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DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRENATAL
1- GENERALIDADES
El diagnóstico prenatal es el conjunto de técnicas y capacidades disponibles para
conocer la adecuada formación y desarrollo del feto antes de su nacimiento.
En sus inicios, el diagnóstico prenatal consistía fundamentalmente en el cuidado de la
madre. Esta situación ha cambiado radicalmente en las últimas décadas debido al uso
sistemático y mejoras técnicas de la ecografía, y a los avances en los procedimientos
invasivos, no invasivos y diagnóstico molecular. Este proceso también ha generado un
incremento en la tasa de diagnóstico prenatal de malformaciones congénitas, y ha
llevado a acuñar el concepto del feto como paciente.
En la actualidad, el diagnóstico prenatal incluye, además del cuidado de la madre, la
evaluación de la salud fetal, la pesquisa y el diagnóstico de defectos congénitos, la
búsqueda de la etiología de los mismos, el seguimiento y estrategias de manejo, y
eventualmente, intervenciones terapéuticas.
Un concepto central es que el diagnóstico prenatal de una malformación fetal requiere
de un enfoque multidisciplinario que involucre a especialistas en obstetricia y en
imágenes, genetistas, neonatólogos, cardiólogos infantiles y a los especialistas en
cirugía infantil. Este concepto de equipo multidisciplinario trasciende el conocimiento y
la experiencia de los especialistas en sus respectivas áreas, aumentando las
competencias del equipo en el asesoramiento de los padres y en la planificación de un
mejor manejo perinatal.
Específicamente, el diagnóstico prenatal evalúa al feto con riesgo de presentar una
anomalía de cromosomas, de genes o una malformación congénita. O sea, que todos
los especialistas involucrados en el diagnóstico prenatal de defectos congénitos van a
estar involucrados en mayor o menor medida con conceptos y nociones generales de
la genética
1.1 – CLASIFICACIÓN DE LOS DEFECTOS CONGÉNITOS
Un defecto congénito es definido como cualquier anomalía anatómica, bioquímica o
funcional que está presente al momento del nacimiento.
Los defectos congénitos se pueden clasificar desde distintos enfoques. Por el número
de malformaciones se los clasifica en simples o aislados (una sola malformación) o
múltiples (dos o más). De acuerdo a su magnitud se los clasifica en mayores y
menores: los defectos mayores son aquellos defectos que resultan en mortalidad o en
morbilidad o alteración cosmética significativa, o que requieren tratamiento quirúrgico;
los defectos menores no tienen consecuencias médicas ni cosméticas significativas.
Entre el 2 y el 3 % de los recién nacidos presentan una malformación mayor al
momento del nacimiento, y cerca del 10 % una malformación menor.
1.2 – ETIOLOGÍA DE LOS DEFECTOS CONGÉNITOS
La clasificación etiológica de los defectos congénitos es importante para aclarar los
factores de riesgo, determinar qué método de diagnóstico prenatal se utilizará,
establecer un pronóstico perinatal cierto, y realizar un correcto asesoramiento
genético. La etiología se divide en tres grandes grupos: genética, ambiental y
poligénica o multifactorial (Tabla 1).
Tabla 1: Etiología de los defectos congénitos
Etiología Ejemplos
Genética
(10 – 25 %)
Anomalías
cromosómicas
Trisomias 21; 18 y 13; síndrome de Turner,
triploidías, polisomías de cromosomas
sexuales, translocaciones
Anomalías génicasAcondroplasia, fibrosis quística, poliquistosis
renal, distrofia muscular de Duchenne
Poligénica o
Multifactorial
(65 – 85 %)
Defectos anatómicos
aislados
Anencefalia, espina bífida, hidrocefalia, fisura
labiopalatina, cardiopatías, agenesia renal,
hernia diafragmática, onfalocele.
Ambiental
(< 10 %)
Agentes físicos Radiaciones
Agentes químicos Alcohol, medicamentos
Agentes biológicos toxoplasmosis, rubeola, CMV, parvovirus
1.2.1 – Anomalías de causa genética
1.2.1.1 – Anomalías de cromosomas
Las anomalías de cromosomas pueden deberse a una alteración en el número o en
la estructura de los mismos.
Las anomalías cromosómicas numéricas involucran la ganancia o pérdida de un
cromosoma completo (aneuploidía completa) o de un segmento de un cromosoma
(aneuploidía parcial). Se denomina trisomía cuando hay 3 copias de un cromosoma
en particular en lugar de 2; monosomía cuando sólo está presente un miembro del
par; poliploidía cuando hay uno o más sets extra de cromosomas (triploidía: 69;
tetraploidía:94); polisomía cuando hay uno o más cromosomas sexuales; y
mosaicismo cuando coexisten en un mismo tejido o individuo 2 ó más líneas celulares
con distinto complemento cromosómico.
Las anomalías cromosómicas estructurales consisten en cambios en segmentos
dentro de un mismo cromosoma o entre cromosomas distintos. El efecto depende del
tamaño y localización de la anomalía, y si se produce pérdida o ganancia de material
genético. Ejemplos de anomalías estructurales son: deleción (pérdida de material
genético), duplicación (ganancia de material genético), translocaciones (intercambio de
material entre cromosomas), inversiones (rearreglos intracromosoma), cromosomas en
anillo (por pérdida de telómeros y unión entre los extremos de un mismo cromosoma),
isocromosomas (cromosomas formados por ambos brazos cortos o ambos brazos
largos).
Las anomalías cromosómicas pueden ser diagnosticadas por las técnicas de
citogenética clásica o por citogenética molecular. Además de las anomalías
cromosómicas clásicas descriptas previamente, existe otra categoría que corresponde
a las microdeleciones o microduplicaciones. Se trata de una deleción o duplicación
cromosómica que involucra un segmento de un cromosoma, pero que es demasiado
pequeño para ser detectado por los métodos citogenéticos clásicos. Las
microdeleciones deben ser estudiadas por técnicas moleculares (FISH o análisis de
ADN). En la tabla 2 se mencionan algunos síndromes por microdeleción.
Tabla 2: Síndromes por microdeleción
Síndrome Localización
Angelman 15q11.2-q13
Aniridia-tumor de Wilms 11p13
DiGeorge 22q11.2
Miller-Diecker 17p13.3
Prader-Wili 15q11.2-q13
Rubenstein-Taibi 16p13
Wolf-Hirschhorn 4p16.3
Williams 7q11.23
1.2.1.2 – Anomalías génicas
Las anomalías génicas están causadas por cambios en la estructura de un gen. De
acuerdo al mecanismo de transmisión se clasifican en enfermedades de herencia
autosómica dominante, autosómica recesiva, ligada al cromosoma X, y de herencia
mitocondrial (tabla 3).
Tabla 3: Enfermedades génicasAutosómicas dominantes
Autosómicas recesivas
Ligadas al X Mitocondrial
Acondroplasia
Enf. de Hungtington
Hipercolesterolemia
Síndrome de Marfan
Neurofibromatosis
Riñón poliquístico del
adulto
Distrofia Miotónica de
Steinert
Fibrosis quística
Mucopolisacaridosis
Fenilcetonuria
Tay-Sachs
Talasemias
Hiperplasia Suprarrenal
Atrofia Muscular Espinal
Ceguera para los
colores
Distrofia Muscular de
Duchenne
Displasia ectodérmica
Hemofilia A
Hemofilia B
Lesh-Nyhan
Agammaglobulinemia
Neuropatía óptica de
Leber
Síndrome de Leigh
Síndrome de Kearns-
Sayre
MELAS
1.2.2 – Anomalías de etilogía poligénica/multifactorial
Las anomalías multifactoriales o poligénicas son relativamente comunes (alrededor
de 1% de los recién nacidos) y ocurren por la interacción de factores genéticos y
ambientales. Aunque tienen una leve tendencia a recurrir, no siguen patrones de
herencia mendelianos. La ocurrencia de un defecto de origen multifactorial implica un
riesgo de recurrencia del 1% a 5 % para la hermandad y la descendencia del afectado.
En la tabla 4 se observan ejemplos de anomalías multifactoriales.
Tabla 4 Anomalías multifactorialesFisura labial
Pie bot
Cardiopatías congénitas
Defectos del tubo neural:
espina bífida
anencefalia
Estenosis pilórica
Hernia diafragmática
Luxación congénita de cadera
Onfalocele
Hidrocefalia
Agenesia renal
Anomalías ureterales
Valvas uretrales posteriores
Hipospadias
Defectos de fusión mullerianos
Esta etiología también explica la mayoría de los rasgos fenotípicos normales de un
individuo, como el color de ojos, de cabello y de piel, la altura, la presión arterial, la
edad de la menarca y de la menopausia, etc.
1.2.3 – Anomalías de origen ambiental
Los defectos congénitos de origen ambiental pueden ser causados por exposición
embrionaria o fetal a agentes denominados teratógenos. Clásicamente los agentes
teratogénicos pueden dividirse en agentes físicos, químicos o biológicos. Los agentes
físicos más relacionados con defectos congénitos son las radiaciones ionizantes.
También se ha postulado que la hipertermia severa y prolongada puede estar
asociada a malformaciones. No existe evidencia de que otros agentes físicos como las
microondas, ondas de radio, y otros agentes producto del diagnóstico prenatal por
ultrasonido o resonancia magnética incrementen la tasa de defectos congénitos.
Los agentes químicos descriptos incluyen las drogas recreativas como el alcohol, y
medicamentos como la talidomida, el ácido retinoico, los anticoagulantes orales, y
algunos anticonvulsivantes y antineoplásicos, entre otros. Los agentes biológicos
fuertemente asociados a malformaciones incluyen la primoinfección por rubéola,
toxoplasmosis y CMV. De menor riesgo parecen ser las infecciones por varicela,
herpes, Chagas y VIH, entre otras, o la reinfección por CMV.
1.3 – PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO PRENATAL DE DEFECTOS CONGÉNITOS
Los diversos métodos de diagnóstico prenatal permiten en la actualidad detectar un
número creciente de defectos congénitos a través de estudios citogenéticos y
moleculares, análisis bioquímicos, y evaluación tanto de la anatomía como de la
fisiología fetal mediante técnicas de imágenes. Al igual que en cualquier proceso
diagnóstico en medicina, el diagnóstico prenatal debe ser apropiado y dirigido a la
anomalía sospechada por factores de riesgo previamente presentes o ante hallazgos
incidentales en la evaluación obstétrica de rutina. De acuerdo al tipo de metodología,
el diagnóstico prenatal se divide en métodos invasivos, métodos no invasivos y
diagnóstico genético preimplantación (PGD) (Tabla 5).
Tabla 5: Técnicas actuales de diagnóstico prenatal
MÉTODOS INVASIVOS
Biopsia de vellosidades coriónicas/ placenta
Amniocentesis
Cordocentesis
Otros procedimientos
toracocentesis
vesicocentesis
paracentesis
MÉTODOS NO INVASIVOS
Imágenes
Ecografía (2D, 3D, 4D)
Doppler
Resonancia Magnética
Tomografía Computada Helicoidal
Marcadores bioquímicos en sangre materna
Ácidos nucleicos fetales en sangre materna
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTATORIO (PGD)
1.3.1 – Indicaciones del diagnóstico prenatal invasivo
Las indicaciones diagnósticas de los procedimientos prenatales invasivos más
comunes se detallan en la tabla 6.
Tabla 6: Indicaciones de procedimientos invasivos de diagnóstico prenatal
Riesgo aumentado para anomalías de cromosomas
Edad materna avanzada
Screening positivo para anomalías de cromosomas
Hallazgos ecográficos: anomalías fetales, restricción de crecimiento intrauterino,
anomalías del volumen del líquido amniótico
Embarazo o hijo previo con una trisomía
Anomalía cromosómica en los padres
Sospecha de enfermedad genética
Por hallazgos ecográficos
Por antecedentes de enfermedad genética familiar con mutaciones conocidas
Parejas heterocigotas (portadoras) para enfermedades autosómicas recesivas
Mujeres portadoras de enferemedades recesivas ligadas al X
Padre o madre afectados con enfermedades autosómicas dominantes
Otras indicaciones de diagnóstico prenatal invasivo
Almacenamiento de ADN
Evaluación de la anemia fetal
Evaluación de la madurez pulmonar feta
Evaluación de infecciones fetales
1.3.1.1 Edad materna avanzada:
El principal factor de riesgo para anomalías cromosómicas numéricas es la edad
materna. La asociación entre edad materna y el riesgo de tener un embarazo con una
trisomía se conoce desde hace años (Tabla 7).
Tabla 7. Riesgo de anomalías de cromosomas de acuerdo a la edad de la madre.
Edad alnacimiento (años)
Riesgo paraTrisomía 21
Riesgo para cualquier anomalía cromosómica
15 1: 1578 1: 454
20 1: 1480 1: 525
25 1: 1340 1: 475
30 1: 940 1: 384
35 1: 353 1: 178
40 1: 85 1: 62
45 1: 35 1: 18
A medida que aumenta la edad materna aumenta el riesgo de un embarazo con
trisomía 21, pero también de otras trisomías como trisomía 13, trisomía 18, trisomía
16; y polisomías como 47,XXX y 47,XXY. La edad materna no altera el riesgo para
monosomía del X (síndrome de Turner) ni para triploidías.
Hasta hace algunos años la “la edad materna avanzada”, definida arbitrariamente
como igual o mayor a 35 años, constituyó la principal indicación de diagnóstico
prenatal invasivo. En la actualidad existe una tendencia a informar a todas las
embarazadas, independientemente de la edad, sobre la posibilidad de realizar un
screening prenatal para anomalías de cromosomas, con el objetivo detectar qué
pacientes podrían beneficiarse con un estudio invasivo.
1.3.1.2 Hijo o embarazo previo con una anomalía de cromosomas:Se ha descripto que ciertas trisomías en recién nacidos, en fetos muertos o en abortos
presentan un riesgo de recurrencia mayor que el esperado simplemente por azar. Esto
es principalmente cierto para trisomía 21. Se ha observado que las parejas con
cariotipo normal que han tenido un hijo con trisomías 13, 18 ó 21 presentan un riesgo
de recurrencia de otro hijo afectado cercano al 1%, o un exceso del 0,7 % por encima
del riesgo de la edad materna.
1.3.1.3 Anomalías cromosómicos en los padresLos individuos portadores de anomalías estructurales son fenotípicamente normales,
dado que no presentan exceso ni déficit de material cromosómico. No obstante,
muestran habitualmente impacto reproductivo con una alta frecuencia de abortos y la
posibilidad de recién nacidos anormales, debido a durante la meiosis se puede
producir un disbalance del rearreglo cromosómico. El riesgo depende del tamaño y
contenido génico de los segmentos que intervienen en el rearreglo. Los rearreglos más
comunes son las translocaciones balanceadas.
1.3.1.4 Screening positivo para anomalías de cromosomas En la actualidad en muchos países del mundo es una práctica de rutina dentro del
control obstétrico ofrecer un screening para anomalías de cromosomas, y determinar
el subgrupo de embarazos con mayor para una anomalía, y no estimar el riesgo sólo
en base a la edad materna. Existen múltiples esquemas de combinaciones de
marcadores del primer y segundo trimestres, siendo el método más eficiente el
“screening combinado de primer trimestre”. Este screening toma en cuenta en el
cálculo de riesgo la edad materna, marcadores bioquímicos en sangre materna
(PAPP-A y fracción libre de la Beta hCG), y marcadores ecográficos (translucencia
nucal, sumada a uno o más de los siguientes marcadores: hueso nasal, Doppler del
ductus venoso, y Doppler de la válvula tricúspide) entre las 11 y 14 semanas de
embarazo. El uso de este esquema de screening prenatal ha permitido aumentar
notablemente la detección de anomalías de cromosomas, y evitar la realización de
estudios invasivos innecesarios en la mayoría de los embarazos no afectados, y se ha
transformado en la principal indicación de diagnóstico prenatal invasivo (tabla 8)
Tabla 8: Performance de los diferentes esquemas de screening para trisomía 21
EM EM+TN EM+TN+Bq EM+TN+Bq+HN+DV+VT
TD 30% 75% 85% 95%
TFP 5% 5% 5% 2,5%
VPP 1/120 1/40 1/35 1/15
EM: edad materna; TN: translucencia nucal; Bq: marcadores bioquímicos en sangre materna (PAPP-A y
Beta-hCG libre), HN-DV-VT: hueso nasal, ductus venoso y válvula tricúspide
TD: tasa de detección; TF: tasa de falsos positivos
VPP: valor predictivo positivo, expresado en número de procedimientos necesarios para diagnosticar un
caso de trisomía 21.
1.3.1.5 Hallazgos ecográficos anormales: anomalía fetal estructural, restricción del crecimiento intrauterino, anomalía del volumen de líquido amnióticoLa identificación de estos hallazgos por ecografía es una indicación cada vez más
común de estudios invasivos para cariotipo fetal. La mayoría de las malformaciones
congénitas, salvo excepciones, se asocian en mayor o menor medida con mayor
riesgo de aneuploidía. Este riesgo se incrementa aún más con el número de defectos
detectados por ecografía. En líneas generales, las malformaciones aisladas se asocian
con un riesgo de anomalías de cromosomas entre 5 y 10 %, mientras que en el caso
de malformaciones múltiples el riesgo asciende al 20 % o más.
1.3.2 – Procedimientos invasivos
Los procedimientos prenatales invasivos corresponden en su mayoría a punciones
sobre el embarazo con agujas finas bajo control ecográfico, con el objetivo de extraer
muestras para el diagnóstico de distintas condiciones fetales.
Los procedimientos invasivos más empleados en la práctica de la medicina fetal son la
amniocentesis y la aspiración de vellosidades coriónicas o biopsia de placenta, y en
menor medida, la cordocentesis o punción de cordón umbilical (Figura 1).
Estos procedimientos tienen distintos grados de complejidad, pero todos poseen como
factor común el riesgo potencial de la pérdida de embarazo. En consecuencia deben
ser realizados o supervisados por especialistas en medicina materno-fetal con
entrenamiento en procedimientos invasivos, deben ser correctamente indicados, las
pacientes deben ser informadas previamente sobre las características, las
posibilidades y los riesgos del procedimiento, deben prestar su consentimiento
informado, y las pacientes Rh negativas no sensibilizadas deben recibir profilaxis con
gamma-globulina anti-D dentro de las 72hs posteriores al procedimiento.
Figura 1: Procedimientos invasivos en diagnóstico prenatal para obtener una muestra
de tejido para cariotipo
1.3.2.1 Amniocentesis
La amniocentesis consiste en la introducción de una aguja en la cavidad amniótica a
través del abdomen materno para extraer líquido amniótico generalmente con fines
diagnósticos y menos frecuentemente con fines terapéuticos (amniorreducción).
Excepcionalmente se puede usar para introducir líquido (amnioinfusión) o drogas.
Las principales indicaciones diagnósticas incluyen riesgo aumentado para anomalías
de cromosomas, para enfermedades mendelianas, o para defectos de cierre del tubo
neural, y la evaluación del grado de anemia fetal, infecciones fetales y de la madurez
pulmonar fetal. La evaluación del grado de anemia fetal se hace mediante la
espectrometría de líquido amniótico en casos de isoinmunización materna por Rh u
otros antígenos eritrocitarios fetales. La amniocentesis puede servir para confirmar una
corioamnionitis mediante la técnica de Gram. Ante la sospecha de una infección fetal
con posibles efectos teratogénicos la extracción de líquido amniótico permite detectar
la presencia de un agente infeccioso mediante cultivo o con la técnica molecular de
PCR. Ante una posible finalización anticipada del embarazo por compromiso de la
salud materna y fetal, la evaluación de la madurez pulmonar fetal puede hacerse
mediante la medición del cociente lecitina: esfingomielina, el dosaje de fosfatidilglicerol
y el recuento de cuerpos lamelares.
La tasa de complicaciones de la amniocentesis es baja. La principal complicación es la
pérdida del embarazo, probablemente cercana al 0,5%. Otras complicaciones menos
frecuentes incluyen la pérdida transitoria de líquido amniótico y la corioamnionitis. Las
pacientes Rh negativas no sensibilizadas deben aplicarse una dosis de gamma-
globulina dentro de las 72 hs posteriores a la punción para evitar la sensibilización
materna.
1.3.2.2 Aspiración de vellosidades coriónicas o biopsia de placenta
La biopsia o aspiración de vellosidades coriónicas es el procedimiento de elección
para el diagnóstico prenatal de trastornos genéticos durante el primer trimestre.
Inicialmente la toma de la muestra se realizó por vía transvaginal, técnica que ha sido
reemplazada paulatinamente desde la década de los noventa por la punción
transabdominal
La principal indicación de la biopsia de vellosidades coriónicas es el embarazo con
riesgo aumentado para anomalías de cromosomas o para anomalías génicas, similar a
las indicaciones de la amniocentesis. El procedimiento puede realizarse a partir de las
11 semanas de amenorrea y extenderse hasta avanzado el tercer trimestre.
Los riesgos del procedimiento son similares a los de la amniocentesis, con una tasa de
pérdidas de embarazo del 0,5-1 %. Las pacientes Rh negativas no sensibilizadas
deben recibir una dosis de gamma-globulina luego del procedimiento. Debido a una
potencial asociación entre defectos de transversos de miembros, la aspiración de
vellosidades coriónicas no debe realizarse en edades gestacionales menores a 10
semanas.
1.3.2.3 CordocentesisLa extracción de sangre directamente de la vena umbilical tiene como principal
indicación la medición directa de la hemoglobina y el hematocrito fetal en fetos con
sospecha de anemia fetal severa en los embarazos con isoinmunización Rh. En los
trastornos plaquetarios fetales el análisis de la sangre fetal puede ser útil para la
evaluación plaquetaria en cuanto a su cantidad y funcionalidad, como por ejemplo en
la púrpura trombocitopénica autoinmune (PTI) y en la púrpura trombótica alloinmune.
En casos de sospecha de infección fetal por toxoplasmosis, CMV o rubéola, en sangre
fetal puede aislarse directamente el agente infeccioso (toxoplasmosis) o buscar
anticuerpos IgM específicos. La mayoría de estas indicaciones han sido reemplazadas
en la actualidad por estudios moleculares en líquido amniótico.
Además de las indicaciones diagnósticas, la cordocentesis tiene claras indicaciones
terapéuticas, como la transfusión sanguínea intrauterina en los fetos con anemia
severa. También se usa para la administración de drogas como fentanilo y vecuronio
para lograr analgesia y parálisis fetal antes de procedimientos terapéuticos
intrauterinos, como transfusiones, toracocentesis, pericardiocentesis, colocación de
catéteres de derivación pleuroamniótico o vesicoamniótico, etc.
La cordocentesis puede realizarse en forma confiable a partir de las 18 semanas. El
riesgo de pérdidas fetales asociado a la cordocentesis varía ampliamente de acuerdo
a la indicación del estudio. Por ejemplo, el riesgo es mayor si la indicación del estudio
es por anomalías fetales severas o hidrops fetal. Se estima que para operadores
entrenados las pérdidas fetales atribuibles a la punción serían de alrededor de 1 a 2%.
1.3.2.4 Otros procedimientos diagnósticos prenatales
De acuerdo a la situación clínica, puede ser necesario tomar muestras de distintos
tejidos (por ejemplo, músculo, piel e hígado) o de distintas cavidades o
compartimientos (por ejemplo, ascitis, árbol urinario, quiste de ovario, hidrotórax,
derrame pericárdico, lesiones quísticas pulmonares y abdominales, higroma quístico)
tanto con fines diagnósticos o terapéuticos. Los riesgos de estos procedimientos son
en general similares a los referidos para cordocentesis, siendo mayores en casos de
anomalías fetales severas, retardo de crecimiento e hidrops fetal.
2 – RESULTADOS CITOGENÉTICOS EN DIAGNÓSTICO PRENATAL
La citogenética clínica es el estudio de los cromosomas, su estructura, y su modo de
herencia, aplicada a la práctica de la genética médica. Las anomalías cromosómicas
se observan en aproximadamente el 1 % de los recién nacidos (Tabla 9), en más del
50 % de los abortos de primer trimestre y en el 6 % de las muertes intrauterinas.
Además, son la causa de un gran porcentaje de malformaciones congénitas y retraso
madurativo en la infancia.
Tabla 9: Anomalías cromosómicas en recién nacidos
Anomalía cromosómica Frecuencia en recién nacidosTranslocación balanceada
Translocación no balanceada
Trisomía 21
Trisomía 18
Trisomía 13
47,XXY
47,XYY
47,XXX
45,X
1 en 500
1 en 2000
1 en 700
1 en 3000
1 en 5000
1 en 1000 varones
1 en 1000 varones
1 en 1000 mujeres
1 en 3000 mujeres
2.1 - CARIOTIPO
El estudio “gold standard” de la citogenética prenatal es el cariotipo de bandeo G
(Figura 2).
Figura 2: Cariotipo euploide masculino: 46,XY
Para realizar un cariotipo la célula debe estar en división celular. Por lo tanto, se
puede usar cualquier tejido que tenga células nucleadas que sean capaces de crecer y
dividirse en cultivo.
2.1.1 Cariotipo prenatal en vellosidades coriónicas
Las vellosidades coriónicas están compuestas por una capa externa de células
trofobláticas (citotrofoblasto), que se dividen espontáneamente, y una capa interna de
células mesenquimáticas que forman el core mesodérmico (Figura 3).
Figura 3: Componentes celulares de una vellosidad coriónica
A partir del cultivo de una muestra de vellosidades se pueden obtener tres resultados
distintos::
- DIRECTO de células trofoblásticas
- CULTIVO: Corto plazo: de células trofoblásticas. Como se dividen
espontáneamente, se obtiene un número de
células adecuado para el análisis en menos
tiempo que el largo plazo.
Largo plazo: de células mesenquimáticas.
La constitución cromosómica de las células mesenquimáticas es más representativa
del cariotipo fetal que el de las células trofoblásticas, porque las primeras tienen un
origen embriológico más cercano a las células del macizo celular interno que va a dar
origen al embrión. En la tabla 10 pueden observarse las principales características del
estudio directo y de los cultivos a corto y largo plazo a partir de una muestra de
vellosidades coriónicas.
Tabla 10: Características del estudio en vellosidades coriónicas.
Tiempo del resultado
Tipo de células
ResoluciónContaminación
maternaMosaicismo
Directo 48 hs. citotrofoblasto + + muy baja
Cultivo a corto plazo
7-10 días citotrofoblasto ++ + +++
Cultivo a largo plazo
15-20 días mesénquima +++ +++ +
2.1.2 Cariotipo prenatal en líquido amniótico
La muestra obtenida por amniocentesis también se cultiva, con un tiempo entre la
obtención de la muestra y la entrega del resultado de aproximadamente 3 semanas. El
líquido amniótico obtenido posee una mezcla de células amnióticas y células
descamadas de la piel del feto, y en menor proporción del sistema gastrointestinal y
respiratorio fetal. Estas células reflejan estrechamente la constitución cromosómica del
feto y por lo tanto el cultivo de células de líquido amniótico es de gran utilidad para
aclarar el grado de compromiso fetal ante la presencia de un mosaicismo obtenido en
vellosidades coriónicas.
2.3 – CERTEZA DEL DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO PRENATAL
El cariotipo fetal a partir de una muestra de vellosidades coriónicas o de líquido
amniótico tiene una certeza superior al 99,5 %. El principal problema que puede surgir
en este contexto de un resultado citogenético prenatal es que el resultado del cariotipo
no refleje la constitución cromosómica real del feto. En consecuencia la información
que se le brindará a los padres en cuanto a diagnóstico y pronóstico será incorrecta. El
resultado citogenético prenatal lo podemos agrupar en cariotipo NORMAL, cariotipo
ANORMAL, o cariotipo de SIGNIFICADO INCIERTO. La certeza del estudio va a
depender en primer lugar de la experiencia del citogenetista y del laboratorio, y en
segundo lugar del tipo de muestra evaluada.
2.3.1 Resultado normal Si el resultado citogenético prenatal es normal significa que el cariotipo fetal es
euploide sin anomalías estructurales, con complemento cromosómico sexual normal:
46, XX ó 46,XY. La certeza en vellosidades coriónicas depende del tipo de cultivo. Si
se realizó cultivo de corto y largo plazo, y ambos fueron informados como normales, la
probabilidad descripta de que el feto tenga una anomalía de cromosomas es inferior al
0,08 %. Si sólo se realizó cultivo de corto plazo, la probabilidad de discrepancia es
mayor, de alrededor de 0,4 %.
Las razones por las que se explica un resultado “falso negativo” (cariotipo normal en
vellosidades coriónicas y anormal en el feto) pueden ser variadas: mosaicismo de bajo
grado en la placenta con línea celular única anormal en el feto; fenómeno de no
disyunción mitótica en una célula del macizo celular interno (a partir del cual se forma
el embrión); contaminación de la muestra con células maternas y por lo tanto, análisis
de células maternas y no fetales; fenómeno del “gemelo evanescente”, donde se
obtiene material de un lugar de la placenta que habría correspondido a otro embrión
producto de un embarazo dicigota que se detuvo muy temprano. La recomendación
actual internacional para el manejo de muestras de vellosidades coriónicas es realizar
siempre cultivo de corto y largo plazo.
Si la muestra es de líquido amniótico, la posibilidad de un resultado “falso negativo” a
partir de una muestra de líquido amniótico es muy baja, de alrededor de 0,02 %.
2.3.2 Resultado anormal Si el resultado citogenético prenatal es anormal significa que el cariotipo fetal tiene una
anomalía cromosómica numérica (trisomía, monosomía poliploidía, polisomía), o una
anomalía cromosómica estructural (deleción, duplicación, translocación, etc.).
En general, las discrepancias en este sentido involucran un mosaicismo en la muestra
prenatal con una línea celular anormal y otra línea celular euploide, siendo el feto
normal, situación que se denomina mosaicismo confinado a la placenta (MCP). El
MCP se observa en el 1% de las muestras de vellosidades, y en el 0,2% de las
muestras de líquido amniótico. Menos frecuentemente se observa una línea única
anormal en la muestra prenatal y línea única normal en el feto. Para vellosidades
coriónicas se describe una frecuencia de 0,2 % en cultivo de corto plazo, y 0,06 % en
cultivo de largo plazo.
Frente a un resultado citogenético prenatal, sea éste normal o anormal, es importante
considerar una serie de variables, que van a aportar información adicional para ayudar
a determinar si el cariotipo prenatal es representativo del cariotipo fetal. Se deben
tener en cuenta:
Tipo de muestra analizada: Vellosidades coriónicas con cultivo de corto y/o
largo plazo; o líquido amniótico.
Edad gestacional al momento del estudio invasivo, o durante la
reevaluación ecográfica.
Tipo de anomalía y cromosoma involucrado.
Hallazgos ecográficos.
Motivo del estudio: Screening positivo, hijo previo afectado, rearreglos
cromosómicos parentales.
Debido a la alta letalidad intraútero de las anomalías de cromosomas, la prevalencia
de las mismas disminuye con la edad gestacional. En consecuencia algunos defectos
raros de observar al nacimiento, como triploidías o trisomías, no son infrecuentes
durante el primer trimestre de embarazo. La mayoría de las trisomías completas
autosómicas y virtualmente todas las monosomías autosómicas finalizan en las
primeras semanas de embarazo en forma de aborto espontáneo. Unas pocas
trisomías autosómicas no son necesariamente letales intraútero y progresan más allá
del segundo y tercer trimestre. Al nacimiento se observan sólo las trisomías
autosómicas 21, 18 y 13; la monosomía del X; las polisomías XXX, XXY, XYY, XXXX;
y excepcionalmente la trisomía 22. El resto de las trisomías se pueden observar sólo
en forma de mosaico. Las triploidías y tetraploidías raramente se progresan en el
segundo trimestre con actividad cardíaca.
Así mismo, es importante correlacionar un resultado prenatal con los hallazgos
ecográficos, ya que hay ciertas anomalías de cromosomas que producen fenotipos
conocidos que se pueden manifestar en el período prenatal (Tabla 11).
Tabla 11: Fenotipos asociados a anomalías de cromosomas
Trisomía 21 Trisomía 18 Trisomía 13 Triploidía
Braquicefalia
Ventriculomegalia
Edema nucal Defectos
atrio-ventriculares
Cabeza en forma de
frutilla
Quistes de plexos
coroideos
Agenesia de cuerpo
Holoprosencefalia
Mielomeningocele
Microcefalia
Defectos cardíacos
Placenta molar
RCIU severo y
asimétrico
Ventriculomegalia
Atresia duodenal
Intestino ecogénico
Pielectasia leve
Fémur corto Húmero
corto
Signo sandálico
Clinodactilia
Derrames serosos
calloso
Cisterna magna
ensanchada
Fisura labial
Micrognatia
Edema de nuca
Defectos cardíacos
Hernia diafragmática
Atresia esofágica
Onfalocele
Defectos renales
Mielomeningocele
RCIU
Acortamiento de
miembros
Aplasia radial
Dedos superpuestos
Pie bot
Defectos renales
Onfalocele
Polidactilia post-axial
RCIU
Defectos cardíacos
Mielomeningocele
Poli-sindactilia de
manos y pies
Las anomalías de los cromosomas sexuales tienen un efecto menos deletéreo en el
fenotipo, y salvo la monosomía del X, no presentan manifestaciones prenatales
características ni mayor frecuencia de aborto.
En cuanto a las anomalías estructurales detectadas en una muestra de diagnóstico
prenatal, es importante, en principio, determinar si la anomalía es heredada de los
progenitores o se presenta por primera vez en el embarazo (anomalía “de novo”).
También se debe evaluar si el rearreglo es balanceado o desbalanceado, ya que,
generalmente, las anomalías desbalanceadas van a manifestar anomalías en el
fenotipo. En algunos casos producen malformaciones estructurales que se pueden
detectar por ecografía.
Frente a un resultado citogenético prenatal estructural “de novo” informado como
aparentemente balanceado, se debe asesorar a los padres de que existe un riesgo
empírico residual de defectos congénitos de alrededor de 5 a 6 %, ante la posibilidad
de que se trate de una anomalía desbalanceada no detectada. Por otra parte, en las
anomalías “de novo” realmente balanceadas también existe un riesgo residual de que
el recién nacido presente una anomalía, debido a disrupción de algún gen localizado
en el punto de ruptura del segmento cromosómico afectado, o debido a una alteración
en la función del gen porque la nueva localización se encuentre alejada de su sitio
original.
2.3.3 Resultado de significado inciertoSe denominan resultados inciertos a aquellos en donde se necesitan más estudios
para definir el cariotipo fetal y realizar un asesoramineto más preciso. Los dos
resultados de origen incierto más relevantes son el mosaicismo y los cromosomas
marcadores. De acuerdo al caso en particular se complementará con estudio de
líquido amniótico, cariotipo a los padres, estudios moleculares, o más raramente
cordocentesis.
2.3.3.1 Mosaicismo
El mosaicimo es la presencia de dos o más líneas celulares con distinta constitución
cromosómica. En el contexto del diagnóstico prenatal de anomalías citogenéticas,
existen tres tipos de mosaicismos:
Pseudomosaicismo: producto del cultivo celular in vitro, es un artefacto de
laboratorio.
Mosaicismo confinado a la placenta (MCP), o más raramente, el
mosaicismo confinado al líquido amniótico, o líquido amniótico y placenta.
Mosaicismo constitucional
Para interpretar la presencia de un mosaicismo en un estudio prenatal hay que tener
en cuenta el origen embrionario de las células estudiadas (Figura 4).
Figura 4: origen embrionario del material obtenido para diagnóstico prenatal
Por lo tanto, cuando se realiza una amniocentesis, se toma una muestra de células
que tienen su origen cercano al del embrión, es por eso que es altamente probable
que tengan la misma constitución cromosómica. La punción de vellosidades coriónicas
toma una muestra de células más distantes desde el punto de vista embriológico
2.3.3.1.1Mosaicismo confinado a la placenta (MCP): Existe una línea celular anormal,
ya sea con una aneuploidía o con una anomalía estructural, junto con una línea celular
euploide. La línea celular con anomalía de cromosomas existe sólo en los tejidos
extraembrionarios (placenta, amnios), siendo el feto euploide. Esta situación es más
frecuente en placenta (1 %) que en líquido amniótico (0,2 %).
El MCP en la mayoría de los casos no refleja el cariotipo fetal. El MCP tiene dos
orígenes posibles: un error mitótico en una célula del trofoblasto en una concepción
inicialmente euploide, que lleva a la aparición de una línea celular anormal en una
porción de la placenta (Figura 5), o una concepción inicialmente aneuploide,
típicamente debido a un error meiótico, con un evento mitótico subsiguiente que
genera una línea celular normal por “rescate” (Figura 6). La distribución de las líneas
celulares normales y anormales en el feto y la placenta depende del momento y del
lugar del evento mitótico.
Figura 5: Mosaicismo confinado a la placenta por error mitótico postcigótico
Figura 6: Mosaicismo confinado a la placenta por error meiótico y rescate trisómico
2.3.3.1.2 Mosaicismo constitucional: Es un mosaicismo infrecuente pero real en el feto.
El fenotipo va a depender de la distribución tisular de las líneas celulares normal y
anormal, y de la proporción de las mismas en los distintos tejidos (Figura 6)
Figura 6: Mosaicismo constitucional 45,X/46,XX
Frente a un resultado citogenético prenatal en vellosidades coriónicas con un
mosaicismo, lo que urge es hacer la distinción entre MCP y mosaicismo constitucional
fetal. Para ello, en primera instancia, se debe realizar una amniocentesis, y si el
cariotipo en líquido amniótico es normal se infiere que el mosaicismo es confinado a la
placenta, es decir, que la aneuploidía no involucra tejidos fetales.
Por otra parte, la probabilidad de que el resultado en vellosidades coriónicas
represente una aneuploidía en el feto depende del cromosoma involucrado y de los
hallazgos ecográficos: es más probable que se trate de MCP si involucra una trisomía
de un cromosoma no viable con ecografía normal, que si involucra los cromosomas
21, 13, 18, con una ecografía anormal.
Cuando se diagnostica un MCP, si bien la aneuploidía no está presente en el feto,
existen dos potenciales complicaciones. Por un lado existe mayor riesgo de
complicaciones por disfunción placentaria. Aparentemente, un embarazo con una
placenta trisómica tiene mayor riesgo de restricción de crecimiento intrauterino y
muerte intrauterina. El mecanismo es desconocido. Este mecanismo estaría limitado a
determinados cromosomas (Ej.: cromosomas 14, 16, 20, 22), y a la fracción de la
placenta con trisomía. Algunos autores sugieren que si el origen del MCP tiene un
origen meiótico el riesgo es mayor (Ej. mosaico de trisomías 15, 16, 22 tienen con
mayor frecuencia origen meiótico; 3 y 7, mitótico; 2 ambos orígenes).
La otra potencial complicación del MCP está relacionada con la disomía uniparental.
Esto sucede cuando un cigoto inicialmente trisómico para un cromosoma (con 2 copias
de un progenitor y una copia del otro) corrige la trisomía tempranamente en las
subsiguientes divisiones mitóticas, con la pérdida de uno de los cromosomas extra. Si
en este proceso denominado rescate trisómico se pierde el cromosoma único aportado
por un progenitor, el embrión se queda con dos cromosomas del mismo padre,
fenómeno denominado disomía uniparental (ambos miembros de un par de
cromosomas homólogos provienen del mismo progenitor). Si bien para la mayoría de
los genes es indistinto el progenitor de origen, para otros genes que tienen imprinting
no lo es. El imprinting de un gen o “marca epigenética”, es metafóricamente una
etiqueta que reciben determinados genes al ser transmitidos de padres a hijos. Esta
etiqueta se coloca en el gen que se hereda de un progenitor pero no del otro.
Determinados genes reciben esta etiqueta genómica en el cromosoma de origen
materno, y otros en el cromosoma de origen paterno. Y es este imprinting el que
determina si el gen va a estar activo o no. El principal mecanismo de imprinting es la
metilación de los genes. Si un segmento de un cromosoma tiene imprinting quiere
decir que está silenciado, mientras que el segmento que no lo tiene está activo. Por lo
tanto, algunos genes sólo están activos en el cromosoma de origen materno, e
inactivos en el paterno, y viceversa, dependiendo del imprinting que recibieron. Se
denomina efecto del “padre de origen”..
En una situación normal, donde la herencia de cada cromosoma de un par es de cada
progenitor, los segmentos o loci con imprinting funcionan con una sola copia activa.
Pero si ambos segmentos de un cromosoma se originan del mismo progenitor
(disomía uniparental), habrá expresión doble o ninguna expresión de ese segmento,
dependiendo del progenitor de origen. Por el contrario, si un cromosoma no tiene
imprinting, la disomía uniparental no causa anomalías por sí misma. Los cromosomas
sujetos a imprinting son: 6, 7, 11, 14, 15, 16 y 20 (Tabla 13) Parecería, hasta el
momento, que los otros cromosomas no tienen genes con imprinting.
Por lo tanto, cuando se diagnostica MCP de los cromosomas mencionados, se podría
ofrecer estudio molecular prenatal para evaluar la posibilidad de disomía uniparental.
Tabla 13: Síndromes asociados a disomía uniparental
Cromosoma y tipo de imprinting Síndrome
6 paterno Diabetes mellitus neonatal
7 materno Russel-Silver
11 paterno Beckwith-Wiedeman
11 materno Russel-Silver
14 materno RCIU, retraso madurativo leve
14 paterno RCIU, retraso madurativo, tórax en campana
15 paterno Angelman
15 materno Prader-Willy
16 materno RCIU
En conclusión, frente al diagnóstico de mosaicismo en vellosidades coriónicas, lo más
probable es que el feto sea euploide y el curso del embarazo normal. La posibilidad de
complicaciones se debe a: 1) que el feto sea aneuploide; 2) que exista un MCP con
disfunción placentaria y mayor riesgo de RCIU y muerte intrauterina; 3) que exista un
MCP con disomía uniparental con efecto deletéreo cuando determinados cromosomas
están involucrados.
2.3.3.2 Cromosomas pequeños supernumerarios o marcadores
Los cromosomas pequeños supernumerarios, tradicionalmente llamados cromosomas
marcadores, son cromosomas que no pueden ser caracterizados o identificados por
completo con técnicas de citogenética convencional. Tienen una estructura anormal,
de origen incierto, y de un tamaño similar o inferior al cromosoma 20. Se observa una
prevalencia de 0,8 a 1,5 cada 1000 estudios prenatales, y aproximadamente de 0,06
% en la población general. Es frecuente que se encuentren en estado de mosaico. Un
gran porcentaje derivan de brazos cortos de cromosomas acrocéntricos: 13, 14, 15,
21, 22. Pueden ser heredados o aparecer por primera vez en el embarazo (“de novo”).
El impacto en el fenotipo dependerá del cromosoma de origen, y si contienen o no
eucromatina. Algunos cromosomas supernumerarios no producen anomalías en el
fenotipo ya que contienen sólo heterocromatina, y por lo tanto, no poseen genes. Para
un asesoramiento adecuado, en primer lugar, se debe tratar de determinar si el
marcador es heredado, el cromosoma de origen y contenido.
Si el marcador es heredado de un progenitor sano, se asume que el riesgo de
anomalía en el fenotipo fetal es bajo. Si el marcador es “de novo” es necesario la
caracterización precisa del cromosoma supernumerario utilizando otras técnicas
citogenéticas, FISH o array CGH. En estos casos el riesgo empírico de
malformaciones congénitas descripto es de 10 a 15 %. Si el feto presenta anomalías
ecográficas, el riesgo es mayor.
2.4 – LIMITACIONES DEL DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO PRENATAL
Las principales limitaciones del cariotipo convencional están relacionadas con el
tiempo hasta obtener el resultado, con la posibilidad de fracaso del estudio, con la
posibilidad de contaminación con células maternas, y con la resolución del estudio.
2.4.1 TiempoEl tiempo necesario para obtener un resultado está principalmente determinado por la
necesidad de obtener un cultivo celular a partir de la muestra. Se calcula alrededor de
7 a 10 días para vellosidades coriónicas, y de 15 a 21 días para líquido amniótico. A
partir del momento que se logra el cultivo, se realiza el bandeo y se analizan las
metafases. Es un estudio que va a depender también de la disponibilidad de un
citogenetista con experiencia para el análisis.
2.4.2 Fracaso del cultivoExiste la posibilidad de que las células no crezcan en cultivo, o crezcan en forma
insuficiente para el análisis. El fracaso del cultivo es extremadamente raro, inferior al
0,1%. Las causas principales son: contaminación bacteriana de la muestra o del
medio, mala calidad del cultivo, muestra inadecuada en cantidad, o una falla en la
incubación.
2.4.3 Contaminación del cultivo con células maternasUn problema importante es analizar células maternas en lugar de analizar células
fetales, por contaminación de la muestra con células maternas. En la punción de
vellosidades coriónicas se puede producir la contaminación con células maternas
provenientes de la decidua; y en la amniocentesis por sangre materna y rara vez por
fibroblastos maternos. En la práctica clínica esta complicación es muy poco frecuente
y se puede minimizar descartando los primeros mililitros de líquido amniótico en la
amniocentesis; y en la punción de vellosidades coriónicas, tomando una muestra en
cantidad adecuada, separando las vellosidades de la decidua con el microscopio, y
fundamentalmente que estas maniobras se realicen en un laboratorio con experiencia.
2.4.4 ResoluciónEsta es la principal limitación del cariotipo, que como hemos dicho detecta rearreglos
de segmentos en el orden de las 5 Mb o de mayor tamaño, mucho menor que la
mayoría de las técnicas moleculares disponibles en la actualidad.
3 - ESTUDIOS MOLECULARES EN DIAGNÓSTICO PRENATAL
Si bien el cariotipo convencional sigue siendo la técnica de elección para evaluar
anomalías cromosómicas en diagnóstico prenatal, las limitaciones descriptas,
principalmente en tiempo y resolución, han llevado al desarrollo de técnicas
moleculares, disponibles en la práctica clínica, que superaron algunas de estas
limitaciones. Estas técnicas son: FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), MLPA
(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification), QF-PCR (Quantitative Fluorescent
Polymerase Chain Reaction), Array. No necesitan cultivo celular lo cual disminuye el
tiempo del estudio, tienen mayor nivel de resolución para detectar anomalías, y
algunas de estas técnicas permiten el manejo de gran cantidad de muestras a la vez.
Estas técnicas moleculares aplicadas a la evaluación de anomalías cromosómicas se
denominan en conjunto “citogenética molecular”. Cuando se utilizan para la evaluación
rápida de las aneuploidías más comunes, se las denominan en conjunto “métodos
rápidos de detección de aneuploidías” (RAD rapid aneuploidy detection). Permiten
tener un resultado en 24-48 hs y de esta forma mejorar el manejo clínico y/o disminuir
la ansiedad parental. El reciente desarrollo e implementación clínica del array ha
resultado en el cambio más rápido y significativo en el área de la citogenética desde el
desarrollo de las técnicas de bandeo en la década del setenta.
3.1 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization):
El FISH permite determinar la presencia o ausencia de una secuencia específica de
ADN, y utilizando sondas específicas de los cromosomas, evaluar tanto el identidad,
número y organización de los mismos (Figura 7).
Figura 7: a) FISH en interfase b) FISH en cromosomas en metafase
(Gentileza Dr. T. Matayoshi)
Para realizar FISH en muestras prenatales (vellosidades coriónicas o líquido
amniótico) no es necesario realizar cultivo celular, por lo que el resultado puede
obtenerse en 24 hs. Las sondas pueden aplicarse a núcleos en interfase (fuera del
ciclo de división celular), o a extendidos de cromosomas en metafase (cultivo celular).
Se recomienda evaluar 100 células para excluir mosaicismo superior al 10 -15 %
Las sondas pueden ser de distinto tipo de acuerdo a la indicación del estudio. Las
sondas centroméricas son complementarias al centrómero de algunos cromosomas
(Ejemplo: centroméricas específicas de los cromosomas 18, X e Y). Se las utiliza para
el diagnóstico de anomalías numéricas, y para identificar el origen de cromosomas
marcadores. Las sondas teloméricas son utilizadas para la evaluación de rearreglos
subteloméricos. Las sondas específicas de un locus se las utiliza para la evaluación de
anomalías cromosómicas (Ej.: Sondas de cromosoma 21 y 13), y para identificar
cambios submicroscópicos como deleciones, duplicaciones, translocaciones (Ejemplo:
Sonda 22q11). En este último caso, para elegir la sonda de un locus en particular debe
existir previamente sospecha diagnóstica de un síndrome basada en los antecedentes
familiares o los hallazgos ecográficos (véase síndromes de microdeleción en tabla 2)).
Se pueden utilizar múltiples sondas a la vez para “pintar” cromosomas enteros. A su
vez, con técnicas de imagen especializadas, es posible evaluar simultáneamente los
23 pares de cromosomas utilizando 24 colores distintos, por medio de un proceso
denominado SKY (spectral karyotyping) o M-FISH (multi-FISH) (Figura 8). Sin
embargo, debido a la complejidad y costo del estudio, se utiliza poco en diagnóstico
prenatal.
Figura 8: Técnica SKY de pintado de cromosomas
Las ventajas del FISH con respecto al cariotipo son el menor tiempo para obtener un
resultado (24-48 hs), y mayor resolución (1-5 Mb). Las desventajas de la técnica son
que, al igual que el cariotipo de bandeo G, necesita un citogenetista con experiencia,
es una técnica laboriosa, no se puede aplicar al manejo de gran número de muestras,
y el costo es muy alto. Si bien puede ser usada en diagnóstico prenatal de
microdeleciones y microduplicaciones en distintas situaciones, la limitación crítica del
FISH es que necesita orientación clínica previa para elegir la sonda apropiada.
En la práctica clínica prenatal, se aplica la técnica de FISH en las siguientes
situaciones clínicas:
Para diagnóstico rápido de aneuploidías.
Para aclarar dudas del cariotipo: evaluar el origen de cromosomas
marcadores, interpretar anomalías estructurales
Para diagnosticar microdeleciones-duplicaciones ante la sospecha de
síndromes causados por estas anomalías submicroscópicas.
El FISH como técnica RAD se utiliza en conjunto con el cariotipo convencional, para
tener el resultado en menor tiempo. En general, se ofrece en embarazos con alto
riesgo de anomalías cromosómicas, o a edades gestacionales avanzadas, para
modificar el manejo clínico o disminuir la ansiedad de los padres. Se utilizan sondas
dirigidas contra los cinco cromosomas responsables de más del 80% de las anomalías
cromosómicas en el período prenatal: 13, 18, 21, X e Y. La tasa de de detección para
anomalías de los cromosomas evaluados varía entre 98-99%, de acuerdo a los
estudios publicados. El 2-5% de los casos se consideran “no informativos” ya sea
porque el número de células es inadecuado, por falla en la hibridización o
contaminación con células maternas, con lo que se debe repetir el estudio. En la
mayoría de los casos el resultado del FISH es concordante con el resultado del
cariotipo, siendo la tasa publicada de falsos positivos inferior al 1%.
3.2 QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction):
La QF-PCR es una técnica molecular que puede ser usada para determinar el número
de copias de una secuencia de ADN que se quiere evaluar (Figura 9).
Figura 9: Resultado de QF-PCR de trisomía 21, utilizando un “kit” de 17 marcadores
polimórficos correspondientes a los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Se observan 3
secuencias correspondientes al cromosoma 21 con 3 picos cada una.
La QF-PCR aplicada al diagnóstico prenatal se utiliza para el diagnóstico rápido de las
aneuploidías más comunes. Se extrae ADN de células de vellosidades coriónicas o
líquido amniótico (no es necesario el cultivo celular, aunque también se puede extraer
ADN de muestras cultivadas). En la actualidad existen “kits” comerciales que ofrecen
un conjunto de primers para loci polimórficos, para diagnóstico de trisomía 21, 13, 18,
aneuploidías de los cromosomas sexuales, y triploidía. El resultado se obtiene en
menos de 24 hs desde que se extrae la muestra, y se pueden procesar varias
muestras simultáneamente, lo que disminuye el costo del estudio. La certeza del test
para el diagnóstico de las aneuploidías de los cromosomas evaluados es similar al
FISH y cariotipo de bandeo G, con una tasa de detección de 99-99,3% y una
especificidad del 99%. En el 0,8 % de los estudios no se obtiene resultado. Luego de
un resultado normal de QF-PCR, se calcula que el riesgo de una anomalía
cromosómica clínicamente significativa es de 0,4 %.
Se han publicado discrepancias entre el resultado de QF-PCR para los cromosomas
evaluados, y del cariotipo convencional. Generalmente la discrepancia ocurre cuando
un test informa una trisomía y el otro un mosaicismo. Estas diferencias dependen
principalmente del tipo de muestra analizada: líquido amniótico versus vellosidades
coriónicas, células no cultivadas versus cultivadas. En relación a muestras de líquido
amniótico, no han sido descriptas discrepancias completas para trisomías
autosómicas, sólo para cromosomas sexuales (XX en QF-PCR, X/XXX en cariotipo).
Por el contrario, en las muestras de vellosidades coriónicas es más frecuente observar
diferencias en el resultado entre técnicas debido a mosaicismos placentario. La
incidencia varía ampliamente entre distintos centros, y se supone que depende de la
calidad de la muestra, de la estrategia en el procesamiento del material, y de la
experiencia en la interpretación de los resultados. Mientras que existen centros que
publican discrepancias completas entre QF-PCR y cariotipo en 1 cada 800 estudios,
otros centros presentan diferencias mucho menores, en 1 cada 10.000 estudios.
Una de los principales beneficios de QF-PCR es el menor tiempo para obtener un
resultado, con una sensibilidad y especificidad para las anomalías evaluadas similar al
cariotipo. Como ventajas, comparada con el cariotipo y FISH, QF-PCR tiene menor
costo, puede procesar muestras simultáneamente en forma automatizada, permite
diagnosticar molas completas (debido a la utilización de alelos polimórficos), y detecta
mejor contaminación de la muestra con células maternas (10%). Al igual que con las
otras dos técnicas, es posible diagnosticar mosaicismos superiores al 15% y
triploidías. Como desventaja, no detecta las anomalías cromosómicas no evaluadas,
ni anomalías estructurales balanceadas.
En la actualidad, en varios países de Europa se utiliza como estudio inicial en todas
las muestras de diagnóstico prenatal invasivo, o como alternativa al cariotipo. En
Inglaterra, por ejemplo, se realiza QF-PCR, y si el resultado es normal, sólo se utiliza
el cariotipo de bandeo G ante la sospecha de otras anomalías cromosómicas (ya sea
por lo hallazgos ecográficos o antecedentes familiares). Con esta estrategia
escalonada se detectan más del 99 % de las anomalías cromosómicas mayores, se
evitan resultados de significado incierto o ambiguo del cariotipo de bandeo G (0,15 %),
con un riesgo residual de 0,07-0,08% de anomalías clínicamente significativas.
3.3 MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification):
El MLPA es una técnica molecular basada en PCR que amplifica y cuantifica
secuencias específicas de ADN (secuencias “target”). Determina cambios en el
número de copias de hasta 45 secuencias de ADN a la vez en una misma muestra.
Tiene mayor resolución que el cariotipo convencional y el FISH, ya que puede
discriminar secuencias que difieren en un solo nucleótido; obteniendo el resultado en
24-48hs. Esta técnica molecular requiere muy poca cantidad de ADN (20 – 500 ng), es
más sencilla que QF-PCR, permite el manejo automatizado de las muestras, y puede
procesar hasta 96 muestras por ciclo. Puede utilizar ADN parcialmente degradado,
como el que se obtiene de muestras en parafina o formol.
El MLPA en diagnóstico prenatal se utiliza para el diagnóstico rápido de aneuploidías.
También se han desarrollado “kits” con sondas para la evaluación de secuencias
subteloméricas, centroméricas, y regiones involucradas en síndromes de
microdeleción y microduplicación. Los cambios en el número de copias de secuencias
subteloméricas pueden sugerir la presencia de translocaciones desbalanceadas,
cuando se observa pérdida de una región subtelomérica de un cromosoma, y ganancia
en otro. Así mismo, las sondas teloméricas y centroméricas son útiles en la evaluación
de cromosomas marcadores. En casos de enfermedades monogénicas, se puede
utilizar MLPA si se conoce la mutación familiar.
El MLPA como técnica RAD tiene una sensibilidad cercana al 100% y una
especificidad de 99,8% para las aneuploidías no mosaico evaluadas. Dentro de las
desventajas descriptas, no detecta todos los casos de triploidías, no diagnostica
anomalías estructurales balanceadas, y no diferencia contaminación con células
maternas. Con respecto al mosaicismo, todavía no se sabe realmente cuál es la
capacidad diagnóstica del MLPA, pero algunos estudios describen que puede detectar
mosaicismos superiores al 20-30%. Se ha descripto una discordancia entre resultados
del MLPA y cariotipo de bandeo G de alrededor del 0,6% de anomalías detectadas por
el cariotipo, distintas a las aneuploidías numéricas de los cromosomas evaluados.
3.4 ARRAY CITOGENÉTICO
El array citogenético o cromosómico (o microarray) es una técnica molecular que
aplicada al diagnóstico prenatal permite evaluar en una muestra de ADN fetal la
ausencia o duplicación de regiones de ADN. Estas variaciones en la cantidad de ADN
se denominan CNV (copy number variants o variación en el número de copias). Las
CNV son regiones del ADN generalmente superiores a 1 Kb (1000 pb) que están
presentes en un número de copias anormal en comparación con un genoma de
referencia.
Esta técnica supera algunas de las limitaciones del cariotipo, como son el tiempo y la
resolución de la citogenética convencional, y es capaz de evaluar prácticamente todo
el genoma. Detecta anomalías de 150 Kb, pero podría detectar, según el diseño,
variaciones en secuencias de 20 a 50 Kb, o sea, tiene una resolución 100 veces mayor
que el cariotipo, y el resultado está disponible en 48 a 72 hs, ya que no necesita
invariablemente cultivo celular. El ADN se puede extraer de la muestra sin procesar, o
de cultivo.
3.4.1 Tipos de arrayExisten distintos tipos de array. Los que se usan en diagnóstico prenatal son los arrays
genómicos, que a su vez se subdividen en dos clases de acuerdo a la técnica que
usan para evaluar el ADN: array-CGH (array comparative genome hybridization) y
SNP-array (single nucleotide polymorphism array). En la actualidad, también existen
arrays que combinan ambos tipos en una sola plataforma.
3.4.1.1 Array-CGH
En el array-CGH se compara la cantidad de ADN normal (control) de secuencias
conocidas contra el ADN de la muestra que se quiere analizar. Un programa de
computación analiza si en la muestra existe exceso de ADN en determinada/s
secuencia/s o si existe déficit (deleción) en relación al ADN control (Figura 10)
Figura 10: Trisomía 21 diagnosticada por Array-CGH. Se observa un exceso de ADN
del paciente en las secuencias correspondientes a regiones del cromosoma 21,
comparadas contra el ADN normal
El array-CGH se puede construir utilizando secuencias originadas en clones
bacterianos: son los BAC- arrays, o secuencias cortas, los oligonucleótidos:
BAC-array (bacterial artificial chromosome): con secuencias entre 150 a 170 kb
Oligoarray : con secuencias de oligonucleótidos tan pequeñas como de 20 a 50 pb
A su vez, la cantidad de secuencias se determina de acuerdo a los segmentos del
genoma que se quiere investigar. Existen dos diseños:
Targeted array : diseñados para detectar partes del genoma asociadas a síndromes
conocidos o genes asociados a patología. Va a incluir sólo la cantidad de
patologías que se quiera evaluar. Por lo tanto, va a detectar la mayoría de las CNV
clínicamente significativas, disminuyendo resultados de significado incierto. El
riesgo es no detectar secuencias asociadas a patologías no evaluadas por el array.
Necesita actualización a medida que se descubren síndromes nuevos.
Whole genome array : evalúa prácticamente todo el genoma. Puede incluir millones
de secuencias. Detecta mayor cantidad de CNV asociadas a patología (mayor
resolución), pero también mayor porcentaje de resultados de significado incierto.
Una de las ventajas es que no se necesita agregarle secuencias para actualizarlo.
Las CNVs se clasifican en tres grupos: benignas, patogénicas, o de significado
incierto. Algunos laboratorios subdividen a las benignas en normales y benignas. La
interpretación del significado de las CNV se basa fundamentalmente en la experiencia
de casos postnatales.
Benignas : Se ha detectado en cantidades iguales en pacientes y controles.
Corresponde al 0,4 % del origen de la variación genética
Patogénicas: Contiene genes asociados a patología
Contiene genes sensibles a la dosis
CNV asociadas a síndromes de microdeleción/ duplicación CNV asociadas a síndromes de anomalías de cromosomas
De significado incierto: Hasta el momento no se ha determinado su valor
o la información es insuficiente para sacar
conclusiones válidas
Algunos laboratorios sugieren no informar las CNVs de significado incierto; otros
laboratorios interrogan a la pareja sobre su deseo de obtener este tipo de información.
El asesoramiento predictivo de la probabilidad de que una CNV sea patogénica y que
resulte en una anomalía en el fenotipo depende de algunas variables:
- Tamaño de la CNV
- Contenido de genes
- Revisión de la literatura
- Revisión de las bases de datos (UCSC, DECIPHER, ISCA, dbGAP,
EUCARUCA, Ensembl)
- Menos importante: ecografía, antecedentes familiares, herencia.
En general, si la CNV son superiores a 1 Mb de largo, involucran regiones con genes,
o si la CNV es “de novo” tiene mayor probabilidad de causar patología. En la mayoría
de los laboratorios, junto con la muestra de ADN fetal se solicita una muestra de
sangre para extracción de ADN de los padres, para descartar contaminación con
células maternas, y para interpretar si un hallazgo es heredado o no. Hoy en día se
sabe que la determinación de la herencia de una CNV no tiende a ser informativa en la
mayoría de los casos individuales debido a la posibilidad de expresividad variable y
penetrancia incompleta de ciertas CNVs. También es una práctica habitual almacenar
material para cultivo o realizar un cultivo paralelo, para confirmar cualquier CNV
detectada utilizando otra técnica como FISH, MLPA o array.
3.4.1.2 SNP-array
El SNP-array utiliza dos tipos de sondas: SNPs y secuencias no polimórficas (CNP:
non polymorphic copy number probes). Mediante esta técnica se puede evaluar si
existe hay pérdida o ganancia de material, por un lado, y detectar además regiones
con pérdida de la heterocigocidad (para diagnóstico de disomía uniparental, mola
completa y consanguinidad)
El método de array presenta una tasa de detección de anomalías citogenéticas
superior al cariotipo convencional. A su vez, como hemos dicho, la resolución es 100
veces mayor. En la mayoría de los estudios publicados el array detectó 3,6% mayor
cantidad de anomalías cromosómicas que el cariotipo convencional; con 1,1% de
CNVs de significado incierto. El cariotipo no detectó anomalías cromosómicas cuando
el array fue normal. Más aún, si la indicación para realizar el array era por
malformaciones ecográficas, la tasa de detección se incrementa aún más, en el orden
de 5,2%, con 1,9% de CNVs de significado incierto.
Hasta el momento, no hay un diseño de array ideal para diagnóstico prenatal. La
mayoría de los laboratorios usan array-CGH con oligonucleótidos, o una combinación
de SNP-array con oligonucleótidos. El número, tamaño y espaciado de las sondas,
tanto en las zonas con genes como en las zonas entre genes, determina el tamaño de
las CNVs que pueden ser detectadas y la tasa de detección de anomalías. El ideal
sería diseñar un array que equilibre la detección de la mayor cantidad de CNVs
patogénicas, minimizando las CNVs de significado incierto. Sería útil contar con más
de un tipo de plataforma, de acuerdo a la indicación del estudio. Por ejemplo, si la se
solicita el array por hallazgos ecográficos, existiría más chance de detectar una CNV y
por lo tanto, sería mejor elegir un array con alta densidad de sondas; en cambio, si la
indicación es edad materna o ansiedad parental, sería más apropiado elegir una
plataforma targeted o con menor densidad de sondas.
3.4.2 Ventajas del Array en diagnóstico prenatal en relación al cariotipo convencional:Los beneficios del array en diagnóstico prenatal son:
1. Diagnostica TODAS las anomalías cromosómicas no mosaico no balanceadas
que diagnostica el CARIOTIPO de bandeo G
2. Mayor resolución: Mayor tasa de detección de anomalías citogenéticas
3. Menor tiempo para obtener un resultado
4. Automatizado
3.4.3 Potenciales Indicaciones del Array:
En la evaluación genética postnatal de neonatos o niños con retraso madurativo,
malformaciones múltiples, o alguna manifestación del espectro del autismo, se usa el
array como primera herramienta diagnóstica.
En diagnóstico prenatal el array está transitando un camino hacia la práctica clínica.
Uno de los problemas en diagnóstico prenatal es que el fenotipo del feto es incompleto
o incierto. La literatura disponible sobre CNV y su impacto está basada en el
reconocimiento postnatal de un fenotipo anormal, quizás sesgado hacia el extremo
más severo de la patología. La recomendación del Colegio Americano de Ginecología
y Obstetricia y del Colegio Americano de Genética Médica es ofrecer el array en los
embarazos con anomalías ecográficas fetales y cariotipo normal, y frente a una muerte
fetal donde no es posible realizar cariotipo.
Las indicaciones del array en diagnóstico prenatal podrían ser:
La evaluación de un embarazo con una o múltiples anomalías ecográficas con
cariotipo normal, ya que el array aumenta la tasa de detección de anomalías.
Interpretación de resultados de significado incierto de un cariotipo convencional,
como por ejemplo frente al diagnóstico de cromosomas marcadores. En estos
casos ayuda a determinar el origen y contenido génico de los cromosomas
supernumerarios.
La evaluación de las translocaciones balanceadas “de novo” detectando o no
CNVs en el sitio de ruptura de los segmentos translocados, no diagnosticadas con
técnicas de menor resolución.
En los casos de muerte intrauterina, existe mayor probabilidad de obtener un
resultado citogenético con array ya que es una técnica que no necesita
invariablemente cultivo celular. Es sabido que en los casos de muerte intrauterina,
y principalmente si el feto tiene cierto grado de maceración, existe mayor riesgo de
fracaso del cultivo.
Análisis de ADN de muestras embebidas en parafina.
3.4.4 Limitaciones del array en diagnóstico prenatal Ningún diseño de array detecta anomalías estructurales balanceadas. Si bien esta
situación no es clínicamente relevante en diagnóstico prenatal ya que no va a
producir una anomalía en el fenotipo, sí es importante para el asesoramiento de
generaciones futuras y otros miembros de la familia. En algunos casos una
translocación balanceada tendrá consecuencias por disrupción de genes en el sitio
de ruptura de los segmentos involucrados, sin ganancia ni pérdida de material
genético.
No diagnostican la localización de los segmentos duplicados y/o delecionados.
Por ejemplo, no distingue entre la duplicación de un segmento por translocación
desbalanceada de la producida por trisomía libre.
Con respecto al array-CGH:
No detecta triploidía
No detecta tetraploidía
Diagnostica mosaicismo sólo si la segunda línea celular está en una proporción de
20 a 30 % o más.
Con respecto al SNP-array:
No detecta tetraploidía
Diagnostica mosaicismo sólo si la segunda línea celular está en una proporción
superior al 15%
3.4.5 Problemas del uso del array en diagnóstico prenatal
Uno de los problemas más frecuentes en la utilización del array en diagnóstico
prenatal es la detección de CNVs de significado incierto. Cuanta más experiencia
acumulen los laboratorios sobre el tema, esta situación va a ocurrir con menor
frecuencia ya que muchas serán recategorizadas en benignas o patogénicas.
Otra situación difícil es la observación de CNV que pueden producir un amplio
espectro de patología en el fenotipo, desde leve a severa. El origen de esta
variabilidad en la afectación está dada principalmente, por la expresividad variable y/o
penetrancia incompleta de ciertos genes. En estos casos, es imposible predecir con
exactitud el compromiso del feto en cada caso en particular. De la misma complejidad
es el diagnóstico de CNVs asociadas a enfermedades de comienzo tardío, por ejemplo
aquellas asociadas con mayor predisposición a determinados cánceres.
Finalmente, cuando se utilizan SNP-array existe la posibilidad de diagnosticar
consanguinidad y paternidad alterna.
3.5 CONCLUSIÓN
La rapidez con que se desarrollan las técnicas moleculares muchas veces no se
acompaña con la misma velocidad de la evidencia de beneficio clínico para introducir
determinada técnica en la práctica clínica.
Uno de los desafíos más importantes en diagnóstico prenatal, no es aplicar la
tecnología disponible, sino interpretar los resultados en forma confiable y segura. Las
técnicas moleculares descriptas, como todo estudio genético prenatal, deben ir
siempre acompañadas de asesoramiento genético antes del estudio y luego del
resultado. Es importante recalcar que un resultado “NEGATIVO” no indica que la
patología no tiene origen “GENÉTICO”
La interpretación del resultado y el asesoramiento genético en el contexto de un
estudio de array son más complejo que en el ámbito de la citogenética clásica. Si bien
en algunos centros de diagnóstico prenatal de países desarrollados se utiliza el array
como primera herramienta de evaluación citogenética, luego de un procedimiento
invasivo independientemente de la indicación del estudio, todavía no hay una
recomendación formal de que sea un estudio de primera línea o que deba reemplazar
al cariotipo de bandeo G.
4 - DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO POR ANÁLISIS DE CÉLULAS Y ÁCIDOS NUCLEICOS FETALES EN SANGRE
MATERNA
4.1 GENERALIDADES
Tradicionalmente, el diagnóstico prenatal de anomalías cromosómicas o génicas
fetales se basa en obtener una muestra de material genético fetal utilizando estudios
diagnósticos invasivos (punción de vellosidades coriónicas, amniocentesis,
cordocentesis). Debido a que estos estudios están asociados con un pequeño riesgo
de pérdida de embarazo, desde hace años se buscan fuentes alternativas de material
fetal para evitar la punción y permitir realizar diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD).
En la actualidad, el NIPD se refiere a la detección de anomalías genéticas fetales
utilizando material genético fetal obtenido de sangre materna, sin el riesgo asociado a
un procedimiento invasivo.
Inicialmente, la investigación estaba dirigida a aislar y evaluar células fetales, pero a
partir del año 1997, con el descubrimiento de ADN fetal libre en plasma materno, la
misma se concentró en el desarrollo de técnicas que involucraran la detección de
ácidos nucleicos fetales.
En la sangre de toda mujer embarazada se puede demostrar la presencia de genoma
fetal circulando en el interior de células fetales o en forma ácidos nucleicos libres (se
los denomina ácidos nucleicos libres debido a que no se los encuentra dentro de las
células, sino libres en el plasma materno).
4.2 CÉLULAS FETALES EN SANGRE MATERNA
En la sangre de mujeres embarazadas circulan células pertenecientes al embarazo de
distinto tipo (células trofoblásticas, linfocitos, neutrófilos y células nucleadas de la serie
roja) mezcladas con las células sanguíneas maternas. Luego de más de dos décadas
de investigación dedicada al NIPD utilizando células fetales se llegó a la conclusión de
que aislar estas células a partir de la sangre materna es técnicamente complicado: las
células fetales se encuentran en poca cantidad (1 célula fetal cada 107 células
maternas nucleadas); y pueden permanecer durante muchos años en el cuerpo de la
mujer luego de finalizado el embarazo (hasta 25-27 años luego del parto), interfiriendo
con el análisis de embarazos subsiguientes.
En el año 1991, se detectó por primera vez una anomalía cromosómica fetal (trisomía
18) en sangre materna aplicando FISH a células fetales en interfase. Utilizando la
misma técnica se logró, años más tarde, realizar NIPD de trisomía 21. A pesar de que
distintos grupos de investigadores lograron aislar células fetales y llegar al diagnóstico
de aneuploidía fetal, todos coinciden en que el procedimiento es muy complicado y,
hasta el momento, no se han logrado resultados consistentes. En la actualidad, el
enfoque más prometedor en esta área parecería involucrar el aislamiento y evaluación
de células trofoblasticas.
4.3 ÁCIDOS NUCLEICOS LIBRES EN SANGRE MATERNA
Los ácidos nucleicos fetales (ADN y ARN) circulan libremente en el plasma materno,
desde algunas semanas luego de la concepción, y desaparecen pocas horas luego del
parto debido a que tienen una vida media muy corta (aproximadamente 16 minutos). El
ADN libre en plasma materno es una mezcla de ADN materno y fetal, siendo en su
mayoría materno (Figura 11).
Figura 11: el ADN en sangre materna es una mezcla del ADN materno y fetal
El ADN fetal libre proviene de las células trofoblásticas (sinciotrofoblasto), y circula
como fragmentos cortos (largo promedio 143 pares de bases). Comienza a detectarse
en plasma materno desde aproximadamente la 5° semana de gestación, y su
concentración fraccional promedio aumenta con la edad gestacional (9-10% del total
de ADN en plasma materno en primer y segundo trimestre, a 20% en tercer trimestre,
pero es altamente variable entre embarazos). A partir de la 7° semana de gestación el
plasma materno contiene suficiente cantidad de ADN fetal libre como para ser
detectado mediante técnicas de NIPD. El ARN fetal libre es de origen fetal y
placentario, comienza a detectarse en plasma materno a partir de la sexta semana de
embarazo, y su concentración permanece constante a lo largo de la gestación.
Por estas características, parecería ser que el ADN fetal libre en plasma materno sería
la fuente más adecuada de material genético fetal para NIPD: puede detectarse
temprano en el embarazo y es específico de la gestación en curso. Dado que todo el
genoma fetal está representado en estas moléculas de ADN fetal libre circulantes,
teóricamente, cualquiera anomalía genética fetal podría ser detectada a través de
NIPD.
Uno de los factores limitantes para desarrollar tests prenatales basados en ADN fetal
libre es la dificultad en poder diferenciar el ADN fetal del materno (Figura 12). El
segundo obstáculo es que el ADN fetal representa sólo una pequeña cantidad,
alrededor del 10%, del ADN total circulante.
Figura 12: ADN fetal (celeste) mezclado con ADN materno (rojo). ADN fetal en menor
proporción que el materno.
Por este motivo, los primeros intentos de NIPD focalizaron la investigación en
secuencias de ADN fetal que no estuvieran presentes en el genoma materno (tanto
heredadas del padre como secuencias específicas del feto). Ejemplos de aplicación
clínica, son el NIPD de secuencias del cromosoma Y de fetos masculinos, o del gen
RHD fetal en mujeres Rh negativas. Esta perspectiva está cambiando rápidamente
con el desarrollo de tecnologías como la PCR digital o la “secuenciación masivamente
paralela” (MPS, massively parallel sequencing). Estas técnicas permitieron desarrollar
tests de NIPD para enfermedades monogénicas y aneuplodías, a pesar de que estén
presentes alelos o cromosomas maternos idénticos a los fetales.
Por lo tanto, NIPD puede utilizarse en la evaluación de anomalías génicas y
cromosómicas, así como también aplicarse al manejo de complicaciones del embarazo
(isoinmunización por Rh D). La determinación del genotipo RHD fetal de todas las
mujeres Rh D negativas podría convertirse en una práctica clínica de rutina en los
próximos años. Así mismo, otras complicaciones del embarazo, como la preclampsia,
el parto prematuro y la restricción de crecimiento intrauterino, han demostrado estar
asociadas con aumento de la concentración de ADN fetal libre, y quizás, en el futuro,
embarazos en riesgo puedan ser identificados a través de NIPD.
4.3.1 DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE ADN ESPECÍFICAS DEL FETO EN PLASMA MATERNO:
La primera aplicación clínica de NIPD se relacionó con la detección de secuencias de
ADN específicas del feto no presentes en el ADN materno, como la determinación de
sexo o del gen Rh D fetal en embarazadas Rh negativas. Estas secuencias pueden
ser detectadas por medio de técnicas moleculares como la PCR convencional o PCR
en tiempo real. La presencia de secuencias del cromosoma Y o del gen Rh D en
sangre materna son interpretadas como provenientes del feto, ya que las mismas no
están presentes normalmente en el genoma materno.
4.3.1.1 Análisis de ADN fetal del cromosoma Y:
El diagnóstico prenatal de sexo fetal puede realizarse por ecografía, pero en el primer
trimestre es confiable sólo a partir de la semana 12-13 y es altamente dependiente de
la experiencia del operador.
La detección en plasma materno de secuencias de ADN exclusivas del cromosoma Y,
como el gen SRY (sex determining region Y), o la secuencia multicopia DYS14 dentro
del gen TSPY1 (testis specific protein, Y-linked 1), se utiliza en la actualidad en NIPD
de sexo fetal. Es un estudio prenatal que puede ser realizado desde la semana 7 de
edad gestacional usando PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Si en plasma
materno se detecta ADN del cromosoma Y, el feto es masculino (ya que el genoma
normal de una mujer embarazada no posee cromosoma Y). Por el contrario, si no se
detecta cromosoma Y se asume que el feto es femenino.
Una de las principales indicaciones clínicas para determinar sexo fetal a edades
gestacionales tempranas es en el contexto de enfermedades ligadas al sexo, como por
ejemplo hemofilia o distrofia muscular de Duchenne. En mujeres portadoras de
mutaciones de enfermedades con este tipo de herencia, los fetos masculinos son lo
que presentan riesgo de desarrollar la patología (o las manifestaciones más severas),
mientras que los fetos femeninos son considerados de bajo riesgo.
Otra situación clínica de aplicación de NIPD de sexo fetal donde es útil la identificación
temprana del sexo es para el manejo de patologías asociadas con el desarrollo de
genitales externos ambiguos, como la hiperplasia suprarrenal congénita (HSC). La
HSC es una enfermedad con herencia autosómica recesiva. La deficiencia en la
síntesis de cortisol resulta en sobreproducción de andrógenos. En fetos femeninos
afectados con HSC la exposición prenatal a un exceso de andrógenos puede producir
distintos grados de virilización de los genitales externos. Por lo tanto, existe la
recomendación actual que las embarazadas con riesgo de fetos afectados por HSC
reciban tratamiento con corticoides desde las semanas 6 - 7 de embarazo para reducir
el grado de virilización en fetos femeninos afectados. A partir de la semana 11 se
puede realizar biopsia de vellosidades coriónicas para diagnóstico de sexo fetal y
evaluar la presencia de las mutaciones de la enfermedad. El tratamiento iniciado con
corticoides se puede discontinuar en fetos masculinos o femeninos no afectados.
Como el NIPD de sexo fetal puede realizarse a partir de las 7 semanas de edad
gestacional, sólo las embarazadas con fetos femeninos deberían continuar el
tratamiento con corticoides y realizar un estudio invasivo, acortando el tratamiento
innecesario en fetos masculinos.
La determinación del sexo fetal por medio de ADN en plasma materno también puede
ser aplicada para clarificar ciertos hallazgos ecográficos, por ejemplo, confirmar el
sexo fetal si se identifican genitales ambiguos; o aportar información adicional en
patologías genéticas asociadas a “sex reversal” como la displasia campomélica.
Los resultados publicados sobre NIPD de sexo fetal con ADN fetal libre en plasma
materno describen una tasa de detección de 95% y una especificidad de 98, %, entre
7 y 12 semanas de edad gestacional, incrementándose a 99% y 99,6%,
respectivamente luego de las 20 semanas. Antes de las 7 semanas la sensibilidad es
baja (75%).
Este estudio presenta dos principales limitaciones: un 5% de fracaso del test, por lo
que se requiere repetir el estudio; y la posibilidad de falsos negativos, ya que los fetos
femeninos son identificados a través de un resultado negativo, que también puede
implicar insuficiente cantidad de ADN en la muestra. Una forma de solucionar este
último problema es utilizar marcadores fetales específicos, fuera del cromosoma Y,
para estar seguros de que hay suficiente cantidad de ADN fetal en la muestra.
El NIPD de sexo fetal se utiliza actualmente en la práctica clínica en algunos países El
estudio se debe realizar luego de la semana 7 de edad gestacional, y previamente
determinar que no sea un embarazo múltiple. Como la tasa de detección no es del 100
%, se recomienda realizar una ecografía luego de la semana 12 para confirmar el
resultado del NIPD.
4.3.1.2 Determinación del Rh D fetal:
El antígeno Rhesus D (Rh D) es un antígeno de superficie de células sanguíneas de la
serie roja. Aproximadamente el 15% de la población caucásica es Rh D negativa, o
sea no poseen el gen RHD que codifica al antígeno (dd). En una mujer embarazada
Rh D negativa la presencia de secuencias del gen RHD en plasma sugiere que el feto
es Rh D positivo.
Los fetos Rh D positivos de embarazadas Rh D negativas con inmunización previa
pueden desarrollar anemia por hemólisis prenatal y neonatal. En estos casos, es útil
determinar el estado Rh del feto mediante la determinación del genotipo RHD en ADN
fetal, ya que los fetos Rh D negativos no presentan riesgo de hemólisis y por lo tanto
realizar seguimiento estricto y estudios complementarios son innecesarios. Esta
muestra de ADN fetal puede obtenerse mediante biopsia de vellosidades coriónicas o
amniocentesis, con el riesgo asociado de pérdida de embarazo y la posibilidad de
incrementar la producción de anticuerpos maternos, y por lo tanto la hemólisis. En este
contexto es ideal, desde un punto de vista clínico, obtener la muestra mediante un
procedimiento prenatal no invasivo.
En el año 1998 se describió por primera vez la posibilidad de NIPD del genotipo RHD
fetal en mujeres Rh D negativas por medio del análisis de ADN fetal libre en plasma
materno. A partir de ese momento, numerosos estudios han evaluado la capacidad
diagnóstica de esta técnica. El NIPD de genotipo RHD fetal tiene una exactitud
diagnóstica de 94,8%. Así mismo, tres estudios de screening RHD fetal en mujeres Rh
D negativas realizados en Holanda, Inglaterra, y Alemania, describieron una tasa de
detección entre 99,799,8%, y una especificidad de 94-99 %. Los casos de falsos
positivos se debieron principalmente a falta de ADN fetal en la muestra de sangre
materna, y se pensó que podrían disminuirse utilizando marcadores fetales como
controles para demostrar que el plasma contiene ADN fetal.
Otra potencial aplicación de NIPD de genotipo RHD fetal en plasma materno es para
detectar las mujeres embarazadas Rh D negativas que se beneficiarían con profilaxis
con inmunoglobulina anti-Rh D: sólo las mujeres Rh D negativas con fetos Rh D
positivos son las que presentan riesgo de isonmunización, y por lo tanto necesitan
profilaxis. Esta estrategia reduciría costos ya que evitaría administrar
innecesariamente inmunoglobulina a 38% de mujeres Rh D negativas con fetos Rh D
negativos.
En la actualidad, NIPD de genotipo RHD fetal es una técnica que se encuentra
disponible en la práctica clínica en varios centros del mundo.
4.3.2 DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Los primeros intentos de lograr NIPD de enfermedades monogénicas fueron en
familias con patologías con herencia autosómica dominante donde el padre era el
afectado. En estos casos, el padre es portador de una mutación que le produce, en
mayor o menor medida, manifestaciones de la enfermedad; mientras que la madre
posee sus dos alelos normales, y por lo tanto es sana. La detección (o no) de la
mutación paterna en plasma materno permite confirmar (o excluir) que el feto haya
heredado la mutación (y por lo tanto la enfermedad), ya que es imposible que ese ADN
mutado provenga de la madre. El NIPD de enfermedades dominantes con herencia
paterna, o si la mutación fetal era “de novo”, ha sido aplicado con éxito utilizando
técnicas como PCR en distrofia miotónica, QF-PCR en enfermedad de Huntington,
PCR seguida de RFLP (restriction fragment length polymorphism) en acondroplasia,
entre otras.
Mucho más complejo es evaluar si el feto ha heredado una mutación materna, como
en enfermedades de herencia autosómica recesiva, o dominantes donde la madre es
portadora de la mutación, debido a la dificultad para distinguir si una secuencia de
ADN circulante proviene de la madre o del feto. Uno de los principales obstáculos es
la gran cantidad de ADN materno libre en plasma, comparado con la poca cantidad de
ADN fetal.
En relación a las enfermedades recesivas, los primeros intentos se basaron en
descartar que el feto haya heredado la mutación paterna, en situaciones donde las
mutaciones parentales eran distintas. El razonamiento se basa en que si el feto ha
heredado el alelo paterno mutado, la probabilidad de heredar el alelo materno mutado,
y por lo tanto, la patología, es del 50%. En estos casos, se puede ofrecer un estudio
de diagnóstico prenatal invasivo para evaluar los alelos fetales. Por el contario, si en
plasma materno no se detecta el alelo paterno mutado, el feto sería no afectado.
Lo y colaboradores desarrollaron dos estrategias para aplicar
Existen dos estrategias en el estudio prenatal de enfermedades autosómicas recesivas
y para determinar si el feto ha heredado la mutación paterna. En familias donde los
progenitores son portadores de mutaciones distintas (el feto sería heterocigota), se
propuso determinar marcadores polimórficos o SNPs (polimorfismos de nucleótido
único, secuencias de ADN que difieren en un nucleótido) asociados a las mutaciones
parentales para diferenciar los alelos. La identificación en plasma materno de SNPs
asociados a un determinado alelo permite inferir si el feto ha heredado ese alelo y por
lo tanto, deducir si manifestará o no la enfermedad. El problema de esta estrategia es
la cantidad de SNPs que hay que evaluar para que el estudio sea informativo, y la
necesidad de evaluar más miembros de la familia para asociar SNPs con alelos. Esto
ha sido aplicado a enfermedades como la beta-talasemia y la hiperplasia suprarrenal
congénita.
Para extender la evaluación a enfermedades recesivas donde ambos progenitores son
portadores de la misma mutación, y por lo tanto es imposible diferenciar en plasma
materno si la secuencia es de la madre, o del feto heredada del padre, o ambas, se
desarrolló una estrategia cuantitativa denominada “dosis relativa de la mutación”
(relative mutation dosage, RMD). Para que sea posible aplicarla, la madre debe ser
heterocigota para la mutación del locus en evaluación (las secuencias de los alelos
deben ser distintas: un alelo mutado y otro normal). En este contexto, para un gen en
particular, tanto el padre como la madre tienen cada uno un alelo mutado idéntico y un
alelo normal. La estrategia de RMD compara las cantidades relativas del alelo normal
y del mutado en plasma materno, sin determinar si el origen es materno o fetal, sólo
determina cantidad de secuencias. Para RMD se utiliza PCR digital, que es una
técnica molecular cualitativa y cuantitativa. La máquina de PCR digital realiza cientos a
miles de ciclos de PCR al mismo tiempo, donde en cada ciclo se analiza una molécula
única de ADN. De esta forma, se determina, no sólo la presencia de una secuencia
determinada, sino la cantidad de secuencias contando la cantidad de reacciones de
PCR positivas. Si se fabrica un “kit” de PCR con primers para un conjunto de
mutaciones y secuencias normales de un gen a estudiar, se puede cuantificar tanto
secuencias mutadas como normales, y luego pueden comparar las cantidades
relativas de cada secuencia. Por ejemplo, si tanto una mujer embarazada como el feto
son heterocigotas para la mutación (un alelo mutado y uno normal), debe haber
cantidades iguales de secuencias de ADN con la mutación y secuencias normales.
Pero si el feto es homocigota porque heredó el otro alelo mutado del padre
(recordemos que las mutaciones de los progenitores son idénticas), habrá
proporcionalmente (no cantidades absolutas) en plasma materno más copias del alelo
mutado que de el normal. Por el contario, si el feto no heredó ninguna mutación (sus
dos alelos son normales) habrá más secuencias normales que con la mutación. Su
utilidad ha sido demostrada en el estudio de la beta-talasemia aplicando PCR digital
para una cantidad determinada de mutaciones y secuencias normales del locus de la
beta-globina (HBB). De la misma forma, se podría aplicar RMD al estudio de
enfermedades dominantes heredadas de la madre.
Por lo descripto, se podría aplicar NIPD para, prácticamente, cualquier enfermedad
monogénica de herencia autosómica recesiva o dominante, mediante la evaluación de
ADN en plasma materno. En la actualidad, esto se realiza en forma clínica pero en
laboratorios seleccionados comprometidos con la investigación en esta área.
4.3.3 DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO DE ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS:
La evaluación de anomalías cromosómicas es la indicación más frecuente para
realizar un procedimiento de diagnóstico prenatal invasivo. Debido a que estos
procedimientos están asociados con un riesgo de pérdida de embarazo, sería ideal
lograr el NIPD de aneuploidías utilizando ADN fetal libre en plasma materno. Sin
embargo, existen dos aspectos que dificultan esta tarea: la gran cantidad de ADN
materno circulante interfiere con el análisis de ADN fetal; y la complejidad de
determinar la cantidad de cromosomas del feto, ya que el ADN fetal circulante está
mezclado con el materno. Se han desarrollado varias estrategias para superar estas
dificultades. Las dos principales incluyen la identificación en plasma materno de
secuencias específicas del feto, y la utilización de técnicas de cuantificación de
moléculas.
4.3.3.1 Análisis de secuencias de ácidos nucleicos específicas del feto:
El análisis de secuencias de ácidos nucleicos de un cromosoma específicas del feto
en plasma materno, o sea que no están presentes en genoma materno, permite
identificar ese cromosoma. De esta forma el ADN materno circulante no interferiría con
la evaluación del ADN fetal. Se han utilizado secuencias de ARNm expresado sólo por
la placenta, o secuencias con cambios epigenéticos específicas de la placenta, ambas
originadas en el cromosoma de interés.
Un ejemplo de cambio epigenético es la metilación del ADN, que está asociada con la
regulación de la expresión génica. La metilación del ADN se refiere a la presencia de
un grupo metilo en el carbono 5´de un nucleótido de citosina que precede a un
nucleótido de guanina. Como cada tejido tiene un perfil propio de expresión génica,
determinado en gran parte por este mecanismo, la metilación de ciertos genes también
difiere en los tejidos. Por lo tanto, una forma de identificar el ADN fetal es buscar
secuencias de ADN de genes que difieren en su estado de metilación entre el tejido
placentario (de donde proviene el ADN fetal libre circulante) y las células sanguíneas
maternas (de donde proviene el ADN materno libre circulante): por ejemplo,
secuencias de ADN idénticas en la madre y en el feto, pero metiladas sólo en el feto.
Ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos fetales específicas del feto son: ARNm de
“PLAC4” (placenta-specific 4)y ARNm de “c21orf105” (chromosome 21 open reading
frame 105), ambos del cromosoma 21; ARNm de “SERPINB2” (serpin peptidase
inhibitor,clade B (ovalbumin), membrane 2), “SERPINB5” hipometilado, ambos del
cromosoma 18; y “HLCS” hipemetilada (holocarboxilasa sintetasa) del cromosoma 21.
Una vez identificadas las secuencias del feto hay que evaluar la cantidad de las
mismas para inferir el número de copias del cromosoma de origen (euploide, trisomía
o monosomía).
Cuantificación por “Proporción de alelos”
Una forma de cuantificación de cromosomas es utilizar la “proporción de alelos”
(“allelic ratio”). Esta estrategia consiste en determinar las cantidades relativas de cada
alelo (para cada secuencia, los alelos deben ser distintos, o sea el feto debe ser
heterocigota para el locus en estudio). Un ejemplo de la estrategia “ARN-SNP”
comprende la determinación en plasma materno de la proporción entre los alelos del
ARNm del PLAC4 localizado en el cromosoma 21. Recordemos que este ARNm no se
expresa en la madre, por lo tanto todas las secuencias de PLAC4 en plasma materno
son sólo de origen placentario (fetal). La mayoría de los fetos son heterocigotas para
PLAC4, por lo tanto sus dos cromosomas 21 tienen cada uno un alelo diferente. Si un
feto es euploide para el cromosoma 21 (2 copias), las cantidades relativas de ambos
alelos de PLAC4 deben ser aproximadamente iguales. Por el contrario, si el feto es
portador de una trisomía 21 (3 copias: 2 alelos iguales y uno distinto) uno de los alelos
va a observarse en mayor cantidad relativa que el otro. Se demostró que esta
estrategia tenía una sensibilidad de 90% y una especificidad de 96,5%. De la misma
forma se aplicó NIPD de trisomía 18 a través del análisis de la proporción de alelos
del ARNm de SERPINB2.
La principal desventaja de esta estrategia de “proporción de alelos” es que sólo puede
aplicarse a la evaluación de fetos heterocigotas para la secuencia evaluada. Por lo
tanto, es necesario evaluar más de una secuencia por cromosoma de modo de que el
feto sea heterocigota para uno o más marcadores evaluados, y por lo tanto poder
aplicar la técnica a toda la población.
Cuantificación por “Proporción epigenética-genética”
Otra estrategia para la determinación de cantidad de cromosomas se denomina
“proporción epigenética-genética” (EGG). Se elige un marcador epigenético fetal
específico derivado de un cromosoma potencialmente aneuploide, por ejemplo HLCS
del cromosoma 21, y un marcador genético fetal específico de otro cromosoma, para
normalizar la dosis cromosómica. El marcador genético fetal podría pertenecer al
cromosoma Y para fetos masculinos, o podría ser un alelo polimórfico de herencia
paterna. La ventaja de EGG es que no necesita secuencias polimórficas en el
cromosoma aneuploide. Sin embargo, se necesitan aun estudios de mayor escala para
confirmar su eficacia diagnóstica.
4.3.3.2 Cuantificación molecular de secuencias de ADN del cromosoma 21 en plasma
materno
El reciente desarrollo de técnicas moleculares de cuantificación de moléculas
individuales de ADN permite detectar anomalías cromosómicas fetales en plasma
materno sin tener que limitar el estudio a secuencias de ácidos nucleicos específicas
del feto. Ejemplos de estas técnicas son la PCR digital y secuenciación masivamente
paralela o MPS, que permiten la cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos
contando cada molécula individual, y con un nivel de precisión superior a la PCR
convencional. Por este método se determina la proporción de ADN en plasma que
corresponde a un cromosoma en particular, y a esta proporción se la identifica como
la dosis cromosómica fetal. Se supone que la proporción relativa de moléculas de ADN
que se originan en un determinado cromosoma, por ejemplo, cromosoma 21, es
constante en embarazos euploides. El valor debería reflejar la representación
genómica del cromosoma 21 en embarazos normales. Por otro lado, si una mujer está
embarazada de un feto con trisomía 21, la cantidad proporcional de moléculas de ADN
en plasma que se originan en el cromosoma 21, se incrementa. El incremento relativo
del contenido de ADN del cromosoma 21 en plasma materno debería ser del 50% del
contenido fraccional de ADN fetal de ese cromosoma (Figura 13). El inconveniente, es
que la modificación en la cantidad de ADN es generalmente pequeña y depende de la
concentración fraccional de ADN fetal circulante.
PCR digital La estrategia se denomina “dosis cromosómica relativa”, donde se compara la
cantidad de moléculas de ADN provenientes de un cromosoma aneuploide, (por
ejemplo el cromosoma 21) en plasma materno, con la cantidad de moléculas de ADN
de otro cromosoma de referencia. La proporción de secuencias del cromosoma 21
debe ser mayor que la de secuencias del cromosoma de referencia, y el grado de
incremento está relacionado con la concentración de ADN.
Figura 13: Proporción de oléculas de ADN fetal en sangre materna en un feto normal y
uno con trisomía 21
Secuenciación cuantitativa
Se demostró que se puede realizar NIPD de trisomía 21 fetal con el uso de MPS (una
forma de “next-generation sequencing”). “Next generation sequencing” se denomina a
una forma de secuenciación que apareció después de la secuenciación clásica. Se la
denomina de tercera o cuarta generación, de acuerdo a técnicas subsiguientes, y en
conjunto se las denomina “de próxima o nueva generación”. Estos secuenciadores
pueden analizar la secuencia de millones a billones de moléculas de ADN en cada
ciclo de secuenciación. Secuencian masivamente y en paralelo, de ahí el nombre de la
técnica MPS. Las secuencias de ADN se ordenan en relación al genoma humano para
identificar el origen cromosómico de cada secuencia. Además de la identidad de las
moléculas, se puede obtener la frecuencia de distribución de las moléculas de ADN en
la muestra, y gracias a ello cuantificar moléculas con impresionante exactitud. La
hipótesis desarrollada es que el ADN en plasma materno, que se encuentra
naturalmente fragmentado, puede ser secuenciado para identificar el origen
cromosómico de cada secuencia de ADN, y determinar la proporción relativa de
moléculas derivadas de un cromosoma potencialmente aneuploide, por ejemplo,
cromosoma 21, para después comparar las proporciones con una muestra normal. Si
se analiza una muestra de plasma materno con un feto con trisomía 21, y se
identifican el número total de secuencias pertenecientes al cromosoma 21, se pueden
determinar pequeños incrementos de estas secuencias comparadas con el número
obtenido de una muestra normal. La cantidad de moléculas secuenciadas y el análisis
estadístico posterior determinan el límite inferior en la proporción de secuencias para
la detección de aneuploidías.
Los estudios a gran escala de validación clínica de NIPD de trisomía 21 con MPS,
demostraron una sensibilidad de 79-100%, y especificidad de 98-99 %, para trisomía
21, utilizando distintos protocolos (mejores resultados evaluando menor número de
muestras por ciclo de secuenciación) con la misma plataforma de secuenciación. Los
estudios más recientes muestran una sensibilidad de 99-100 % y una especificidad de
99,7 a 99,8 %.. Los intentos de aplicar la técnica a la evaluación de trisomía 18 y 13
han observado una mayor dificultad para la detección de estas trisomías, sobre todo
para trisomía 13, debido a su alto o bajo contenido en secuencias de guanina-citosina
(GC) que comprometen la secuenciación. Esto pudo ser mejorado con modificaciones
en el análisis bioinformático tomando en cuenta esta desviación en el contenido de
GC.
Con la tecnología actual, el NIPD tendría para las anomalías cromosómicas más
frecuentes (trisomías 21; 18 y 13; y monosomía del X) una sensibilidad y especificidad
cercanas al 100%. Si bien estos estudios fueron realizados en población de alto riesgo
para anomalías cromosómicas, los datos sugieren que NIPD de trisomía 21 en plasma
materno usando MPS tiene suficiente sensibilidad y especificidad para comenzar la
validación para su aplicación clínica en embarazadas de población general.
Estudios recientes evaluaron la MPS para NIPD de trisomía 21 y 18, usando una
estrategia “target”, donde se realiza la MPS de secuencias determinadas del ADN
fetal, en lugar de evaluar todas las secuencias de ADN contenidas en la muestra de
plasma materno. Este tipo de NIPD “target” logra tasas de detección para trisomía 21
de 100 % y 98 % para trisomía 18, a la vez que permite analizar mayor cantidad de
muestras por vez, y por lo tanto disminuir los costos.
Como hemos dicho, en plasma materno circulan moléculas de ADN fetal libres que
corresponden a todo el genoma fetal. Por lo tanto, existe la posibilidad de determinar
la concentración fraccional de todos los cromosomas y, en un futuro próximo, realizar
un cariotipo fetal en forma no invasiva. Las secuencias de ADN podrían ser analizadas
para determinar la herencia fetal de enfermedades monogénicas. Por lo tanto, NIPD
tiene el potencial de ser aplicado a la evaluación de todas las enfermedades genéticas
fetales.
4.4 ESTADO ACTUAL DE NIPD
El NIPD en sangre materna está transitando hacia la práctica clínica. En los próximos
años, junto con otros avances en biología molecular, va a modificar sustancialmente la
práctica del diagnóstico prenatal. Luego de años de investigación basada en células
fetales, pareciera ser que utilizar ácidos nucleicos en plasma materno sumado a las
nuevas técnicas de secuenciación es la base del NIPD de forma más efectiva. Si bien
no hay duda sobre su beneficio en medicina fetal, el principal problema reside en la
forma de introducirlo en la práctica clínica.
En la actualidad, NIPD en plasma materno se implementa de rutina en varios países
del mundo en dos situaciones clínicas: para la determinación prenatal de sexo fetal, y
para identificar el genotipo Rh D fetal en embarazadas Rh D negativas.
Con respecto a NIPD de aneuploidías, varios laboratorios comerciales, que han
formado parte de los estudios de validación clínica, han comenzado a ofrecer estos
tests en forma pública. Es claro que aplicar un estudio no invasivo para el diagnóstico
de anomalías cromosómicas tiene la ventaja de evitar el riesgo de pérdida de
embarazo asociado a los estudios invasivos. Otros potenciales beneficios serían la
posibilidad de ofrecer estos estudios a una edad gestacional temprana, con una alta
tasa de detección y una baja tasa de falsos positivos. Lo ideal sería que NIPD en
plasma materno se convierta en un estudio diagnóstico que no necesite un segundo
paso confirmatorio (biopsia de vellosidades coriónicas, amniocentesis) antes de dar
una respuesta definitiva.
Sin embargo aún no hay consenso sobre cómo estos tests deben ser ofrecidos a la
población de embarazadas: como tests de screening a toda la población, como
alternativa a un estudio invasivo en embarazadas consideradas de alto riesgo luego de
un estudio de screening, o un intermedio entre los estudios de screening y los de
diagnóstico para disminuir la cantidad de estudios invasivos.
Algunos autores los consideran, por el momento, “tests de screening avanzado”. Se
basan en que los estudios de validación han sido aplicados a mujeres de alto riesgo
para anomalías de cromosomas, y por ello, podrían ofrecerse luego de un estudio de
screening convencional y de esta forma disminuir casi 99 % los estudios invasivos. Por
otro lado debido a que presentan una pequeña tasa de falsos positivos, todavía parece
prudente confirmar un estudio anormal con un estudio invasivo.
La Sociedad Internacional de Diagnóstico Prenatal (ISPD) definió en 2011su posición
en relación a NIPD usando MPS. Considera este estudio como screening, con probada
eficacia en población de alto riesgo, pero sugiere que falta evidencia en población de
bajo riesgo, y en subpoblaciones partriculares como embarazos múltiples o resultado
de técnicas de fertilización asistida de alta complejidad. Esta sociedad acepta el uso
de MPS, con asesoramiento genético previo, en pacientes con un estudio de screening
positivo, mientras que no apoya su uso, por ahora, en embarazadas de bajo riesgo
para aneuploidías fuera de un protocolo de validación clínica. Por último, recomienda
un estudio invasivo para mujeres con alto riesgo en la descendencia de enfermedades
monogénicas, y/o microdeleciones.
Por el contrario, otros autores proponen que NIPD, en un futuro cercano, deberá ser
considerado un estudio diagnóstico. El resultado de NIPD utilizando MPS en plasma
materno depende fundamentalmente de la concentración fraccional de ADN en el
mismo. Está demostrado que esta concentración fraccional no presenta variación
significativa entre embarazadas con fetos con trisomía 21 o euploides, ambas
consideradas previamente de alto riesgo para anomalías cromosómicas. La misma
tampoco depende de la edad materna o de la indicación para realizar el estudio. Por
esto, sugieren que la capacidad diagnóstica del test no va a ser sustancialmente
diferente en población de bajo riesgo.
De cualquier forma todavía quedan interrogantes por resolver antes de su
implementación en la práctica clínica. Se deben considerar el costo del estudio, la
edad gestacional límite para aplicarlo, las indicaciones específicas, y cómo se van a
articular o combinar con la ecografía y los protocolos de screening para aneuploidías
existentes. Es importante que la evaluación de NIPD no se focalice sólo en el
desarrollo de la tecnología, sino que incluya consideraciones éticas, psicosociales y
económicas. Por último hay que tener en cuenta que NIPD no es el único avance
tecnológico introducido en el campo del diagnóstico prenatal. Las opciones en técnicas
de diagnóstico se han incrementado exponencialmente en cantidad y complejidad (Ej.
Array, MLPA). Por lo tanto, cualquier estrategia que se considere para la
implementación de NIPD también debe tener en cuenta todas las opciones
disponibles.
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