J.M. Zúñiga. SPEA.CIC.UGR Jornadas Armonización. Mayo, 2011

Índices de severidadEscalas de invasividadAplicación criterios de PF Fichas de supervisión (IBAs)Habituación y socialización. Técnicas de EARefinements are modifications in animal-based procedures thateither decrease pain, distress, and discomfort or increase animalwell-being. Morton (2000).

ILAR Journal V41(2) 2000. Humane Endpoints for Animals Used in Biomedical Research and Testing. http://dels.nas.edu/ilar/jour_online.asp?id=jour_online

Posibles mecanismos correctores

Clasificación de la severidad de los procedimientos. Directiva, 2011

 Los Estados miembros velarán por que todos los procedimientos se clasifiquen:

"sin recuperación" "leves" "moderados" "severos",

Severidad de un Procedimiento relacionada con: 1. Deprivación y rangos de variables

medibles o cuantificables 2. Conjunto de variables que pueden

causar dolor, ansiedad o sufrimiento

Muy relacionada con la aplicación depaliativos

Índice de severidad Severidad: baja/Intermedia o alta.Escalas:

Descriptiva simpleNuméricaAnalógica visualMelbourneColorado, etc. Para establecer dolor “agudo”

argen discriminación observador valorar dolor.argen relacionado con capacidad para percibirlo

Hombre hasta 20 niveles de dolor desde – a + nimal < gº sensibilidad. < 10 niveles fiables

Protocolos supervisión

Permiten detectar a los animales que experimentan dolor o sufrimiento intenso. Imprescindibles para aplicar medidas correctoras.

Investigador debe diseñar ficha de supervisión individualizada antes del procedimiento, especialmente cuando dicho procedimiento sea de severidad media o alta.

¿ Es difícil evaluar el estado?, con un poco de observación ¡NO!:

Conocer conducta y apariencia normal

Observación de signos clinicos del estado del animal

Signos claves (ILAR, LASA, FELASA) ycriterios claves (Morton & Grifith, 1985)

Ficha de supervisiónPeso: menor consumo alimento y crecimiento.

Parámetro >> útil en CRÓNICOS. Pérdidas => 20-25% Aspecto:

Piloerección, pelo desordenado, sin brilloEstrés crónico inhiben acicalamientoSecreciones oculares o nasalesRestos de diarrea en la región perianalAparición halo porfirinas en ojo

(cromodacriorrea).Posturas anormales antiálgidas y temblores

Protocolos de supervisión:• Permiten detectar dolor o sufrimiento • Son imprescindibles.Aspecto

del animal•Piloerección•Inhibición de acicalamiento •Secreciones oculares, nasales o presencia de restos de diarrea• Halo de porfirinas alrededor del ojo (cromodacriorrea). •Posturas anormales antiálgidas

Comportamiento: Inactividad y falta de interacción. Tener en cuenta fotoperiodoAutomutilación, convulsiones, disnea y vocalizaciones anormales: problema grave.

Respuesta a manipulación

Útil solamente con personal familiarizado Respuesta excesivamente pasiva como muy agresiva, problema.

Peso del animal: Pérdidas => 20-25% son indicativas de falta de bienestar.

Variables clínicas:

•Temperatura, frecuencia cardíaca y respiratoria indican estrés o dolor. •Corticoides en heces

RCEND POINT Se define como el momento en el cual se

reduce, minimiza o termina el dolor y/o diestrés* del animal, mediante acciones tales como:  EutanasiaFinalizar el procedimiento dolorosoTratamiento paliativo dolor y/o diestrés.

 El EP debe ser compatible con el experimento.

*Similar el concepto de sufrimiento

Objetivos para definir un EP: Realizar las observaciones apropiadas (conducta, fisiología...)

Asignar valores a las observaciones realizadas

Determinar que observaciones son las más indicadoras de dolor y/o diestrés en la investigación

Determinar que observaciones pueden predecir mejor un mayor deterioro del animal para, identificar el punto mas temprano donde aparecen los síntomas.

Establecer EP significativo y objetivo

Observaciones apropiadas de los animales 

Evaluación del dolor: cambios de peso corporal

apariencia física externasignos clínicos mediblescambios en la conducta espontánearespuestas conductuales a estímulos externos

Importante, conocer las características conductuales de la especie,animal o cepa (los roedores y lagomorfos pueden NO mostrar

muchos cambios conductuales aun cuando sufren dolor).

Protocolo Observar al animal sin molestarlo. Ver si

manifiesta conductas normales o anormales y sus reacciones a estímulos externos

Examen clínico. Los signos clínicos y las mediciones se anotan

Usar tablas de cuantificación estandarizadas (facilitar recogidas datos).

 + signos de dolor y/o diestrés relacionados con la condición bajo estudio (se deben usar).

Posibles áreas de deprivación psicológica o biológica-1

Denegación de:Alimento / aguaSueño / Auto limpiezaPrivacidad / Espacio vitalRelaciones sociales / Contacto

confortableEstimulación sensorialDesfogue de agresividad

Posibles áreas de deprivación psicológica o biológica-2

Denegación de:Evitación / Actividad esqueleto muscularExploración/ElecciónCambios ejecutables del ambienteMedioambiente natural o naturalizadoOportunidad para desarrollar otras

pautas de conductaAnalgésicos frente al dolor

Estudios de toxicología

Me toca bailar con la/el más…

Mayor esfuerzo en Alternativas….

EPAA (Asociación Europea de Enfoques Alternativos)

Public Funding for 3Rs Research Sobre 12 m €ReprotectSens-it-iv ACuteTox OSIRIS PREDICT-IV

Carcinogenomics VITROCELLOMICS

INVITROHEARTESNATS NanoTEST

Evaluación preclínica y seguridad de productos químicos, farmacéuticos, aditivos alimentarios, cosméticos u otros

Comportamiento fisiológico/patofisiológico después del tratamiento con una sustancia

Efecto farmacológico/tóxico de sustanciasConcentraciones eficaces de medicamentosEfectividad y seguridad de vacunasReacción a materiales/sustancias ajenos

(xenobioticos)

Modelos Animales en Procesos Biológicos

“La Gran carnicería”

Libro Blanco de sustancias químicas que impulsa la Comisión Europea de MA

La Comisaria de MA de la UE, Margot Wallström, propone la revisión de 30.000 de los 100.000 productos químicos que están actualmente en el mercado.

¡OJO! Responsable la industria química

El informe comunitario cifra el coste económico para la industria en

32.000.106 €La consultora Mercer Management

Consulting estima que significaría una pérdida del 1.8% del PIB anual de la UE, cifras que la industria hace suyas.

Tipos de toxicidad

AGUDA (sin supervivencia): se pueden mantener un mínimo de horas o días

SUBAGUDA (supervivencia a corto plazo).CRÓNICA (supervivencia a largo plazo).

medidas de control máximo. (i) Con observación constante (ii) con observación ocasional

 

* Tipo de test (Toxicidad):Toxicidad Aguda & Sub-aguda, hasta 28 díasMétodos que utilizan letalidad a término [A]Dosis letal ( LD o LD50 –50% de los animales ensayados-) [B] Otros métodos letales [C] Métodos clínicos no letalesToxicidad Sub-crónica & crónica: [D] Más de 28 días incluido carcinogénesis [E] Teratogenia, Mutagenicidad y Toxicidad Reproductiva [F] Irritabilidad Ocular [G] Irritabilidad Cutánea [H] Otros

Li

LifeLab

Tipos de ensayos DL50 oral en rata (15 cada 14 días por ensayo - dos ensayos a la

vez- n= 30) Irritabilidad dérmica  en conejo: 3 cada 14 días/ensayo –2

ensayos- n=6- DL50 inhalatoria en ratas: 10 (5 ♀♀ y 5 ♂♂) por cada nivel de dosis

y aprox. son de 3 a 5 niveles. 50 ratas cada 14 días Absorción dérmica: 25 ratas cada 14 días por ensayo LC50 en Pez cebra. Efecto en organismos acuáticos. 35

(7/concentración). DL50 en aves (Coturnix coturnix).

Hepatotoxicidad provocada por plantas medicinales

Kava kava (Pipper methysticum).Se le atribuyen propiedades

ansiolíticas y contra el insomnio. En 2006, la FDA restringe su uso

debido a efectos hepatotóxicos.

¿ Se produce realmente dolor? Aprox 2.7 million (2005,UK). 21.5% test toxicidadAcute/subacute lethal studies (124.000 animals)Acute/subacute range-finding, limit testing, etc(109.000)Reproductive/teratogen/mutagen studies (71.400 )

Suiza (2001) Holanda (2000-01)

Nivel Dolor N % N %

Bajo 

343.385 69.8 419.576 56.6-52.0

Moderado 

112.351 22.8 186.114 25.1-29.2

Severo 

36.480 7.4 

135.484 18.3-18.8

1. Leve:Niveles de severidad Directiva 2011

 Farmacocinético, única dosis y nº limitado de muestras de sangre (totalizando < 10% del volumen circulante). No se prevé que la sustancia cause ningún efecto nocivo perceptible;

Administración de sustancias por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, por sonda gástrica e intravenosa a través de los vasos sanguíneos superficiales. Sustancia sólo tiene un efecto leve en el animal, y los volúmenes se encuentran dentro de límites apropiados para el tamaño del animal

Estudios que implican la privación a corto plazo de interlocutores sociales, enjaulado solitario a corto plazo de ratas o ratones adultos de cepas gregarias;

2. Moderado:

Estudios de determinación de la gama de dosis causante de toxicidad aguda, subaguda y/o pruebas de toxicidad crónica/ carcinogenicidad, con EP no letales

3. Severo:

Toxicidad, con situaciones fisiopatológicas intensas y EP muerte. Ej, toxicidad aguda con una única dosis (ver OCDE)

Ensayo de potencia de una vacuna, caracterizada por la (i) alteración persistente del estado del animal, (ii) enfermedad progresiva que causa la muerte, (iii) asociada con dolor, angustia o sufrimiento moderados duraderos.

GUIDANCE DOCUMENT ON THE RECOGNITION, ASSESSMENT, AND USE OF CLINICAL SIGNS AS HUMANE ENDPOINTS FOR EXPERIMENTAL ANIMALS USED IN

OECD, 2000. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment

SAFETY EVALUATION

CLINICAL SIGNS AND CONDITIONS OFANIMALS REQUIRINGACTION BY ANIMAL CARE STAFF ANDSTUDY DIRECTORS.

MC Toxicidad aguda Interacción de compuesto con las células y los

tejidos corporales y no sus efectos terciarios (físicos)

Estudio piloto previo a la investigación para determinar los comportamientos indicadores de dolor.

Este estudio se hace < nº animales y dosis bajas para poder fijar los end points.

También se tendrá en cuenta la morbilidad en lugar de la mortalidad

MC Toxicidad subcrónica ( 6 m) y crónica (24 m)

 Estudio sea efectivo la supervivencia > del 50%.

 Alojamiento para envejecidos (> 18 meses): Exceso de peso: lesiones en cojinete plantar, obesidad y tumores Jaulas piso sólido y un lecho adecuado. Agua y el alimento suministro especial.

MCEnfermedades infecciosas, vacunas...

En animales infectados por bacterias Tª < de 34ºC implica la muerte .

El end point se fija cuando:Existe perdida de peso superior al 20%La disminución de Tª animal es > 4ºC.

Los signos evidentes de dolor y sufrimiento son: Pelo erizado // Perdida de pesoDescarga ocular // LetargiaEncorvamiento // Ataxia Hipotermia 

 

Estudios de nutrición

Tipos de estudiosRelacionados con toxicidad de aditivos

alimentariosActuación y diseño de alimentos

funcionalesAlteraciones y disfunciones (anorexia,

obesidad)Patologías del sistema digestivo

1. Leve:

 Alimentación con dietas modificadas, que no cubren las necesidades nutricionales de todos los animales y se prevé que causen una anomalía clínica leve en el periodo de estudio;

 Confinamiento a corto plazo (< 24h) en j-metabólicas;  Adición a la dieta de marcadores inertes para seguir el

paso de la ingestaRetirada de alimentación durante un periodo < a 24h en

ratas adultas;

. Moderado:

Uso de jaulas metabólicas que impliquen una restricción moderada de movimientos durante un período prolongado (hasta 5 días);

Estudios con dietas modificadas que no cubren las necesidades nutricionales de todos los animales y que se espera que causen una anomalía clínica moderada en el periodo de estudio;

Retirada de la alimentación durante 48 horas en ratas adultas;

3. Severo:

 Uso de jaulas metabólicas que impliquen restricción severa de los movimientos durante un período prolongado;

 Inmovilización de ratas para inducir úlceras gástricas o fallo cardiaco por estrés;

 Inflamaciones o ulceraciones irreversibles en colon y digestivo

En Modelos inducidos o manipulados. Ejemplo aplicados estudios de nutrición 1. Administración substancias biológicas activas:diabetes

con aloxano o de estreptotozina.

2. Por manipulación quirúrgica: ligadura pilórica; hepatectomía parcial (regeneración hepática), etc

3. Por inducción basada en dietas modificadas: carenciales o suplementadas base para el estudio de hiperlipemias, esclerosis vasculares, hipovitaminosis, cancerogénesis.

Modelos dolorosos (colitis o inflamación intestinal)

Mediante un enema de 10 mg de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en 0,25 ml de etanol al 50%

Suplementación del agua de bebida con sulfato de dextrano sódico (DSS) al 5% (p/v) en el agua de bebida.

Por transferencia de poblaciones linfocitarias por vía intraperitoneal a ratones SCID.

Modelos inducidos

4. Inducción por cambios etológicos: modificaciones de factores sociales o entorno, aslamiento, inmovilización.

5. Manipulación genética: transgénicos, obtención de > nºmodelos especiales y comprensión de acción de tipo

patológicos & terapéuticos  

Ejemplos concretos

R obesa Zucker (fa/fa). Obesa a 5 sem.; edad, pesando a las 40 sem. doble Rnormal. Por hipertrofia-hiperplasia > tamaño, nº adipocitos.

r Non Obese Diabetes. Insulino dependiente. infiltración del parenquima pancreático por linf. CD8 y CD4, B y macrofagos.

Restricción de movimientos

Alimentación Controlada En períodos de tiempo fijados (uno o más /día) los

animales consumen tanta comida como quieranPara estudios con estado nutricional controlado.Sistemas automáticos de acceso al alimento

(chronofeeder)Permiten controlar la cantidad de comida 

Reducción inmovilización

Envejecimiento/ Life span

Los vicios adquiridos-transmitidos reciclaje y actualización

Reticencia aplicación de analgesia Ej. Con colitis ulcerosa, la acción de probioticos no varia con

ketofen y buprenorphina Métodos invasivos anticuados Ej. Vías de administración y extracción en desusoInmovilización innecesaria Ej retenedores vs telemetría y teledetecciónAislamiento prolongado sin justificar Ej. Animales aislado en alimentación restringidaMétodos de eutanasia inapropiadosEj. Inhalación éter vs sobreanestésico, CO2 vs C02+ O2

Elementos dianaformación. EXP & INV

Valorar nivel de BA(grupo/individuo) Valorar nivel dolor/estrés/ansiedad y… Aplicar mecanismos de reducción Proporcionar una batería de cuidados Limitar duración y severidad de

condiciones experimentales Reducción de riesgos (bioseguridad)

….. Gracias