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12/10/2012

of 15

C O D A - C E R V A-TERVUREN

Leuvensesteenweg 17 - B 3080 Tervuren

PRO/5.4/02/DOC01/V04

VALIDATIEDOSSIER

DOSSIER DE VALIDATION

Dosage par LC-MS/MS de la patuline dans des fruits et produits dérivés

(jus, cidres, compotes)

SOP/MYC/ANA/10


PRO/5.4/02/DOC02/V01

HISTORIEK VAN DE VALIDATIEDOSSIER / HISTORIQUE DU DOSSIER DE VALIDATION

SOP/MYC/ANA/10

DATUM / DATE

FASE – WIJZIGING / PHASE - MODIFICATION

Avril 2013 – Janvier 2014

Expérimentation des analyses de dosage de la patuline

par LC-MS/MS :

Jus de pomme «trouble» (Option choisie:

Extraction au toluène)

Test de récupération et de répétabilité avec des

échantillons de jus de pomme «trouble» et extension par

vérification de l’applicabilité de la méthode aux

compotes de pommes et cidre

Test de récupération et de répétabilité avec des

pommes

Participation au PT2013 organisé par EU-RL (European

Union Reference Laboratory for mycotoxin «Project ID:

MYCO-PT-2013-PAT)

Rédaction du dossier de validation (1ère

version)

Finalisation de la rédaction du dossier de validation


PRO/5.4/02/DOC03/V01

TOEPASSINGSGEBIED VAN DE SOP / DOMAINE D’APPLICATION DE LA SOP:

Cette instruction s’applique au dosage de la patuline (PAT) dans des fruits (pomme) et produits dérivés tels que les

jus, cidre et compote.

La SOP est entièrement validée pour les jus de pomme et les pommes (fruit) et son applicabilité est vérifiée pour

quelques des produits dérivés de pomme tels la compote et le cidre.

La validation repose sur les teneurs maximales autorisées (LMA) fixées par la réglementation de la Commission

Européenne (CE N° 1881/2006) et tient compte des exigences légales sur les performances des méthodes

analytiques pour le contrôle officiel des niveaux de mycotoxins dans les produits alimentaires (CE N° 401/2006) et la

décision de la commission Européenne portant modalités des méthodes d’analyse et l’interprétation des résultats

2002/657/CE.

Responsabilités et membres du personnel impliqués

Responsable Méthodes LC-MS/MS ou son suppléant: Mise en place de la méthode et contrôle des résultats

(THIRY C. et HUYBRECHTS B.)

Analyste (essais de validation): technicienne (LOUVIAU I.)

Critères de validation

L’évaluation des performances de la SOP repose sur les critères de validation résumés dans le tableau 1.

Tableau 1: Critères de validation

Matrices LMA1

Justesse

Variation des pourcentages

de récupération

Répétabilité*

Reproductibilité*

Jus de pommes 50 µg/L 70 - 105% CVr < CVR < CV

0,5xLMA

Pommes 50 µg/kg 70 - 105% CVr < CVR < CV

0,5xLMA

*

: Concernant la reproductibilité des fractions pondérales inférieures à 100 µg/kg, l’application de l’équation d’Horwitz (CV

= 2(1-0,5logC)

) donne des valeurs élevées. Par conséquent, il est stipulé que les CVr doivent être aussi bas que possible (CVr

Répétabilité intra laboratoire < CV Reproductibilité (CVR) < 2xCV

(Horwitz)/3. La méthode doit obtenir une reproductibilité

intralaboratoire qui n’est pas supérieure au CV de reproductibilité correspondant à une concentration de 0,5 x LMA.

VALIDATIEPARAMETERS / PARAMETRES DE VALIDATION

Les paramètres de validation testés sont :

1- Spécificité

2- Robustesse

3- Fidélité : Répétabilité et reproductibilité intra laboratoire

4- Justesse (Récupération)

5- Incertitudes de mesures

6- Limite de décision (CCα) et capacité de détection (CCβ)

7- Linéarité et courbe de calibration

8- Limites de détection et de quantification

1. Spécificité

L’examen des chromatogrammes révèle que pour les matrices testées (pomme, jus de pomme), il n’y pas de

problème de pics de substances interférentes dans la fenêtre d’observation du pic de la PAT.

1

: Cette limite est de 25 µg/kg pour les produits solides à base de pomme et devient 10 µg/L ou 10 µg/kg pour les

jus de pommes et les produits destinés aux nourrissons et aux jeunes enfants (CE N° 1881/2006).


De façon satisfaisante, les temps de rétention obtenus avec les échantillons rapportés aux temps de rétention des

standards [tRSTD

-tREch

)*100/tRSTD

] sont inférieures à 2,5 % aussi bien pour les jus de pomme que pour les échantillons

de pommes (Tableau 2).

Tableau 2: Intervalles de variation des temps de rétention (Ecart relatif par rapport aux temps de rétention

obtenus avec les standards) pour la détection de la PAT dans les extraits de jus de pomme et pomme.

Jour 1 Jour 2 Jour 3

Jus de pommes -0,5% à 0,2% -0,9% à 1,4% -0,5% à 1,3%

Pommes -0,8% à 0,6% -0,3% à 0,2% -0,6% à 0,9%

*: [tRSTD

-tREch

)x100/tRSTD

] < 2,5%

La détection par spectrométrie de masse nécessite aussi la fragmentation de la PAT qui donne deux produits

ioniques. Les rapports d’intensités ioniques obtenus avec les extraits de jus de pommes et pommes sont comparés à

ceux obtenus avec les standards de PAT. Les déviations obtenues (Tableau 3) sont inférieures à 25% fixés par la

décision 2002/657/CE de la commission européenne (Tableau 4).

Tableau 3 : Intervalles de variation des rapports d’intensité ioniques*


Jus de pommes -14,7% à 20,5% -10,9% à 14,8% -12,3% à 15,2%

Pommes -6,4% à 20,5% -14,6% à 20,9% -18,1% à 23,5%

*: 0,2 < Rapport ionique < 0,5 : variation attendue = ± 25%.

Tableau 4: Tolérances maximales admissibles pour les intensités ioniques relatives.

Intensité relative

(Rapport ionique)

CL-SM*

(Variation relative acceptée)

> 0,50 ± 20%

> 0,20 – 0,50 ± 25%

> 0,10 – 0,20 ± 30%

≤ 0,10 ± 50%

* : 2002/657/CE.

Effet de suppression ou de renforcement de signaux de détection de la patuline

Les extraits de jus de pomme et pomme ont été dopées avec le standard 13

C (25 µg/kg) et les surfaces de pics

obtenues sont comparées à celles issues du dopage des étalons de 12

C (courbe d’étalonnage). Cette comparaison

permet de conclure que les extraits de jus de pomme et pommes induisent légèrement la suppression des signaux de

quantification du 13

C (Tableau 5).

Tableau 5: Pourcentage de diminution de la récupération de la patuline 13

C (dose initiale = 25 µg/kg)


Jus de pommes 20,1% ± 8,8% 60,5% ± 5,8% 23,3% ± 5,4%

Pommes 21,9% ±10,7% 16,1% ± 5,7% 9,8% ± 6,7%

Cet effet de suppression des signaux ainsi observé varie d’un jour à un autre.

Note : L’utilisation systématique du standard interne de patuline 13

C est faite quotidiennement en vue de corriger les

surfaces obtenues.

2. Robustesse

La méthode analytique comprenant peu d’étapes manuelles est applicable sans modification aux échantillons de

jus de pommes, compotes, cidre, pommes, poires et prunes. Elle est relativement simple et ne présente aucune étape

de purification sur colonne à phase solide (SPE) ou d’immunoaffinité (IAC), ni de dérivatisation. Les sources

d’incertitudes pertinentes sont :

le rendement d’extraction

la reproductibilité des mesures par LC-MS/MS


l’ampleur de l’effet matrice (suppression ou renforcement des signaux)

l’hétérogénéité éventuelle de distribution de la PAT dans les échantillons

le type et la nature des fruits (pomme, poire, prune) et produits dérivés (jus, cidre, compote, nectar)

la justesse des solutions de référence (stabilité des standards de PAT utilisés).

3. Fidélité : Répétabilité et reproductibilité intra laboratoire

La détermination de la répétabilité et de la reproductibilité est faite sur la base des expériences de validation 3x3x3

analyses de jus de pommes et de pomme dopés à 0,5 x LMA, 1x LMA et 1,5 x LMA en triplicata pendant 3 différents

jours. Le Tableau 6 récapitule les résultats obtenus et l’Annexe 1 présente le détail des traitements statistiques des

données.

Tableau 6: Répétabilité intra-laboratoire

Matrices Concentrations

nominales

Concentrations Moyennes

mesurées

Répétabilité intra-laboratoire

incertitude (u(k = 1)

*)

(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) %

Jus de pommes 25 24,24 3,17 13,09%

50 46,24 4,28 9,25%

75 66,53 5,56 8,35%

Pommes 25 23,26 2,92 12,56%

50 43,24 5,11 11,81%

75 66,11 7,92 11,98%

(*) u = sd

La détermination de la répétabilité respecte les critères de performance CVr < CV0,5xLMA

<2xCVHorwitz

/3

4. Justesse (Récupération)

4.1 Pourcentage de récupération

Les pourcentages de récupération ont été déterminés par régression linéaire de la base de données obtenue des

expériences de validation 3x3x3 analyses d’échantillons de jus de pommes et de pomme dopés à 0,5 x LMA, 1x LMA

et 1,5 x LMA. Les résultats obtenus (Tableau 7) sont tous dans les limites requises (70% à 105%) comme critères de

performance. L’Annexe 2 présente le détail des traitements statistiques des données.

Tableau 7: Pourcentages de récupération

Intervalle de

concentrations

testées (µg/kg)

Pourcentages

de récupération

Ordonnée

à l’origine

R2

Jus de pommes 25 - 75 84,6% 3,39 0,9505

Pommes 25 -75 85,7% 1,35 0,9212

Note : Un pourcentage de récupération est systématiquement déterminé lors des analyses de routine et au

cours des contrôles de 2ème

et 3ème

lignes pour vérifier le bon fonctionnement de la méthode.

4.2 Justesse

Les résultats détaillés du PT organisé par EU-RL pour les jus de pommes sont présentés en Annexe 3 et résumés

dans le Tableau 8.


Tableau 8: Résultats du PT EU-RL 2013-2014

Jus de pommes Concentrations

assignées (EU-RL)

Incertitude

élargie (k =2)

Résultats obtenus

(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) Z-scores Zeta-scores

« Sample A » 39,1 1,5 33 -0,7 -0,9

« Sample B » 60,5 2,0 54 -0,5 -0,5

Z-scores entre -2 et +2.

5. Incertitudes de mesures

5.1 Incertitudes élargies

Les Annexes 1et 2 présentent les détails des traitements statistiques donnant les incertitudes résumées dans le

Tableau 9.

Tableau 9: Incertitudes élargies et maximales estimées

Matrices Concentrations

nominales

Incertitude élargie Uext, (k = 2) (**)

Incertitude élargie maximale estimée Umax. (k = 2) (***)

(µg/kg) ug/kg % ug/kg %

Jus de pomme 25 6,35 26,2% 7,3 29,3% 50 8,55 18,5% 14,7 29,3% 75 11,11 16,7% 22,0 29,3% Pommes 25 5,84 25,1% 7,3 29,3%

50 10,22 23,6% 14,7 29,3% 75 15,85 24,0% 22,0 29,3%

(*) u = sd (**) U = 2 sd (***) from modif. Horwitz for Srw, Umax = 2xSHortwitz/3

cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08

La détermination de la répétabilité respecte les critères de performance Uext(k=2)

< Umax (k=2)

( avec Umax = 2xSHortwitz/3)

5.1 Incertitudes combinées

Les incertitudes combinées sont calculées à partir des incertitudes de répétabilité, des biais estimés et d’autres

variations estimées à 10% (Tableau 10).

Tableau 10 : Incertitudes combinées (Précision + Justesse+ 10% de variations additionnelles)

Jus de pommes Pommes

Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 1 Jour 2 Jour 3

u comb (bias+prec,%) 13,1% 11,4% 13,5% 13,6% 16,9% 15,9%

u comb (bias+prec+addit,%) 16,4% 15,2% 16,8% 14,5% 17,7% 16,6%

Uc(prec.+bias+10%add.) (k=2) 32,9% 30,3% 33,6% 29,0% 35,3% 33,3%

U(Hw-Th) (k=2) 44,0% 44,0% 44,0% 44,0% 44,0% 44,0%

Uprec

= incertitude répétabilité/reproductibilité ; Ubias

= Incertitude de justesse +10% de variations diverses

Sur base des profils d’incertitudes des 2 matrices (jus de pomme et pomme), l’incertitude de mesure MU(k=2)

est

estimée à 35%.

5. Limite de décision (CCα) et capacité de détection (CCβ)

La limite de décision (CCα) et la capacité de détection (CCβ) n’ont de signification que par rapport aux limites

maximales autorisées (LMA). Les estimations de CCα et de CCβ sont reportées dans le Tableau 11.


Tableau 11: Limites de décision et capacité de détection

Matrices LMA CCα CCβ

(µg/kg) (µg/kg) %LMA (µg/kg) %LMA

Jus de pomme 50 58,42 116,8% 66,94 133,9%

Pomme 50 60,78 121,6% 71,78 143,6%

6. Linéarité et courbe de calibration

6.1 Linéarité

Après corrections par les étalons internes 13

C, les courbes d’étalonnage sont linéaires (R2

>0,9791) dans la gamme

de concentrations étudiée (12,5 – 150 µg/L) équivalentes à 25 - 300 µg PAT/L de jus de pommes et 50 - 600 µg

PAT/kg de pommes.

Le RIKILT Test (Tableau 12) illustre cette linéarité des réponses aux injections des étalons de PAT (µg/L).

Tableau 12: Linéarité des réponses (surfaces de pic) aux injections d’étalons de patuline

Concentration

de PAT (µg/L)

(Ci)

Surfaces de

pics (Yi)

Surfaces de

pic

normalisées

(Ri=Yi/Ci)

Ecart à la

moyenne

(Ei=Ri-M)

Déviations

relatives

(Ei/M)

12,5 11366 909,2 2,2 0,2%

25,0 23629 945,2 38,1 4,2%

50,0 48498 970,0 62,9 6,9%

100,0 66752 890,0 -17,0 -1,9%

150,0 87930 879,3 -27,8 -3,1%

Moyenne (M) 907,1

RIKILT Test (Van Trijp & Roos, 1991)

De façon satisfaisante, les déviations sont inférieures à 10%, ce traduit une très bonne linéarité des réponses

6.2 Variation des courbes d’étalonnages

Les variations intra-journalières sont minimes (CVpentes

= 1,1%) entre 2 séries injectées au cours de la même journée

(Figure1).

Figure 1: Courbes de calibration des standards (variation intra-journalière)


Les variations découlant des préparations de standards restent acceptable (<10%), mais peuvent constituer une

source d’incertitude de mesure.

Note: Une courbe de calibration sera systématiquement établie lors des analyses de routine (avant et après la

série d’échantillons)

7. Limite de détection et de quantification

La limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) ont été déterminées à partir des bruits de fonds (BF)

d’échantillons non contaminés (blancs). Le tableau 13 présente l’estimation des LOD et LOQ calculées à l’aide des

formules ci-après :

LOD = LOQ =

Avec

Yblank

= moyenne des réponses obtenues en injectant des échantillons blancs

SDblank = Standard de déviation des réponses obtenues

Pente = Pente de la droite d’étalonnage

n = le nombre d’échantillons blancs

Tableau 13 : Valeurs estimées des limites de détection et de quantification

LOD

LOQ

Limite de rapportage

Jus de pomme 1 µg/L 2 µg/L 3 µg/L

Pomme 2 µg/kg 5 µg/kg 7 µg/kg

Le broyage des échantillons (pommes) est obligatoire et doit permettre l’homogénéisation. Pour des échantillons

homogènes (liquides et solides), les règles ci-après sont utilisées pour exprimer les résultats d’analyse :

Pour un échantillon dont le résultat <LOQ, le résultat sera rapporté en tant que «traces» et l’échantillon sera

déclaré conforme

Pour un échantillon dont le résultat est >LOQ mais reste <CCα, ce résultat sera reporté et l’échantillon sera

déclaré conforme

Pour un échantillon dont le résultat >CCα, cette valeur sera reportée et l’échantillon sera déclaré non conforme.

8. Application de la méthode à d’autres matrices telles que la compote et le cidre

L’extension de l’utilisation de la méthode a été vérifiée et appréciée au moyen des paramètres ci-après (Tableau 14).

Tableau14: Application de la méthode pour le dosage de la patuline dans le cidre et la compote.

Cidre Compote

Intervalle de variation des temps de rétention (Ecart relatif) 0% à 0,4% 0,2% à 0,4%

% de récupération de PAT 13

C (dose initiale = 25 µg/kg) 24,5% ± 6,6% 33,7% ± 3,0%

Pourcentage de récupération12C (dose = 50 µg/kg) 95,4% ±18,0% 95,3% ±14,3%

Les pourcentages des récupérations obtenues sont tous dans les limites requises (70% à 105%) comme critères de

performance.


PRO/5.4/02/DOC04/V01

FACTOREN DIE DE JUISTHEID EN BETROUWBAARHEID VAN DE BEPROEVINGEN BEÏNVLOEDEN

FACTEURS QUI INFLUENCENT L’EXACTITUDE ET LA FIABILITE DES ESSAIS

SOP/MYC/ANA/10

1. UITRUSTING EN LABORATORIUMMATERIAAL / EQUIPEMENT ET MATERIEL DE LABORATOIRE

Equipement et Matériel de Laboratoire Contrôle

LC-MS/MS Entretien annuel + Entretien périodique

Injection QC + check list avant analyse

Solvants/solutions Qualité LC (minimum) pour la LC-MS/MS et qualité

analytique (au minimum) pour les extractions

Contrôle des durées de conservation des solutions

Pipettes Contrôlées en routine

Étalonnage périodique

Balances Contrôlées en routine

Étalonnage périodique

Contrôle de poids

Verrerie Standard + procédure de nettoyage

Congélateur/Réfrigérateur Vérification quotidienne des températures

2. STALEN EN PRODUCTEN / ECHANTILLONS ET PRODUITS

L’hétérogénéité des échantillons est contrôlée par un broyage préalable suivi d’une homogénéisation de tout

l’échantillon de pomme. Quant au jus un mélange rapide par plusieurs secousses du vase est effectué.

Les interférences mesurées par l’effet matrice sont corrigées par les étalons marqués 13

C.

La justesse des étalons est contrôlée par des solutions certifiées ou par mesures spectrophotométriques.

L’eau Milli Q est maîtrisée via l’entretien de l’appareillage (Millipore) et vérification journalière

3. PRINCIPE VAN DE METHODE / PRINCIPE DE LA METHODE

Les facteurs critiques liés au principe de la méthode sont la répétabilité des mesures, les interférences matricielles et

les variations instrumentales liées aux réponses du détecteur MS-MS. Pour les résultats douteux, les échantillons

seront soumis à de nouvelles analyses.

4. OMGEVING / MILIEU AMBIANT

L’influence de l’environnement sur les étapes d’extraction est négligeable. Les solutions standards sont conservées au

congélateur par précaution. La LC-MS/MS utilisée est placée dans une salle thermostatisée afin d’éviter d’éventuelles

perturbations des réponses du détecteur MS-MS susceptible d’être influencé par la température du milieu ambiant.

La température de la salle est relevée.

5. PERSONEEL / PERSONNEL

Les étapes de préparation requièrent de la rigueur et la maîtrise des manipulations de base dans les laboratoires à

savoir les pesées, les dilutions, les centrifugations ainsi que les respects des règles de sécurité et de maintien de

propreté dans les laboratoires. En outre, la vérification des résultats requiert de la rigueur dans l’interprétation des

chromatogrammes et de la maîtrise des logiciels accompagnants la LC-MS/MS.


Annexes

Liste des annexes

Annexe 1 : Calcul de répétabilité, de reproductibilité et de pourcentage de récupération de la patuline dans du jus

de pommes

Annexe 2: Calcul de répétabilité, de reproductibilité et de pourcentage de récupération de la patuline dans la

pomme

Annexe 3: Illustration des résultats du PT EU-RL (Sample A et Sample B)

Annexe 4: Calcul des incertitudes combinées (profile d’exactitude) pour la détermination de la patuline dans des jus

de pommes

Annexe 5: Calcul des incertitudes combinées (profile d’exactitude) pour la détermination de la patuline dans des

pommes


Annexe 1: Calcul de répétabilité, de reproductibilité et de pourcentage de récupération de la patuline dans du jus de

pommes

CALCULATION of REPEATABILITY, WITHIN-LAB REPRODUCIBILITY, CCa, CCb and RECOVERY (reminder : formulas, with "E" = "sum of" :

ACCORDING TO 2002/657/EC, ISO 11843-1 and Van Loco & Beernaert (2004) SSrepl = Ed Er (Y-Ymoy(level,day))2

Srep2 = Srepl2 = MSrepl = SSrepl/(n-ndays)

DATA : RESULTS AND GRAPHS : SSdays = nrepl E(Ymoy(level,day)-Ymoy(level))2

MSdays = SSdays / (ndays-1)

Analyte : PATULINE linear regression : recovery intercept R2 Sdays2 = (MSdays-MSrepl) / nrepl

Method : 84,6% 3,39 0,9505 Srw2 = Sdays2 + Srep2 )

Matrix : APPLE JUICE warning : this is only the "repe-repro"

MRL : 50 (Maximum Residue Limit) CCa, CCb : t(26,0.05) Yc CCa CCb part of the MU and does not include lab bias

unit : ug/kg ug/kg % of MRL ug/kg % of MRL (possibly different for different samples)

Nrepl : 3 (number of replicates) 1,706 52,79 58,42 116,8% 66,94 133,9%

Ndays : 3 (number of days or analysts)

(Nlev : 3 (number of levels)) SD, U : nom.ccn av.meas. uncertainty (k = 1) (*) U, ext. unc. (k = 2) (**) Umax. (k = 2) (***)

Measured concentrations : ug/kg ug/kg ug/kg % ug/kg % ug/kg %

(NOT corrected for recovery) : 25 24,24 3,17 13,09% 6,35 26,2% 7,3 29,3%

50 46,24 4,28 9,25% 8,55 18,5% 14,7 29,3%

conc. repl : day or analyst : 75 66,53 5,56 8,35% 11,11 16,7% 22,0 29,3%

(µg/kg) 1 2 3 4 5 6 (*) u = sd (**) U = 2 sd (***) from modif. Horwitz for Srw, HorRat < 2x2/3

level 1 : 1 23,3 21,2 24,2 60,447 SSrepl cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08

25 2 29,5 20,6 26 10,074 MSrepl

3 20,7 25,7 27 3,174 Srepl

4 24,244 average for level

5 15,976 SSdays

6 7,988 MSdays

7 -0,696 Sdays2

8 0,000 Sdays

9 3,174 Srw

10

level 2 : 1 39,4 44,7 46,5 64,093 SSrepl

50 2 46,4 49,1 49,8 10,682 MSrepl

3 43,7 43,5 53,1 3,268 Srepl


5 67,029 SSdays

6 33,514 MSdays

7 7,611 Sdays2

8 2,759 Sdays

9 4,277 Srw

10

level 3 : 1 72 61,7 68,1 185,220 SSrepl

75 2 56,3 70,6 68 30,870 MSrepl

3 64,7 71,5 65,9 5,556 Srepl


5 22,320 SSdays

6 11,160 MSdays

7 -6,570 Sdays2

8 0,000 Sdays

9 5,556 Srw

10

average level 1 : 24,5 22,5 25,733 average

SumSquares 40,88 15,54 4,0267 SumSquares

average level 2 : 43,167 45,767 49,8 average calculations performed by : date

SumSquares 24,927 17,387 21,78 SumSquares using template : ValMethTerv ver 1.71

average level 3 : 64,333 67,933 67,333 average template date : 11-juil-13


0

2

4

6

8

10

12

2 x Srepl 2 x Sdays 2 x Srw

Uncertainty (ug/kg) (k=2, 95% conf. int.)

25

50

75

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%


Uncertainty (%) (k=2, 95% conf. int.)

25

50

75

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.5 x MRL

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 x MRL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1.5 x MRL

y = 0,8458x + 3,3852R² = 0,9505

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0

linear regression


Annexe 2: Calcul de répétabilité, de reproductibilité et de pourcentage de récupération de la patuline dans la

pomme

CALCULATION of REPEATABILITY, WITHIN-LAB REPRODUCIBILITY, CCa, CCb and RECOVERY (reminder : formulas, with "E" = "sum of" :

ACCORDING TO 2002/657/EC, ISO 11843-1 and Van Loco & Beernaert (2004) SSrepl = Ed Er (Y-Ymoy(level,day))2

Srep2 = Srepl2 = MSrepl = SSrepl/(n-ndays)

DATA : RESULTS AND GRAPHS : SSdays = nrepl E(Ymoy(level,day)-Ymoy(level))2

MSdays = SSdays / (ndays-1)

Analyte : PATULINE linear regression : recovery intercept R2 Sdays2 = (MSdays-MSrepl) / nrepl

Method : SOP-MYC-ANA 85,7% 1,35 0,9212 Srw2 = Sdays2 + Srep2 )

Matrix : APPLE warning : this is only the "repe-repro"

MRL : 50 (Maximum Residue Limit) CCa, CCb : t(26,0.05) Yc CCa CCb part of the MU and does not include lab bias

unit : ug/kg ug/kg % of MRL ug/kg % of MRL (possibly different for different samples)

Nrepl : 3 (number of replicates) 1,706 53,44 60,78 121,6% 71,78 143,6%

Ndays : 3 (number of days or analysts)

(Nlev : 3 (number of levels)) SD, U : nom.ccn av.meas. uncertainty (k = 1) (*) U, ext. unc. (k = 2) (**) Umax. (k = 2) (***)

Measured concentrations : ug/kg ug/kg ug/kg % ug/kg % ug/kg %

(NOT corrected for recovery) : 25 23,26 2,92 12,56% 5,84 25,1% 7,3 29,3%

50 43,24 5,11 11,81% 10,22 23,6% 14,7 29,3%

conc. repl : day or analyst : 75 66,11 7,92 11,98% 15,85 24,0% 22,0 29,3%

(µg/kg) 1 2 3 4 5 6 (*) u = sd (**) U = 2 sd (***) from modif. Horwitz for Srw, HorRat < 2x2/3

level 1 : 1 24,4 22 24,6 39,653 SSrepl cfr Codex Alim - mth criteria - draft 14.2.08

25 2 17,9 24,4 22,5 6,609 MSrepl

3 20,5 26 27 2,571 Srepl


5 24,749 SSdays

6 12,374 MSdays

7 1,922 Sdays2

8 1,386 Sdays

9 2,921 Srw

10

level 2 : 1 40,1 54 41,8 79,633 SSrepl

50 2 39,9 47,5 41,3 13,272 MSrepl

3 38,8 41,8 44 3,643 Srepl


5 103,509 SSdays

6 51,754 MSdays

7 12,827 Sdays2

8 3,582 Sdays

9 5,109 Srw

10

level 3 : 1 58,5 72 61,7 210,267 SSrepl

75 2 62,9 72,1 63,1 35,044 MSrepl

3 56 69,8 78,9 5,920 Srepl


5 236,442 SSdays

6 118,221 MSdays

7 27,726 Sdays2

8 5,266 Sdays

9 7,923 Srw

10

average level 1 : 20,933 24,133 24,7 average


average level 2 : 39,6 47,767 42,367 average calculations performed by : date

SumSquares 0,98 74,527 4,1267 SumSquares using template : ValMethTerv ver 1.71

average level 3 : 59,133 71,3 67,9 average template date : 11-juil-13


0

5

10

15

20


Uncertainty (ug/kg) (k=2, 95% conf. int.)

25

50

75

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%


Uncertainty (%) (k=2, 95% conf. int.)

25

50

75

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.5 x MRL

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 x MRL

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1.5 x MRL

y = 0,8571x + 1,3481R² = 0,9212

0

20

40

60

80

100

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0

linear regression


Annexe 3: Illustration des résultats du PT EU-RL (Sample A et Sample B)


Annexe 4: Calcul des incertitudes combinées (profile d’exactitude) pour la détermination de la patuline dans des jus

de pommes

Fill in and/or check blue cells

(note : if you paste data from other file : using "paste special / values" will preserve the formatting of this sheet)

(note : the number of replicates may be different for different levels, but MUST be the same for all series within one level)

Calculation of "accuracy profile"(*) and of combined U (2 approaches : precision+bias and RMS)

((*) cfr e.g. p. 50 of CEN/TC 275 NWIP French proposal charcaterization protocol for validation)

level 1 2 3

theor mean ccn (µg/kg) 25 50 75

for accuracy profile : proba of tol (beta) 95%

for U :additional u (e.g. spikes) 10,0%

for U : k 2

repl :

series : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ni SCEi

1 23,3 29,5 20,7 3 40,88

2 21,2 20,6 25,7 3 15,54

3 24,2 26 27 3 4,026667

4 0

5 0

6 0

1 39,4 46,4 43,7 3 24,92667

2 44,7 49,1 43,5 3 17,38667

3 46,5 49,8 53,1 3 21,78

4 0

5 0

6 0

1 72 56,3 64,7 3 123,4467

2 61,7 70,6 71,5 3 58,68667

3 68,1 68 65,9 3 3,086667

4 0

5 0

6 0

nb of series (I) 3 3 3

nb of meas (IJ) 9 9 9

nb of repl (J) 3 3 3

resid SCE 60,44667 64,09333 185,22

total SCE 76,42222 131,1222 207,54

inter-series SCE 15,97556 67,02889 22,32

interm calc of s2B -0,695556 7,610741 -6,57

repe variance (s2r) 10,07444 10,68222 30,87

inter-series vaiance (s2B) 0 7,610741 0

precision variance (s2FI) 10,07444 18,29296 30,87

precision

mean recovered ccn 24,24444 46,24444 66,53333

repe st dev (sr) 3,174027 3,268367 5,556078

inter-series st dev (sB) 0 2,758757 0

precision st dev (sFI) 3,174027 4,277027 5,556078

measurement trueness

bias (%) -3,02% -7,51% -11,29%

tolerance interval coverage factor

variance ratio sr 0 0,712468 0

coeff B2 1 0,545823 1

nb deg freedom 7,714286 4,722873 7,714286

proba of tol (beta) 95% 95% 95%

lower Student's t 2,364624 2,776445 2,364624

upper Student's t 2,306004 2,570582 2,306004

coverage factor (ktol) 2,322753 2,627632 2,322753

st dev of tol (sIT) 3,345718 4,692205 5,85662

tolerance interval

lower limit of tol int 16,47317 33,91506 52,92985

upper limit of tol int 32,01572 58,57383 80,13681

accuracy profile

theor ccn 25 50 75

mean recov (%) 97,0% 92,5% 88,7%

'100%' 100% 100% 100%

lower limit tolerance interval 65,9% 67,8% 70,6%

upper limit 128,1% 117,1% 106,8%

Uc(prec.+bias+10%add.)(bias & Srw & additional)

u comb (bias+prec,%) 13,1% 11,4% 13,5%

u comb (bias+prec+addit,%) 16,4% 15,2% 16,8%

Uc(prec.+bias+10%add.) (k=2) 32,9% 30,3% 33,6%

lower limit 67,1% 69,7% 66,4%

upper limit 132,9% 130,3% 133,6%

U(RMS+10%add) (RMS & additional)

RMS (%) 12,0% 10,7% 13,0%

u comb (RMS+addit,%) 15,7% 14,7% 16,4%

U(RMS+10%add) (k=2) 31,3% 29,3% 32,8%

lower limit 68,7% 70,7% 67,2%

upper limit 131,3% 129,3% 132,8%

U(Hw-Th) (Horwitz-Thompson)

22,0% 22,0% 22,0%

U(Hw-Th) (k=2) 44,0% 44,0% 44,0%

lower limit 56,0% 56,0% 56,0%

upper limit 144,0% 144,0% 144,0%

ValMethTerv ver 1.71

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

0 20 40 60 80

ccn (µg/kg)

accuracy profile

mean recov (%) '100%' tolerance interval

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

160%

0 20 40 60 80

ccn (µg/kg)

accuracy profile, vs U(prec+bias+add), U(RMS+add), U(Horw-Th)

mean recov (%) '100%'

tolerance interval Uc(prec.+bias+10%add.) (k=2)

U(RMS+10%add) (k=2) U(Hw-Th) (k=2)


Annexe 5: Calcul des incertitudes combinées (profile d’exactitude) pour la détermination de la patuline dans des

pommes

Fill in and/or check blue cells

(note : if you paste data from other file : using "paste special / values" will preserve the formatting of this sheet)

(note : the number of replicates may be different for different levels, but MUST be the same for all series within one level)

Calculation of "accuracy profile"(*) and of combined U (2 approaches : precision+bias and RMS)

((*) cfr e.g. p. 50 of CEN/TC 275 NWIP French proposal charcaterization protocol for validation)

level 1 2 3

theor mean ccn (µg/kg) 25 50 75

for accuracy profile : proba of tol (beta) 95%

for U :additional u (e.g. spikes) 5,0%

for U : k 2

repl :

series : 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ni SCEi

1 24,4 17,9 20,5 3 21,40667

2 22 24,4 26 3 8,106667

3 24,6 22,5 27 3 10,14

4 0

5 0

6 0

1 40,1 39,9 38,8 3 0,98

2 54 47,5 41,8 3 74,52667

3 41,8 41,3 44 3 4,126667

4 0

5 0

6 0

1 58,5 62,9 56 3 24,40667

2 72 72,1 69,8 3 3,38

3 61,7 63,1 78,9 3 182,48

4 0

5 0

6 0

nb of series (I) 3 3 3

nb of meas (IJ) 9 9 9

nb of repl (J) 3 3 3

resid SCE 39,65333 79,63333 210,2667

total SCE 64,40222 183,1422 446,7089

inter-series SCE 24,74889 103,5089 236,4422

interm calc of s2B 1,921852 12,82741 27,72556

repe variance (s2r) 6,608889 13,27222 35,04444

inter-series vaiance (s2B) 1,921852 12,82741 27,72556

precision variance (s2FI) 8,530741 26,09963 62,77

precision

mean recovered ccn 23,25556 43,24444 66,11111

repe st dev (sr) 2,570776 3,643106 5,919835

inter-series st dev (sB) 1,386309 3,581537 5,265506

precision st dev (sFI) 2,920743 5,10878 7,922752

measurement trueness

bias (%) -6,98% -13,51% -11,85%

tolerance interval coverage factor

variance ratio sr 0,290798 0,966485 0,791154

coeff B2 0,689384 0,504297 0,530954

nb deg freedom 6,197495 4,208645 4,542245

proba of tol (beta) 95% 95% 95%

lower Student's t 2,446912 2,776445 2,776445

upper Student's t 2,364624 2,570582 2,570582

coverage factor (ktol) 2,43066 2,733493 2,664817

st dev of tol (sIT) 3,147329 5,643591 8,712387

tolerance interval

lower limit of tol int 15,60547 27,81773 42,8942

upper limit of tol int 30,90564 58,67116 89,32803

accuracy profile

theor ccn 25 50 75

mean recov (%) 93,0% 86,5% 88,1%

'100%' 100% 100% 100%

lower limit tolerance interval 62,4% 55,6% 57,2%

upper limit 123,6% 117,3% 119,1%

Uc(prec.+bias+5%add.)(bias & Srw & additional)

u comb (bias+prec,%) 13,6% 16,9% 15,9%

u comb (bias+prec+addit,%) 14,5% 17,7% 16,6%

Uc(prec.+bias+5%add.) (k=2) 29,0% 35,3% 33,3%

lower limit 71,0% 64,7% 66,7%

upper limit 129,0% 135,3% 133,3%

U(RMS+5%add) (RMS & additional)

RMS (%) 12,8% 16,2% 15,1%

u comb (RMS+addit,%) 13,7% 17,0% 15,9%

U(RMS+5%add) (k=2) 27,4% 34,0% 31,9%

lower limit 72,6% 66,0% 68,1%

upper limit 127,4% 134,0% 131,9%

U(Hw-Th) (Horwitz-Thompson)

22,0% 22,0% 22,0%

U(Hw-Th) (k=2) 44,0% 44,0% 44,0%

lower limit 56,0% 56,0% 56,0%

upper limit 144,0% 144,0% 144,0%

ValMethTerv ver 1.71

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

0 20 40 60 80

ccn (µg/kg)

accuracy profile

mean recov (%) '100%' tolerance interval

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

160%

0 20 40 60 80

ccn (µg/kg)

accuracy profile, vs U(prec+bias+add), U(RMS+add), U(Horw-Th)

mean recov (%) '100%'

tolerance interval Uc(prec.+bias+5%add.) (k=2)

U(RMS+5%add) (k=2) U(Hw-Th) (k=2)

validatiedossier dossier de validation...12/10/2012 page 1 of 15 c o d a - c e r v a-tervuren...

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