maior

prevalência do gene cagE em pacientes com úlcera péptica (KAUSER et al. , 2005).

Quanto a presença do gene cagE verificou-se no presente estudo que 65/137

(47,4%) portavam esse genótipo estando o mesmo associado a úlcera duodenal, semelhante

ao encontrado por Modena et al (2007) em estudo realizado na região sul do Brasil com 99

pacientes sendo 37 portadores de gastrite, 56 com doença ulcerosa péptica (31 úlcera

gástrica e 25 úlcera duodenal) e 6 com mucosa gástrica normal em que verificou maior

prevalência do gene cagE nos pacientes com úlcera e mostrou associação do gene cagE com

úlcera duodenal. Em concordância, estudo realizado na Turquia com 93 pacientes com

gastrite, úlcera péptica e câncer gástrico, encontrou prevalência de cagE de 59,3% e

associação desse gene com úlcera duodenal e câncer gástrico em análises não ajustadas e

ajustadas (ERZIN et al., 2006). Em contraste, estudo realizado no Iran não encontrou

associação do gene cagE com as afecções gástricas (BAGHAEI et al., 2009).

Observou-se no presente estudo que o gene cagE encontrava-se associado

inversamente aos pacientes com gastrite. Estudo realizado na região Sul do Brasil, também

encontrou associação do gene cagE com o resultado endoscópico de gastrite erosiva

(RAMIS et al., 2013).

Estudo realizado por Chomvarin et al. (2008) na Tailândia detectou o gene cagE

em 88,4% dos pacientes infectados por H. pylori com maior prevalência desse genótipo no

câncer gástrico do que na gastrite e na úlcera péptica. Vale ressaltar que a distribuição de

cagE varia entre regiões geográficas distintas bem como a associação dos mesmo com

patologias gástricas e que na maioria dos países Orientais o gene cagE não está associado

com úlcera péptica, enquanto que no ocidente existe essa associação.

Estudos apontam que a região norte e nordeste do Brasil tem um padrão de cepas

de H. pylori circulantes diferente do resto do país (QUEIROZ et al., 2010; CAVALCANTE

et al., 2012; GONÇALVES et al., 2013). Diante disso, podem apresentar diferente relação

dos seus genótipos com a capacidade de virulência da bactéria. Daí a importância de um

mapeamento desse perfil genético do H. pylori e o estabelecimento de suas devidas

correlações nas cepas circulantes nessa região do Brasil e sua associação com as principais

afecções gástricas oriundas da infecção por essa bactéria.

O presente estudo mostrou a expressão dos genótipos EPIYA e cagE do

H.pylori nas afecções gastrite e úlcera péptica, contribuindo para melhor compreensão da

interação molecular desses marcadores de virulência com as afecções gástricas estudadas na

52

comunidade local, que são necessárias para o estabelecimento de parâmetros de prevenção e

tratamento seguros e eficazes no que concerne às doenças advindas da colonização crônica

pelo H. pylori, considerando o grande potencial de variabilidade genética dessa bactéria nas

diferentes regiões do pais e do mundo.

Tendo em vista a associação, no presente estudo, do genótipo EPIYA ABCCC com

os pacientes com gastrite e sua ausência nos pacientes com úlcera péptica, bem como a

associação do gene cagE com os pacientes com úlcera duodenal, é importante avaliar em

estudos posteriores detalhadamente como esses genótipos aparecem no grupo de pacientes

com afecções gástricas mais graves como o câncer gástrico.

6 CONCLUSÕES

53

As cepas estudadas apresentam perfil genético de sítios de fosforilação de

tirosina EPIYA com resíduo C, que é descrito para o tipo de cepas ocidentais do H. pylori.

Sendo a maioria das cepas com 1 sitio C de fosforilação, um número reduzido apresentou

três sítios C. Observou-se alta prevalência de padrão EPIYA misto na amostra estudada.

O grupo de pacientes com gastrite apresentou maior prevalência do genótipo

EPIYA ABCCC, o mesmo não foi observado no grupo de pacientes com úlcera péptica,

sendo essa associação com as afecções gástricas estudadas significante.

Evidenciou-se uma associação significativa entre o genótipo cagE e a úlcera

péptica, sendo fator de risco para úlcera duodenal. No entanto, apresentou associação

inversa com gastrite.

Os dados sugerem que na amostra populacional estudada a presença do gene

cagE encontra-se associada a úlcera duodenal.

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APÊNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

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63

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título: Estudo das cepas cagA do Helicobacter pylori e sua correlação com as alterações

encontradas na mucosa gástrica de pacientes dispépticos.

Introdução: Antes de aceitar participar desta pesquisa, é necessário que você leia e

compreenda as explicações sobre os procedimentos propostos. Esta declaração esclarece o

objetivo, procedimentos, benefícios, riscos, desconfortos e precauções do estudo. Também

descreve os procedimentos alternativos que estão disponíveis para você e o seu direito de se

retirar do estudo a qualquer momento.

Objetivo: Esse trabalho tem como objetivo investigar o papel de determinados tipos (cepas)

da bactéria Helicobacter pylori nas alterações encontradas na mucosa do estômago de

pacientes com sintomas de dispepsia (azia, desconforto abdominal, dor epigástrica, etc.),

através de biópsias (pequenos fragmentos) colhidas durante o exame endoscópico, de forma

totalmente indolor, permitindo identificar a presença de alterações na mucosa gástrica. As

biópsias também serão utilizadas para se avaliar, através de técnica de biologia molecular

(extração do DNA da bactéria), os determinados tipos fenotípicos (cepas) de Helicobacter

pylori.

Resumo: O H. pylori é uma bactéria que causa gastrite e úlcera péptica. A dispepsia é um dos

sintomas mais comuns de problemas gastrointestinais e está relacionada a doenças como

gastrite e úlcera. O Helicobacter pylori apresenta características distintas entre suas

populações (cepas) que podem torná-lo mais ou menos perigoso à saúde humana, dentre elas,

está a produção de proteínas que danificam a mucosa gástrica denominadas Cag e Vac, das

quais a proteína Cag é alvo deste estudo, por isso procuramos identificar e estudar as cepas

Cag desta bactéria. Como a infecção pelo Helicobacter pylori acomete cerca de 50% das

pessoas no mundo, é muito importante esclarecer o papel do H. pylori no desenvolvimento

das doenças gástricas e também procurar alternativas de tratamento para essa infecção.

Procedimento: Serão realizadas biópsias da mucosa gástrica, por ocasião desse estudo, nos

pacientes com sintomas dispépticos. Essa coleta nos permitirá identificar a presença ou não de

Helicobacter pylori, bem como avaliar mais detalhadamente as alterações microscópicas,

após análise complementar de um médico patologista.

Com relação à punção venosa para a colheita de sangue, pode haver dor local e ocasionar a

formação de hematomas no local da punção. Risco de gravidade mínima para o paciente. A

colheita de sangue será feita por profissionais devidamente treinados, o que certamente tende

a minimizar o desconforto causado e evitar a formação de hematomas no local da punção.

Não há benefício direto, por tratar-se de estudo experimental, com a finalidade de testar a

hipótese de que o Helicobacter pylori se relaciona com algumas patologias gástricas. Somente

ao final do estudo poderemos concluir a presença de algum benefício.

Despesas: Não há despesas pessoais do paciente para a realização do estudo em qualquer uma

de suas fases, incluindo exames e consultas. Também não há compensação financeira

relacionada à sua participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida pelo

orçamento da pesquisa. Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos

ou tratamentos propostos neste estudo (nexo de causa comprovado), o paciente tem direito a

tratamento médico, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.

Benefícios: A sua participação será muito importante para o conhecimento médico da

infecção pelo H. pylori e poderá contribuir no futuro para a melhoria do controle da infecção

em nosso país. Vale ressaltar que ao participar da pesquisa não haverá nenhum tipo de

prejuízo para você e seu filho assim como não haverá nenhum tipo remuneração.

Confidencialidade: Os seus resultados serão fornecidos individualmente e mantidos em sigilo.

Nenhum paciente será identificado quando da exposição ou divulgação dos resultados finais

64

deste estudo. A equipe de profissionais da saúde responsável pelo estudo o manterão

informado (a) quanto ao progresso da pesquisa, de acordo com suas solicitações.

Desligamento: Você poderá se afastar a qualquer momento sem prejuízo para o seu

acompanhamento médico. O seu médico poderá finalizar a sua participação neste estudo em

qualquer ocasião sem prejuízo para o seu acompanhamento.

Contato com o pesquisador: Dra Lucia Libanez B.C. Braga e Cícero Igor Simões Moura

Silva, pode ser feito pelo telefone (085) 3366-8052. Caso tenha alguma dúvida sobre os seus

direitos como paciente de pesquisa, você poderá ligar para o Comitê de Ética em Pesquisa da

UFC no número (085) 3366-8338.

Consentimento Livre e Esclarecido:

Li e entendi as informações precedentes. Tive oportunidade de fazer perguntas e todas

as minhas dúvidas foram respondidas. Este formulário está sendo assinado voluntariamente

por mim, indicando o meu consentimento para que participe do estudo, até que eu decida o

contrário. Receberei uma cópia assinada deste consentimento.

Assinatura do Paciente:

______________________________________________________________________,

__________anos, RG: _______________________, órgão expedidor: _____________ Data:

_______________

Assinatura da testemunha:

_____________________________________________________________________

Data: ______________

Assinatura do responsável pelo estudo:

______________________________________________________________________

Data: _____________

65

APÊNDICE B – ESTUDO CLÍNICO, EPIDEMIOLÓGICO DO CÂNCER GÁSTRICO E

SUA ASSOCIAÇÃO COM H. PYLORI

Estudo clínico, epidemiológico do câncer gástrico e sua associação com H. pylori

CÓDIGO:________________ DATA:_____/_______/________

Preenchido por: ___________________

1.IDENTIFICAÇÃO

1.1 Paciente:______________________________________________

1.2 Sexo: 1.|__| Masculino 2.|__| Feminino 1.3 Idade: ________

1.4 Data de Nascimento ___/___/___

1.5 : Naturalidade__________________________ 1.6 Procedência __________________________

1.7 Endereço: ______________________________________________________________________

1.8 Fones contato: _______________________________ 1.9 Referência: ______________________

1.10 Cidades: ___________________________________ 1.11 Estado: ________________________

1.12 Qual parentesco como caso índex:______________________

2.HISTÓRIA CLÍNICA

2.1) Queixa Principal: _______________________________________________________________

2.2) Dor: 1.|__| Queimação 2.|__| Pontada 3.|__|”Roendo” 4. |__| Tipo “fome”

5. |__| Outra: _________________________________________

2.3) Localização: 1.|__| Epigástrica 2.|__|Hipocôndrio direito 3.|__| Costas

4.|__| Outra:________________________________________

2.4) Dor noturna: : 1.|__| Freqüente 2.|__| Rara 3.|__| Nunca

2.5)Relação com o estresse: 1. |__| Sim 2.|__| Não

2.6)Alívio da Dor: 1. |__| Alimentação 2. |__| Antiácidos 3. |__| Antagonista H2

4. |__| Inibidor de bomba de próton 5. |__| Outros: __________

2.7) Hematêmese : 1. |__| Sim 2. |__| Não. 2.8) Melena: 1. |__| Sim 2.|__| Não

2.9) Perda de peso? 1. |__| Sim 2. |__| Não Quantos quilos? _____ Há quanto tempo? ______

2.10) Empachamento? 1. |__| Sim 2. |__| Não 2.11) Azia: 1. |__| Sim 2. |__| Não

2.12) Disfagia? 1. |__| Sim 2. |__| Não

2.13) Endoscopia prévia? 1. |__| Sim Quantas:_____ 2. |__| Não

Resultados:__________________________________________________________________________

2.14) História de úlcera na família? 1. |__| Sim; Qual o parentesco? __________________

2. |__| Não

2.15) Câncer gástrico na família? 1. |__| Sim; Qual o parentesco?

1.1|__| Irmão (ã); 1.2 |__| Tio/Tia; 1.3|__| Pai; 1.4|__| Mãe; 1.5|__| Avô/Avó;

1.6 |__| Filho(a); 1.7 |__|Pai e Mãe Qual a idade de aparecimento do Câncer?_____________

2. |__| Não

2.16) Câncer na família em outros sítios? 1.|__| Sim; Local __________________

2.|__|Não

2.17) Uso freqüente de AINES (Anti-inflamatórios Não-Esteroidais)?

1.|__|Sim. Qual? _________________________ 2.|__| Não

2.18) Em uso atual (Últimos 30 dias)? 1. |__| Sim 2. |__| Não

2.19) Fumante (atual) 1.|__| Sim Idade de início:______ Quantos maços/dia:________________

O que fuma?___________ Há quanto tempo?__________ Se parou, há quanto tempo?___________

2.|__| Não

2.20) Etilista? 1.|__| Sim Idade de início:_________ Quantidade: ___________

O que bebe? _______________ Há quanto tempo?__________ Se parou, há quanto tempo?_________

2.|__| Não

2.21) Uso freqüente de antibióticos? 1. |__| Sim 2.|__| Não

2.22) Em uso atual (Últimos 30 dias)? 1. |__| Sim Qual _____________ 2.|__| Não

66

2.23) Uso freqüente de anti-secretores? 1. |__| Sim Qual:_____________ 2.|__| Não

2.24) Em uso atual (Últimos 30 dias)? 1. |__| Sim Qual:_____________ 2.|__| Não

3.CONDIÇÕES PSICO-SOCIAIS

3.1 Tipo de moradia: 1.|__| Alvenaria; 2. |__|Taipa; 3.|__| Madeira; 4.|__|Papelão; 5.|__| Outro

3.2 Quantos cômodos? _________________ 3.3 Quantas pessoas residem? __________________

3.4 Possui rede de esgoto? 1.|__| Sim 2.|__| Não

3.5 Possui água encanada? 1.|__| Sim 2.|__|Não

3.6 Possui banheiro na casa? 1.|__| Sim 2.|__| Não

3.7 Tipo de ingesta da água? 1. |__| Sem tratamento 2.|__| Filtrada 3.|__| Fervida

4. |__| Ozonizada 5.|__| Mineral 6.|__| Outros_________

3.8 Formação escolar: 1.|__| Analfabeto 2 |__|Semi-analfabeto 3.|__| 1º grau incompleto

4.|__| 1º completo 5.|__| 2º incompleto 6.|__| 2º completo 7.|__| 3º incompleto 8.|__| Nível Superior

3.9 Estado civil: 1.|__| Solteiro 2.|__| Casado 3.|__| Divorciado 4.|__| Outros___________

3.10 Profissão: _______________________________________________________________

3.11 Renda mensal 1.|__| < 1SM 2.|__| 1SM a 2 SM 3.|__| 2SM a 3SM

4. |__| 3SM a 5SM 5. |__| > 5 SM

Números de irmãos ______ Número de irmãos mais novos __________

Posição na família: ___________

4.HÁBITOS ALIMENTARES

4.1 Ingesta frequente de defumados? 1.|__| Sim Freqüência:____________ 2.|__| Não

4.2 Ingesta frequente de carnes secas/salgadas? 1. |__| Sim Freqüência:__________ 2.|__| Não

4.3 Ingesta frequente de farináceos? 1.|__| Sim Freqüência:_____________ 2. |__| Não

4.4 Ingesta frequente de verduras/frutas citricas? 1.|__| Sim Freqüência:__________ 2.|__| Não

4.5 Forma de armazenamento/estocagem dos alimentos? __________________________________

4.5.1 Geladeira/Freezer: 1. |__| Sim Uso habitual?__________ 2.|__| Não

4.5.2 “Salga” e “Seca” as carnes 1.|__| Sim Freqüência:__________ 2.|__| Não

4.5.3 Outros: 1. |__| Sim Qual? _________________ 2.|__| Não

5.CASO INDEX: 5.1 Data do Diagnóstico: _______/_______/_______

5.2 Evolução __________________________________________________________________________

5.3: Data do último acompanhamento _______/________/________

OBS:______________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________

__________________________

5.4: Número de irmãos na família:________________ 5.5:Posição na família:__________________

67

APÊNDICE C – FICHA DE ENDOSCOPIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ-UFC

Faculdade de Medicina

Mestrado em Cirurgia

Projeto de Pesquisa

Estudo das cepas cagA do Helicobacter pylori e sua correlação com as alterações encontradas

na mucosa gástrica de pacientes dispépticos.

69

ANEXO A – MAPA DE BIÓPSIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ-UFC

Faculdade de Medicina

Mestrado em Cirurgia

Projeto de Pesquisa

Estudo das cepas cagA do Helicobacter pylori e sua correlação com as alterações encontradas na

mucosa gástrica de pacientes dispépticos.

MAPA DE BIÓPSIAS

70

ANEXO B - APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

71

DADOS BRUTOS

Gel de agarose para cagA/úlcera

Gel de agarose para cagA/gastrite

72

Planilha dos pacientes cagA negativos

PACIENTES COM ÚLCERA E GASTRITE cagA NEGATIVOS

PU0628 PU1800 PG1623 PG1662 PG2651

PU0737 PU1882 PG1632 PG1678 PG2654

PU1100 PU2011 PG1633 PG1691 PG2659

PU1132 PU2138 PG1634 PG1719 PU1169 PU2147 PG1640 PG1727 PU1195 PU2393 PG1641 PG1735 PU1208 PU2661 PG1647 PG2609 PU1291 PU2806 PG1650 PG2617 PU1403 PU2861 PG1654 PG2618 PU1409 PG1598 PG1661 PG2642

Sitios Epiya * Úlcera gástrica

Úlcera gástrica

Total sim não

Sitios Epiya 1 sítio epiya 10 40 50

acma de 2 sítios epiya 4 37 41

Total 14 77 91

Gene cagA

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid sim 94 68,6 68,6 68,6

não 43 31,4 31,4 100,0

Total 137 100,0 100,0

73

Sitios Epiya * Úlcera duodenal

Úlcera duodenal

Total sim não



Total 37 54 91

Sitios Epiya * Gastrite Antral

Gastrite Antral

Total sim não



Total 29 62 91

Sitios Epiya * Gastrite Corpal

Gastrite Corpal

Total sim não



Total 7 84 91

universidade federal do cearÁ faculdade de … · dra. marta maria das chagas medeiros, professora...

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