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MONOG VP900560 INT+GUARDAS.indd 2 20/09/11 17:25

Monografía de producto

CaniLeish®


Índice

Página

La amenaza de la leishmaniosis canina

CaniLeish®: un avance decisivoen la prevención de la leishmaniosis canina

CaniLeish®: eficacia probada

CaniLeish®: un excelente perfilde seguridad

CaniLeish® en la clínica diaria

19

2953

7

67


La amenazade la leishmaniosis canina1


9

Un problema serio y extendidoLa leishmaniosis (en medicina veterinaria) y la leishmaniasis (en medicina humana) son enfermedades parasitarias transmitidas por un vector y causadas por protozoos del género Leishmania. Estos parásitos infectan a una variedad de animales vertebrados y se transmiten por la picadura de un flebotomo infectado. Los perros son el principal reservorio para esta zoonosis,1,2 que causa un serio problema veterinario y además tiene un impacto creciente sobre la salud pública.2

La leishmaniosis canina, una enfermedad grave y de fatales consecuencias, se extiende por la cuenca mediterránea, parte de Asia, América Central y Sudamérica. Se describió por primera vez en perros hace poco más de 100 años.3 En la cuenca mediterránea, la enfermedad está causada por L. infantum, sinónimo de L. chagasi en Centro y Sudamérica, aunque también hay informes de focos aislados de L. tropica en Grecia. Se calcula que, solamente en el suroeste europeo, hay al menos 2,5 millones de perros infectados (véase la figura 1.2) y que la enfermedad se está extendiendo hacia el norte.4-6

La leishmaniasis humana comprende un grupo de enfermedades que, en gran parte, son zoonóticas. Incluye la forma visceral (también conocida como kala azar) que afecta a los órganos internos y es mortal si no se trata, y las formas cutánea y mucocutánea que pueden curarse espontáneamente pero que dejan cicatrices que causan desfiguración.7

Más de 350 millones de personas en 88 países se encuentran en situación de riesgo de leishmaniasis (véase la figura 1.1) y la tasa de mortalidad de la leishmaniasis visceral, causada por el complejo Leishmania donovani (que comprende L. infantum y L. donovani), solo es superada entre las enfermedades parasitarias por la malaria.9

Distribución geográfica de la leishmaniasis visceral

Figura 1.1 Leishmaniasis visceral humana (de Rosenthal y Marty, 2004)8

1La amenazade la leishmaniosis canina

1.1


10

Epidemiología de la leishmaniosis caninaUn problema con elevada prevalencia

Además de los 2,5 millones de perros infectados que se calcula que viven en las áreas endémicas, se ha diagnosticado la enfermedad en perros de países no endémicos que han vivido o viajado a áreas endémicas anteriormente.10 El número creciente de perros que viajan al sur de Europa o de perros importados como mascota procedentes de las áreas endémicas ha suscitado serias preocupaciones sobre la introducción de enfermedades transmitidas por vectores, tales como la leishmaniosis canina, en áreas no endémicas de Europa.10

El número de perros infectados en Sudamérica se calcula también en millones. Las tasas de infección son elevadas en algunas áreas de Venezuela y Brasil, donde una prevalencia alta de la infección canina se asocia a un riesgo elevado de enfermedad en humanos.11 También se ha descrito la infección en gatos, cánidos salvajes y caballos en áreas en las que la enfermedad es común en perros.12-14

La figura 1.2 (gentileza del Prof. P. Bourdeau) muestra la extensa situación epidemiológica actual en Europa.

1.21.2.1

Puntos clave:

• L. infantum, el parásito de la leishmaniosis canina, se incluye en el complejo L. donovani (en ocasiones se utiliza incorrectamente el nombre L. donovani para referirse a L. infantum).

• En Sudamérica se conoce como L. chagasi. L. infantum y L. chagasi son idénticas, y el nombre L. infantum debería reemplazar al nombre L. chagasi.

• L. infantum está extendida y causa enfermedad significativa en humanos y perros en la cuenca mediterránea.

• El perro es el reservorio principal para L. infantum en Europa.

Altamente enzoótica

Potencial de extensiónpor la presencia del vector

Países / zonas en los que se han descrito casos autóctonos (no enzoótica)

Enzoótica

Zona de extensión enzoótica

Casos importados

*Los límites entre las zonas no se representan de forma precisa*Este mapa deriva de estudios y congresos europeos (Bourdeau: EMOP 2004; WorldLeish4 2009; ECVD 2009; RESFIZ 2009)

1La amenaza de la leishmaniosis canina

Situaciones poco documentadas: ¿Casos autóctonos? ¿Enzoótica? ¿Casos importados?

??

?

Figura 1.2 Leishmaniosis canina en Europa (Original del Prof. P. Bourdeau)


11


Dentro de las áreas endémicas o enzoóticas también hay variaciones locales. Una selección de publicaciones de los últimos diez años muestra una amplia variación de la prevalencia de la leishmaniosis canina, detectada mediante serología, en áreas de Europa consideradas como endémicas. Los resultados variaron entre el 1,4% en la provincia de Pisa, Italia, y el 30,3% en áreas del oeste de Liguria, Italia.15,16 Además, la sospecha de que la seroprevalencia infravalora el número verdadero de perros infectados quedó confirmada por los resultados de estudios basados en la prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en perros seronegativos. Los datos pusieron de relieve una prevalencia del 80% en Marsella, Francia, y del 67% en la isla española de Mallorca.17,18

Tabla 1 Distribución geográfica de algunas especies de Leishmania que infectan a perros y sus vectores (adaptada de Solano-Gallego et al, 2009)21

Especies de Leishmania

Distribucióngeográfica

Vectorescomprobados

Vectoressospechados

L. infantum

Cuenca mediterránea Phlebotomus perniciosus, P. ariasi, P. longicuspis, P. syriacus, etc.

Oriente MedioP. perfiliewi, P. neglectus,P. langeroni, P. tobbi

Sur de Asia, Irán,Armenia, Afganistán

P. kandelakii P. brevis, P. halepensis, etc.

Asia Central, China P. chinensis, P. alexandriP. smirnovi, P. transcaucasicus, P. longiductus

L. infantum (= L. chagasi)

Centroaméricay Sudamérica

Lutzomyia longipalpis, Lu. Evansi, Lu. Olmeca olmeca

Lu. Antunesi, Lu. Shannoni

L. donovani Este de África P. orientalis, P. martini P. rodhaini

L. tropica Norte de África P. sergenti, P. arabicus P. chabaudi, P. saevus

Cualquier medida preventiva debe basarse en el conocimiento del ciclo biológico del parásito y en los posibles resultados de la exposición al mismo.

La importancia del ciclo biológico de Leishmania

El complejo ciclo biológico de los parásitos L. infantum va del estadio de amastigote en un hospedador vertebrado (p. ej. perro o ser humano) hasta el estadio de promastigote en un vector invertebrado flebotomo. Aunque algunos estudios han investigado la posibilidad de que garrapatas y pulgas actúen como vectores de transmisión de Leishmania, aún no existen evidencias de que esto pueda ocurrir.19,20 Solo unas especies concretas de un insecto del género Phlebotomus (Lutzomyia en el Nuevo Mundo) están adaptadas para la transmisión de Leishmania (véase la tabla 1).

Puntos clave:

• Existe un número considerablemente elevado de perros infectados o expuestos.

• Su salud genera una gran preocupación en sus propietarios.

• Estos perros también representan un importante reservorio de la infección con potencial zoonótico.

Conclusión: existe la necesidad de hallar nuevas formas de abordar el problema de la leishmaniosis canina antes de que llegue a las fases clínicas.

1.2.2


12

El flebotomo hembra es el único que pica para obtener la sangre. Los machos son vegetarianos. La hembra queda parasitada cuando ingiere amastigotes de Leishmania contenidos en la sangre de un hospedador infectado. Durante un periodo de entre 4 y 25 días, el parásito continúa su desarrollo en el interior del flebotomo, donde sufre una transformación importante22 (véase la figura 1.3). Los amastigotes, carentes de movilidad, son liberados de las células de los mamíferos hospedadores y se transforman en promastigotes, que se multiplican y desarrollan en el segmento anterior del intestino.23

Cuando un flebotomo parasitado pica a otro hospedador vertebrado, inocula la forma final, el promastigote metacíclico, en el nuevo hospedador. Una vez que el parásito entra en la dermis, es fagocitado por un macrófago. Este macrófago intenta eliminarlo a través de una cascada de metabolitos basados en oxígeno como el óxido nítrico. Los parásitos poseen mecanismos específicos para evadir esta defensa del hospedador y, de este modo, pueden continuar creciendo, desarrollándose y multiplicándose en el interior del macrófago en forma de amastigotes carentes de movilidad y completar así su ciclo biológico.21 Con el tiempo, cuando el macrófago está casi lleno de amastigotes, revienta y libera los parásitos que invadirán a otros macrófagos. El resultado de la inoculación en un hospedador vertebrado depende de la eficacia del sistema inmune del hospedador.25

La transmisión sin vector, independiente del flebotomo, parece ser poco frecuente, aunque posible. Se han descrito tanto transmisiones transplacentarias como venéreas.26,27 Se sospecha de la transmisión directa entre perros Foxhound en los EE.UU.,28 y se ha confirmado la transmisión a través de transfusión de sangre.29 Está claro que, en estos casos, las estrategias de prevención centradas exclusivamente en el vector no aportan ningún beneficio.

FLEBOTOMO

PIEL DEL HOSPEDADORINGESTADE SANGRE

Promastigotes

Fagocitaciónpor un macrófago

HOSPEDADOR

Multiplicación de amastigotes

Liberación de amastigotes

Órganos internos

Infecta otrascélulas

Transformaciónen promastigotes

Multiplicación


Figura 1.3 Ciclo biológico de L. infantum (adaptado de Roze, 2005)24


13


1.2.3

Puntos clave:

• El parásito Leishmania existe en dos formas: promastigote (en el vector) y amastigote (parásitos intracelulares de los hospedadores vertebrados).

• El resultado de la inoculación en un perro (o ser humano) depende de la eficacia del sistema inmune del hospedador.

El resultado de la exposición al parásito es variable

Los estudios sobre los factores de riesgo asociados a la leishmaniosis canina han revelado varios factores clave en las áreas endémicas:5

• El género no parece ser un factor de riesgo.

• Todas las razas son susceptibles. Sin embargo, hay algunas razas como el Bóxer, Cocker Spaniel, Rottweiler y Pastor Alemán que parecen ser más susceptibles que la media al desarrollo de la enfermedad sintomática. Otras razas, como el Podenco Ibicenco, raramente desarrollan signos clínicos.30-32

• La prevalencia de leishmaniosis canina aumenta hasta los tres años de edad para declinar posteriormente hasta que el perro es mayor de 7 u 8 años, momento en el que se observa otro pico.

• El riesgo depende de la actividad del perro y del riesgo de exposición resultante a las picaduras de flebotomos infectados.

• La respuesta inmune individual del perro y la virulencia de la cepa de L. infantum juegan un papel importante.

La mayoría de los perros expuestos al parásito no desarrollan leishmaniosis clínica. Aunque una proporción pasará a desarrollar el síndrome clínico, algunos perros pueden eliminar por completo el parásito y un número considerable permanecerá infectado subclínicamente.4,18 No obstante, no puede asumirse que el estado subclínico en perros infectados aunque sanos sea permanente. Algunos perros pasarán a eliminar la infección tras un tiempo, pero factores como la inmunosupresión y las enfermedades concomitantes pueden dar como resultado la progresión de la enfermedad clínica.4 También debe recordarse que los perros que están infectados pero son asintomáticos pueden seguir siendo una fuente de infección para los flebotomos, incluso cuando no muestren signo alguno de la enfermedad.33

Dada esta gran variabilidad, la clasificación de los perros expuestos al parásito Leishmania no es sencilla. Varios grupos han estudiado este problema. La figura 1.4 que aparece al dorso está adaptada a partir de dos de estas fuentes.5,21 El símbolo del flebotomo representa un estado en que el perro puede ser considerado infeccioso para el vector. En la sección 3.2.2.3. puede hallarse una discusión adicional sobre la clasificación de los perros.


14

Inmunología de la leishmaniosis canina¿Cómo resiste un perro al parásito?Existen muchas evidencias que demuestran que la orientación de la respuesta inmune es el factor decisivo que determina si un perro será resistente al parásito o evolucionará por la vía de la infección activa de los macrófagos y acabará desarrollando la enfermedad clínica.34,35

Aunque sea simplificar mucho la realidad, puede considerarse que el sistema inmune adaptativo suele funcionar con dos tipos principales de actividad en equilibrio36 (véase también la figura 1.5). La respuesta Th1 funciona principalmente a través de la inmunidad celular, con células como los linfocitos T citotóxicos (Tc) como principales células efectoras. También puede estimularse algo de producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B, pero no es la característica principal de una respuesta Th1. La respuesta inmune Th1 se dirige principalmente contra patógenos intracelulares. La respuesta Th2 funciona principalmente a través de la inmunidad humoral, que se caracteriza por una producción considerable de anticuerpos por parte de linfocitos B y células plasmáticas. Es, ante todo, efectiva contra patógenos extracelulares. Además, ambos tipo de respuesta inmune pueden producir células de memoria. Estas células son capaces de estimular una respuesta tipo Th1 o Th2 en fechas posteriores si el organismo se encuentra de nuevo con el mismo antígeno.

En ratones y seres humanos, se ha demostrado que los anticuerpos del subtipo IgG1 están asociados a una respuesta Th2 y que los anticuerpos del subtipo IgG2 están asociados a una respuesta Th1. Sin embargo, a pesar de que algunos informes iniciales sugerían lo mismo en perros, no parece que sea el caso y la relación IgG1/IgG2 no parece estar relacionada con la protección.37

Perro intacto en una región endémica Sin parásito (no expuesto)

Se controla el parásitoy se elimina del organismo

Curado y sin parásito

El parásito permanece silente durante cierto

tiempo (perro subpatente)

Infección activa asintomática

Infección activa asintomática a largo plazoInfección activa sintomática

Infección crónica (mortal)

Expuesto al parásito

El parásito siguemultiplicándoseen el organismo

1.3


Figura 1.4 Los resultados de la exposición al parásito en perros


15


Cuando un macrófago fagocita a un patógeno, presenta antígenos del patógeno a los linfocitos T helper intactos (linfocitos Th0) (véase la figura 1.5). Los linfocitos T no suelen ser capaces de responder frente a antígenos solubles y dependen de la presentación de antígenos por parte de las células presentadoras de antígeno (CPA) tales como los macrófagos y células dendríticas.36 Dependiendo del entorno local, el tipo de antígeno y de otros factores, estos linfocitos Th0 reciben estímulos para diferenciarse en linfocitos Th1 o Th2. En este momento empieza a formarse una polaridad en la respuesta.40 Al liberar citoquinas específicas, los linfocitos Th1 sirven de soporte para una respuesta inmune mediada por células, y los linfocitos Th2 para una respuesta inmune humoral.

Estimulación

DiferenciaciónDivisión

Linfocito T intacto (Th0)

Th2

Th1 dememoria

Tc

Producciónde IgG1

Producciónde IgG2

Progresión haciala enfermedad

Eliminación del parásitoResistencia a la enfermedad

Th1

IFN-γ

Activación de la víadel Óxido NítricoLisis del parásito

Linf. B

Macrófago

Macrófagoinfectado

SupresiónIFN-γ

IFN-γ

Linf. B

Th2 dememoria

La resistencia a la leishmaniosis canina está asociada a una fuerte inmunidad Th1 mediada por células, con un predominio de las citoquinas Th1 en la respuesta global mixta Th1/Th2.34,35 La evolución hacia la enfermedad clínica está asociada a un predominio de las citoquinas Th2 y a una marcada respuesta humoral en ausencia de una respuesta Th1 fuerte.38 Esta reacción inmunitaria inapropiada, con una producción de cantidades excesivas de anticuerpos a lo largo de periodos prolongados, contribuye al síndrome clínico.39

Figura 1.5 Vías inmunitarias que llevan a la resolución de la infección o a la enfermedad activa


16

En caso de leishmaniosis, los macrófagos no son solo las CPA sino que también son las células que acogen al parásito. Las citoquinas liberadas por los linfocitos tienen un profundo efecto sobre el modo en el que el macrófago se encarga del parásito.41

En un estudio muy reciente en seres humanos que buscaba marcadores de citoquinas para ser usadas en la evaluación de antígenos candidatos a una vacuna potencial para leishmaniasis, 42 la producción de interferón gamma (IFN-γ) solo se asoció de forma significativa a los individuos protegidos contra la enfermedad. Esta investigación confirmó que el IFN-γ es una citoquina fundamental en la identificación de la respuesta inmune adecuada.

Este hallazgo está en consonancia con trabajos anteriores en perros que también habían demostrado la importancia de la expresión del IFN-γ en los linfonodos.43 En un estudio con perros con infección natural, los perros sintomáticos presentaban una carga parasitaria en sus linfonodos 73 veces mayor que los perros asintomáticos. Se demostró que la expresión del IFN-γ en los linfonodos estaba relacionada con un número inferior de parásitos y la protección frente a la enfermedad sintomática.

En los últimos años se han esclarecido las razones del papel fundamental del IFN-γ. Cuando los linfocitos activados estimulan a su vez a los macrófagos, usando uno de los dos perfiles alternativos de citoquinas, la elección de un perfil de citoquinas Th1 o Th2 tiene un gran impacto sobre el modo en que el macrófago abordará al parásito.41,44 Esto es así, en parte, por los efectos de esta estimulación sobre el metabolismo de la L-arginina.

La L-arginina es un nutriente clave utilizado tanto por los macrófagos como por los parásitos de Leishmania. Existen dos vías alternativas para su metabolismo que tienen resultados muy distintos, como refleja la figura 1.6.

Tras la estimulación por parte de las citoquinas Th1, sobre todo por el IFN-γ, el macrófago regula a la alza una enzima llamada óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Este proceso tiene como resultado el metabolismo de la L-arginina en óxido nítrico (ON) leishmanicida e inhibe la actividad de la otra enzima llamada arginasa.45 Sin embargo, tras una estimulación por citoquinas Th2, el macrófago favorece la actividad arginasa. Como consecuencia, se producen poliamidas, una fuente importante de nutrientes esenciales para los parásitos de Leishmania que favorecen la replicación y persistencia del parásito.46,47 Se ha demostrado la existencia de una correlación en perros infectados con Leishmania entre el número de macrófagos que expresan iNOS y una reducción del número de amastigotes de Leishmania en los macrófagos.48 Por tanto, las citoquinas Th1 tales como el IFN-γ desempeñan una labor fundamental en la dirección de la vía correcta de la respuesta inmune.

Parece que un factor clave en el resultado de la infección es la capacidad de los linfocitos para responder a la presentación de antígeno produciendo IFN-γ, una citoquina Th1 destacada.



17


Crecimiento del parásito

L- Arginina

iNOS

Muerte delparásito

ÓxidoNítrico

Poliamidas Nutrientes clave para

el parásito

Arginasa

CitoquinasTh2

P. ej. IL-10

CitoquinasTh1

P. ej. IFN-γ

Límites de las estrategias actuales para prevenirla leishmaniosis caninaEl ciclo biológico del parásito Leishmania puede romperse en más de un punto. Es probable que la solución ideal implique actuar en más de un punto siempre que sea posible.

Hasta ahora, la prevención de la leishmaniosis canina se ha centrado en los métodos de control del vector. Las fórmulas parasiticidas y repelentes de parásitos pueden proporcionar una eficacia razonable cuando se utilizan en situaciones experimentales ideales. Sin embargo, en condiciones de campo, los mayores problemas con estas opciones provienen de los factores de cumplimiento que no pueden controlarse fácilmente.2 Los collares pueden perderse y los productos de aplicación tópica suelen aplicarse de forma incorrecta, sin un contacto suficiente con la piel. Los propietarios también olvidan a menudo la reaplicación de los productos tópicos o la sustitución de los collares en los intervalos adecuados, dejando así periodos ventana en los que el perro no está protegido.

Incluso con una utilización correcta, ninguno de estos productos tópicos puede prevenir totalmente todas las picaduras del flebotomo.25 La mayoría de estos productos ha demostrado funcionar bien a lo largo de un periodo de tiempo corto, pero existen algunas evidencias que sugieren que la eficacia puede verse reducida a más largo plazo.49 Además, una vez que el perro ha sido contaminado con el parásito, el producto repelente no tiene ningún tipo de influencia sobre el resultado.

El control del estilo de vida puede ayudar a reducir el desafío. Los flebotomos pican sobre todo al amanecer y atardecer, por lo que el mantenimiento de los perros en el interior en estos periodos

Macrófago

1.4

Figura 1.6 Impacto de las citoquinas Th1 y Th2 sobre el metabolismo de la L-arginina en los macrófagos y el impacto resultante sobre el control del parásito


18

Sin embargo, y a pesar de inversiones considerables, hasta ahora no se había conseguido una vacuna en Europa. Esto se debe a la elevada complejidad que conlleva la producción de una respuesta inmune efectiva frente al parásito, como resumió JF Williams en una revisión de las perspectivas de profilaxis del parásito:54

“Los motivos para el optimismo son menos evidentes que los motivos para el entusiasmo”...

... ¡Y así era hasta ahora!

Resumen• La leishmaniosis canina es un problema global grave y extendido.

• Está expandiéndose hacia áreas no endémicas de Europa.

• El ciclo biológico de Leishmania implica la transferencia de la infección entre los vectores y los hospedadores mamíferos susceptibles, como el perro o los seres humanos.

• La susceptibilidad de un perro al parásito depende de varios factores, incluyendo la raza, edad y orientación y eficacia del sistema inmune.

• La citoquina Th1 IFN-γ juega un papel fundamental en la dirección hacia una respuesta inmune correcta.

• Varios autores han opinado que la vacunación podría ser el medio más adecuado para controlar el problema de la leishmaniosis canina.

puede disminuir el número de picaduras. No obstante, como las ventanas suelen dejarse abiertas para ventilar, los flebotomos son atraídos por la luz y pueden entrar en las casas y picar, incluso teniendo mucho cuidado al respecto.50

También se ha intentado prevenir la leishmaniosis y la leishmaniasis a nivel epidemiológico, controlando los perros infectados. En algunas áreas del mundo, como en Brasil, se ha probado una estrategia de eutanasia obligatoria de los perros seropositivos por motivos de salud pública y con algunos posibles resultados positivos.51,52 Sin embargo, estas estrategias son muy difíciles de aceptar socialmente en otras partes del mundo. En cualquier caso, el perro es infeccioso para el vector antes de convertirse en seropositivo, por lo que este abordaje no es suficiente para romper el ciclo de transmisión.52,53 Los hospedadores cánidos salvajes, como los zorros, también pueden mantener el ciclo de infección a pesar de la eliminación de los perros domésticos que alojan las mayores cargas parasitarias.

El tratamiento de los perros infectados con quimioterápicos puede disminuir la carga parasitaria de forma considerable y es probable que disminuya la presión de la infección de los flebotomos que pican a estos perros. Sin embargo, el tratamiento no convierte al perro en completamente no infeccioso para los flebotomos, por lo que tampoco puede romper el ciclo.21

La solución ideal consiste en volver resistentes a los desafíos naturales a la inmensa mayoría de los perros sin tener que depender únicamente del cumplimiento del propietario y su destreza en la aplicación de las opciones parasiticidas. Un control adicional del vector para disminuir la dosis de parásitos recibidos por un perro vacunado sería, cómo no, complementario de este abordaje fundamental. Esto se sabe hace tiempo, y varios autores han opinado que el método más adaptado para el control de esta enfermedad sería la vacuna.

Hasta ahora, la opción que faltaba era una herramienta para incrementarla efectividad de la respuesta inmune al tratar los desafíos recibidos.

1.5



CaniLeish®: un avancedecisivo en la prevenciónde la leishmaniosis canina2


20


21

2CaniLeish®: un avance decisivoen la prevención de la leishmaniosiscanina

El primer capítulo de la historiaSoluciones a partir de investigaciones de vanguardiaEl desarrollo de esta innovadora vacuna es el resultado de la colaboración entre los equipos de l+D del Institut de Recherche pour le Développement (IRD), BioVétoTest (BVT) y Virbac. Se basa en una patente del IRD relacionada con el cultivo de Leishmania.

El IRD es un instituto público de investigación francés que trabaja en favor del desarrollo de los países del sur. Sus investigaciones se centran en desafíos importantes para el desarrollo en relación con el medio ambiente, desarrollo sostenible de los recursos vivos y estudios sociales y sanitarios. Por lo tanto, tiene un interés considerable en el campo de la leishmaniasis. A principio de los años 90, IRD estuvo trabajando en una nueva y revolucionaria forma de reproducir el ciclo biológico completo de los parásitos de Leishmania sin la utilización de animales de experimentación. Aunque los promastigotes pueden cultivarse de forma repetida in vitro, se pierde su antigenicidad y virulencia. Es necesario hacerles pasar por el estadio de amastigote para revertirlos de nuevo a un estado virulento y antigénico.

IRD obtuvo una patente para el sistema de cultivo sin suero ni células descubierto gracias a esta investigación básica. Con este nuevo sistema no solo se consiguió producir todos los estadios del desarrollo del parásito sin utilizar animales de experimentación sino que también se pudo conseguir un sistema de producción del parásito considerablemente más rápido al mismo tiempo que se mantenían sus propiedades virulentas y antigénicas. Además, dado el exclusivo medio de cultivo utilizado, todas las proteínas del sobrenadante son producidas por los parásitos. Son las llamadas ‘proteínas secretadas-excretadas’ o PSE.55 IRD otorgó una licencia exclusiva a BVT para la utilización de esta patente en aplicaciones para la salud animal.

BVT es una compañía especializada en diagnóstico, 100% filial de Virbac. Se estableció inicialmente como compañía independiente, también a principio de los años 90, como respuesta a la necesidad de los profesionales veterinarios de disponer de tests rápidos y económicos. Los primeros tests producidos por BVT fueron Leishmatest (un test rápido de aglutinación) y Fluoleish (un test IFI, el método de laboratorio de referencia). Al desarrollar la gama de la compañía, la utilización de antígenos producidos mediante las innovadoras condiciones de cultivo desarrolladas por el IRD propició una estrecha colaboración entre ambas organizaciones.

En 1998, cuando creció el conocimiento sobre los mecanismos inmunitarios de la leishmaniosis, BVT y el IRD decidieron trabajar conjuntamente para evaluar el uso potencial de los antígenos PSE junto con un adyuvante para la vacunación inmunoterapéutica en casos de leishmaniosis canina clínica. Todo el trabajo previo sobre los efectos de las PSE sobre el equilibrio inmune había sido realizado en ratones, y los resultados fueron prometedores.56,57

Se consiguieron resultados alentadores en un pequeño ensayo con casos clínicos que indicaban que las proteínas PSE podían acabar desplazando la respuesta inmune hacia un tipo Th1 más apropiado y también mejorar la salud global de los perros.58 Las pruebas experimentales y de campo con un prototipo de vacuna PSE formulada con el adyuvante muramil dipéptido (MDP) en perros sanos también dieron resultados positivos, indicando que estas proteínas podrían proteger frente a la leishmaniosis canina.59,60

2.1


22

¿Qué significa exactamente PSE?

Si analizamos el extracto completo de proteínas de los promastigotes de L. infantum podemos identificar más de 2000 proteínas. Sin embargo, una proporción elevada de las mismas son proteínas internas, por lo que quedan fuera del alcance del sistema inmune como puntos para atacar al parásito vivo. De hecho, se ha sugerido que la respuesta inmune frente a algunos antígenos inmunógenos internos del parásito (liberados tras la muerte del parásito) podría contribuir a la progresión del estado de enfermedad.64 Una vacuna que utilizara parásitos muertos enteros contendría todas estas proteínas, de las que una gran parte carece de importancia y algunas pueden ser perjudiciales.

Las PSE son proteínas excretadas y secretadas por varios protozoos parásitos, incluyendo Toxoplasma, Plasmodium, Babesia, Leishmania y otros. Este grupo de proteínas posee varias funciones importantes, incluyendo alguna de especial interés para nosotros. Estas funciones importantes incluyen su contribución a la infección de la célula por parte del parásito y la multiplicación intracelular posterior además de la modulación de la respuesta inmune del hospedador.56 Entre las proteínas liberadas, aquellas que confieren una ventaja selectiva al parásito son un objetivo adecuado para las intervenciones terapéuticas o preventivas. Además, varias proteínas de este grupo existen en dos formas: la forma secretada y excretada y la forma anclada en la membrana celular superficial.65 Esto significa que algunas de estas proteínas también son antígenos diana de la superficie del parásito.

El departamento I+D de Virbac se unió a BVT y al IRD en 2003 para respaldar este proyecto. Siguió invirtiéndose considerablemente en experiencia, tiempo y recursos económicos para definir mejor, mejorar y seguir desarrollando el producto hasta llegar a la situación actual. Durante este tiempo también se definieron los parámetros para la producción industrial y se cambió el adyuvante por QA-21, que ofrece mejor tolerancia y es conocido por estimular la respuesta inmune tipo Th1 incluso con más fuerza que MDP.61-63

CaniLeish® – Una vacuna especializaday altamente evolucionadaCaniLeish® consta de varios componentes (véase la figura 2.1). Cada uno desempeña un papel importante en la producción y actividad de esta nueva vacuna.

2.2

Antígenos - PSE, un mínimo de 100 µg

Adyuvante - QA-21, 60 µg

Excipiente del liofilizado - TMS

Disolvente - 1ml de NaCl al 0,9%

2.2.1

2Un avance decisivo en la prevenciónde la leishmaniosis canina

Figura 2.1 La vacuna


23


Es importante que el sistema inmune pueda procesar estas proteínas para estimular la proliferación de linfocitos T. Los estudios de la proliferación de linfocitos de ratón específicos contra Leishmania realizados por Rosa y colaboradores concluyeron que las PSE de L. infantum estimulan mejor la proliferación de los linfocitos T que la proteína bruta del parásito.56

Gracias al método exclusivo de producción utilizado para fabricar CaniLeish®, toda la proteína del sobrenadante en los cultivos es PSE.

El análisis de las PSE, en contraste con el del extracto de parásito entero, solo identifica entre 50 y 100 proteínas.

Se trata de algo mucho menos complejo que el extracto de parásito entero, lo que hace más factible su caracterización. Así pues, se ha identificado a las proteínas principales. Curiosamente, una proporción considerable de las proteínas PSE estaba formada por miembros de la familia del antígeno de superficie del parásito (ASP). El ASP ya ha sido definido en varias publicaciones como un importante antígeno de superficie de interés.66-68

El ASP es una familia de glicoproteínas importantes que inicialmente se creía que solo se expresaba en los promastigotes, por lo que se les llamó antígeno de superficie del promastigote. Sin embargo, cuando se descubrió que también se expresaban en amastigotes, se propuso el cambio de nombre aunque el acrónimo ASP permanece invariable.69 Estas proteínas se expresan sobre la superficie de la membrana del parásito y también son excretadas por casi todos los miembros del género Leishmania.65 Trabajos adicionales han demostrado que el ASP es producto de varios genes localizados en más de un cromosoma en ocho subfamilias.70 Casi todos estos genes ASP están altamente conservados entre las distintas cepas de L. infantum, y también entre las especies L. infantum, L. major y L. braziliensis.70

También se ha demostrado que, a pesar de que algunas especies de Leishmania modifican el nivel de ASP entre los diferentes estadios, en L. infantum71 se expresa de forma constitutiva tanto en promastigotes como en amastigotes. Esto es extremadamente importante porque el parásito llega al cuerpo del hospedador en forma de promastigote pero pasa la mayor parte de su vida en el perro en forma de amastigote.

A pesar del interés obvio por el ASP, la presencia de un parásito tan complejo en el organismo en más de un estadio de su ciclo biológico hace que siga siendo beneficioso disponer de una selección relativamente amplia de dianas antigénicas importantes. Esto es lo que ocurre con las PSE en lugar de con una proteína ASP única.

Figura 2.2 Promastigotes de L. infantum en un cultivo

Cop

yrig

ht: V

irbac


24

Producción de PSE - Un sistema de producción de antígenos únicoy adaptado

El innovador proceso de producción de las PSE que contiene CaniLeish® proporciona una fuente única y extremadamente bien adaptada de antígenos para esta vacuna.

Los parásitos se cultivan en un medio que no contiene células ni suero. Reciben suplementos con todas las moléculas micronutrientes (sales, azúcares, hemina, tampón, nucleótidos, vitaminas y aminoácidos) necesarios en cada estadio del desarrollo en este medio completamente definido para permitir que sigan creciendo y multiplicándose. Se empieza con un pequeño vial de siembra y se va aumentando el volumen de medio de crecimiento de forma secuencial para proporcionar un lote de producción final del cultivo (véase la figura 2.3).

Este ingenioso sistema de cultivo, desarrollado y patentado inicialmente por el IRD al principio de los años 90 y adaptado y perfeccionado posteriormente para su uso industrial por Virbac I+D, proporciona una fracción líquida en la que las únicas proteínas presentes son las PSE del parásito. Todas las proteínas son producidas de forma natural por los propios parásitos de Leishmania, y con las modificaciones post traduccionales adecuadas tales como la glicosilación se asegura la retención de la conformación original. Esto es especialmente importante a la vista de un ensayo llevado a cabo con otra vacuna candidata en la que los antígenos, inicialmente prometedores, no pudieron proporcionar protección cuando se produjeron en forma de proteína recombinante con múltiples subunidades.72 Los trabajos en los que se utiliza ASP de L. major han demostrado que tiene un efecto protector en ratones cuando se expresa en parásitos de Leishmania, pero no cuando se expresa en bacterias Escherichia coli (E. coli), a pesar de seguir estimulando preferentemente una respuesta Th1. Esto confirma la necesidad de retener la conformación original.73

Viales de siembra

Puntos clave:

• Las proteínas PSE estimulan mejor la inmunidad mediada por células que los extractos de parásito entero.

• La fracción ASP de las proteínas PSE es una diana antigénica conocida y deseable y se encuentra en cantidades elevadas.

• Se encuentra en todos los estadios del ciclo biológico y está altamente conservada entre cepas del parásito.

2.2.2


Figura 2.3 Aumento secuencial del volumen de cultivo para producir los lotes finales


25


Tras haber completado un lote de producción, se asegura la pureza final de las PSE aisladas gracias a una filtración. Esto proporciona la certeza de haber eliminado todos los parásitos, que se asegura posteriormente mediante el cultivo del producto final sobre un medio de crecimiento específico y mediante pruebas sobre la membrana del filtro para confirmar su integridad (véase la figura 2.4).

El filtrado también permite eliminar las otras pequeñas moléculas restantes del medio de cultivo como sales o azúcares además del exceso de agua para conseguir una elevada concentración de las proteínas producidas por los parásitos durante su crecimiento (véase la figura 2.5).

Parásitos

Proteínas

Sales, azúcares, etc.

Agua

Membrana

Proteínas

Sales, azúcares, etc.

Agua

Membrana

El resultado de este proceso es una solución estéril de proteínas altamente concentradas, todas ellas elaboradas por parásitos de Leishmania y que, por consiguiente, retienen su conformación original. Esto proporciona una solución ideal de antígeno con una selección de proteínas parasitarias que puede ser utilizada para estimular la respuesta inmune contra todos los estadios del parásito.

Figura 2.4 Un proceso de filtración elimina los parásitos y retiene las PSE

Figura 2.5 Otro proceso de filtración permite concentrar las PSE producidas


26

¿Cómo se pueden obtener PSE de calidad constante a partir de un parásito tan delicado como éste?

Los parásitos de Leishmania tienen un gran poder de adaptación y pueden cambiar sus características de forma considerable en respuesta a leves cambios en su entorno inmediato o, en este caso, en el sistema de cultivo. Es fundamental asegurar que no haya cambios en la cepa del parásito como consecuencia de pasos seriados. La utilización de un “sistema de siembra de lotes” elimina la posibilidad de cambios en las características del parásito a lo largo del tiempo y asegura la uniformidad durante más de 100 años de producción.

También es esencial disponer de sistemas rigurosos y adaptados de control de calidad durante el proceso de elaboración para asegurar que cada lote responderá tan bien como los lotes usados para el desarrollo y pruebas de la vacuna.

Se controla cada uno de los pasos del proceso de fabricación de manera estricta para asegurar que el entorno del parásito se mantiene dentro de un reducido margen de parámetros. Además, se elaboraron varias pruebas de control de calidad específicas durante el desarrollo de CaniLeish® para permitirnos detectar pequeños cambios en el perfil de las PSE producidas y rechazar cualquier lote que no se ajustara a estrictos requerimientos.

Una prueba desarrollada específicamente por el Laboratorio de Desarrollo Biológico de Virbac produce una “huella proteica” que es capaz de detectar cualquier perfil alterado en las PSE (véase la figura 2.6). Puede poner de manifiesto contaminantes proteicos inesperados o poner de relieve daños secundarios de las proteínas, por ejemplo por calor. Cada uno de los lotes de PSE producido se somete a un análisis informático del “índice de similitud” para poder detectar cualquier lote que no coincida con la muestra de referencia. Esta técnica también se utiliza para evaluar la estabilidad del producto durante su conservación y para confirmar su durabilidad. De este modo se asegura un producto de una calidad muy constante.

Refe

renc

ia

Similar Nosimilar

Nosimilar

Acep

tabl

e

Refe

renc

iaD

añad

o

Refe

renc

iaD

añad

o

2.2.3


Cop

yrig

ht: V

irbac

Figura 2.6 Ejemplo de huella proteica mediante electroforesis como las que se usan en los controles de calidad


27


¿Por qué se eligió QA-21 como adyuvante para esta vacuna?

El requisito principal para una vacuna contra la leishmaniosis canina es que produzca una fuerte respuesta inmune mediada por células Th1. La inyección de antígenos inactivados solos no suele producir resultados de este tipo de forma eficaz. Por otro lado, muchos adyuvantes convencionales solo son eficaces en la estimulación de una respuesta inmune humoral.

Los adyuvantes tipo saponina poseen la rara habilidad de estimular una inmunidad mediada por células además de una inmunidad humoral con dosis bajas.74,75 Su capacidad excepcional para estimular la respuesta Th1 y la producción de linfocitos T citotóxicos los hace ideales para vacunas dirigidas contra patógenos intracelulares.75 Quil-A, una de las primeras saponinas adyuvante, es una fracción parcialmente purificada de la corteza del árbol Quillaja saponaria que contiene una compleja mezcla de moléculas. Sin embargo, se la considera demasiado tóxica para ser utilizada en vacunas humanas, habiendo producido reacciones locales graves con granulomas y hemolisis en muchos casos.74-76

Una estrategia que puede utilizarse para conservar el efecto adyuvante de las saponinas a la vez que se mejora su seguridad consiste en utilizar fracciones concretas con una actividad adyuvante y una baja toxicidad identificadas altamente purificadas. QA-21 es una saponina purificada integrante de Quil-A. Posee un muy buen perfil de seguridad y ha demostrado ser aceptable en ensayos con vacunas humanas (en los que se conoce como QS-21) en los que fue bien tolerada.76,77 Se encuentra en la vacuna candidata más avanzada contra la malaria, que actualmente está en las pruebas de la fase III.78 También ha sido utilizada durante muchos años en la vacuna Leucogen® para FeLV en gatos con un excelente perfil de seguridad. QA-21 es considerablemente más segura que Quil-A, y en pruebas con otro prototipo de vacuna para Leishmania indujo el mayor nivel de producción de IFN-γ en perros vacunados que cualquier otro adyuvante probado, incluyendo Quil-A y la saponina Riedel de Haen.75 Esto significa que posee un excelente perfil beneficio : riesgo.

COOHCHO

OH

OH

OH

OH

OH

O

CH2OH

O

O

O

O

OO

OO

O

OH

OO

OH

OH

OOH

OH

O

OH

O

O

O

OO

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

2.2.4

Figura 2.7 Estructura química de QA-21


28

¿Qué papel juega el excipiente para liofilización?

Durante la conservación de las vacunas a base de proteínas, los antígenos pueden sufrir varias reacciones de degradación que pueden llegar a destruir la eficacia de la propia vacuna. Para prevenir que esto ocurra, puede utilizarse una formulación liofilizada que requiera el uso de un excipiente para la liofilización apropiado. El excipiente de CaniLeish® contiene un tampón (Tris) para mantener un pH correcto, un lioprotector (sacarosa) para prevenir el daño en las proteínas durante el proceso de congelación y un agente que proporciona la masa para el granulado liofilizado (manitol).

¿Cómo se eligieron los niveles de antígeno y adyuvante?

Durante la extensa fase de desarrollo de CaniLeish® se probaron muchas formulaciones de la vacuna que utilizaban cantidades distintas de PSE y QA-21.

La realización de pruebas para la inmunidad mediada por células específica frente a Leishmania demostró que las vacunas formuladas con tan solo 60μg de QA-21 produjeron resultados muy parecidos a las formuladas con cantidades superiores, pero con una mejor tolerancia local.

Las mismas pruebas también demostraron que se necesitaba un mínimo de 100μg de PSE asociados al adyuvante para asegurar que todos los perros produjeran sistemáticamente una inmunidad específica mediada por células con resultados por encima del umbral.

Así, para conseguir un beneficio protector máximo con el mayor margen de seguridad, se determinó que la formulación final debía contener al menos 100μg de PSE junto con 60μg de QA-21.

Resumen

•CaniLeish® es un avance decisivo en la prevención de la leishmaniosis canina.

•Las proteínas PSE estimulan mejor la inmunidad mediada por células que los extractos de parásito entero.

•Una consecuencia del método exclusivo de producción usado para fabricar CaniLeish® es que toda la proteína del sobrenadante en los cultivos es PSE.

•Una proporción considerable de las PSE está formada por miembros de la familia ASP, una diana antigénica deseable.

•Las modificaciones postraduccionales, tales como la glicosilación, aseguran la retención de la conformación original de la proteína.

•Las PSE pueden utilizarse para cebar la respuesta inmune frente a todos los estadios del parásito.

•QA-21 dirige al sistema inmune para asegurar la respuesta de memoria Th1 apropiada.

2.2.5

2.2.6

2.3



CaniLeish®:eficacia probada3


31

AntecedentesEl objetivo primario de la vacunación contra cualquier enfermedad protozoaria es el de minimizar el número de perros vacunados que progresa hacia un estado de enfermedad sintomática en el que la vida del perro está en peligro y se requiere tratamiento. No obstante, en el contexto de la naturaleza extremadamente variable de la leishmaniosis canina, también tiene mucho valor el minimizar el número de animales en el grupo de perros con infección asintomática (véase la figura 1.4). Estos perros, aunque no aparenten sufrir la enfermedad y por ello no sean motivo de preocupación a menos que el propietario tenga conciencia de ello, siguen siendo infecciosos para el vector y, en consecuencia, siguen contribuyendo de forma considerable a la epidemiología de la enfermedad.33 También tienen el riesgo de progresar hacia el estadio sintomático.4,21

Para poder conseguir estos objetivos, el principal requisito para una vacuna contra la leishmaniosis canina es que induzca una inmunidad sólida, específica y mediada por células apropiada para un patógeno intracelular.79 Una respuesta como esta será capaz de reconocer el antígeno y desarrollar una memoria inmunológica de larga duración con una fuerte polaridad Th1 que, a su vez, podrá desencadenar una respuesta activa eficaz con predominio Th1 en los encuentros posteriores con el parásito. Esta forma de respuesta ya ha sido revisada profundamente en la sección 1.3. Durante el desarrollo de CaniLeish® se han investigado tanto el objetivo (protección clínica) como el requisito (estimulación específica de una inmunidad mediada por células con respuesta de memoria Th1).

Protección clínica demostradaPara dar respuesta a la necesidad de demostrar la protección clínica (objetivo de la vacunación), CaniLeish® ha demostrado su beneficio de dos maneras.

Primero, en un modelo de desafío experimental diseñado para demostrar la duración de la inmunidad y, segundo, en un ensayo en estación en el que se expuso a los perros a presiones elevadas y continuadas de infección natural a lo largo de dos temporadas de transmisión.

Un modelo experimental de desafío demuestra la excelente capacidad de protección de CaniLeish® un año después de la última vacunación

En circunstancias normales, la prueba definitiva para una vacuna, y requerida para su registro, es un estudio de desafío experimental. Sin embargo, la producción de un modelo de desafío adecuado para esta enfermedad es todo un desafío en sí mismo.35,72 Un desafío normal en condiciones de campo consiste en la exposición repetida a un número relativamente pequeño de promastigotes inoculados intradérmicamente junto con la saliva del flebotomo. Los trabajos realizados sobre infecciones naturales con L. infantum sugieren que, bajo condiciones óptimas para el vector, los perros de algunas áreas rurales mediterráneas pueden recibir hasta una picadura infecciosa por hora a lo largo de la noche en los meses cálidos.72 La respuesta a esta exposición es muy variable y muchos perros pueden controlar de forma efectiva este nivel de desafío. Esto significa que puede ser difícil desarrollar modelos de desafío artificial en los que se induzcan infecciones activas y repetibles en un porcentaje elevado de los casos. Algún trabajo ha demostrado que la administración intravenosa de promastigotes puede aumentar su infectividad.80 Se probaron varias cepas del parásito para el desafío y se acabó desarrollando satisfactoriamente un modelo de desafío útil que se adaptaba a la evaluación de la duración de la inmunidad proporcionada por una vacuna para leishmaniosis canina.

3CaniLeish®:eficacia probada

3.1

3.2

3.2.1


32

Se utilizaron veintiséis perros de seis meses de edad sin contacto previo con Leishmania.81 Se sometió a diez perros al programa normal de vacunación de tres inyecciones a intervalos de tres semanas. Se formuló la vacuna para que contuviera un 10% menos de antígeno que una dosis comercial normal, requerimiento habitual para el estudio de los modelos de eficacia con fines de registro y para asegurar que el producto se prueba en condiciones difíciles. Otros diez perros sirvieron de control sin vacunación. Había cinco machos y cinco hembras en cada grupo.

Un año después del programa de vacunación inicial, momento en el que debería aplicarse un refuerzo, todos los perros se sometieron a un desafío mediante inyección intravenosa de 108,5 promastigotes de L. infantum altamente virulentos. Estos promastigotes fueron preparados a partir de amastigotes obtenidos del bazo de perros infectados para asegurar su infectividad. Este número tan elevado de parásitos virulentos inoculados y la ruta intravenosa de inyección elegida para favorecer una rápida diseminación por el organismo representaron unas condiciones extremas de desafío artificial diseñadas para producir una infección activa en el máximo número de perros.

Se siguió de cerca el estado clínico de cada uno de los perros durante el año siguiente. Se examinó su médula ósea en varios momentos mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para detectar la presencia de ADN del quinetoplasto del parásito y también mediante cultivo para detectar la presencia de parásitos vivos. La utilización de esta técnica qPCR altamente sensible permitió la detección positiva de un umbral de 0,1 parásitos por tubo de muestra. También se realizaron pruebas para evaluar la respuesta inmune humoral y la mediada por células.

GrupoTIEMPO

S0 S15 S23 S32 S40 S47

Perros vacunados 0 50 50 50 40 30*

Perros control 0 80 80 70 70 80*

Desglose de los resultadosEn el grupo control:

•Siete perros tuvieron resultados positivos para PCR y cultivo, y permanecieron así durante el resto del estudio.

•Dos perros tuvieron resultados positivos para PCR la semana 15 pero mantuvieron cultivos negativos; uno de los perros pasó a tener un resultado negativo para PCR la semana 23 y el otro la semana 32.

•Un perro tuvo un resultado positivo para PCR al final del estudio pero mantuvo cultivos negativos.

•Ninguno de los perros bloqueó completamente el desafío antes de que se extendiera a la médula ósea.

Utilizando las definiciones provenientes del estudio en estación (véase la sección 3.2.2 para una explicación completa), el desglose definitivo al final del estudio fue el siguiente: siete perros tuvieron una infección activa asintomática, un perro fue positivo solo a ADN y dos perros se mantuvieron libres de Leishmania.

# >0,1 parásitos por tubo de muestra* significativamente distinto p=0,0246 (prueba chi-cuadrado)

3Eficacia probada

Tabla 3.1 Porcentaje de perros con PCR positiva# durante la fase de desafío (la semana 0 es un año después de la última vacunación e inmediatamente antes de la inoculación IV de 108,5 promastigotes)


33


En el grupo vacunado:

•Cinco perros tuvieron resultados positivos para PCR y cultivo; tres perros permanecieron así durante el resto del estudio, mientras que dos pudieron controlar la infección y tener resultados negativos tanto para PCR como para cultivo al final del estudio.

•Dos perros tuvieron resultados positivos para PCR la semana 15 pero mantuvieron cultivos negativos, y ambos pasaron a tener un resultado negativo para PCR la semana 23.

•Tres perros bloquearon completamente el desafío y permanecieron negativos para todas las pruebas a lo largo del estudio.

Utilizando las definiciones provenientes del estudio en estación, el desglose definitivo al final del estudio fue el siguiente: tres perros tuvieron una infección activa asintomática, mientras que siete perros se mantuvieron libres de Leishmania.

Es especialmente notable que tres de los perros vacunados permanecieran negativos para ambas pruebas a lo largo de todo el estudio. El número extremadamente elevado de parásitos administrado intravenosamente hace que fueran rápidamente detectables en la médula ósea. Además, la qPCR sigue pudiendo detectar fragmentos de parásito que permanecen en la médula ósea durante un tiempo después de que hayan muerto. Esto hizo que todos los perros control dieran positivo al menos en una ocasión en este estudio. Este intenso desafío intravenoso también produjo una tasa muy elevada de infección activa en los perros control en comparación con la esperada con el desafío intradérmico natural y normal recibido en áreas incluso altamente endémicas.

En este estudio, en que se administró un desafío intravenoso masivo con promastigotes virulentos de L. infantum un año después de haber completado la primovacunación, las distintas respuestas al desafío en los dos grupos demuestran un claro beneficio de la vacunación con CaniLeish®. Este beneficio es evidente incluso a pesar de que el desafío tuvo lugar un año después de las vacunaciones y sin administrar ningún refuerzo, lo que confirma que la inmunidad tiene una duración mínima de un año.

También puede apreciarse claramente este beneficio cuando se representa gráficamente la carga parasitaria en la médula ósea medida mediante qPCR (véase la figura 3.1). Hay un aumento constante de la carga parasitaria media a lo largo del tiempo en los perros control. Sin embargo, a pesar de un incremento inicial en la carga parasitaria media de los perros vacunados, hay un descenso hacia el final del estudio. Este perfil refleja el impacto de CaniLeish® en los perros con infección activa asintomática que consiguieron solucionar la infección.

Media geométricade la carga parasitaria /

ml de médula ósea

2.000

1.500

1.000

500

00 10 20 30 40

Semanas despuésdel desafío

Control Vacunados

Figura 3.1 Carga parasitaria en la médula ósea tras un desafío experimental


34

El estudio de un desafío natural demuestra los beneficios convincentes de la vacunación

3.2.2.1 Esbozo del estudioA pesar del interés de los modelos como el que hemos presentado para demostrar la duración de la inmunidad, la mejor prueba para probar la eficacia de una vacuna para una enfermedad como ésta es, por supuesto, reproducir las condiciones de campo tanto como sea posible. En la vida real, los perros no están expuestos a un desafío de dosis única elevada sino a múltiples picaduras infectadas a lo largo de un periodo prolongado durante las temporadas de transmisión.72

Este estudio en estación involucró a 90 perros Beagle (46 vacunados y 44 controles) de aproximadamente 6 meses de edad.82 Fueron obtenidos en un área libre de Leishmania y se confirmó que eran seronegativos para Leishmania y Ehrlichia al comenzar el estudio. Todos los perros recibieron las vacunas convencionales habituales para cachorros (MHP(Pi) o MHP(Pi)LR) y los correspondientes refuerzos siguiendo los protocolos estándares en vigor en las unidades de cría y perreras en los que se alojaban. Los perros del grupo vacunado fueron vacunados con CaniLeish® formulada según las especificaciones comerciales normales y de acuerdo con el programa recomendado (inicialmente tres inyecciones a intervalos de tres semanas seguidas de refuerzos anuales). El tiempo transcurrido entre las vacunas convencionales y CaniLeish® fue de al menos tres semanas en todos los casos.

Entre tres y cuatro semanas después de haber completado el programa de vacunación con CaniLeish®, todos los perros fueron trasladados a perreras a cielo abierto en áreas conocidas por ser altamente endémicas para L. infantum (cerca de Nápoles, Italia, y cerca de Barcelona, España), con una distribución uniforme de perros control / vacunados y machos / hembras en cada lugar. Los lugares fueron seleccionados tras haber examinado detalladamente los datos epidemiológicos de años anteriores para asegurar que los perros estarían expuestos a una presión parasitaria extremadamente elevada a lo largo del periodo de estudio. El traslado se programó para que los perros llegaran a mediados de julio en el caso de Italia y a finales de junio en el caso de España y asegurar así una rápida exposición a un nivel elevado de desafío infeccioso natural. Estuvieron alojados continuadamente en el exterior y sin tratamientos repelentes para los flebotomos; aunque se permitieron tratamientos no repelentes esporádicos para pulgas y garrapatas cuando fue necesario.

80 perros completaron el estudio (41 vacunados y 39 controles). A lo largo del periodo de seguimiento de dos años, diez perros murieron por causas no relacionadas con la leishmaniosis, por ejemplo por enfermedades no relacionadas, heridas, peleas, etc. sin diferencias entre los dos grupos. Dado que cuatro de las muertes en el escenario español mostraron indicios de estar causadas por leptospirosis (dos vacunados y dos controles), se introdujo una vacunación semestral contra leptospirosis con Nobivac® para los perros españoles (habían sido vacunados previamente con Duramune®) siguiendo los protocolos vigentes en las perreras. Se sometió a estos perros a una evaluación completa para asegurar que la leishmaniosis no jugaba ningún papel en el cuadro de enfermedad.

El seguimiento de los perros del escenario italiano se llevó a cabo en colaboración con el Departamento MIPI del Istituto Superiore di Sanità de Roma y la Universidad Federico II de Nápoles bajo la supervisión de los Drs. L. Grandoni y G. Oliva.

El seguimiento de los perros del escenario español se hizo en colaboración con el Centro Colaborador de la OMS para Leishmaniasis Instituto de Salud Carlos III de Madrid bajo la supervisión de los Drs. C. Cañavate, J. Moreno y J. Nieto.

El estudio fue ciego y los investigadores clínicos y el personal que realizó los análisis en el laboratorio desconocían a qué grupo pertenecían los perros.

3.2.2

3Eficacia probada


35


3.2.2.2 Parámetros monitorizados durante el estudioSe monitorizó de forma regular la condición clínica de los perros y su estado respecto a Leishmania a lo largo de la fase de exposición natural del estudio y de acuerdo con el programa de la tabla 3.2. Todos los perros estaban sanos y libres de Leishmania en el momento de inclusión (mes -2) y cuando fueron trasladados a las áreas endémicas para empezar la fase de desafío (mes 0).

Elemento M0 M3 M6 M9 M11 M12 M15 M18 M21 M23 M24

Examen clínico completo

Serología (IFI, PSE y ASP IgG1/IgG2 mediante ELISA)

Hematología

Bioquímica

Cultivo de parásitos

nPCR

qPCR

Vacunación refuerzo con CaniLeish®

A) Para evaluar el estado respecto a Leishmania se realizaron las pruebas nested PCR (nPCR) y qPCR sobre médula ósea, y el cultivo con aspirado de linfonodo (Italia) o bien de médula ósea (España).

Se realizaron dos técnicas distintas de PCR en laboratorios distintos para aumentar la sensibilidad de la detección. Un perro que diera positivo en cualquiera de las dos pruebas PCR pasó a ser considerado PCR positivo. Se utilizó médula ósea para estas muestras porque es conocida como una de las muestras más específicas y sensibles para el diagnóstico de la leishmaniosis mediante PCR.21

La nPCR se llevó a cabo en el Departamento MIPI, Istituto Superiore di Sanità, en Italia y en el Instituto de Salud Carlos III de Madrid en España. Ambos laboratorios usaron las mismas secuencias para el primer. La nPCR consiste en un proceso PCR de dos pasos en el que: [1] se amplifica la región del gen que codifica la subunidad pequeña ribosomal (de la que existen múltiples copias en cada parásito) y [2] un fragmento más pequeño de la primera diana se reamplifica usando otra pareja de primers específicos. Este método es más sensible y específico que la PCR convencional pero conlleva el riesgo de una mayor posibilidad de contaminaciones, debido a una mayor manipulación de la muestra.83

Tabla 3.2 Programación de las acciones durante la fase de desafío de 24 meses


36

La qPCR se llevó a cabo en los laboratorios de Virbac I+D. Esta prueba amplifica un fragmento de ADN que se encuentra en los minicírculos de ADN del quinetoplasto. Existen aproximadamente 10.000 copias del gen por parásito, lo que permite la aplicación de un umbral muy sensible de 0,1 parásitos por tubo de muestra. Esto equivale a 40 parásitos por mililitro de médula ósea. Si comparamos esto con el hecho de que un solo macrófago infectado puede contener varios parásitos, se puede apreciar que se trata de una prueba extremadamente sensible. Además, también es más específica.83

Los cultivos se realizaron en el Departamento MIPI para los perros de Italia y en el Instituto de Salud Carlos III para los perros de España. Las muestras se obtuvieron de la médula ósea o del linfonodo (en función del lugar) porque se sabe que estos son los dos órganos linfoides en los que el parásito alcanza niveles elevados en las etapas iniciales de la infección.84 Una punción del bazo también habría proporcionado resultados fiables, pero no resultaba práctica en el contexto de este estudio por los riesgos inherentes de esta práctica. Las muestras se inocularon directamente en medio bifásico y se monitorizaron para detectar el crecimiento de los parásitos. Se eligió el cultivo dada la sensibilidad superior de esta técnica respecto a la visualización directa del parásito en extensiones. En este estudio descubrimos que el cultivo también permitía detectar infección activa asintomática en una fase más temprana que la elevación del título IFI, lo que confirma la utilidad de esta técnica.

B) Para evaluar el estado clínico se utilizaron los resultados de laboratorio (hematología, bioquímica), títulos de serología y los síntomas clínicos.

La hematología y la bioquímica se realizaron en la Universidad de Nápoles en el caso de los perros de Italia y en el Hospital Zoològic Barcelona para los perros de España. Se controlaron los parámetros que puede esperarse que se alteren como consecuencia de la leishmaniosis, incluyendo los recuentos leucocitarios, recuentos de plaquetas, recuentos de eritrocitos, proteínas totales y relación albúmina : globulina. La prueba IFI se realizó en el Departamento MIPI para los perros de Italia y en el Instituto de Salud Carlos III para los perros de España. Suele considerarse que un título prolongado superior a cuatro veces el umbral de positividad está asociado a la progresión de la enfermedad.83 La utilización de esta prueba a intervalos regulares a lo largo del estudio permitió seguir las tendencias a lo largo del tiempo. No obstante, y como la propia vacuna puede causar ocasionalmente un título IFI positivo elevado y transitorio, esta prueba no podía utilizarse como parte del sistema de clasificación durante la fase de seguimiento del estudio.

Se revisaba a los perros a diario y se informaba de cualquier signo de mala salud. Además, se evaluó de forma específica cualquier posible síntoma clínico durante los detallados exámenes clínicos programados. En concreto, se buscaron de forma específica determinados signos, incluyendo trastornos cutáneos como úlceras, nódulos, caspa y onicogriposis, linfadenopatía periférica, esplenomegalia, síntomas oculares como blefaritis, conjuntivitis, queratitis y uveítis, artritis, etc.

3Eficacia probada


37


Parámetros clínicos Estado de infección

Sin evidencia de infección activa

Infección activa confirmada (enfermedad)

Clínicamente sano(≤3 resultados laboratoriales anómalos o ≤2 resultados laboratoriales anómalos + 1 signo clínico compatible con leishmaniosis)

Signos clínicos y/o anomalíashematológicas/bioquímicas(>3 resultados laboratoriales anómalos o >2 resultados laboratoriales anómalos + 1 signo clínico compatible con leishmaniosis)

Libre de Leishmania (no infectado) (PCR -, cultivo -, clínicamente bien)

Solo positivo a ADN de Leishmania(PCR +, cultivo -, clínicamente bien)

Clasificación

Infección activa asintomática(PCR +, cultivo +, clínicamente bien)

Infección activa sintomática(PCR +, cultivo +, sintomático)

3.2.2.3 Clasificación de los perros de acuerdo con el estado de LeishmaniaTras la combinación de los resultados de los análisis parasitológico, bioquímico y hematológico y el examen clínico, se asignó un estado en cada momento y siguiendo el esquema mostrado en la figura 3.2, que está basada en varias referencias de la literatura.21,72,83,85,86

La naturaleza altamente variable del resultado de la exposición al parásito hace que la clasificación sea todo un reto. La infección activa sintomática es relativamente fácil de clasificar, igual que un perro completamente libre del parásito. El problema radica en la definición de un perro que ha estado expuesto al parásito pero no presenta signos clínicos.

La presencia de ADN del parásito en la médula ósea (PCR +) confirma que el perro ha tenido contacto con el parásito y sugiere que el parásito ha sobrevivido el tiempo suficiente para extenderse desde la piel a la médula ósea. Sin embargo, se sabe que los resultados positivos para PCR obtenidos de médula ósea durante o poco después de la exposición de un perro pueden ir seguidos del restablecimiento de resultados negativos.83,87 Este restablecimiento ocurre porque un perro resistente es capaz de eliminar el parásito a pesar de la extensión inicial hacia la médula ósea. Además, la presencia de ADN del parásito en la médula ósea no revela si el parásito está muerto o vivo, de modo que no puede constituir una evidencia de infección activa por sí misma. Puesto que los macrófagos circulan hacia la médula ósea y hay gran cantidad de genes diana de la qPCR por parásito, es de esperar que incluso los perros muy resistentes puedan exhibir resultados positivos transitorios durante un desafío activo como consecuencia de residuos del parásito muerto en los macrófagos. Es por ello que la PCR no está recomendada como prueba de criba rutinaria en perros sanos.83 Gradoni definió a los perros con una PCR positiva pero con extensiones/cultivos negativos y sin enfermedad clínica como “subpatentes” y además señaló que habría “conversión ocasional hacia resultados negativos” en este grupo.72 Es de esperar que la utilización de una vacuna efectiva pueda hacer que este fenómeno sea menos ‘ocasional’ y más frecuente. Si, no obstante, hay un cultivo positivo de la médula ósea, se confirma la presencia de parásitos vivos activos y estos perros se clasifican como con infección activa asintomática. Es mucho más infrecuente que un perro viaje en la dirección contraria y elimine el parásito una vez que ha alcanzado esta fase.72

Figura 3.2 Sistema de clasificación del estado de Leishmania de los perros durante un estudio de desafío natural


38

La repetición de las pruebas incrementa la confianza en este sistema de clasificación. Los perros que dan positivo a la PCR de forma repetida a lo largo del tiempo y luego tienen cultivos positivos se encuentran claramente en progresión hacia el estado de enfermedad. Los perros que dan positivo a la PCR durante un tiempo pero que luego se vuelven negativos está claro que están consiguiendo el control del parásito. De este modo puede seguirse el progreso de los perros a lo largo de un periodo de dos años y evaluar la diferencia entre los perros vacunados y los perros control.

3.2.2.4 Resultados al completar el estudioLas características del estudio son las siguientes:•Había 80 perros en dos escenarios.

•Había 39 perros control y 41 perros vacunados, con ambos grupos divididos equitativamente entre los dos escenarios.

•Los perros se trasladaron a estaciones de desafío elevado en regiones altamente endémicas tras haber completado el protocolo de vacunación y se confirmó el nivel elevado del desafío por el hecho de que el 72% de los perros control dieron positivo a la PCR al menos en una ocasión a lo largo del estudio.

•Perros alojados en el exterior, sin protección contra los flebotomos.

•Evaluaciones a intervalos regulares a lo largo de un periodo de seguimiento de dos años.

1 Diferencia significativa entre el número de perros sintomáticos por grupo en el mes 24; p=0,0462 Diferencia significativa entre el número de perros con infección activa por grupo en el mes 24; p=0,025

La distribución global de los perros entre los que tienen infección activa sintomática, infección activa asintomática y ausencia de infección activa también fue significativamente distinta; p=0,024

Control Vacunados

Group TOTAL 39 41

Infección activa

Sintomático (PCR +, cultivo +, presenciade signos clínicos [puntuación >3])

91

132

31

52

Asintomático (PCR +, cultivo +,clínicamente sano [puntuación ≤3)

4 2

Sin infección activa

Solo positivo a ADN (PCR +, cultivo -,clínicamente bien)

1326

1536

Libre de Leishmania (todas las pruebas -) 13 21

Resulta útil desglosar los resultados para ver la diferencia de incidencia de la infección activa y la diferencia en la proporción de perros que desarrollan enfermedad sintomática. La prevención de estos estados es el objetivo principal de la vacunación.

3Eficacia probada

Tabla 3.3 Resumen del estado de Leishmania de los perros en el mes 24 (tras dos años de exposición en una área altamente endémica)


39


Puede verse claramente en la figura 3.3 que, tras dos años de desafío natural intenso, existe una disminución significativa en el riesgo de progresión hacia una infección activa. Lo mismo puede apreciarse cuando se traza una curva de supervivencia para evaluar estadísticamente el efecto del tratamiento a lo largo del tiempo (véase la figura 3.4).

Sin infección activa

VacunadosControl66,7%

87,8%

12,2%

33,3%

Infección activa

p=0,025

VacunadosControl

Tiempo hasta la infección activap=0,027

0 6 12 18 24

Tiempo (en meses)revacunación revacunación

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

Dist

ribuc

ión

Figura 3.3 Existe una diferencia significativa en el número de perros con infección activa entre ambos grupos tras dos años de desafío

Figura 3.4 Existe una diferencia significativa en las curvas de Kaplan-Meier de los dos grupos en cuanto a la progresión hacia una infección activa a lo largo de los dos años de desafío


40

No sintomáticos

VacunadosControl

76,9%

92,7%

7,3%23,1%

Sintomáticos

p=0,046

En este estudio, la vacunación con CaniLeish® disminuyó aproximadamente cuatro veces la probabilidad de estar activamente infectado y de progresar hacia las fases sintomáticas. Los riesgos relativos son una forma habitual de expresión del riesgo comparativo para un acontecimiento. Se calculan a partir de la relación entre la probabilidad de que el acontecimiento suceda frente a que no suceda.

Si solo tenemos en cuenta las infecciones sintomáticas, que son las infecciones que generan mayor preocupación al propietario, se observa un patrón similar. Se hace evidente un efecto estadísticamente significativo cuando revisamos tanto el número de perros sintomáticos en el mes 24 (véase la figura 3.5) como el efecto del tratamiento a lo largo del tiempo sobre una curva de Kaplan-Meier (véase la figura 3.6).

VacunadosControl

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00

Dist

ribuc

ión

Tiempo hasta la infección sintomáticap=0.047

3Eficacia probada

Figura 3.5 Existe una diferencia significativa en el número de perros sintomáticos entre ambos grupos tras dos años de desafío

Figura 3.6 Existe una diferencia significativa en las curvas de Kaplan-Meier de los dos grupos en cuanto a la progresión hacia una infección sintomática a lo largo de los dos años de desafío

0 6 12 18 24

Tiempo (en meses)revacunación revacunación


41


Estos resultados confirman la eficacia de la vacuna incluso ante la posibilidad de niveles excepcionalmente elevados de desafío natural sin protección adicional contra el vector. Este estudio fue diseñado específicamente para maximizar la probabilidad de que los perros desarrollaran leishmaniosis. Los perros involucrados fueron los del grupo más joven que incluye el registro de la vacuna, y se sabe que la maduración de la capacidad para montar una respuesta inmune mediada por células es más lenta que para la capacidad de respuesta humoral.88 Los escenarios fueron elegidos expresamente para asegurar una presión de infección máxima. En realidad, es muy poco probable encontrar niveles tan excepcionales de desafío en la práctica clínica. Se sabe que una dosis elevada de parásitos está relacionada con un riesgo elevado de progresión hacia la enfermedad clínica.25 Este efecto se observa claramente en el grupo control, en el que 1/3 de los perros se infectó de forma activa y cerca de 1/4 presentó enfermedad sintomática en los dos años de duración del estudio. La incidencia normal de enfermedad clínica en áreas endémicas suele ser inferior al 10% a lo largo de la vida del animal.21

Este estudio confirma que, incluso en el peor de los escenarios, con niveles muy superiores de desafío natural que los encontrados normalmente en perros de compañía, CaniLeish® sigue siendo capaz de proporcionar una reducción significativa del riesgo de infección activa y de enfermedad clínica.

Además, si seguimos el estado de los individuos a lo largo del tiempo, puede observarse que, en comparación con los perros control, una proporción mayor de los perros vacunados es capaz de volver al estado negativo tras haber dado positivo a PCR. La figura 3.7 representa estos datos gráficamente. Puede apreciarse que la muestra final se obtuvo al inicio de la tercera temporada de transmisión y que varios perros exhiben resultados positivos para PCR por primera vez en este momento. La posibilidad de resultados positivos transitorios para PCR durante la exposición ya había sido observada.83 Estos resultados son coherentes con la actividad esperada de la vacuna. No solo previene la entrada del parásito en el organismo sino que orienta la respuesta inmune y hace que el animal sea más capaz de tratar el desafío recibido.

3.2.2.5 Se observó un buen perfil de seguridadTambién se hizo un seguimiento de la seguridad de la vacuna a lo largo de este estudio. Durante la fase de vacunación no hubo reacciones generales tales como fiebre, malestar, etc. relacionadas con la vacuna. Se notaron reacciones locales comúnmente, pero resolvieron espontáneamente en unos días tras la vacunación. Además, no hubo diferencia en el número de perros control y vacunados que desarrollaron enfermedades no relacionadas durante la fase de desafío del estudio. La seguridad de la vacuna se discute con más detalle en el capítulo cuatro.

Conclusión: CaniLeish® cumple con su objetivo y proporciona beneficios clínicos

En estos estudios de desafío, la vacunación con CaniLeish® proporcionó beneficios estadísticamente significativos y constantes a los perros vacunados. En el estudio en estación, la probabilidad de convertirse en infectado activamente y progresar hacia las fases sintomáticas de la leishmaniosis se redujo aproximadamente cuatro veces. Al demostrar concluyentemente la eficacia de la vacuna en tales condiciones extremas, estos datos confirman la utilidad de las propiedades estimulantes de CaniLeish® sobre el sistema inmune para los perros que pueden estar expuestos a este parásito.

3.2.3


42

Libre de Leishmania ADN +AsintomáticoSintomáticoVacunados

41

40

39

38

37

36

35

34

33

32

31

30

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

Perr

os

9 12 15 18 21 24

Controles

9 12 15 18 21 24

39

38

37

36

35

34

33

32

31

30

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

Perr

os

3Eficacia probada

Figura 3.7 Estado de Leishmania de cada uno de los perros a lo largo del tiempo que demuestra la mejor capacidad de los perros vacunados para librarse de la infección


43


ELISA IgG1 (ASP/PSE)

Producciónde IgG1

Evaluación del mecanismo de acciónEl análisis minucioso del mecanismo de acción de CaniLeish® nos permite:

•Estudiar mejor las evidencias referentes al inicio y duración de la inmunidad.

•Comprender mejor cómo produce los resultados obtenidos en los estudios de eficacia.

En los estudios realizados durante el desarrollo de CaniLeish® se midieron varios parámetros. Resulta interesante relacionar estos hallazgos con los mecanismos de la inmunidad antiparasitaria discutidos en la sección 1.3. Recientemente se ha propuesto la investigación de tales parámetros como una importante fuente de datos suplementarios al evaluar cualquier vacuna para la leishmaniosis canina.89 La figura 3.8 muestra el punto en el que estos parámetros (en los óvalos amarillos) encajan en el proceso.

CPA: Célula presentadora de antígenoIFN-γ: Interferón gammaTc: Linfocito T citotóxicoTh: Linfocito T helper

Linfocito T intacto

Macrófago Anticuerpos IgG

Linfocito T

Técnicas

Linfocito B

Estimulación

Macrófagoinfectado

Linfocito T intactoTh1

Producciónde IgG2

Progresiónhacia la enfermedad

Eliminación del parásitoResistencia a la enfermedad

Th1

IFN-γ

CPA

ELISA IgG2 (ASP/PSE)

ELISpot

CMLA

LTT

LTT

Vacuna(PSE, incluyendo ASP)

Th2

DiferenciaciónDivisión

Th1 de memoria

Tc

Supresión

Th2 de memoria

IFN-γ

IFN-γ

Linf. B

Activaciónde la vía del ONLisis del parásito

Macrófago

3.3

Linf. B

Figura 3.8 Pueden utilizarse varios tests en perros para demostrar que la vacuna dirige la respuesta inmune correcta y da como resultado células de memoria Th1 apropiadas capaces de estimular la eliminación del parásito en los macrófagos


44

Respuesta IgG1/IgG2 frente a la vacunación

En las primeras etapas de desarrollo de esta vacuna, la creencia predominante era que la relación IgG2:IgG1 de los perros estaría relacionada con las respuestas Th1/Th2 respectivamente, igual que ocurre en ratones y seres humanos. Como ya hemos explicado, se ha demostrado que no ocurre así.37 Sin embargo, aunque la relación IgG1:IgG2 no puede demostrar la orientación de la respuesta inmune, la capacidad del sistema inmune para producir anticuerpos específicos frente proteínas solubles actúa como marcador simple de la inmunogenicidad del antígeno. También confirma que la proteína ha sido procesada por las células presentadoras de antígeno (CPA) puesto que no se producen anticuerpos contra proteínas solubles antigénicas a no ser que hayan sido procesadas por las CPA. Además, la naturaleza y velocidad de la respuesta de los anticuerpos frente a una exposición subsiguiente a dosis bajas de proteínas del parásito tras haber completado el programa de vacunación puede confirmar la presencia de una respuesta anamnésica (de memoria).

La figura 3.9 muestra los títulos de dos subconjuntos de IgG (IgG1 y IgG2) contra PSE total y antígeno de superficie del parásito (ASP) medidos mediante pruebas ELISA específicas durante un estudio en la fase de desarrollo. En este estudio, diez perros recibieron el protocolo normal de vacunación y se realizó un test cutáneo intradérmico un año después de la última vacuna.90 Esto supuso utilizar una inyección intradérmica de leishmanina (promastigotes de L. infantum desnaturalizados) con el objetivo de evaluar la respuesta inmune local mediada por células indicada por la inflamación específica en el punto en las 48-72 horas posteriores. Los resultados serológicos demuestran que, tres semanas después de haber completado la primovacunación, hay una buena respuesta a las PSE, y al ASP en particular. Además, los resultados muestran que cuando un perro se expone a un antígeno intradérmico de leishmanina un año más tarde se obtiene una respuesta rápida de memoria de tipo IgG. Los diez perros control no desarrollaron ninguna respuesta IgG específica en ningún punto de este estudio

4

3

2

1

0

1og1

0(x+

1)

0 6 8 30 42 58 61

Tiempo (en semanas)

IgG1 PSEIgG2 PSE

vacunaciones

3.3.1

testintradérmico

3Eficacia probada

Figura 3.9 Las respuestas serológicas frente a PSE y ASP demuestran que se retiene una respuesta de memoria al menos durante un año


45


El reconocimiento y presentación del antígeno por parte de las CPA puede estimular una proliferación específica de linfocitosy la polarización Th1 en los perros vacunados

Es fundamental que cuando las CPA procesan el antígeno, éste sea capaz de estimular la diferenciación y expansión clónica de linfocitos Th0 hacia la forma Th1. La forma Th1 es la que está asociada a la producción de IFN-γ y la protección frente al desarrollo del síndrome clínico. Además, en el contexto de la vacunación, es vital que se produzcan linfocitos T de memoria con una polaridad Th1 durante este proceso. Esta producción se evalúa mediante dos pruebas utilizadas en paralelo.91,92 Estas pruebas fueron desarrolladas por el Profesor J. Moreno y su equipo y realizadas en su laboratorio del Centro Colaborador de la OMS para Leishmaniasis del Instituto de Salud Carlos III en Madrid.

El Test de Transformación Linfoblástica (LTT) mide la capacidad de los linfocitos T para expandirse de forma clónica como respuesta a la estimulación con un antígeno específico. Cuando se aíslan los linfocitos de un perro vacunado y se estimulan con el antígeno leishmanina, cada una de las células de memoria específicas para Leishmania existentes responderá de forma rápida expandiéndose para formar un clon de linfocitos Th1 o Th2 dependiendo de la polaridad de la respuesta inmune inicial que causó su formación. De este modo, el LTT demuestra la capacidad de las células del perro para ‘recordar’ el antígeno y responder frente a él en un futuro. No revela la polaridad de su respuesta.

La segunda prueba utilizada en paralelo con el LTT es la prueba InmunoSpot unida a enzima (ELISpot). Esta prueba mide la proporción de linfocitos T del LTT que está produciendo IFN-γ. En consecuencia, puede utilizarse para identificar la producción de clones con una polaridad Th1 apropiada.

Combinando ambas pruebas, puede demostrarse la presencia de una respuesta inmune de memoria apropiada frente al antígeno como consecuencia de la vacunación.

Las muestras de sangre se obtuvieron de perros en varios puntos del estudio de desafío experimental que discutimos anteriormente en la sección 3.2.1. Las muestras fueron evaluadas posteriormente utilizando estas dos pruebas (véase la figura 3.10).

4

3

2

1

0

1og1

0(x+

1)

IgG1 ASPIgG2 ASP

3.3.2

0 6 8 30 42 58 61

Tiempo (en semanas)

vacunacionestest

intradérmico


46

Linfoproliferación específica para antígeno soluble de Leishmania

(con error estándar de la media)

Media en vacunadosMedia en controles

0 9 58 105Semana

Primovacunaciónsemanas 0, 3, 6

Desafío intravenososemana 58

0 9 58 105Semana



1,30

1,20

1,10

1,00

0,90

0,80

0,70

Índi

ce d

e lin

fopr

olife

raci

ón

Media en vacunadosMedia en controles

Producción de IFN-γ ELISpot(con error estándar de la media)

14,00

12,00

10,00

8,00

6,00

4,00

2,00

0,00

Spot

s po

r 2x

510 c

élul

as

3Eficacia probada

Figura 3.10 Las pruebas LTT y ELISpot de producción de IFN-γ ponen de manifiesto la duración de un año de la inmunidad y una respuesta apropiada frente a la infección subsiguiente


47


En la semana 58, los perros aún tienen una fuerte capacidad de producción de IFN-γ como respuesta a la estimulación específica con leishmanina, es decir, antes de haberse encontrado con parásitos de Leishmania y cuando aún tendrían pendiente recibir la vacunación de refuerzo. El resultado ELISpot sumamente fuerte observado en el grupo vacunado en la semana 105, es decir, durante la fase de desafío, confirma que esta orientación Th1 no se invierte como consecuencia de un desafío virulento y se correlaciona con la disminución de la carga parasitaria ya vista en este estudio (véase la sección 3.2.1). Este hallazgo es extremadamente importante a la vista del trabajo hecho en ratones que sugiere que la inoculación experimental de L. major muerta en ratones con inmunidad adquirida de forma natural frente a este parásito tiene como resultado la pérdida de esta inmunidad adquirida como consecuencia de la repolarización de la respuesta inmune hacia una forma dominada por Th2.93

La respuesta de memoria Th1 producida como respuesta a la vacunación es, a su vez, capaz de estimular la respuesta leishmanicida correcta en los macrófagos de los perros

A pesar de demostrar que se sigue el camino hacia la respuesta de memoria Th1 correcta, sigue siendo necesario demostrar que esto tiene como resultado una mayor capacidad de los macrófagos de los perros para controlar el parásito. El Profesor I. Vouldoukis y su equipo desarrollaron la prueba Test de Respuesta Leishmanicida de Macrófagos Caninos o Canine Macrophage Leishmanicidal Assay (CMLA)94,95 y la realizaron en su laboratorio del INSERM, UPMC-UMRS 945, Immunité et Infections, París. En esta prueba se obtiene una muestra de sangre del perro y se aíslan por separado linfocitos y monocitos. Se hace madurar a los monocitos hacia macrófagos y posteriormente se infectan con un número estandarizado de promastigotes. Una vez se ha establecido la infección, se vuelven a mezclar con los linfocitos autólogos.

Si los linfocitos contienen una población de células de memoria Th1 específica para Leishmania, deberían responder a la presentación del antígeno de Leishmania por parte de los macrófagos expandiéndose de forma clónica hacia linfocitos efectores Th1 productores de IFN-γ. Esto, a su vez, debería hacer que los macrófagos cercanos seleccionaran la vía del óxido nítrico (ON) del metabolismo de la arginina, causando así la destrucción oxidativa de los parásitos contenidos en ellos (véase la figura 1.6 y la discusión circundante en la sección 1.3 para repasar esta vía metabólica más detalladamente). Al final de la prueba se hace un recuento de la proporción de macrófagos con parásitos intactos y del número de parásitos por macrófago para proporcionar un índice de actividad leishmanicida. Tras una validación previa, se ha establecido un umbral mínimo para este índice del 30% para poder relacionarlo con una respuesta protectora.

Para brindar una confianza adicional a la prueba se evaluaron más parámetros de forma paralela. También se midió la inducción de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la producción de dióxido de nitrógeno (NO2), medida indirecta de la formación del radical NO de corta vida media en los macrófagos. El resultado de la prueba CMLA solo se considera positivo para un perro individual si también hay un incremento relacionado de la iNOS (>10%) y NO2 (>8 nmol / 105 células / 72h). Por todo esto, un resultado positivo en esta prueba supone la demostración de la existencia de la cascada correcta e intacta de respuestas relacionada con la resistencia a la enfermedad que empieza con la producción de células de memoria Th1 y finaliza con los macrófagos activados.

Para demostrar la duración de la inmunidad de la vacuna es necesario probar el incremento de CMLA como consecuencia exclusiva de la vacunación y no por la exposición al parásito en condiciones de campo. En consecuencia, las muestras para esta prueba también se obtuvieron en distintos momentos del estudio de desafío experimental discutido anteriormente (véase la sección 3.2.1).

3.3.3


48

Los resultados de esta prueba confirman la rápida aparición de la capacidad de eliminación del parásito en las tres semanas posteriores al final de la primovacunación (véase la figura 3.11). Puede notarse que también existe un incremento aparente en el grupo control, aunque mucho menor que para el grupo vacunado. Se cree que se corresponde con la maduración del sistema inmune de estos perros jóvenes. Sin embargo, cabe destacar que ninguno de los diez perros control alcanzó el umbral del 30% en ningún momento y que todos los perros vacunados permanecieron por encima de este umbral en cada ocasión desde la semana nueve a la 90. El ligero incremento adicional observado en la semana 90 es consecuencia de la estimulación adicional por parte de parásitos virulentos en la fase de desafío del estudio.

Los resultados de las pruebas iNOS y NO2 realizadas en paralelo con la prueba CMLA estuvieron relacionados y, de este modo, confirmaron los resultados aquí presentados (véase la figura 3.12). También merece la pena señalar que todos los perros vacunados permanecieron por encima del umbral en estas dos pruebas de soporte entre las semanas nueve y 90. Todos los perros control permanecieron por debajo del umbral hasta la semana 58. En la semana 90, durante la fase de desafío, un pequeño número de perros control alcanzó niveles ligeramente por encima del umbral en ambas pruebas.

Test de respuesta leishmanicidade macrófagos caninos (CMLA)(con error estándar de la media)

50.0

40.0

30.0

20.0

10.0

0.0

Índi

ce C

MLA

0 9 30 58 90

Media en vacunadosUmbralMedia en controles

Semana



3Eficacia probada

Figura 3.11 Los resultados CMLA confirman una duración de la inmunidad de un año y la presencia de una respuesta leishmanicida correcta tras desafíos subsiguientes


49


Expresión iNOS(con error estándar de la media)

Semanas



Índi

ce iN

OS

18,00

16,00

14,00

12,00

10,00

8,00

6,00

4,00

2,00

0,00

0 9 30 58 90

Semanas


14,00

12,00

10,00

8,00

6,00

4,00

2,00

0,00Prod

ucció

n de

NO

2 (nm

ol /1

05 cél

ulas

/72h

)

0 9 30 58 90

Producción NO2(con error estándar de la media)




Figura 3.12 Los resultados iNOS y NO2 confirman la validez de los resultados del índice CMLA


50

CaniLeish® propicia un cambio en la respuesta inmune de memoria hacia a un perfil Th1 apropiado

El primer requisito inmunológico exigido a una vacuna efectiva contra la leishmaniosis canina es que sea capaz de cambiar la respuesta inmune para desarrollar una capacidad de memoria efectiva contra el parásito con predominio Th1. Los datos mostrados arriba demuestran claramente que hay un cambio en el perfil de la respuesta inmune hacia el parásito tras la vacunación. También es obvio que este cambio queda retenido en la capacidad de memoria. Los perros que se encuentran con el parásito por primera vez un año después de la vacunación mantienen la capacidad de montar una respuesta primaria mediada por células y caracterizada por la producción de IFN-γ en sus linfocitos y una capacidad incrementada de eliminación de Leishmania en los macrófagos, entre otros parámetros.

La figura 3.13 está adaptada de una revisión hecha por Reis y colaboradores que tiene en cuenta varios factores implicados en la respuesta inmune frente a Leishmania y sus implicaciones en la búsqueda lógica de vacunas eficaces contra esta enfermedad.89 Ilustra el cambio en la respuesta inmune visto en los perros vacunados y la disminución resultante del riesgo de enfermedad en estos perros

Susceptibilidad Resistencia

Vacunación

Proliferación de linfocitos específicos, IFN-γ en los

linfocitos, índice CMLA elevado,

producción de iNOS y ON

Carga parasitaria incrementada.Respuesta serológica elevada frente al desafío.

Susceptibilidad Resistencia

Proliferación de linfocitos específicos, IFN-γ en los

linfocitos, índice CMLA elevado,

producción de iNOS y ONCarga parasitariaincrementada.Respuesta serológica elevadafrente al desafío.

3.3.4

3Eficacia probada

Figura 3.13 La vacunación eficaz tiene como resultado un cambio de los parámetros inmunes hacia un perfil asociado a la protección (adaptado de Reis y colaboradores89)


51


Conclusión: CaniLeish® cumple tanto con el objetivo como con el requisito para una vacuna eficaz contrala leishmaniosis caninaLos datos tanto del estudio en estación con una presión de infección natural excepcionalmente elevada como del estudio de desafío intravenoso experimental demuestran de manera concluyente la significativa y valiosa reducción del riesgo de infección activa y leishmaniosis clínica obtenidas con la utilización de la vacuna CaniLeish®. Por tanto, CaniLeish® cumple con el objetivo clínico de minimizar el número de perros que progresan hacia un estado de enfermedad sintomática.

Estos hallazgos tienen el respaldo adicional de los datos resultantes de varios parámetros inmunológicos medidos en más de un estudio que demuestran el desarrollo de una respuesta inmune de memoria beneficiosa de orientación Th1.

Por consiguiente, CaniLeish® también cumple con el requisito principal para una vacuna contra la leishmaniosis canina al estimular una respuesta inmune de memoria específica y duradera con una fuerte polaridad Th1.

Estos resultados aportan una importante novedad a este campo: CaniLeish® es la pieza que faltabaHasta ahora solo disponíamos de estrategias centradas en el vector y su contacto con el hospedador canino. Esto significaba que no se podía completar el círculo de protección contra esta enfermedad mortal.

Por primera vez en Europa, CaniLeish® proporciona un método eficaz de control del sistema inmune del perro y favorece considerablemente su resistencia al desafío. Esto conlleva el beneficio de la provisión de una protección sistemática y firme que no se interrumpe, como ocurriría en caso de un mal cumplimiento por parte del propietario con la aplicación de insecticidas tópicos. La verdadera protección para toda la vida y bajo la supervisión directa del veterinario ya es posible.

Las pruebas descritas en este documento se realizaron en los peores escenarios posibles con desafíos mucho más intensos que los experimentados normalmente. Se sabe que, cuanto mayor sea el desafío, mayor es la probabilidad de progresar hacia la enfermedad clínica.25 Sin embargo, CaniLeish® fue capaz de proporcionar beneficios estadísticamente significativos y valiosos a los perros en tales circunstancias extremas.

En condiciones normales de campo en las que la presión de infección natural es inferior y se utilizan insecticidas tópicos para reducir aún más esta presión en perros individuales, la capacidad de estimular de forma correcta la repuesta inmune permite ahora y por primera vez completar el círculo de la protección. Esta capacidad proporciona los niveles más elevados de protección posibles a animales de un valor incalculable para sus propietarios.

3.4

3.5


52

Resumen•Aunque el objetivo primario de la vacunación contra cualquier enfermedad protozoaria consiste en minimizar el número de perros que progresa hacia un estado de enfermedad sintomática, también tiene mucho valor minimizar el número de perros del grupo con infección activa asintomática.

•Un modelo de desafío experimental demostró la excelente capacidad de protección de CaniLeish®

un año después de la última vacunación.

•Tras dos años de desafío natural intenso, la vacunación con CaniLeish® disminuyó aproximadamente cuatro veces la probabilidad de estar activamente infectado y de progresar hacia las fases sintomáticas.

•El reconocimiento y presentación del antígeno por parte de las CPA puede estimular la proliferación de linfocitos específicos y la polarización Th1 en perros vacunados con CaniLeish®.

•La respuesta de memoria Th1 producida como consecuencia de la vacunación es, a su vez, capaz de estimular la respuesta leishmanicida correcta en los macrófagos de los perros.

•Se observa una aparición rápida de la capacidad de eliminación del parásito en las tres semanas posteriores a haber completado la primovacunación y se mantienen durante un mínimo de un año.

•CaniLeish® cumple con el objetivo primario para una vacuna de minimizar el número de perros que progresa hacia un estado de enfermedad sintomática.

•CaniLeish® cumple con el requisito principal para una vacuna contra la leishmaniosis canina al estimular una respuesta inmune de memoria específica y duradera con predominio Th1.

3.6

3Eficacia probada


Canileish®: un excelenteperfil de seguridad4


55

AntecedentesLa seguridad es un punto importante a tener en cuenta con cualquier vacuna. A diferencia de los tratamientos para estados de enfermedad, las vacunas están destinadas a ser administradas a animales sanos de forma optativa. Esto significa que los propietarios suelen estar menos dispuestos a aceptar efectos secundarios de las vacunas en comparación con los fármacos terapéuticos. Por otro lado, el nivel aceptable de reacción a una vacuna también varía en función de la gravedad del problema para el que confiere protección.

Las reacciones adversas a las vacunas suelen clasificarse mediante dos sistemas:

1) Las reacciones se clasifican en “normales’”o “inapropiadas”. La fiebre, malestar, inflamación local y leve dolor local transitorios se clasifican como reacciones “normales” a las vacunas porque son consecuencia de la respuesta inmune normal frente a la vacunación.36

Las reacciones que persisten más tiempo o tienen mayor intensidad se clasificarían como “inapropiadas”.

2) Las reacciones también se dividen en “locales” y “generales”. Las reacciones locales que tienen lugar en el punto de inyección poco después de la administración de la vacuna son relativamente fáciles de vincular al acto de la vacunación. Las reacciones generales tales como trastornos gastrointestinales o malestar son más difíciles de vincular con seguridad a la administración de la vacuna, porque también pueden estar causadas por otros sucesos no relacionados. El tiempo de aparición y la repetibilidad de dichas reacciones pueden ayudar a formar una opinión sobre su importancia.

Se ha realizado un trabajo importante a lo largo del desarrollo de CaniLeish® para asegurar que el elevado nivel de protección que proporciona también vaya asociado a un buen perfil de seguridad y para evaluar las reacciones esperadas que pueden aparecer durante su utilización.

El método exclusivo de producción de antígenos en CaniLeish® reduce el riesgo de reacciones “inapropiadas”Los riesgos más significativos de reacciones inapropiadas asociadas a las vacunas son:36

1) Respuestas alérgicas.

2) Virulencia o toxicidad residuales.

3) Enfermedad en hospedadores inmunodeficientes.

4) Complicaciones neurológicas.

5) Efectos nocivos sobre los fetos.

Las respuestas alérgicas pueden aparecer como respuesta a cualquier proteína y, por lo tanto, como respuesta a cualquier vacuna. Estas reacciones suelen ser raras e idiosincrásicas. También se cree que son más comunes cuando se hace crecer a las vacunas en cultivos celulares o en medios a base de huevo o suero,96 como consecuencia de la posible contaminación de la vacuna con fragmentos celulares o con proteínas de huevo o del suero. Por tanto, sería de esperar que el exclusivo medio de cultivo libre de proteínas utilizado para producir CaniLeish® disminuya aún más este pequeño riesgo.

4CaniLeish®: un excelenteperfil de seguridad

4.1

4.2


56

La virulencia residual y la enfermedad en hospedadores inmunodeficientes están causadas por la administración de organismos inactivados o atenuados de forma inadecuada, o por la incapacidad del hospedador inmunosuprimido para prevenir la replicación de un organismo vacunal atenuado de forma apropiada. CaniLeish® no es ni “viva modificada” ni “muerta”; los parásitos de Leishmania no están presentes en la vacuna. Solo se han incluido proteínas cuidadosamente filtradas del sobrenadante del cultivo y se realizan controles estrictos para evitar cualquier contaminación accidental del producto proteico con organismos de cualquier tipo. Esto significa que no hay organismos vivos que puedan ser virulentos en ningún hospedador, tenga o no tenga un compromiso inmunológico, lo que proporciona un beneficio considerable de seguridad.

Las complicaciones neurológicas suelen ser consecuencia de los efectos primarios del organismo involucrado. En ocasiones poco comunes, los virus que causan enfermedad neurológica (tales como el virus del moquillo canino) pueden conservar la posibilidad de inducir efectos secundarios neurológicos en el estado atenuado. Incluso entonces, la incidencia de problemas neurológicos es poco común y ocurre con una frecuencia muy inferior que los mismos tras una infección natural.97 En CaniLeish®, no hay organismos vivos. Esto significa que no sería de esperar la aparición de efectos secundarios neurológicos como respuesta primaria a la vacuna.

Los efectos nocivos para el feto pueden tener lugar por varios mecanismos. La infección activa del feto con organismos vivos modificados es, quizás, el mayor riesgo. Por supuesto, pueden ocurrir reacciones idiosincrásicas que ocasionan fiebre masiva o shock con cualquier intervención médica y dañan al feto, pero sería de esperar que fueran extremadamente raras. Además, la vacuna no se comercializa para ser utilizada en animales gestantes.

Riesgo Principales causas Pasos tomados para minimizar el riesgo

Respuestas alérgicas

Se cree que los desencadenantes habituales son las proteínas provenientes de los medios de cultivo, como proteínas de huevo, suero bovino u otras proteínas del cultivo celular96

Medio de cultivo exclusivo sin células ni suero, en el que las únicas proteínas presentes provienen de Leishmania

Virulencia o toxicidad residuales.Enfermedaden hospedadores inmunodeficientes.

Inactivación o atenuación inadecuadas de organismos vacunales virulentos

La vacuna no contiene organismos, solo proteínas secretadas-excretadas

Complicaciones neurológicas

Efectos de los organismos vacunales neurotrópicos

La vacuna no contiene organismos, solo proteínas secretadas-excretadas

Efectos nocivossobre los fetos

Los organismos vacunales cruzan la barrera placentaria e infectan al feto

La vacuna no contiene organismos, solo proteínas secretadas-excretadas. Vacuna sin registro para ser utilizada durante la gestación

4Un excelente perfil de seguridad

Tabla 4.1 Riesgos más importantes de reacciones inapropiadas a las vacunas


57


¿Pueden esperarse reacciones “normales” causadaspor CaniLeish®?Las reacciones “normales” se consideran algo esperable e incluso apropiado en ciertos casos con la utilización de todas las vacunas eficaces, aunque pueden seguir siendo motivo de preocupación para los propietarios de animales de compañía. Por consiguiente, pueden esperarse reacciones “normales” causadas por CaniLeish®. Se han realizado pruebas exhaustivas durante el desarrollo de CaniLeish®, de modo que se ha logrado un buen conocimiento de las reacciones esperadas tras la vacunación.

Es útil recordar que la vía inflamatoria forma parte del sistema normal de defensa del organismo y que una vacuna que no induzca cierto grado de respuesta inflamatoria no proporcionará ninguna protección. Los adyuvantes se utilizan para incrementar esta respuesta de forma específica dentro de unos parámetros seguros y, en el caso de CaniLeish®, también para dirigir el equilibrio correcto en esta respuesta con la finalidad de estimular la inmunidad protectora apropiada de tipo Th1. Como consecuencia, podemos esperar que haya una respuesta inflamatoria local con el uso de una vacuna como esta y que sea detectable por el propietario en determinados casos.

También puede observarse hipertermia generalizada y malestar poco comunes en algunos individuos susceptibles con cualquier tipo de vacuna como consecuencia de la respuesta inmune normal a la vacunación.

Estudios detallados han confirmado el perfilde seguridad apropiado de CaniLeish®

Durante la fase de pruebas de CaniLeish® se realizaron varios estudios de seguridad. Alguno de estos estudios se realizó en escenarios experimentales altamente controlados en los que pudieron obtenerse datos muy precisos del tamaño exacto y naturaleza de las inflamaciones locales y respuestas de hipertermia. Los estudios en los escenarios experimentales también fueron diseñados para simular situaciones más severas que las experimentadas por los animales en condiciones normales de campo. Esto se consiguió utilizando perros más jóvenes que los de la edad recomendada, dosis más elevadas de antígenos y no realizando masaje en los puntos de inyección. Estos requerimientos son habituales en estudios de seguridad con objetivos de registro

Se realizaron otros estudios en escenarios de campo en los que podía obtenerse una percepción más normal de la importancia de dichas reacciones para el animal y para el propietario. Estos estudios implicaron a un número muy superior de perros y a varias razas para obtener una mejor visión de qué podía esperarse con el uso diario normal de la vacuna en la clínica general.

Seguridad de una dosis extra

En este estudio,98 diez cachorros de raza Beagle de cuatro meses de edad recibieron cuatro dosis de la vacuna a intervalos de tres semanas. Se afeitó el punto de inyección para apreciar mejor el tamaño de cualquier inflamación resultante. Además, se formuló la vacuna para que contuviera un 10% más de antígeno que una dosis normal y no se realizó masaje en el punto de inyección tras ésta. Se mantuvieron cinco perros sin vacunar como control.

Se examinó a los cachorros justo antes de cada vacunación, cuatro horas después de la vacunación y una vez al día posteriormente y durante dos semanas. Esto implicó la supervisión cuidadosa del punto de inyección, registro de la temperatura rectal y una evaluación del estado general de salud. Además, se obtuvieron muestras de sangre y se evaluó la presencia de cualquier cambio hematológico una vez por semana desde el día -8 (una semana antes de la primera vacunación) y hasta el día 77.

4.3

4.3

4.4.1


58

Los resultados de este estudio pueden dividirse en signos generales y locales.

1) Generales:

•Un cachorro vacunado exhibió una ligera hipertermia durante las cuatro horas posteriores a la primera inyección que resolvió rápida y espontáneamente. Ningún cachorro mostró hipertermia relacionada con la vacunación después de la segunda, tercera y cuarta inyección.

•No se notó ningún impacto sobre el comportamiento general.

•No se notó ninguna diferencia en la ganancia de peso entre los perros tratados y los perros control.

•No se notaron diferencias en los parámetros hematológicos entre los perros tratados y los perros control.

2) Locales:

•No se notó dolor durante la inyección ni con la palpación suave del punto de inyección en los siguientes exámenes de los cachorros.

•Aparecieron hinchazones locales en todos los cachorros vacunados tras todas las inyecciones excepto en un cachorro tras la primera inyección solamente.

•El tamaño máximo de estas inflamaciones fue de diez centímetros en todo momento, pero la mayoría fueron detectables solamente mediante palpación a pesar de haber afeitado la zona. Las inflamaciones aparecieron entre las 4 y 24 horas y todas resolvieron completamente en 12 días, bastante antes del momento para la siguiente inyección.

•Se notaron pequeños nódulos en la zona de inflamación que duraron un máximo de siete días en cuatro y dos cachorros tras la primera y segunda inyección respectivamente.

En términos generales, la administración de cuatro dosis de la vacuna en estos jóvenes cachorros fue bien tolerada. Los únicos hallazgos significativos fueron las inflamaciones locales, leves y transitorias.

Seguridad de una sobredosis

Este estudio también involucró a 15 cachorros de raza Beagle de cuatro meses de edad. Se mantuvo a cinco cachorros como controles y se administró una sola inyección equivalente al 220% de la cantidad normal de proteínas secretadas-excretadas o PSE (es decir, dos dosis de la vacuna formuladas con un 10% más de antígeno de lo normal) a diez cachorros.99 Se afeitaron los puntos de inyección el día antes de la vacunación y no se realizaron masajes tras la vacunación.

Se examinó a los cachorros justo antes de la vacunación, cuatro horas después de la vacunación y una vez al día posteriormente y durante dos semanas. Se obtuvieron muestras de sangre para hematología los días -8, -4, 0, 7 y 14.

De nuevo, los resultados de este estudio pueden dividirse en signos generales y locales.

1) Generales:

•Tres de los diez vacunados tuvieron una hipertermia muy ligera el día uno que resolvió espontáneamente al día siguiente. No obstante, esos mismos tres animales presentaron una hipertermia ligera similar en otras ocasiones como consecuencia del stress, pero sin relación con la vacunación. No hubo diferencias significativas en la temperatura rectal en ningún momento entre los grupos control y tratamiento, y ambos grupos presentaron un ligero aumento de la temperatura rectal media el día uno.

4.4.2



59


•No se notaron alteraciones en la hematología ni en otros signos generales y no hubo diferencias entre los grupos en cuanto al peso corporal.

2) Locales:

•Siete de los diez cachorros vacunados presentaron una inflamación local detectable mediante palpación de una duración máxima de cinco días y un tamaño máximo de siete centímetros Dos de los cachorros gimieron débilmente durante la administración, pero estos cachorros exhibían un comportamiento especialmente agitado en el momento de la inyección.

En términos generales, la administración de una sobredosis de la vacuna en estos jóvenes cachorros fue bien tolerada. Igual que con la administración de cuatro dosis normales, los únicos hallazgos significativos fueron las inflamaciones locales leves y transitorias.

Seguridad en varias razas según reveló una prueba de campo

Esta prueba de campo implicó a animales con propietario de cuatro meses de edad en adelante tanto en áreas endémicas como no endémicas de Francia.100 Todas las razas podían ser incluidas en el estudio. Las razas más comunes fueron el Epagneul Bretón (7,9% de los perros), el Labrador Retriever (7,3% de los perros) y el Rottweiler (4,6% de los perros). El resto de las razas no representaron más del 4% del número total de perros.

Se reclutaron un total de 151 perros para el estudio (78 hembras y 73 machos) de 28 puntos clínicos geográficamente distintos. De estos perros, 135 fueron presentados de forma espontánea en las clínicas veterinarias participantes por sus propietarios y 16 fueron examinados en centros de cría. No se reclutaron más de diez animales por clínica y no se permitió reclutar más de cinco perros por propietario.

Todos los perros habían recibido las vacunas de rutina para perro (MHP(Pi), con L y R opcionales) al menos 14 días antes de la vacunación con CaniLeish®. Todos ellos habían sido desparasitados en los seis meses anteriores y todos ellos estaban en un buen estado de salud en el momento de empezar el curso de vacunación con CaniLeish®.

No se estaban utilizando fármacos inmunosupresores ni antiinflamatorios de forma concurrente. Si tuvo que administrarse algún fármaco antiinflamatorio por cualquier motivo, no se registraron los datos de las vacunas afectadas. Esta exclusión parcial afectó a cuatro de los perros.

Los perros recibieron la primovacunación con CaniLeish® consistente en tres inyecciones administradas en intervalos de tres semanas. Para este estudio, la vacuna se produjo siguiendo las mismas especificaciones para la vacuna comercial. El punto de inyección se frotó con alcohol al 70% y se permitió que el veterinario diera un masaje en este lugar tras la inyección como si fuera una vacunación normal.

Los perros se dividieron en dos grupos para el análisis.

•Un total de 90 animales tenían seis o más meses, que es el grupo de edad aprobado en el registro para esta vacuna. Estos perros se sometieron al protocolo normal de seguimiento.

•61 de los animales eran cachorros de entre 16 y 24 semanas de edad (en consecuencia, por debajo de la edad recomendada para esta vacuna) y se les programó un protocolo de seguimiento mejorado. Seis de estos se sometieron al seguimiento estándar, lo que significa que a 55 cachorros se les aplicó el protocolo mejorado.

El protocolo estándar consiste en las siguientes revisiones por parte del veterinario:

4.4.3


60

•Día 0 (pre-vacunación), día 0 + 4h (cuatro horas después de la vacunación), y posteriormente los días 2, 7, 14 y 21. Se repitió este patrón para cada una de las vacunaciones. El examen clínico general debía incluir una evaluación del comportamiento general, apetito, signos digestivos, color de las mucosas, estado de hidratación y cualquier otra anomalía detectable. También se realizó un examen específico del punto de inyección, y una evaluación del dolor, prurito, inflamación (con registro del tamaño), nódulos y eritema.

•Se pidió a los propietarios que evaluaran cada día el estado general del animal, apetito y cualquier signo no habitual como apatía, vómitos o diarrea. También se les pidió que inspeccionaran cada día el punto de inyección por si hubiera dolor, enrojecimiento o inflamación.

El protocolo mejorado supuso un examen veterinario adicional los días uno, tres y cuatro, de modo que el animal era examinado a diario durante cuatro días a partir de la inyección.

Resultados:No se observó ninguna reacción adversa grave en ningún momento del estudio.

Los resultados de las reacciones generales y locales observadas están resumidos en las tablas 4.2 y 4.3, respectivamente. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que se representan todos los eventos con posibilidad de estar relacionados con la administración de la vacuna. Incluye algunos eventos que empiezan tan tarde como 14 días después de la administración de la vacuna y que, en consecuencia, podrían no estar relacionados.

Risk Cachorros (por debajo de la edad mínima recomendada para la vacunación) Adultos

Número(%)

Tiempo entre la inyección y la primera

aparición

Duración máxima(días)

Número(%)


aparición


1ª V

acun

ació

n

Hipertermia 2 (3,3%) 1d – 7d 2d 4 (4,4%) 4h – 2d 1d

Apatía 9 (14,8%) 4h – 12d 2d 6 (6,7%) 4h – 14d 3d

Apetito disminuido 7 (11,5%) 1d – 4d 3d 5 (5,6%) 1d – 2d 3d

Diarrea 8 (13,1%) 1d – 7d 1d 3 (3,3%) 8h – 13d 3d

Vómitos 7 (11,5%) 1d – 8d 1d 3 (3,3%) 2d – 13d 2d

2ª V

acun

ació

n

Hipertermia 1 (1,7%) 4h 2d 2 (2,2%) 4h 1d

Apatía 7 (11,7%) 4h – 8d 2d 8 (9%) 4h – 6d 5d

Apetito disminuido 6 (10%) 1d – 11d 2d 4 (4,5%) 4h – 1d 5d

Diarrea 4 (6,7%) 1d – 13d 2d 1 (1,1%) 4h 1d

Vómitos 3 (5%) 1d – 8d 2d 1 (1,1%) 4h 1d

3ª V

acun

ació

n

Hipertermia 2 (3,4%) 4h – 1d 4d 4 (4,5%) 4h – 7d 1d

Apatía 7 (12,1%) 4h – 8d 2d 9 (10,1%) 4h – 11d 6d

Apetito disminuido 5 (8,6%) 4h – 1d 2d 5 (5,6%) 4h – 11d 5d

Diarrea 2 (3.4%) 4h – 1d 1d 5 (5,6%) 4h – 14d 3d

Vómitos 4 (6,9%) 4h – 2d 1d 2 (2,2%) 4h 1d


Tabla 4.2 Frecuencia de los signos generales observados tras la vacunación


61


Risk Cachorros (por debajo de la edad mínima recomendada para la vacunación) Adultos

Número(%)


aparición


Número(%)


aparición


1ª V

acun

ació

n

Inflamación en el punto de inyección (0-5 cm) 24 (39,3%) 4h – 6d 14d 19 (21,1%) 4h – 3d 15d

Inflamación en el punto de inyección (>5 cm) 1 (1,6%) 1d 1d 0 - -

Dolor en puntode inyección 11 (18%) 4h – 1d 11d 16 (17,8%) 4h – 1d 5d

2ª V

acun

ació

n

Inflamación en el punto de inyección (0-5 cm) 23 (38,3%) 4h – 2d 10d 15 (16,9%) 4h – 2d 5d

Inflamación en el punto de inyección (>5 cm) 1 (1,7%) 4h 1d 3 (3,4%) 4h – 2d 3d

Dolor en puntode inyección 13 (21,7%) 4h – 2d 2d 16 (18%) 4h – 2d 7d

3ª V

acun

ació

n

Inflamación en el punto de inyección (0-5 cm) 18 (31%) 4h – 1d 9d 18 (20,2%) 4h – 7d 6d

Inflamación en el punto de inyección (>5 cm) 3 (5,2%) 4h – 1d 1d 1 (1,1%) 1d 3d

Dolor en puntode inyección 9 (15,5%) 4h – 1d 3d 18 (20,2%) 4h – 7d 6d

Es interesante notar que en la mayoría de las ocasiones no son los mismos perros que reaccionan repetidamente a la vacuna. Por ejemplo, en los animales que presentaron hipertermia, un cachorro tuvo hipertermia después de la primera y tercera inyecciones, pero no de la segunda. El resto de casos de hipertermia en cachorros fueron aislados y no se repitieron. Un adulto tuvo hipertermia tras cada una de las inyecciones, pero también episodios registrados de hipertermia no relacionados con la vacunación. Ninguno de los otros adultos que mostraron hipertermia lo hizo después de más de una vacuna.

Tabla 4.3 Frecuencia de los signos locales observados tras la vacunación


62

Conclusiones:Estos resultados demuestran que la vacuna se tolera muy bien en condiciones de campo. El porcentaje significativamente inferior de perros en los que se reportó una reacción local (a pesar de los cuidadosos exámenes profesionales para detectarlas) en comparación con los del estudio en laboratorio puede explicarse por el hecho de no haber afeitado el punto de inyección en estos individuos.

En este estudio, no todos los perros eran de áreas endémicas. Sin embargo, se sometió a todos ellos a un análisis IFI antes de incluirlos en el estudio. Solo hubo un perro con resultado positivo (título 1/200) y no presentó ningún signo local o general tras ninguna de las vacunaciones.

Un segundo estudio de campo para evaluar la percepción de propietario en cuanto a la seguridad

El segundo estudio de campo solo implicó a perros de áreas endémicas y proporcionó información útil sobre la percepción de los propietarios relativa a la seguridad de esta vacuna.101 Este estudio siguió el programa de visitas que podría esperarse con la utilización rutinaria de la vacuna.

El día 0 se obtuvo una muestra de sangre y de médula ósea y el perro recibió la primera inyección de CaniLeish®. La muestra de sangre se utilizó para realizar una prueba IFI para Leishmania (con un umbral positivo establecido en 1/200) además de un perfil hematológico. La muestra de médula ósea se utilizó para realizar un análisis qPCR para Leishmania (con el umbral de positividad establecido en 0,1 parásitos por tubo de reacción).

La siguiente visita fue el día 21 ± 2 para la segunda inyección de CaniLeish®, y posteriormente el día 42 ± 2 para la tercera inyección de CaniLeish®. En cada visita para vacuna se realizó un examen clínico completo y se pidió al propietario que informara al veterinario y llevara el perro al veterinario en caso de notar cualquier síntoma clínico anormal en el animal durante el periodo intermedio.

Los perros fueron reexaminados por el veterinario dos semanas después de la tercera inyección. No fueron examinados por un veterinario en ninguna otra ocasión a no ser que el propietario detectara algún problema. Es por ello que el diseño del estudio es bastante distinto al de los estudios de seguridad realizados con fines de registro.

La vacuna estaba formulada de acuerdo con las especificaciones comerciales normales. El punto de inyección se desinfectó con alcohol al 70% antes de la inyección y se permitió el masaje posterior. La medicación concomitante estaba permitida siempre que no interfiriera con los objetivos del estudio (por ejemplo, modificación de la respuesta inmune) y se autorizó el uso de antiparasitarios externos. Si el perro requería tratamiento para la leishmaniosis, se retiraba del estudio.

Se reclutaron 231 perros (115 machos y 116 hembras) en 36 clínicas veterinarias (24 en Francia y 12 en Italia). Un centro de Francia reclutó a 13 perros, pero ninguna otra clínica reclutó a más de diez animales.

La edad de los perros iba de los 5,5 meses a los 12 años. En total, 62 de los perros eran jóvenes o se encontraban cerca de la edad mínima recomendada para la vacunación con CaniLeish® (seis meses ± 2 semanas). Los otros 196 perros tenían más de 6,5 meses de edad. Ninguna raza representaba más del 4,2% de la población del estudio. Un 12% de los animales vivían en interiores, y el 88% restante en el exterior.

Todos los perros se encontraban al día de las vacunaciones de rutina (MHP/L como mínimo) y habían sido desparasitados (en los seis meses anteriores para los perros de mayor edad o el mes anterior para los más jóvenes).

4.4.4



63


Los criterios de exclusión aplicados durante la fase de reclutamiento fueron los siguientes:

•Hembras con gestación conocida.

•Perros que habían recibido sueroterapia, transfusión sanguínea, inmunomoduladores, corticosteroides o vacunaciones en los 14 días anteriores a la fecha de inclusión.

•Perros tratados anteriormente para leishmaniosis.

•Perros vacunados anteriormente contra leishmaniosis.

•Perros con alguna enfermedad crónica grave que pudiera amenazar su vida durante el seguimiento.

•Perros con trastornos concomitantes que pudieran interferir en el seguimiento.

•Perros cuyos propietarios hubieran planeado salir del área endémica durante el periodo de estudio.

Resultados:Las reacciones adversas reportadas a través del esquema de monitorización de la Agencia Europea de Evaluación del Medicamento (EMEA) se clasifican utilizando el sistema ABON. ‘A’ indica que parece probable que el signo detectado esté relacionado con la administración del medicamento o vacuna. ‘B’ indica un posible vínculo. ‘O’ indica que no puede determinarse la relación y ‘N’ que es poco probable que el signo esté relacionado con la administración del medicamento o vacuna.

En total, 21 (9,1%) de estos perros presentaron signos que se clasificaron como ‘A’, ‘B’ o ‘O’ al menos tras una de las tres vacunaciones. No obstante, siguieron incluyéndose las reacciones leves que se iniciaron tan tarde como 15 días después de la última vacunación.

Curiosamente, solo ocho (3,5%) perros participantes en este estudio presentaron reacciones locales descritas por sus propietarios. Solo uno de estos perros presentó también un signo general (apatía leve de corta duración) junto con la reacción local.

Además, las reacciones no fueron descritas habitualmente después de cada una de las inyecciones en estos perros. Cuatro de los ocho perros pertenecían al mismo propietario de Italia, y se informó de una inflamación de tres centímetros que duró cuatro días después de la segunda inyección y una inflamación de un centímetro que duró dos días después de la tercera. Ninguno mostró signos generales. Solo uno de los ocho perros presentó un signo local después de las tres vacunaciones (dolor local en el punto de inyección en todas las ocasiones). En este perro, la reacción local duró menos tiempo y fue más leve en cada uno de los episodios posteriores.

Solo uno de los perros recibió un tratamiento por parte del veterinario para la reacción local y se recuperó rápidamente. El resto se recuperó espontáneamente.

Se reportaron signos generales en 14 individuos (6,1%) y la mayoría fueron leves y autolimitantes sin necesidad de tratamiento. También se informó de un signo local en uno de estos perros, como ya indicamos antes.

La reacción general más habitual fue el letargo, que se describió en cinco perros (2,2%) de este estudio. La intensidad del letargo fue descrita como ‘benigna’ para todos los perros y la duración no superó un día, excepto en un perro en el que este signo duró tres días.

Cuatro de los perros presentaron diarrea. Estos cuatro perros pertenecían al mismo propietario de Francia. Uno de ellos se presentó con letargo (clasificado “A’”en el sistema ABON) y diarrea (clasificada “B”) poco después de la segunda vacunación. Los otros tres perros presentaron diarrea 24 horas más tarde y recibieron la clasificación “B”. El perro original exhibió diarrea de nuevo tras la tercera vacunación y recibió la clasificación ‘A’ para esta reacción.


64

Volviendo la vista atrás, este patrón de signos observado en conjunto puede sugerir que es más probable que se deba a una causa infecciosa que a un efecto directo de la vacuna.

Un perro recibió la clasificación “B” por un enrojecimiento leve de los pabellones auriculares dado que se apreció poco después de la vacunación y no se identificó ninguna otra causa específica.

Conclusiones:Aunque la tasa de reacciones descritas por los propietarios bajo condiciones de campo en este estudio es mayor que lo que se esperaría normalmente para una vacuna vírica o bacteriana estándar como MHP(Pi)L, sigue siendo baja para una vacuna anti Leishmania efectiva. Esto es así a pesar de que estos propietarios eran conscientes de estar formando parte de un estudio de una vacuna experimental y se les pidió que registraran de forma activa cualquier anomalía que encontraran.

Sin embargo, los veterinarios pueden considerar apropiado advertir a los propietarios de que puede haber una reacción local con o sin algún signo general ocasional como letargo como respuesta a la vacunación con CaniLeish®.

¿Qué impacto tiene un estado de positividad para Leishmania sobre la tolerancia de la vacuna?

En la primera prueba de campo con 151 perros, solo uno era positivo a Leishmania (mediante IFI). No obstante, este estudio se realizó tanto en áreas endémicas como no endémicas. El único perro positivo no presentó reacciones adversas a la vacunación.

En el segundo estudio de campo con 231 perros, todos ellos en áreas endémicas, 22 perros (9,5%) eran positivos a Leishmania al inicio del estudio. 21 de ellos fueron positivos a qPCR y dos de ellos positivos a IFI. Las únicas reacciones detectadas que pudieron relacionarse con la vacuna en este grupo fueron tres perros con hinchazones locales. Se trata de tres de los cuatro perros que pertenecían al mismo propietario de Italia de los que ya hemos hablado.

Así, aunque la vacuna no está registrada para ser utilizada en perros positivos a Leishmania, parece que la tolerancia de la vacuna es tan buena en estos perros como en el resto de la población.

Conclusiones generales sobre la seguridad de CaniLeish®

Está claro por los estudios experimentales que puede esperarse que todos los perros desarrollen una pequeña inflamación como parte de la reacción normal a esta vacuna. En un pequeño número de casos esto puede ocasionar una sensibilidad o dolor local durante unos pocos días, pero la reacción es autolimitante, sin tratamiento, en casi todos los casos.

Sin embargo, también está claro que muchos propietarios no serán capaces de detectar esta inflamación en circunstancias normales. Aunque sea apropiado advertir a los propietarios de una posible reacción local, también es necesario dejar claro que la falta de detección de dicha inflamación no es indicativa de fracaso de la vacuna.

Resulta interesante notar que las reacciones locales tendieron a tener un tamaño e intensidad inferiores en las vacunaciones posteriores. Esto indicaría que un perro que experimente dicha reacción no necesita que se interrumpa el curso de vacunación.

Igual que ocurre con todas las vacunas, un pequeño número de perros puede experimentar letargo o una ligera hipertermia durante un corto periodo de tiempo tras la vacunación. Una vez más, esto no fue suficiente para impedir la administración del resto del curso de vacunación.

4.4.5

4.4.6



65


Pocas veces se observan reacciones alérgicas con cualquier tipo de vacuna. Ocurrieron con una frecuencia inferior al 1% en los estudios de campo y existen otras explicaciones posibles para los síntomas descritos. No se detectaron reacciones alérgicas a la vacuna durante ninguno de los estudios de desarrollo a pesar de que un gran número de perros recibiera la vacuna durante un largo periodo. No obstante, en caso de que surgieran con su utilización general, lo sensato sería evaluar la relación riesgo: beneficio para el resto del curso de vacunación. Los perros que exhibieron estos síntomas respondieron rápida y completamente al tratamiento.

Los diversos estudios realizados han confirmado que CaniLeish® tiene un buen perfil de seguridad para una vacuna anti Leishmania eficaz.

Resumen•El método exclusivo de producción de antígenos en CaniLeish® reduce el riesgo de reacciones “inapropiadas”.

•Pueden esperarse reacciones “normales” tales como inflamación local con o sin dolor con la utilización de CaniLeish®.

•La administración de una dosis extra fue bien tolerada.

•En general, CaniLeish® se tolera bien en condiciones de campo.

•La tasa de reacciones notificadas por los propietarios en condiciones de campo es baja para una vacuna anti Leishmania eficaz.

•Aunque la vacuna no está registrada para ser utilizada en perros positivos a Leishmania, parece que la tolerancia de la vacuna es tan buena en estos perros como en el resto de la población.

4.5


Canileish®

en la clínica diaria5


69

El calendario de vacunaciónCaniLeish® está indicada para ser utilizada en perros a partir de los seis meses de edad para proporcionar una disminución significativa del riesgo de infección activa con L. infantum o de leishmaniosis clínica. La primovacunación consiste en tres inyecciones administradas a intervalos de tres semanas. Los estudios realizados durante el desarrollo de CaniLeish® han confirmado que este es el programa óptimo para asegurar que se produce el cambio necesario hacia una inmunidad mediada por células con predominio Th1 en el máximo número de perros. La inmunidad comienza cuatro semanas después de haber completado la primovacunación. Es necesaria una revacunación anual posterior para mantener esta inmunidad.

La vacuna debe conservarse en un frigorífico y ser reconstituida inmediatamente antes de ser utilizada. Resulta apropiado acercar la vacuna a la temperatura corporal calentándola en la mano antes de administrarla y realizar un ligero masaje en el punto de inyección tras su administración.

(o al revés con CaniLeish® primero y MHP(Pi)L después)

Como todos los estudios de desafío se realizaron con animales de seis meses de edad en adelante, no existen datos de eficacia para cachorros más jóvenes. Además, se sabe que la respuesta inmune mediada por células madura más tarde que la capacidad de respuesta humoral.88 En consecuencia,

CaniLeish®MHP(Pi)L

intervalo ≥2 semanas

12

3

CaniLeish®MHP(Pi)L


CaniLeish®MHP(Pi)L


Nacimiento

MHP(Pi)L3 meses

CaniLeish®

6 mesesMHP(Pi)L

1 año y 3 mesesCaniLeish®

1 año y 7 mesesMHP(Pi)L

2 años y 3 mesesCaniLeish®

2 años y 7 meses

Separaciónde 10 semanas

3 inyeccionesen 6 semanas

12

3 Revacunacionesanuales

Revacunacionesanuales



Edad:

5 CaniLeish® en la clínica diaria

5.1

Figura 5.1 Calendario normal para cachorros

Figura 5.2 Calendario para adultos empezando la vacunación después de un refuerzo anual MHP(Pi)L


70

es posible que los cachorros jóvenes pudieran estar un poco menos capacitados para responder de forma adecuada a la vacuna con una respuesta Th1.

Afortunadamente, no es frecuente que se aloje a los cachorros jóvenes en el exterior y se expongan a niveles elevados de desafío natural. Como se destacó en el capítulo cuatro, los estudios de seguridad han mostrado que la vacuna sigue siendo bien tolerada cuando se administra a cachorros de menos de seis meses de edad, aunque hay una incidencia ligeramente superior de reacciones adversas.

A falta de resultados de pruebas específicas que confirmen la idoneidad de una administración simultánea, la recomendación actual consiste en separar el periodo de vacunación del resto de vacunas en al menos dos semanas. Normalmente, el sistema inmune puede reconocer de forma adecuada a varios antígenos administrados al mismo tiempo. Sin embargo, aún no se ha evaluado el efecto de la administración de CaniLeish® y Canigen MHP(Pi)L al mismo tiempo. Puede que estudios posteriores confirmen si esto es o no posible, pero hasta que no dispongamos de estos datos se recomienda dejar este periodo de separación.

A la hora de determinar la duración de este espacio de separación debe tenerse en cuenta la posibilidad de una interferencia post-vacunal. Se trata de un fenómeno inmunológico ampliamente reconocido que no es específico para ningún antígeno concreto. Tras la administración de vacunas puede iniciarse un periodo de respuesta disminuida a otras vacunas. Se sabe que dura un mínimo de una semana, pero la mayoría de los expertos recomiendan un periodo de tiempo de dos semanas entre vacunaciones para disponer de un margen de seguridad.102 Ocurriría exactamente lo mismo si, por ejemplo, un veterinario decidiera separar la administración de la leptospira de la MHP(Pi). Si no se administran los antígenos al mismo tiempo, también debería observarse un periodo de separación de dos semanas.

Otros requisitos para la correcta utilización de la vacunaResulta útil entender alguno de los otros requerimientos y sugerencias que aparecen en la hoja de datos de registro del producto.

Las pruebas de serología deberían realizarse antes de la vacunación

Dado que la eficacia de la vacuna se ha establecido en perros negativos a Leishmania, no se sabe la eficacia de la misma para retrasar o prevenir la progresión en perros ya infectados. Además, una vez que un perro ha progresado hacia la infección activa es extremadamente difícil revertir la progresión de la enfermedad y las directrices actuales recomiendan tener en cuenta la utilización de fármacos anti Leishmania.21 Por tanto, se recomienda realizar las pruebas a todos los perros antes de la primera vacunación. Existen diversas opciones para las pruebas de diagnóstico y cada una tiene ventajas e inconvenientes como se ilustra en la tabla 5.1.

5.2

5.2.1

5CaniLeish® en la clínica diaria


71


Prueba Ventajas Inconvenientes

Serología(IFI, ELISA, test rápido)

Rápida y económica. Los títulos elevados están estrechamente asociados a infección activa y es casi seguro que un perro enfermo dará resultados positivos. Aceptada como medida de criba rutinaria para perros

Algunos perros pueden permanecer negativos durante unos meses antes de la seroconversión, por lo que los títulos negativos o positivos bajos pueden seguir estando asociados a un estado de desarrollo de la enfermedad

Visualización mediante microscopía en extensiones teñidas de lesiones cutáneas, linfonodos, médula ósea o bazo

Si es positiva, es seguro que el perro tiene la enfermedad

Posibilidad de resultados negativos incluso en casos de enfermedad muy grave. No es suficientemente sensible. No apropiada como criba pre-vacunal rutinaria para perros sanos.

Inmunohistoquímica de las extensiones anteriores

Si es positiva, es seguro que el perro tiene la enfermedad. Mayor sensibilidad que la visualización directa.

Posibilidad de resultados negativos incluso en casos de enfermedad muy grave. No es suficientemente sensible. No apropiada para la criba pre-vacunal rutinaria en perros sanos y generalmente no disponible en la clínica.

Cultivo de las muestras anteriores

Si es positivo, es seguro que el perro tiene la enfermedad. Mayor sensibilidad que la visualización con o sin tinciones inmunohistoquímicas.

Generalmente no disponible en la clínica diaria y demasiado lenta para ser utilizado como prueba de criba pre-vacunal.

PCR (realizada normalmente sobre aspirados de médula ósea, linfonodos o bazo, o sobre material obtenido de una lesión)

Extremadamente sensible. Está aumentando su disponibilidad con un retraso moderado en la obtención de los resultados.

Una PCR positiva confirma la exposición al parásito, pero no confirma una infección activa. No recomendada en las directrices publicadas como medida de criba rutinaria para perros sanos. Una PCR positiva no equivale a enfermedad.

Está claro que, a pesar de ser un problema muy complejo, la serología es el método de criba prevacunal más adaptado. Sin embargo, también existe más de una opción disponible para la serología.

IFI y ELISAIFI y ELISA proporcionan títulos cuantitativos que pueden dar una información útil acerca de la amplitud de cualquier seroconversión para el parásito. IFI ha sido clasificada como el goldstandard en el diagnóstico, pero también podría ser útil para la criba pre-vacunal. ELISA, aunque menos común, tiene unos usos parecidos. En la mayoría de las clínicas no se puede disponer de los resultados IFI o ELISA el mismo día de realización de la prueba, por lo que se necesitaría una segunda visita para la vacunación.

Si el resultado IFI es negativo, puede procederse a la vacunación. Existe aún la posibilidad de que el perro sea portador del parásito porque el título puede tardar unos meses en elevarse. Sin embargo, no puede eliminarse este riesgo completamente.

Si el resultado IFI es “positivo bajo” (entre el umbral del laboratorio y cuatro veces este umbral), debería realizarse otra prueba IFI unos tres meses más tarde, igual que ocurriría en caso de realizar la prueba con fines diagnósticos.21 Este tipo de resultado puede estar asociado a un estado de enfermedad inminente o a un perro resistente que ha estado luchando contra la infección y que no progresará (al menos en este momento) hacia el estado de enfermedad.

Tabla 5.1 Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de pruebas disponibles


72

Si el siguiente resultado es negativo, la vacunación es una medida sensata. Sin embargo, si la prueba sigue siendo positiva, no se recomienda la vacunación hasta disponer de más datos porque se desconoce la eficacia de CaniLeish®.

Si el resultado IFI es “positivo alto” (más de cuatro veces superior al umbral del laboratorio) no sería apropiado vacunar. Las directrices actuales recomiendan que el perro sea tratado del mismo modo que si se tratara de un perro enfermo.21

La propia vacunación suele tener como resultado títulos positivos transitorios para IFI o ELISA. No obstante, sería de esperar que estos títulos hubieran disminuido cuando llegue el momento de la revacunación anual. Es cualquier caso, las pruebas serológicas prevacunales solo son necesarias antes de la primera vacunación.

Pruebas rápidasLas pruebas rápidas de serología tienen la ventaja de disponer de resultados casi instantáneamente, lo que permite la vacunación del perro el mismo día. Sin embargo, es importante utilizar un test que tenga una buena coincidencia con la IFI para mantener la confianza en los resultados.

Recientemente ha salido al mercado un nuevo test rápido basado en la tecnología de las kinesinas: Speed Leish KTM, con una coincidencia del 98,5% con IFI.103 También está disponible en el test ‘Speed Duo Leish/EhrliTM’ en combinación con Ehrlichia. Un resultado positivo con Speed Leish KTM equivale a un título IFI de alrededor de 1/100 o superior. Esto significa que se trata de una prueba muy sensible pero que mantiene una buena especificidad. No sufre falsos positivos por la infección con otros agentes como Babesia, Ehrlichia, Anaplasma, etc. Es ideal para la criba prevacunal y un resultado negativo permite seguir con la vacunación. Además, este test no da resultados positivos en perros vacunados no infectados porque reconoce elementos del parásito que no están presentes en la vacuna.

Dado que Speed Leish KTM no es una prueba cuantitativa, un resultado positivo podría ser equivalente a dos de las posibilidades de la escala IFI:

1) El título puede ser “positivo bajo” en la escala IFI (entre el umbral positivo para el laboratorio que realiza la prueba y cuatro veces este valor) por lo que sería necesario repetir la prueba en unos tres meses, o

2) El título puede ser “positivo alto” en la escala IFI (≥4x el umbral del laboratorio), lo que sugiere que el perro está desarrollando la enfermedad.

La única manera de diferenciar entre estas dos posibilidades es la realización de una prueba cuantitativa (normalmente IFI). Este abordaje está recomendado en casos con un resultado positivo para Speed Leish KTM.


Cop

yrig

ht: V

irbac


73


Realizar IFIo ELISA

Negativo

Positivo

Proceder con la vacunación. Cabe recordar que, dependiendo de la historia del perro, aún podría seguir siendo positivo para PCR

Speed Leish KTM

Proceder como indicael diagrama para IFI o ELISA

Debería desparasitarse a los animales antes de la administraciónde CaniLeish®

Se trata de un requerimiento habitual que aparece en los prospectos de las vacunas. El motivo principal para su inclusión es que hace tiempo que se sabe que una carga elevada de parásitos puede favorecer la polaridad Th2 de la respuesta inmune.104 De hecho, una revisión reciente del tema informa de varias técnicas confirmadas utilizadas por vermes parásitos para favorecer las respuestas Th2 y, como consecuencia, su propia supervivencia en el hospedador.105 Puede que otros parásitos ejerzan también algún tipo de impacto. Un estudio longitudinal sugiere que es probable que la ehrlichiosis sea un factor que contribuya al establecimiento de la leishmaniosis canina.106

Un buen control general de los parásitos que cubra tanto a los vermes internos como a los parásitos externos tales como las garrapatas no solo es beneficioso para la salud general del perro sino que también ayuda a reducir factores secundarios con una posible acción contraria a los efectos beneficiosos de CaniLeish® sobre el sistema inmune.

Negativo

Proceder a la vacunaciónCabe recordar que, dependiendode la historia del perro, aún podríaseguir siendo positivo para PCR

Es casi seguro que el perro tiene una infección activa. Tener en cuenta las opciones terapéuticas apropiadas

Positivo alto(a partir de 4 veces el umbral

IFI del laboratorio)

IFI

ELISA (cuantitativa)

Se desconoce el estado. El mejor curso de la acción consiste en realizar otra prueba para descubrir si hay o no enfermedad y volver a realizar la prueba en 3 meses si son negativas

Positivo bajo(hasta 4 veces el umbral

del laboratorio)

5.2.2

Figura 5.3 Diagrama de las acciones a llevar a cabo a la vista de un resultado positivo o negativo con la utilización de Speed Leish KTM

Figura 5.4 Diagrama de las acciones a llevar a cabo a la vista de los distintos títulos posibles obtenidos mediante IFI o ELISA


74

La vacuna no debería utilizarse en animales gestantes o en lactancia

Aunque no se prevén problemas concretos de seguridad, no se han realizado estudios en este grupo de animales. La respuesta inmune puede estar ligeramente deprimida al final de la gestación o poco después del parto y sería poco prudente administrar cualquier vacuna en este periodo. Sería más apropiado intentar programar las vacunaciones de modo que se evite este periodo.

No se han evaluado todas las posibles interacciones con otros fármacos

Durante las pruebas de campo, algunos perros estaban recibiendo medicaciones a largo plazo y no se notó ningún problema. No obstante, está claro que no pueden evaluarse todas las interacciones posibles, por lo que se incluye la advertencia general en el resumen de características del producto. Sería necesario tener un cuidado especial si tuviera que utilizarse cualquier medicación que pueda tener un impacto sobre la respuesta inmune.

¿Debe realizarse algún tipo de monitorizacióntras la vacunación?No es necesario hacer pruebas de forma rutinaria a los animales para averiguar si la vacuna ha sido reconocida por el sistema inmune. En la mayoría de los casos, los títulos IFI serán positivos durante un breve periodo tras la vacunación. No obstante, la inmunidad mediada por células es la que ofrece el mecanismo protector y no puede detectarse mediante serología. Es por ello que tampoco sería apropiado intentar determinar el intervalo de revacunación o la necesidad de una vacunación de refuerzo basándose en análisis serológicos. Debe seguirse el protocolo autorizado de revacunación anual.

Si fuera necesario realizar algún test a un perro vacunado, por ejemplo en caso de que el veterinario crea que un perro vacunado está desarrollando la enfermedad, sería aconsejable utilizar un test diferencial como Speed Leish KTM en primer lugar. Si fuera positivo y se necesitaran resultados cuantitativos adicionales, lo más apropiado sería utilizar un laboratorio que ofrezca serología cuantitativa basada en la tecnología de las kinesinas o algún otro antígeno específico no presente en la vacuna. Una prueba IFI positiva en un perro vacunado no significa necesariamente que el perro esté desarrollando la enfermedad. Otros métodos de diagnóstico como la visualización en extensiones, inmunohistoquímica, cultivo y PCR, permanecen inmutables por la vacunación.

Resumen•CaniLeish® está indicada para ser utilizada en perros a partir de los seis meses de edad para proporcionar una disminución significativa del riesgo de infección activa con L. infantum o de leishmaniosis clínica.

•La primovacunación consiste en tres inyecciones administradas a intervalos de tres semanas, con revacunación anual posterior necesaria para mantener esta inmunidad.

•La recomendación actual consiste en separar el momento de vacunación con CaniLeish® del resto de vacunas un mínimo de dos semanas.

•Las pruebas de serología deberían realizarse antes de la vacunación.

5.2.3

5.2.4

5.3

5.4



75


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Bibliografía


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CANILEISH® LIOFILIZADO Y DISOLVENTE PARA SUSPENSIÓN INYECTABLE PARA PERROS. Composición: Proteínas Secretadas y Excretadas (PSE) por Leishmania infantum mínimo 100 μg. Extracto purificado de Quillaja saponaria (QA-21): 60 μg. Indicaciones: Inmunización activa de perros negativos a leishmania a partir de los 6 meses, para reducir el riesgo de desarrollar una infección activa y la enfermedad clínica después del contacto con Leishmania infantum. Posología y modo de empleo: Una dosis/perro vía subcutánea. Se recomienda realizar un test de diagnóstico rápido de leishmania antes de la vacunación. Primovacunación: 1ª dosis a los 6 meses, 2ª dosis 3 semanas más tarde, y 3ª dosis 3 semanas después. Inicio de la inmunidad: 4 semanas después de la Primovacunación. Revacunación anual. Presentación: Caja con 15 dosis. Contraindicaciones: Hipersensibilidad a la sustancia activa, al adyuvante o a algún excipiente. Observaciones: Después de vacunar pueden aparecer anticuerpos transitorios frente a Leishmania. Pueden aparecer reacciones locales como inflamación, nódulo, dolor a la palpación o eritema que se resuelven en 2 a 15 días y otros signos como hipertermia, apatía y trastornos digestivos durante 1 a 6 días. En caso de anafilaxia administrar tratamiento sintomático. Vacunar solo animales sanos y desparasitados. La vacunación no excluye otras medidas para reducir la exposición a flebotomos. En caso de autoinyección accidental, consulte con un médico. No ha quedado demostrada la seguridad durante la gestación ni la lactancia. Los datos de eficacia han demostrado que los perros vacunados tienen 3,6 veces menos riesgo de desarrollar una infección activa y 4 veces menos riesgo de desarrollar la enfermedad clínica que los perros no vacunados. Mantener refrigerado (2ºC - 8ºC). Proteger de la luz. Con prescripción veterinaria. EU/2/11/121/001-009


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