revista mvz córdoba 20(3):2015

EDITORIAL

Rev.MVZ Córdoba 20(3):4675-4676, 2015. ISSN: 0122-0268

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Oropuche virus: A virus present but ignored

Virus de Oropuche: Un virus ignorado pero presenteBunyaviruses are RNA viruses that affect animals and plants; they have five genera and four of them affect humans: Orthobunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus and Hantavirus. All of them are Arbovirus, except Hantavirus. The Orthobunyaviruses comprise Oropouche, Tahyna, La Crosse virus, California encephalitis virus and Heartland virus recently discovered (1). Except for Heartland virus which is transmitted by ticks of the genus Amblyoma, these Phleboviruses have as vectors mosquitoes, which bite small mammals which are able to be as reservoirs amplifiers.

The name of Oropouche virus came from the town of Oropuche Vegas, which is located on the island of Trinidad and Tobago, where it was detected in 1955 in a febrile patient and mosquitoes Coquilletidia venezuelenzis. Oropouche virus is prevalent in many parts of South America and the Caribbean. In the sylvatic cycle, the virus has several mosquitos vectors: Culicoides paraensis, Coquilletidia venezuelenzis and Aedes serratus. Wild mammals are bitten by these mosquitoes and viral loads are augmented, like in the sloth (Bradypus tridactiyus), primates (Aloutta sanguinus) and rodents among others. In the urban cycle, the vectors are Culicoides paraensis and Culex quinquefasciatus mosquitoes, both very common in tropical environments of Colombia (2).

Many outbreaks have been reported, especially in the Brazilian Amazon basin where Oropouche is the second cause of febrile syndrome, after dengue. In studies in febrile patients (Brazil), the fevers by arbovirus were caused as follow: dengue, alphavirus and Orthobunyavirus. Hemorrhagic arboviruses infections are clinically indistinguishable from Oropouche virus. Studies in Ecuador, Peru and Bolivia showed that between 2-6% of patients with undifferentiated fever they had Oropuche infection (2). Symptoms Oropuche fever are similar to those of other viral tropical diseases such as Dengue, Chikungunya, Mayaro, Zika and other arboviruses. The clinical symptoms with rashes should be differentiated from other febrile as rubella, enterovirus rickettsia and leptospirosis (2).

Hernando Groot conducted perhaps the greatest study of sero-surveillance of arbovirus in Colombia between 1956 and 1962. Groot carried out neutralization tests and antibodies in monkeys and humans to Mayaro, Oropuche, Dengue, Ilhleus, Saint Louis, yellow fever, Venezuelan encephalitis, Eastern encephalitis, Bussuquara, Guaroa and Mayaro were found (3). Most Oropuche activity was

Los Bunyavirus son virus ARN que afectan animales y plantas; tienen cinco géneros y cuatro de ellos afectan a los humanos: Orthobunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus y Hantavirus. Todos ellos son Arbovirus, excepto Hantavirus. Los Orthobunyavirus comprenden a Oropouche, Tahyna, La Crosse, virus de la encefalitis de California y el virus Heartland recientemente descubierto (1). A excepción del virus Heartland que es transmitido por garrapatas del género Amblyoma, estos Phlebovirus tienen como vectores a mosquitos, los cuales pican a pequeños mamíferos que a su vez son capaces de actuar como reservorios amplificadores.

El virus de Oropouche deriva su nombre de la localidad de Vegas de Oropuche, la cual se encuentra en la isla de Trinidad y Tobago, en donde fue detectado en 1955 en un paciente febril y en mosquitos Coquilletidia venezuelenzis. El virus de Oropouche es prevalente en muchas regiones de América del Sur y del Caribe. En el ciclo silvestre, el virus tiene varios mosquitos vectores: Culicoides paraensis, Coquilletidia venezuelenzis y Aedes serratus. Los mamíferos silvestres son picados por estos mosquitos y aumentan las viremias, como en el oso perezoso (Bradypus tridactiyus), primates (Aloutta sanguinus) y roedores entre otros. En el ciclo urbano los vectores son mosquitos Culicoides paraensis y Culex quinquefasciatus, ambos muy comunes en los ambientes tropicales de Colombia (2).

Muchos brotes epidémicos se han descrito, especialmente en la cuenca amazónica brasileña en donde Oropouche es la segunda causa de síndromes febriles, después del dengue. En estudios realizados en pacientes febriles (Brasil), la causa de fiebre por arbovirus fueron en su orden: dengue, alfavirus y orthobunyavirus. Las infecciones por arbovirus hemorrágicos son clínicamente indistinguibles de la del virus de Oropouche. Estudios realizados en Ecuador, Perú y Bolivia demostraron que entre el 2-6% de pacientes con fiebres indiferenciadas tenían infección por Oropuche (2). Los síntomas de la fiebre de Oropuche son similares a los de otras enfermedades tropicales virales como el Dengue, Chikungunya, Mayaro, Zika y otras arbovirosis. Los cuadros clínicos con exantemas deben diferenciarse de otros cuadros febriles como rubeola, enterovirus rickettsia y leptospira (2).

Hernando Groot llevó a cabo tal vez el mayor estudio de serovigilancia de arbovirus en Colombia entre 1956 y 1962. Él utilizó pruebas de neutralización y encontró en monos y humanos anticuerpos contra Mayaro, Oropuche, Dengue, Ilhleus, Sant Louis, fiebre amarilla, encefalitis venezolana, encefalitis del Este, Bussuquara, Guaroa y Mayaro (3). La mayor actividad para Oropuche fue detectada en monos del

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detected in monkeys from La Lizama village (Santander), while Mayaro and Bussuquara virus were detected in humans in the Peroles village (Santander). Interestingly, the Dengue virus had at that time a lower prevalence, 55 years later was demostrated the dynamics of the virus and the amazing adaptability of the vectors the cited study (3). Groot’s work marked a milestone in the history of hemorrhagic viruses in Colombia and showed that surveillance must carry out actively looking for the viruses in the vectors, which would ensure the development and up-date of eco-epidemiology in Colombia.

After Groot’s study, the Department of Defense US published in 1998 a work called Disease Vector Ecology Profile Colombia, which pointed out the importance of Oropuche and Mayaro virus among others (4).

Using a sera collection, a recent work in Colombia was carried out by National Institute of Health of Colombia and Secretary of Health of Cundinamarca state, the study was made within the frame of the National Program of Surveillance Febrile Syndromes and Dengue (5). In those sera that were collected between 2000 and 2001, researchers found antibodies to Oropuche and Mayaro viruses in Santander and Cundinamarca provinces.

Through this editorial we wish to point out that viruses are older than humans and they have adapted to versatile vectors that have allowed them to remain among humans and animals without being beated by antiviral drugs. But perhaps most important is without doubt that besides Oropuche virus, there are others viruses in Colombia that have infected us and we have not detected them.

corregimiento de La Lizama (Santander), mientras que los virus Mayaro y Bussuquara fueron detectados en humanos en la localidad de Peroles (Santander). Curiosamente, el virus del Dengue en ese momento tuvo una menor prevalencia, lo que demuestra la dinámica de los virus y la sorprendente adaptabilidad de los vectores 55 años después del citado estudio (3). El estudio de Groot marcó un hito en la historia de los virus hemorrágicos en Colombia y demostró que la vigilancia hay que llevarla a cabo de forma activa buscando los virus en los vectores, lo que garantizaría el desarrollo y actualización de la ecoepidemiología en Colombia.

Un tiempo después del estudio de Groot, el departamento de defensa de los EE.UU. publicó en 1998 un trabajo denominado Disease Vector Ecology Profile Colombia, el cual recalca la importancia del virus Oropuche y Mayaro entre otros (4).

A partir de un banco de sueros se llevo a cabo un trabajo reciente en Colombia por parte del Instituto Nacional de salud de Colombia y a la Secretaria de Salud Departamental de Cundinamarca dentro del Programa Nacional de Vigilancia de Síndromes Febriles y Dengue pertenecientes (5). En esos sueros recolectados entre los años 2000 y 2001, los investigadores encontraron anticuerpos contra los virus Oropuche y Mayaro en los deparatementos de Santander y Cundinamarca.

Mediante este editorial deseamos remarcar que los virus son más viejos que los humanos y que se han adaptado a vectores versátiles que les han permitido mantenerse entre los humanos y los animales sin ser vencidos por fármacos antivirales. Pero tal vez, lo más importante es sin duda que además del virus Oropuche existen otros virus en Colombia que nos han infectado y no los hemos detectado.

Salim Mattar V. Ph.D. Marco González T. M.Sc.

REFERENCES

1. Bosco-Lauth AM, Panella N, Root JJ, Gidlewski T, et al. Serological Investigation of Heartland Virus (Bunyaviridae: Phlebovirus) Exposure in Wild and Domestic Animals Adjacent to Human Case Sites in Missouri 2012–2013. Am J Trop Med Hyg 2015; 92(6):1163-7. doi:10.4269/ajtmh.14-0702.

2. Mira BP, Andreotti R, Silva de AP, Cordeiro MA, Guerreiro RS, Oliveira CJ, et al. Detection of arboviruses of public health interest in free-living New World primates (Sapajus spp.;Alouatta caraya) captured in Mato Grosso do Sul, Brazil. Rev. Soc. Bras. Med. Trop 2013; 46(6): 684-690. http://dx.doi.org/10.1590/0037-8682-0181-2013

3. Groot H. Estudios sobre virus transmitidos por artrópodos, Rev Acad Colomb Cienc Ex Fis Nat 1964; 12(46):197-217.

4. Disease vector ecology profile Colombia. Armed Forces Pest Management Board, Defense Pest Management Information Analysis Center (DPMIAC); Washington, DC. [On line]. 1998. URL available: http://www.afpmb.org/sites/default/files/pubs/dveps/COLOMBIA.PDF

5. Suárez R, Hidalgo M, Niño N, González C, Vesga J, Orejuela L, et al. Las rickettsias como agentes etiológicos de entidades febriles no diagnosticadas en Colombia. Ediciones Uniandes; Bogotá, DC. Colombia: 2008. URL Disponible en: http://publicacionesfaciso.uniandes.edu.co/sip/data/pdf/Las_rickettsias_como_agentes_etiologicos.pdf

http://www.afpmb.org/sites/default/files/pubs/dveps/COLOMBIA.PDF

http://www.afpmb.org/sites/default/files/pubs/dveps/COLOMBIA.PDF

http://publicacionesfaciso.uniandes.edu.co/sip/data/pdf/Las_rickettsias_como_agentes_etiologicos.pdf



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ORIGINAL


Genetic variability of broodstocks of restocking programs in Brazil

Variabilidad genética de lotes de reproductores de programas de repoblación en Brasil

Nelson Lopera-Barrero,1* Ph.D, Ed Lima,1 Zoot, Luiz Filho,2 Ph.D, Elenice Goes,2 M.Sc, Pedro Castro,2 Zoot, Aline Zardin,2 M.Sc, Angela Poveda-Parra,1 Ph.D,

Ricardo Ribeiro2, Ph.D.

1Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Zootecnia, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Rod. Celso Garcia Cid Pr 445 hm 380 Campus Universitário, Londrina, Brasil. 2Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Zootecnia, Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, Avenida Colombo 5790 Jardim Universitário, Maringá, Brasil. *Correspondence: [email protected]

Received: August 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT

Objective. The aim of this study was evaluate the genetic diversity of the following broodstocks: piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus brasiliensis), jundiá (Rhamdia quelen) and cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) already useful for restocking programs in the Paranapanema, Iguaçu and Paraná Brazilian Rivers. Materials and methods. Samples from the caudal fin of 122 fish were analyzed. DNA was extracted by NaCl protocol. PCR products were separated by a horizontal agarose gel electrophoresis. The fragments were visualized by staining with ethidium bromide. Results. The amplification of 25 primers generated different fragments in studied species that allowed characterizing 440 fragments of 100-2900 bp. High percentage of polymorphic fragments (66.67 to 86.29), Shannon index (0.365 to 0.486) and genetic diversity of Nei (0.248 to 0.331) were detected. Conclusions. The level of genetic variability in the broodstocks was adequate for allowing their use in restocking programs in the studied Rivers. However, periodical monitoring studies of genetic variability in these stocks, the mating system, reproductive system and general management must be made to guarantee the preservation of wild populations.

Key words: Genetic conservation, Leporinus elongatus, Pseudoplatystoma fasciatum, Rhamdia quelen, Salminus brasiliensis (Source: DeSC, CAB Thesaurus).

RESUMEN

Objetivo. El objetivo de este estudio fue evaluar la diversidad genética de los siguientes lotes de reproductores: piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus brasiliensis), jundiá (Rhamdia quelen) y cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) utilizados para programas de repoblación en los ríos brasileños Paranapanema, Iguaçu y Paraná. Materiales y métodos. Muestras de aleta caudal de 122 peces fueron analizadas. El ADN fue extraído por el protocolo de NaCl. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis horizontal en gel de agarosa. Los fragmentos fueron visualizados por marcación con bromuro de etidio. Resultados. La amplificación de los 25 iniciadores produjo diferentes fragmentos en las especies estudiadas que permitieron caracterizar 440 fragmentos de 100 a 2900 pb. Fueron detectados un alto porcentaje de fragmentos polimórficos (66.67 a 86.29), de

mailto:[email protected]


índice de Shannon (0.365 a 0.486) y de diversidad genética de Nei (0.248 a 0.331). Conclusiones. El nivel de variabilidad genética en los lotes de reproductores fue adecuado para su utilización en programas de repoblación en los ríos estudiados. Sin embargo, estudios de monitoreo periódico de la variabilidad genética en esos lotes, del sistema de cruzamiento, del sistema reproductivo y del manejo general deben ser realizados para garantizar la preservación de las populaciones naturales.

Palabras clave: Conservación genética, Leporinus elongatus, Pseudoplatystoma fasciatum, Rhamdia quelen, Salminus brasiliensis (Fuente: DeSC, CAB Thesaurus).

INTRODUCTION

In the last seven years, fishing of the world aquatic organisms has pointed out toward decreases and stabilization. In 2005 and 2010, only 92.478.416 and 88.970.124 tons were, respectively, captured, which means a reduction of 3.508.292 tons. In 2011, in contrast, 93.494.340 tons had 4.524.216 tons higher than in 2010 (1). The fish farming, otherwise, has been more significant. For example, in 2005 and 2010 the growth was higher than the catching, when there was an increase from 57.815.836 to 78.028.539 tons, respectively, representing a net output of 20.212.703 tons. In 2011, furthermore, 83.675.661 tons of fish were raised; an output of 5.647.122 tons higher than in 2010 (1).

In Brazil, based on data from the Aquaculture and Fisheries Ministry (2), the fishing exploitation had an increase from 785.366 in 2010 to 803.270 tons in 2011, or 2.3%. Otherwise, the fish farming increased from 479.398 in 2010 to 628.704 tons in 2011, or 31.1%. These data suggest an overlap of fish farming on fishing exploitation in the next years as well as detected in other segments of the animal production (3). The piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus brasiliensis), jundiá (Rhamdia quelen) and cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) species has been highlighted because they are present in several Brazilian basins (4) with several factors encouraging their farming as the good growth and performance, the easy reproduction and the rusticity (5-8). These factors have impacted the Brazilian market of fish. For example, in 2011 were produced 4309.3 and 1747.3 tons of Rhamdia and Leporinus (2).

Other factors, however, as the water pollution, deforestation, habitat destruction, overfishing, introduction of exotic species and river damming (9,10) has been reducing the wild populations of these freshwater fish in Brazil. Among the several decisions made to mitigate the reduction of the wild populations of fish, we highlight the restocking programs (11). Despite they have been applied in Brazil for decades, researches about their genetic and environmental efficiency have still to be done (12). Based on Kalinowski et al (13), the goals of such programs for

INTRODUCCIÓN

En los últimos siete años, la pesca en el mundo de organismos acuáticos apunta a incrementos y estabilización. Entre 2005 y 2010, sólo 92.478.416 Y 88.970.124 t fueron, respectivamente, capturadas, lo cual significa una reducción de 3.508.292 t. En 2011, en contraste, 93.494.340 toneladas fueron 4..524.216 toneladas más que en 2010 (1). La piscicultura, por otro lado, ha sido más significativa. Por ejemplo, en 2005 y 2010 el crecimiento fue mayor que la pesca, cuando hubo un incremento de 57.815.836 a 78.028.539 t, respectivamente, representando una producción de 20.212.703 t. En 2011, asimismo, 83.675.661 t de pescado fueron cultivadas; una producción de 5.647.122 t más que en 2010 (1).

En Brasil, basados en datos del Ministerio de Acuicultura y Pesca (2), la explotación de pesca tuvo un incremento de 785.366 en 2010 a 803.270 t en 2011, o 2.3%. De otra manera, la piscicultura creció de 479.398 en 2010 a 628.704 t en 2011, o 31.1%. Éstos datos sugieren una sobre posición de piscicultura sobre la explotación de pesca en los próximos años así como se ha detectado en otro segmento de producción animal (3). Las especies de piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus brasiliensis), jundiá (Rhamdia quelen) y cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) se han resaltado porque están presentes en varias cuencas brasileñas (4) con diversos factores que estimulan su cultivo como el buen crecimiento y rendimiento, la fácil reproducción y la rusticidade (5-8). Estos factores han impactado el mercado brasilero para los peces. Por ejemplo en el 2011 se produjeron 4309.3 y 1747.3 toneladas de Rhamdia y Leporinus (2).

Otros factores, sin embargo, como la polución del agua, deforestación, destrucción del hábitat, sobrepesca, introducción de especies exóticas y represamiento de los ríos (9,10) han reducido las poblaciones naturales de esos peces de agua dulce en el Brasil. Entre las decisiones tomadas para mitigar la reducción de las poblaciones naturales de peces, resaltamos los programas de repoblación (11). Aunque han sido aplicados en Brasil por décadas, las investigaciones sobre su eficiencia genética y ambiental no se han hecho

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endangered species have been to avoid the complete losses of gene clusters, preserve as much as possible the genetic diversity and reach the first step without compromise the survivorship of the populations in a long term. Many programs, however, were unsuccessful because the mismanagement of parental stocks (11) and the genetic non-monitoring. Thus, the genetic evaluation of the stocks for restocking has to be done. The molecular markers have been one of the most useful methods to approach the genetic diversity and the population structure of the various species and fish lines (14,15).

The aim of the current study was to evaluate the genetic diversity of the piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus brasiliensis), jundiá (Rhamdia quelen) and cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) broodstocks in restocking programs applied in the Paranapanema, Iguaçu and Paraná Brazilian Rivers.

MATERIAL AND METHODS

Study site and sample collection. Caudal fins samples from broodstocks of the species Leporinus elongatus (30 samples), Salminus brasiliensis (30 samples), Rhamdia quelen (36 samples) and Pseudoplatystoma fasciatum (26 samples) were collected. These broodstocks are originally from collections carried in the Paranapanema River - São Paulo State (S 22° 26’ and 47° 54’ W - L. elongatus and S. brasiliensis), Iguacu River - Paraná State (S 25° 40’ and 54° 26’ W - R. quelen) and Paraná river - Parana State (S 23° 16’ and 53° 43’ W - P. fasciatum), Brazil. All these fish will be used to compose the restocking programs in these respective rivers. Experimental procedure. The DNA was extracted using the protocol described by Lopera-Barrero et al (16). The DNA extracted was quantified in the Shimadzu spectrophotometer using the absorbance of 260 nm. The samples were diluted to 10 ng/µL, and the DNA quality was evaluated in 1% agarose gel electrophorese using a buffer TBE 1X (500 mM Tris-HCl, 60 mM boric acid and 83 mM EDTA) at 70 V for one hour. The gel was visualized under UV radiation after treatment with ethidium bromite (0.5 mg/ml) for one hour. Thereafter, the image was photographed using the program Kodak EDAS (Kodak 1D Image Analysis 3.5, EUA).

The DNA was amplified in volume of reaction of 15 μL using the buffer 1X Tris KCl, 2 mM of MgCl2, 0.46 μM of primer, 0.2 mM of every dNTP, one unity of Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, EUA), and 10 ng of target DNA.

(12). De acuerdo con Kalinowski et al (13), las metas de dichos programas para especies en peligro de extinción ha sido evitar las pérdidas completas de conjuntos de genes, preservar en lo más posible la diversidad genética y llegar el primer paso sin comprometer la supervivencia de las poblaciones a largo plazo. Muchos programas, sin embargo, no han sido exitosos debido al mal manejo de los lotes parentales (11) y a la falta de monitoreo genético. Así, la evaluación genética de los lotes para repoblación debe ser realizada. Los marcadores moleculares han sido uno de los métodos más útiles para abordar la diversidad genética y la estructura poblacional de varias especies y líneas de peces (14,15)

El objetivo del presente estudio fue evaluar la diversidad genética de lotes de reproductores de piapara (Leporinus elongatus), dourado (Salminus brasiliensis), jundiá (Rhamdia quelen) y cachara (Pseudoplatystoma fasciatum) en programas de repoblación aplicados en los ríos Brasileños Paranapanema, Iguacu y Paraná.

MATERIALES Y MÉTODOS

Locación del estudio y recolección de muestras. Fueron recolectadas muestras de aleta caudal de estoques de reproductores de las espécies Leporinus elongatus (30 muestras), Salminus brasiliensis (30 muestras), Rhamdia quelen (36 muestras) y Pseudoplatystoma fasciatum (26 muestras). Esos estoques de reproductores son originarios de recolectas realizadas en el río Paranapanema - Estado de São Paulo (S 22° 26´ y 47° 54’ W - L. elongatus y S. brasiliensis), río Iguaçu – Estado del Paraná (S 25° 40´ y 54° 26´ W - R. quelen) y río Paraná – Estado del Paraná (S 23° 16´ y 53° 43´ W - P. fasciatum), Brasil. Todos estos peces serán utilizados para componer los programas de repoblación en estos respectivos ríos. Procedimiento experimental. El ADN fue extraído utilizando el protocolo descrito por Lopera-Barrero et al (16). El ADN extraído se cuantificó en un espectrofotómetro Shimadzu utilizando la absorbancia de 260 nm. Las muestras fueron diluidas a 10 ng/μL y la calidad de la ADN fue evaluada en electroforesis en gel de agarosa 1% utilizando tampón TBE 1X (500 mM Tris-HCl, 60 mM ácido bórico y 83 mM EDTA) a 70 V por una hora. El gel fue visualizado bajo radiación UV después del tratamiento con Bromuro de etidio (0.5 mg/ml) por una hora. Luego, la imagen fue fotografiada utilizando el programa Kodak EDAS (Kodak 1D Análisis de Imagen 3.5, EUA).

Lopera-Barrero - Genetic variability of broodstocks of restocking programs


The reactions were amplified in Eppendorf Mastercycler Gradient (EUA), and the cycles were based on the species. L. elongatus and S. brasiliensis had the DNA denaturized at 96ºC for 5 min and soon after was conducted 40 cycles of 1 min at 94ºC, 1 min and 30 s annealing the primer at 36ºC and extension at 72ºC for 2 min. Thereafter, the final extension was at 72ºC for 7 min. Otherwise, R. quelen had DNA denaturized at 92ºC for 4 min and soon after was conducted 40 cycles of 1 min at a 92ºC, 1 min of annealing at 40ºC and 2 min at 72ºC for extension. Soon after, was did the final extension at 72ºC for 5 min. Finally, P. fasciatum had amplification programmed for 40 cycles, with one initial step of denaturation at 95ºC for 5 min and the final step at 72ºC for 7 min. Every cycle had 1 min at 94ºC, 1 min at 36ºC and two min at 72ºC. Twenty five primers from the Kits OPA, OPW and OPX (Operon Technologies Ltd., Valencia, USA) with 10 bases for every species were tested, when those of best definition and reproducibility were chosen (Table 1).

The amplified products were separated in agarose gel at 1.5% using horizontal electrophoresis. Fifteen microliters of amplified product in conjunction with 2 μL of sample buffer (40% sucrose and 0.25% bromophenol blue) were inserted into the gel. This electrophoresis was carried out in buffer TBE 0.5X (45 mM Tris-Borate and 1 mM EDTA) at 70 V for 4 hours. The quantification and amplification gel were visualized under UV radiation after ethidium bromide dyeing (0.5 μg/mL) for 1 hour. The images were photographed using the program EDAS (Kodak 1D Image Analysis 3.5, New York, USA).

Computer software and statistical analysis. The size of the fragments was estimated by comparing them to the standard ladder of 100 bp (Invitrogen, Carlsbad, USA). The presence or absence of fragments with similar molecular size was used to build a similarity matrix based on the Jaccard coefficient where 1 was the presence and 0 was the absence. The percentage of polymorphic fragments (95% criterion), the Shannon´s index and the genetic diversity of Nei were calculated by the PopGene 1.31 program (17).

RESULTS

The 25 primers (Table 1) had different amplification standards for every fish species. A total of 440 fragments from 100 bp (OPW14-Pseudoplatystoma fasciatum) to 2900 bp (OPW03 - Leporinus elongatus) were amplified. The total number of fragments and number of polymorphic fragments were different among the species. In L. elongatus, 107 in 124 fragments were polymorphic; S.

El ADN fue amplificado en volumen de reacción de 15 μL utilizando tampón 1X Tris-KCl, 2 mM de MgCl2, 0.46 μM de iniciador, 0.2 mM de cada dNTP, una unidad de Platinum Taq DNA polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, EUA), y 10 ng de ADN objetivo.

Las reacciones fueron amplificadas en termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (EUA), y los ciclos se basaron en las especies. L. Elongatus y S. Brasilensis tuvieron el ADN desnaturalizado a 96°C por 5 min y poco después se llevaron a cabo 40 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min y 30 seg de ligación del iniciador a 40°C y 2 min a 72°C de extensión. Poco después, fue realizada la extensión final a 72°C por 5 min. De otro modo, R. quelen tuvo el ADN desnaturalizado a 92°C durante 4 min y poco después se llevaron a cabo 40 ciclos de 1 min a 72°C para la extensión. Posteriormente, se hizo la extensión final a 72°C durante 5 min. Finalmente, P. Fasciatum tuvo amplificación programada para 40 ciclos, con un paso inicial de desnaturalización de 95°C por 5 min y un paso final de 72°C por 7 min. Cada ciclo tuvo 1 min a 94°C, 1 min a 36°C y 2 min a 72°C. Veinticinco iniciadores de los kits OPA, OPW y OPX (Operon Technologies Ltd Valencia, EUA), con 10 bases para cada especie fueron probados, y aquellos de mejor definición y reproductibilidad fueron escogidos (Tabla 1).

Los productos amplificados se separaron en gel de agarosa al 1.5% en el uso de electroforesis horizontal. Quince micro-litros de producto amplificado en conjunción con 2 μL de tampón de muestra (40% de sacarosa y 0.25% de azul de bromofenol) se insertaron en el gel. Esta electroforesis se realizó en tampón TBE 0.5X (45 mM Tris Borato y 1 mM EDTA) a 70 V por 4 horas. El gel de cuantificación y amplificación fue visualizado bajo radiación UV luego de tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/mL) por una hora. Las imágenes fueron fotografiadas utilizando para el programa EDAS (Kodak 1D Análisis de Imagen 3.5, EUA).

Software de computador y análisis estadístico. El tamaño de los fragmentos se estimó comparándolos con la escala estándar de 100 bp (Invitrogen, Carlsbad, USA). La presencia o ausencia de fragmentos con tamaño molecular similar fue utilizada para construir una matriz de similaridad basada en el coeficiente de Jaccard donde 1 era la presencia 0 era la ausencia. El porcentaje de fragmentos polimórficos (criterio de 95%), el índice de Shannon y la diversidad genética de Nei se calcularon con el programa PopGene 1.31 (17).

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brasiliensis had 76 in 105; R. quelen had 128 in 134 fragments, being the highest number of fragments and percentage detected in the current experiment. Finally, P. fasciatum had 71 in 77 fragments (Table 2).

Table 1. Nucleotide sequences and percentage of G+C bases of the primers amplified for the Leporinus elongatus, Salminus brasiliensis, Rhamdia quelen and Pseudoplatystoma fasciatum broodstocks.

Primers Nucleotide sequences Percentage of G + C

OPA02 5’-TGCCGAGCTG-3’ 70

OPA05 5’-AGGGGTCTTG-3’ 60

OPA10 5’-GTGATCGCAG-3’ 60

OPA16 5’-AGCCAGCGAA-3’ 60

OPW01 5’-CTCAGTGTCC-3’ 60

OPW02 5’-ACCCCGCCAA-3’ 70

OPW03 5’-GTCCGGAGTG-3’ 70

OPW04 5’-CAGAAGCGGA-3’ 60

OPW05 5’-GGCGGATAAG-3’ 60

OPW06 5’-AGGCCCGATG-3’ 70

OPW08 5’-GACTGCCTCT-3’ 60

OPW09 5’-GTGACCGAGT-3’ 60

OPW11 5’-CTGATGCGTG-3’ 60

OPW14 5’-CTGCTGAGCA-3’ 60

OPW15 5’-ACACCGGAAC-3’ 60

OPW19 5’-CAAAGCGCTC-3’ 60

OPXO1 5’-CTGGGCACGA-3’ 70

OPX02 5’-TTCCGCCACC-3’ 70

OPX03 5’-TGGCGCAGTG-3’ 70OPX06 5’-ACGCCAGAGG-3’ 70

OPX07 5’-GAGCGAGGCT-3’ 70

OPXO9 5’-GGTCTGGTTG-3’ 60

OPX12 5’-TCGCCAGCCA-3’ 70

OPX13 5’-ACGGGAGCAA-3’ 60

OPX17 5’-GACACGGACC-3’ 70

RESULTADOS

Los 25 iniciadores (Tabla 1) tuvieron diferentes estándares de amplificación para cada especie de pez. Un total de 440 fragmentos de 100 pb (OPW14 - Pseudoplatystoma fasciatum) a 2.900 pb (OPW03 - Leporinus elongatus) fueron amplificados. El número total de fragmentos y el número de fragmentos polimórficos fue distinto entre las especies. En L. elongatus, 107 de 124 fragmentos fueron polimórficos; S. brasiliensis tuvo 76 en 105; R. quelen tuvo 128 en 134 fragmentos, siendo el mayor número de fragmentos y porcentajes detectado en el presente experimento. Finalmente, P. fasciatum tuvo 71 en 77 fragmentos (Tabla 2).

Con relación al porcentaje de fragmentos polimórficos se encontraron valores altos para todas las especies (66.67% al 86.29%). Los valores del índice de Shannon fueron igualmente altos. Los resultados de la diversidad genética de Nei mostraron altas estimaciones que van de 0,248 (S. brasiliensis) a 0.331 (R. quelen) (Figura 1).

DISCUSIÓN

El número total de fragmentos encontrados concuerda con las conclusiones de Telles et al. (2001) que determinaron mayor importancia del número de fragmentos obtenidos (como mínimo 50) que el número de iniciadores utilizados para el cálculo de la diversidad genética.

El porcentaje de fragmentos polimórficos, índice de Shannon y parámetros de diversidad genética de Nei indicaron una alta variabilidad genética que es esencial para un buen desempeño de programas de repoblación. Alelos perdidos de resistencia a enfermedades y reducciones en la capacidad de adaptación son consecuencias de la reducción de variabilidad genética (14). Los datos publicados de marcadores moleculares con las mismas especies estudiadas se muestran en la tabla 3. No se encontraron referencias a P.

Figure 1. Percentage of polymorphic fragments, Shannon index, and the genetic diversity of Nei Leporinus elongatus, Salminus brasiliensis, Rhamdia quelen and Pseudoplatystoma fasciatum broodstocks.



About the percentage of polymorphic fragments high values were found for all the species (66.67% to 86.29%). The Shannon index values were similarly high. The results from the genetic diversity of Nei showed high estimates, ranging from 0.248 (S. brasiliensis) to 0.331 (R. quelen) (Figure 1).

DISCUSSION

The total number of fragments found is consistent to the conclusions of Telles et al. (18) that determined the most important number of fragments obtained (at least 50) than the number of primers used for the calculation of genetic diversity.

The percentage of polymorphic fragments, Shannon index and genetic diversity of Nei parameters indicated high genetic variability that is essential for a good performance of restocking programs. Losses alleles of disease resistance and reduction in the adaptation capacity are consequences of dropping in the genetic variability (14). Literature data from molecular markers with the same studied species are displayed in the table 3. References to P. fasciatum were not found and only one

Table 2. Fragment number, number of polymorphic fragments and size of amplified fragments for Leporinus elongatus, Salminus brasiliensis, Rhamdia quelen and Pseudoplatystoma fasciatum broodstocks.

PrimersLeporinus elongatus Salminus brasiliensis Rhamdia quelen Pseudoplatystoma

fasciatumNF NFP T NF NFP T NF NFP T NF NFP T

OPA02 - - - 17 17 200-2072 17 17 320-1900 - - -

OPA05 - - - - - - 13 12 300-1600 - - -

OPA10 - - - - - - - - - 11 11 200-1200

OPA16 14 13 300-2500 12 09 300-2500 - - - 08 08 250-1300

OPW01 17 12 400-2500 - - - - - - - - -

OPW02 - - - - - - - - - 11 10 300-2072

OPW03 15 13 480-2900 - - - - - - - - -

OPW04 18 17 400-2800 - - - - - - - - -

OPW05 - - - - - - - - - 09 08 200-1400

OPW06 - - - - - - 21 20 300-2072 - - -

OPW08 18 17 350-2400 - - - 18 18 400-1800 - - -

OPW09 - - - - - - 20 18 420-1900 - - -

OPW11 - - - - - - 12 12 420-1800 - - -

OPW14 - - - - - - - - - 10 09 100-1200

OPW15 - - - - - - 16 15 500-1900 - - -

OPW19 14 11 300-2072 - - - - - - 13 11 400-2072

OPXO1 13 10 300-2200 11 06 550-2500 - - - - - -

OPX02 - - - - - - - - - 08 07 200-1600

OPX03 15 14 500-2500 - - - - - - - - -

OPX06 - - - 13 05 400-2072 - - - - - -

OPX07 - - - 12 09 600-2072 - - - - - -

OPXO9 - - - 19 13 200-2600 - - - - - -

OPX12 - - - 08 07 700-2072 - - - - - -

OPX13 - - - 13 10 400-2072 - - - - - -

OPX17 - - - - - - 17 16 430-2072 07 07 250-1300

Total 124 107 300-2900 105 76 200-2600 134 128 100-2072 77 71 100-2072

NF: Fragment number; NFP: number of polymorphic fragments; T: size (bp).

Table 3. Variability and genetic diversity using molecular markers in L. elongatus, S. brasiliensis and R. quelen.

Authors Species %FP IS DGN

(19) R. quelen 93.9 - -

(20) S. brasiliensis 42.19-44.79 - 0.018

(8) L. elongatus 81.3-88.8 0.4086-0.4470 0.0234-0.1224

(22) L. elongatus 76.74 e 86.96 0.425-0.444 -

(14) S. brasiliensis 51.04 0.2805 0.268

(23) S. brasiliensis 33.33-71.43 0.174-0.382 0.198-0.372

(10) L. elongatus 70.6-82.6 - 0.086

(28) S. brasiliensis 36.14-48.02 - 0.1612

%FP: percentage of polymorphic fragments; IS: Shannon index; DGN: Genetic diversity of Nei

fasciatum y solo un manuscrito para R. quelen fue reportado.

Con relación al porcentaje de fragmentos polimórficos (PFP) y el índice de Shannon (IS) de otros artículos (Tabla 3), sólo el PFP de R. quelen encontrados por Lidani et al (19) fue mayor que aquel encontrado en la investigación actual. Ambos parámetros (PFP y IS) fueron un poco menores en todos los artículos de L. elongatus y mucho más pronunciados para S. brasiliensis.

4683

manuscript to R. quelen was reported. Not all the cited references available had evaluated the same parameters investigated in the current experiment.

About the percentage of polymorphic fragments (PPF) and Shannon index (SI) from other manuscripts (Table 3), just the percentage of polymorphic fragments of R. quelen found by Lidani et al (19) was higher than was found in the current investigation. Both parameters (PPF and SI) were slightly lower in all manuscripts about L. elongatus and much more pronounced for S. brasiliensis. Most of the samples evaluated by these authors were collected in Paranapanema River. Working with S. brasiliensis, Lopes et al (20) stated that the genetic variability found in their stocks was the consequence of the small population in the sites where these fish were collected (Canoas complex, Paranapanema River). Thus, despite the river from where was collected the specimens of L. elongatus and S. brasiliensis had been the same the founder effect may have had influence on the genetic variability. Based on Kang et al (21), the small effective number of parental fish in the stock formation may eliminate low frequent alleles, and consequently reducing the genetic variability. This was the factor reported by Lopera Barrero et al (22) which induced high variability in Prochilodus lineatus because the stocks investigated were formed by fish populations from different Rivers. Similarly, Gomes et al (23) found low genetic variability in a group of seven S. brasiliensis with 33.33% of polymorphic fragments and Shannon index of 0.174, the lowest values found in these groups.

The genetic diversity of Nei is a parameter which determines the level of population differentiation. Based on the values obtained in this study, it can be affirmed that there was high heterogeneity between stocks, suggesting that they do not have a common origin. For this parameter, the values expressed in table 3 were classified from low to very high. Based on low values of genetic diversity (0.086), Ramos et al (10) stated that groups collected different periods in the transposition ladder of the UHE in Canoas I and Canoas II were part of only one population with several sub-populations. Similar conclusion was found by Lopez et al (20) to observe a value of 0.018. They also stated that this and other groups were structured in just one population from Capivara reservoir

The efficiency of restocking programs has also to be highlighted beyond proper genetic variability, i.e. the program intensity, number of parents using in the mating, mating system, general management, and the genetic differentiation between wild and broodstock populations.

La mayoría de las muestras evaluadas por estos autores fue recolectada en el río de Paranapanema. Trabajando con S. Brasiliensis, lopes et al (20) declaró que la variabilidad genética encontrada en sus poblaciones fue la consecuencia de la población pequeña en los sitios donde estos peces fueron recolectados. (Complexo de Canoas, Río Paranapanema). Entonces, a pesar de que el río donde los especímenes de L. Elongatus y S. Brasiliensis fueron recolectados fue el mismo, el efecto fundador pudo tener una influencia en la variabilidad genética. Con base en Kang et al (21), el pequeño número efectivo de peces parentales en la formación del lote puede eliminar alelos de baja frequencia, y consecuentemente reducir la variabilidad genética. Este fue el factor reportado por Lopera Barrero et al (22) que indujo una alta variabilidad en Prochilodus lineatus debido a que los lotes investigados se formaron con poblaciones de peces de distintos Ríos. Similarmente, Gomes et al (23) encontraron baja variabilidad genética en un grupo de siete S. Brasiliensis con 33.33% de fragmentos polimórficos y un índice de Shannon de 0.174, los menores valores encontrados en estos grupos.

La diversidad genética de Nei es un parámetro que determina el nivel de diferenciación entre poblaciones. Con base en los valores obtenidos en el presente estudio, puede afirmarse que hubo alta heterogeneidad entre los lotes, sugiriendo que los mismos no presentan una origen en común. Para este parámetro, los valores expresados en la tabla 3 fueron clasificados de bajos a muy altos. Con base en los bajos valores de diversidad genética (0.086), Ramos et al (10) declaro que grupos recolectados en diferentes periodos en la escalera de transposición de UHE en Canoas I y Canoas II fueron parte de sólo una población con distintas subpoblaciones. Una conclusión similar fue encontrada por Lopes et al (20) al observar un valor de 0.018. También establecieron que este y otros grupos fueron estructurados en sólo una población del reservatorio Capivara.

La eficiencia de los programas de repoblación también ha sido resaltada más allá de la variabilidad genética, ej. la intensidad del programa el número de padres utilizado en el apareamiento, el sistema de apareamiento, manejo general, y la diferenciación genética entre poblaciones naturales y lotes de reproductores.

Evaluando la intensidad de repoblación de Salvelinus fontinalis en la diversidad genética de poblaciones naturales, Marie et al (24) estableció que en lagos con mayor intensidad había mayores niveles de diversidad, probablemente debido a la introducción de alelos domésticos. No obstante, Lopera Barrero



Evaluating the intensity of restocking of Salvelinus fontinalis on the genetic diversity of wild populations, Marie et al (24) stated that in the lakes with higher intensity had higher levels of diversity, likely because of the introduction of domestic alleles. However, Lopera Barrero et al (22) reported the importance of genetic monitoring of populations to avoid losses in genetic variability (outbreeding depression), while preventing the introduction of genetic material com high genetic differentiation in relation to the wild population.

On the other hand, showing the negative effect of impropriated number of parents, Machado-Schiaffino et al (25) reported the variability losses in juveniles of Atlantic salmon (Salmo salar L.) from restocking programs in comparison to wild populations likely because the bottleneck effect caused by the reduced number used in breeding matings. In contrast, Lopera-Barrero et al (26) stabilized the variability using 24 parental fish (12 males and 12 females) of Brycon orbignyanus showing the positive effect of adequate number of parents, despite the semi-natural reproductive system that also had influence in maintain the genetic variability.

Another factor with influence in the genetic variability of fish stocks has been the mating system. Gomes et al (14) found higher estimates of genetic variability in the progeny of S. brasiliensis than in the parental fish using the semi-natural reproductive system. When evaluating the paternity of progeny Brycon orbignyanus in semi-natural and extrusion reproductive systems, Lopera Barrero et al (27) found multiple paternities and differentiated reproductive contribution in both systems. The authors, however, suggest more experiments to confirm the reproductive efficiency of semi-natural system in maintaining the genetic variability in other species.

The management of the offspring can also influence the genetic variability of restocking programs. Almeida et al (28) found that instead of releasing each offspring lot separately into the water, mixing specimens produced in the various fry stocks before releasing them in the river would be more feasible. The restocked population will have a genetic structure closer to wild populations. On the other hand, Rodriguez-Rodriguez et al (29) suggested that in the progeny aimed at restocking programs a first genetic analysis must be carried in the larval stage (3 days), which will provide a general overview of the new genetics generation. Then, at 60 or 90 days, depending on environmental conditions of the ecosystem should be performed a second analysis to objectively determine the final genetic variability with which individuals will be released into the river. This analysis should

et al (22) reportó la importancia del monitoreo genético de las poblaciones para evitar pérdidas en la variabilidad genética (depresión exogámica), además de impedir la introducción de material genético con alta diferenciación genética en relación a la población natural.

Por otro lado, mostrando el efecto negativo de un número inapropiado de padres, Machado-Schiaffino et al (25) reportó la pérdida de variabilidad en juveniles de salmón atlántico (Salmo salar L.) de programas de repoblación en comparación con poblaciones naturales probablemente debido al efecto de cuello de botella causado por el reducido número de reproductores usado en los apareamientos. En contraste, Lopera Barrero et al (26) estabilizó la variabilidad utilizando un 24 peces parentales (12 machos y 12 hembras) de Brycon orbignyanus mostrando un efecto positivo en el número adecuado de padres, a pesar de que el sistema reproductivo seminatural también tuvo influencia en mantener la variabilidad genética.

Otro factor con influencia en la variabilidad genética de lotes de peces ha sido el sistema de apareamiento. Gomes et al (14) encontraron mayores estimados de variabilidad genética en la progenie de S. Brasiliensis que en los peces parentales utilizando el sistema de reproducción seminatural. Cuando evaluada la paternidad de la progenie de Brycon orbignyanus en sistemas de reproducción seminatural y de extrusión, Lopera Barrero et al (27) encontró múltiples paternidades y contribución reproductiva diferenciada en ambos sistemas. Los autores, sin embargo, sugieren más experimentos para confirmar la eficiencia reproductiva del sistema seminatural para mantener la variabilidad genética en otras especies.

El manejo de la progenie también puede influenciar la variabilidad genética de programas de repoblación. Almeida et al (28) encontraron que en lugar de liberar cada lote de progenies de manera separada en el agua, mezclar los especímenes producidas en varios lotes antes de liberarlos en el río era más factible. La población repoblada tendrá una estructura genética cercana a la de las poblaciones naturales. Por otro lado, Rodriguez-Rodriguez et al (29) sugirió que en la progenie destinada a programas de repoblación un primer análisis genético debe realizarse en la etapa larval (3 días), lo que proporcionará una visión general de la nueva generación de la genética. Luego, a los 60 o 90 días, dependiendo de las condiciones ambientales del ecosistema, debe ser realizado un segundo análisis para determinar objetivamente la variabilidad genética final con la cual los individuos serán liberados en el río. Ese análisis debe ser realizada para determinar cuáles individuos serán liberados y determinar la verdadera viabilidad de repoblar.

Finalmente, la alta diferenciación genética entre poblaciones naturales y lotes de reproductores puede

4685

inducir a pérdidas de genes importantes asociados con la adaptación local. Similarmente, González et al (30) encontró una alta diferenciación genética entre los lotes de Diplodus sargus (para repoblar el golfo de Castellamare, Italia) y muestras de la población natural. Con base en estos autores, la diferenciación fue posiblemente verificada por la inclusión periódica de individuos naturales de otros lugares y el manejo adoptado en cautiverio.

Con base en los presentes resultados, el nivel de variabilidad genética lotes de reproductores de L. elongatus, S. brasiliensis, R. quelen y P. Fasciatum es adecuado para permitir su uso en programas de repoblación en los Ríos Paranapanema, Iguaçu y Paraná. Sin embargo, el monitoreo periódico de la variabilidad genética de estas poblaciones, el sistema de apareamiento, el sistema reproductivo adecuado y el manejo general puede aún ser estudiada para garantizar la preservación de estas poblaciones naturales.

Agradecimiento

Los autores agradecen a Duke Energy International por proporcionar parte del material biológico y a los investigadores, técnicos y estudiantes que apoyaron el presente experimento.

be performed to determine which individuals will be released and determine the true feasibility of restocking.

Finally, high genetic differentiation between wild and broodstocks can induce important gene losses associated with local adaptation. Similarly, González-Wangüemert et al (30) found high genetic differentiation between stocks of Diplodus sargus (for restocking the Castellamare gulf, Italy) and samples from the wild population. Based on these authors, this differentiation was likely verified by periodic inclusion of wild individuals from other places and the management adopted in captivity.

Based on the current results, the level of genetic variability in the L. elongatus, S. brasiliensis, R. quelen and P. fasciatum broodstocks are therefore adequate for allowing their use in restocking programs in the Paranapanema, Iguaçu and Paraná Rivers. However, periodical monitoring of the genetic variability of these stocks, the mating system, proper reproductive system and general management should be studied to guarantee the preservation of these wild populations.

Acknowledgements

The authors are thanks to the Duke Energy International for providing part of the biological material, and the researchers, technicians and students who supported the current experiment.

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The effect of changing the pre-slaughter handling on bovine cattle DFD meat

Efecto del cambio en el manejo antemortem sobre la presencia de carne DFD en ganado bovino

Cristina Pérez-Linares,1 Ph.D, Alberto Barreras S,1 Ph.D, Eduardo Sánchez L,1 Ph.D, Bárbara Herrera S,1 M.Sc, Fernando Figueroa-Saavedra,1* Ph.D.

Universidad Autónoma de Baja California. Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias. Km 3.5 Carr. a San Felipe, Fracc. Campestre. C.P. 21386, Mexicali, Baja California, México. *Correspondence: [email protected].

Received: September 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT

Objective. To evaluate the effect that a series of changes in the handling techniques used throughout the pre and post slaughter periods and during the handling of cooled carcass have on the presence of DFD (Dark, firm and dry) meat. Materials and methods. Odds ratios (OR) and confidence intervals were estimated applying logistic regression models. Data from 18 visits to the slaughterhouse regarding: animal handling on arrival, slaughter period, and carcass storage was obtained through the use of a questionnaire. A total of 572 carcasses were analyzed to determine DFD meat using pH and color (L*, a*, b* and C*) measurements done on the Longissimus dorsi muscle. Results. Even after of the changes were made, the lairage period to slaughter continued to be a factor (p<0.05) associated to the presence of DFD meat (OR=1.13). Of the complementary variables, the amount of time that cattle spent on the resting pens was associated (p<0.05) to the presence of DFD meat (OR=1.003). Conclusions. Regardless of the changes made in the ante mortem handling, a high frequency of DFD was found (39%), suggesting a permanent audit program to detect other critical points in the supply chain.

Key words: Animal welfare, cattle, dark cutting meat (Source:CAB).

RESUMEN

Objetivo. Para evaluar el efecto de una serie de modificaciones en las técnicas de manejo usadas en el periodo pre y post-sacrificio y manejo de las canales en refrigeración en relación con la presencia de carne DFD (dura, firme y seca). Materiales y métodos. Se obtuvieron razones de desigualdad e intervalos de confianza empleando modelos de regresión logística. En 18 visitas a la planta de sacrificio, se aplicó un cuestionario obteniendo información sobre manejo de los animales desde su llegada a la planta, etapa de sacrificio y almacenamiento de las canales. Se estimó la frecuencia de carne DFD de analizar un total de 572 canales, registrando en el Longissimus dorsi pH y color (L*, a* b*, C*). Results. De las modificaciones realizadas, el tiempo de permanencia al sacrificio sigue siendo fue un factor asociado (p<0.05) a la presencia de carne DFD (OR=1.13). De las variables complementarias, el tiempo de espera en los corrales de descanso resultó correlacionado (p<0.05) a la presencia de carne DFD (OR=1.003). Conclusiones. Independientemente de los cambios realizados en el manejo ante mortem, se encontró una alta frecuencia de carne DFD (39%), sugiriendo un programa de auditoría permanente para detectar otros puntos críticos de la cadena logística.

Palabras clave: Bienestar animal, carne oscura para corte, ganado (Fuente:CAB).

ORIGINAL


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INTRODUCTION

The global commercialization of beef and its products and a growing demand for animal protein has resulted in a worldwide increase in the numbers of animals that are being slaughter (1), as result of this, the animal welfare problem related to transportation and pre slaughter of cattle has worsen (2). An important objective for the beef industry is to supply products that are both safe and of high quality and consumers are aware of the importance of this characteristics but they are also interested in the production process and on the environmental impact of the beef industry (3) so that cattle welfare has become a social issue and has broaden the concept of food quality (4).

In this context, along the production chain, animals are exposed to a series of factors and procedures that may cause them stress. The most common factors are: changes in weather, transport conditions, the way that animals are handled, the preslaughter waiting period, the stunning procedure, and the slaughter method (5). The size of any negative effect depends on the type, duration and intensity of the stressing factors before the animal is slaughter and how susceptible it is to them. These preslaughter adverse effects not only have an impact on animal welfare, but also have negative effects on the quality of the meat and on the income of the production chain participants, specifically in bovines there is evidence that preslaughter stress is detrimental to meat quality (6).

During the pre-slaughter period, stress and physical activity contribute to exhaust muscular glycogen, and as a result of this pH increases and beef changes its appearance so it may be classified as DFD (dark, firm and dry) also known as a dark cut. DFD meat is highly susceptible to bacterial problems because of the increased pH (≥5.8) (7). It is difficult to commercialize DFD meat because the consumer relates its dark color to poor storage conditions or assume that the beef is old (8).

Studies conducted in northwestern Mexico reported a 15.43% and 47.63% incidence of DFD meat during the summer and concluded that both pre slaughter and postmortem factors contribute to the presence of DFD meat, the lairage period before slaughter, relative humidity and the elapsed time period between slaughters were the relevant factor during the premortem period, while cooling temperature and the time that the carcass spent in the cooler were found to be important post mortem factors (9-11). Regarding the economic impact of DFD meat in

Pérez-Linares - Changes in pre-slaughter handling and cattle DFD meat

INTRODUCCIÓN

La globalización del comercio en los productos cárnicos en asociación con la creciente demanda de proteínas de origen animal ha dado lugar a un fuerte aumento en el número de animales sacrificados a nivel mundial (1), como resultado de esto, ha agudizado problemas de bienestar animal derivados del transporte y del manejo pre-sacrificio (2). Un objetivo importante de la industria cárnica es proporcionar productos seguros y de calidad a los consumidores, pero también incluye aspectos relacionados con las condiciones de producción y el impacto sobre el medio ambiente (3), recientemente, el bienestar animal se ha convertido en una preocupación social y un atributo dentro de un más amplio concepto de calidad de los alimentos (4).

En este contexto, durante la cadena productiva los animales están expuestos a una serie de factores y prácticas comerciales que pueden causar estrés en los animales. Estos factores son principalmente las variaciones climáticas, el transporte, el manejo, la espera pre-sacrificio, el aturdimiento y el sacrificio (5). La magnitud de cualquier efecto negativo está en función del tipo, duración e intensidad de los factores estresantes antes del sacrificio y la susceptibilidad individual de los animales Estos efectos adversos pre-sacrificio no solo tienen impacto en el bienestar de los animales, sino que también tienen claras repercusiones en la calidad de la carne y en los beneficios económicos a los participantes de la cadena, específicamente, en bovinos existen evidencias que el estrés pre-sacrificio puede tener un importante efecto perjudicial sobre la calidad de la carne (6).

El estrés y la actividad física de los animales durante el manejo pre-sacrificio tienden a agotar el glucógeno muscular, lo que provoca un incremento en el pH y la obtención de una carne con apariencia firme, oscura y seca (DFD por sus siglas en inglés), también conocida como cortes oscuros. La carne DFD es mayormente susceptible al deterioro bacteriano debido al incremento del pH (≥ 5.8) (7). Esto dificulta comercializar la carne DFD ya que el consumidor asocia su color oscuro a carne vieja o almacenada en malas condiciones (8).

Estudios realizados en el Noroeste de México (Baja California) reportaron un 15.43% y 47.63% de presencia de carne DFD en verano y concluyeron que en ambos los factores pre y post sacrificio contribuyeron a la presencia de carne DFD, el tiempo de espera del ganado antes del sacrificio, humedad relativa, el tiempo promedio entre animal y animal para entrar al


the same region it has been reported that as a result of this problem the carcass exhibits a 10% reduction of price so that its value decreases an average of 88.58 USD, if this amount is multiplied by the total number of carcasses produced between May and June of 2010 the estimated loss attributed to DFD meat is 5.272.946 USD (11).

In the state of Baja California slaughterhouses purchase the cattle on site and the seller is responsible for transporting the cattle to the plant, so if the animals are not handled properly during loading, transportation and unloading and as a result of this the carcass exhibits DFD meat, no economic sanction is received by either the transporter or the producer.

The objective of this study was to evaluate the effect that a series of changes in the handling techniques used throughout the pre and post slaughter periods and during the handling of cooled carcass have on the presence of DFD meat.

MATERIALS AND METHODS

Location. The study was done in the facilities of a (TIF) Federal Inspection Type Slaughter plant in the city of Mexicali, Mexico during the summer of 2009 (July–September). The region is geographically located at 32°40’ N Latitude, 115°28’ W Longitude, at an altitude of 10 meters above sea level, in Northwestern Mexico. Climate in this area can be described as dry desert with a 34.7°C average annual temperature of (-5°C in winter and 50°C in summer) 37 mm average annual rainfall and > 50 % relative humidity.

Pre-slaughter handling. The carcasses studied came from cattle fattened in three feedlots. The cattle are crossbreed Zebu x European (Zebu 30 and European 70%). The mean of final weight was 400 kg. Transportation from the feedlots to the plant was on trucks equipped with cattle cages with a capacity for 50 animals, within a distance of 16 kilometers. The trip time between the feedlots and the slaughter plant took between 15 and 30 minutes and once the cattle arrives to the plant the animals are unloaded and place in waiting pens until slaughter which takes place between 0700 to 1500 h according to the time of arrival.

The slaughter plant can process between 350 and 400 animal at a rate of 40 to 45 animals per hour. The stunning is done by one trained operator but in case of absence he is substituted by an operator with no training or lesser experience. The unloading ramp is made out of concrete

aturdimiento, mientras que la temperatura y las horas de almacenamiento de la canal antes de su embarque fueron factores asociados a la presencia de carne DFD (9-11). En relación al impacto económico de la carne DFD en la misma región se ha reportado que como resultado de este problema las canales exhiben una reducción del 10% del precio reduciendo su valor a un promedio de 88.58 USD, si esta cantidad es multiplicada por el número total de canales producidas entre mayo y junio del 2010, la pérdida estimada atribuida a la carne DFD es de 5.272.946 USD (11).

En el estado de Baja California las plantas de sacrificio compran el ganado en el sitio y el vendedor es el responsable de transportar el ganado a la planta, así que si los animales no son manejados de manera correcta durante el embarque, transporte y desembarque y como resultado de esto las canales exhiben DFD, ni el transportista ni el productor reciben una sanción económica.

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de una serie de modificaciones en las técnicas de manejo usadas a través del periodo pre y post-sacrificio y durante el manejo de las canales en refrigeración en relación con la presencia de carne DFD.


Locación. Este estudio fue hecho en las instalaciones de una planta de Sacrificio Tipo Inspección Federal (TIF) en la ciudad de Mexicali, México, durante el verano de 2009 (Julio –Septiembre). La región está geográficamente ubicada a 32° 40’ norte de latitud, 115° 28’ oeste de longitud, y a una altitud de 10 m sobre el nivel del mar, en el noreste de México. El clima en esta aria puede describirse como desierto árido con una temperatura anual promedio de 34.7 °C (-5˚C en invierno y 50˚C en verano), 37 mm de precipitación anual promedio y >50% de humedad relativa.

Manejo antemortem. Las canales estudiadas provenían de tres unidades de engorda intensiva. El ganado es cruza entre Cebú y Europeo (30% Cebú y 70% Europeo). El promedio de peso final fue de 400 kg. El transporte desde las unidades de engorda intensiva a la planta fue realizado en camiones equipados con jaulas ganaderas con capacidad de 50 animales, en una distancia de 16 km. El tiempo de transporte entre las unidades de engorda intensiva y la planta de sacrificio se llevó entre 15 y 30 minutos y una vez que el ganado llegó a la planta los animales fueron

4691Pérez-Linares - Changes in pre-slaughter handling and cattle DFD meat

with no non-sliding floor and has the same width of the pens which are connected by a series of corridors to a resting area with six 84 m2 roofed pens with non-sliding floors, water is available for the animal but they are not feed. An electric prod is use to lead the animals from the pens to the slaughter area through a curved corridor which connects the resting area to the stunning box that measures 1.80m high, 0.88 wide and 2.53m long and has mechanism to hold the cattle head, the animal enters the box through a guillotine type door and is taken out through a door with an horizontal opening. The slaughter process followed the guidelines established by the federal authorities in the NOM-033-ZOO-1994 norm for the humane slaughter of domestic and animals wild. After being stunned by a captive bolt pistol (model USSS-1 Jarvis) the animal is raised and hanged by the leg with a hook and after being bleed the cattle go to the production line for processing, the process after stunning takes around 40 minutes. The carcasses are stored in refrigerated rooms with temperatures between -2 and 2°C (12).

Data collection. The information was obtained from 18 randomly selected groups of animals, one third of this group came from each of the feedlots. Starting from the arrival of the animals to the plant and until the carcasses where stored all relevant information was recorded. The changes on the handling system were done based on the results obtained from a previous study (13). These results are shown on table 1. Due to their relation to the presence of DFD meat, information was obtained about the following handling procedures: use of the electric prod during unloading process, lairage period in the resting pens, temperature, relative humidity in the resting pens, number of persons that drive the cattle, use of the electric prod to drive the cattle, lairage time before slaughter, average time it takes to get into the stunning box, number of shots applied during stunning,

Table 1. Odds Ratio (OR) values and 95% Confidence Intervals for significant factors in Perez-Linares et al (13) joint with nature of each factor in previous study and changes made.

Factor Nature in the previous study OR 95%CI Change

Relative humidity in the resting pens

Greater than 31%, the cattle arrived at noon and was slaughter the morning of the following day

31.60 4.17-239.18The animals were slaughter the morning of the day of arrival.

Lairage period before slaughter

Equal or greater than 30 minutes 17.96 1.06-303.48 The period was reduced to less than 30

minutes

Average time to enter in stunning box 1.52 minutes or more 24.59 3.25-186.11 Less than one minute

Carcass temperature Between 5 and 10°C 5.28 1.70-16.38 The carcass are stored at least 24 hours in the cold room

Carcass storage time 8 to 12 hours 49.52 10.71-228.81 At least 24 hours of storage

descargados y puestos en corrales de espera hasta el sacrificio que se lleva a cabo entre las 0700 y 1500 h según la hora de llegada.

La planta de sacrificio puede procesar entre 350 a 400 animales por día en un rango de 40 a 45 animales por hora. Para el aturdimiento, un solo operador está capacitado y si llega a ser sustituido, es por un operador con poca o nula experiencia. La rampa de desembarque es de concreto y pisos no derrapantes con un ancho aproximado al ancho de las jaulas ganaderas que están conectadas por una serie de corredores a un área de descanso con 6 corraletas de 84m2 techadas y pisos de concreto no derrapantes. Los animales tienen acceso libre al agua pero no reciben alimento. Se utiliza una picana eléctrica para arrear a los animales desde las corraletas hasta el sacrificio. Los animales son guiados por un corredor curveado que conecta desde el área de descanso hasta el cajón de aturdimiento (1.80m alto x 0.88m de ancho x 2.53 m de largo) que no cuenta con un sistema de fijación de cabeza. El acceso al cajón de aturdimiento es a través de una puerta tipo guillotina y con una puerta de salida de abertura horizontal. El proceso de sacrificio se sigue bajo los lineamientos establecidos por las normas federales en la NOM-033-ZOO-1994 sobre el sacrificio humanitario de los animales domésticos y silvestres. Después de ser aturdido con una pistola de perno cautivo (modelo USSS-1 JARVIS) es izado suspendido en un gancho colocado del miembro posterior, desangrado y transferido a la línea de producción para su procesamiento concluyendo alrededor de los 40 minutos después del sacrificio. Las canales son almacenadas en cuartos refrigerados a una temperatura de entre -2 a 2°C (12).

Recolección de datos. La información obtenida de 18 grupos seleccionada aleatoriamente, un tercio de este grupo provenía de cada unidad de engorda intensiva. Se inició con la llegada de los animales a la planta y hasta que las canales fueron almacenadas, toda la información relevante fue


average time between stunning and bleeding, room temperature during slaughter, the use of a cloth to cover the carcass, carcass storage time and if the carcass was sprayed with water during cold storage, so that it their association with of DFD meat was established.

Meat quality evaluation. The relative frequency of DFD meat was estimated by analyzing 572 carcasses taken at random during the study period. At 24 h after slaughtering the animals, the pH values and color variables measurements (L* a*, b* and C*) were taken from the Longissimus dorsi muscle between the 11th and 12th ribs allowing 30 minutes to pass before the measurements were taken, all the measurements were repeated three times. The pH was measure in center of the muscle using a Delta TRAK ISFET pH 101 (Delta TRAK, Inc., Pleasanton, CA., U.S.A.). Color was determined in the muscle surface through a Minolta CM-2002 spectrophotometer (Minolta Camera Co., Ltd.) provided with SCI (Specular Component Included), a D65 standard illuminant and 10° standard observer function, where L* represents the lightness index (0≤ L* ≤100). Chroma measures the saturation of color and was estimated as C*= (a*2 + b*2)0.5 (14). Beef meat was graded for according to the following categories: normal pH24 5.4-5.8, L* 40-60 and C* >30; and DFD beef pH24 >5.8 (24 hours after slaughter), L* <40 and C* <30.

Statistical analysis. The present study was of the observational, prospective and transversal type. All the variables are of dichotomous nature. The sample size (n=506) was determine using a simple randomized procedure with attributes, considering an infinite population, 95% confidence interval, 5% precision and maximum variance (p=0.5), the sample included an additional 100 carcasses to improve the estimators. The occurrence of DFD meat was estimated as a relative frequency. A Chi squared test was used to perform the independent DFD frequency distribution test in the ith class of the jth handling variable. Odds Ratio (OR) was used as a measure of effect of the handling practice on the occurrence of DFD meat using the following formula

where a, b, c and d represent frequencies for each class defined in a 2x2 contingency table . Confidence intervals at 95% were estimated for each OR considering:

registrada. Los cambios en el sistema de manejo se hicieron basados en los resultados obtenidos de estudios previos (13). Estos resultados se muestran en la tabla 1. Debido a su relación con la presencia de carne DFD, la información fue obtenida de acuerdo a los siguientes procedimientos de manejo: uso de la picana eléctrica durante el proceso de desembarque, periodo en corrales de descanso, temperatura ambiente, humedad relativa en los corrales de descanso, número de personas que arrean el ganado, uso de la picana eléctrica para arrear al ganado, tiempo promedio que lleva a entrar cada animal al cajón de noqueo, número de disparos aplicados durante el aturdimiento, tiempo promedio entre el aturdimiento y desangrado, temperatura del cuarto frío, uso de mantas para envolver a las canales, tiempo de almacenamiento de las canales y si la canales fue rociada con agua durante el almacenamiento, estableciendo su asociación con la presencia de carne DFD.

Evaluación de la calidad de la carne. La frecuencia relativa de carne DFD fue estimada utilizando 572 canales tomadas aleatoriamente durante el periodo de estudio. 24 h después del sacrificio, las medidas de valores de pH y variables de color (L*, a*, b* y C*) fueron tomadas del músculo Longissimus dorsi entre las costillas 11 y 12, esperando 30 minutos antes de tomar las medidas, todas las medidas fueron repetidas tres veces. El pH fue medido en el centro del músculo utilizando un Delta TRAK ISFET pH 101 (Delta TRAK, Inc., Pleasanton, CA., U.S.A.). El color se determinó en la superficie del músculo con un espectrofotómetro Minolta CM-2002 (Minolta Camera Co., Ltd.) con SCI (Componente Especular Incluido), un iluminador estándar D65 y 10˚ de función de observador estándar, donde L* representa el índice de claridad (0≤ L* ≤ 100). Chroma mide la saturación de color y se estimó como C* = (a*2 + b*2)0.5 (14). La carne fue calificada de acuerdo a las siguientes categorías: normal pH24 5.4-5.8, L* 40-60 and C* >30; y carne DFD pH24 >5.8 (24 horas antes del sacrificio), L* <40 y C*<30.

Análisis estadístico. Este estudio fue de tipo observacional, prospectivo, y transversal. Todas las variables son de naturaleza dicotómica. El tamaño de la muestra (n=506) se determinó utilizando un procedimiento aleatorio simple con atributos, considerando una población infinita, intervalo de confianza del 95%, 5% de precisión y varianza máxima (p=0.5), la muestra incluyó 100 canales adicionales para mejorar los estimadores. La ocurrencia de carne DFD se estimó como frecuencia relativa. Una prueba chi-cuadrada se utilizó para llevar a cabo las pruebas de distribución de frecuencia independiente DFD en la i clase de la variable j de manejo. El cociente de probabilidad

4693Pérez-Linares - Changes in pre-slaughter handling and cattle DFD meat

and Zα=1.96, χ2 was estimated using the following formula

OR value indicates magnitude of association between the predisposing component of a factor and positive DFD meat cases. The estimating of OR parameter from data samples organized in 2x2 frequency tables (Table 2).

Table 2. 2x2 frequency table, classified according to the risk factor, and the presence of DFD meat factors.

Sample

Risk factor DFD meat Normal meat Total

Present A B a + b

Absent C D c + d

Total a + c b + d n

Table 3. Mean values for pH and color components in carcasses graded as Normal and DFD meat.

Variables Normal meat (n=349)

DFD meat (n=223)

pH 5.74±0.08 6.12±0.23

L* 36.29±2.98 34.58±3.57

a* 13.37±2.51 13.90±2.21

b* 6.53±2.16 6.47±2.20

C* 14.88±2.99 15.38±2.72

H* 25. 16±5.44 24.13±5.79

Table 4. Mean values , Odds Ratio (OR) and 95% Confidence Intervals for Handling Changes proposed in association with DFD meat.

Factor Mean value OR 95%CI

Relative humidity in the resting pens 34.06±13.80 % N.S.

Lairage period in the resting pens 115.2±102.15 min 1.003 1.00 1.007

Lairage period before slaughter 31.58±12.42 min 1.130 1.083 1.192

Average time to enter in stunning box 68.31±39.86 seg N.S.

Carcass temperature N.S.

Carcass storage time N.S.

N.S.= non-significant (p>0.05)

(OR) fue utilizado para medir el efecto de las prácticas de manejo en la ocurrencia de carne DFD utilizando la siguiente fórmula:

Donde a, b, c y d representan frecuencias para cada clase definida en una tabla de contingencia 2×2. Intervalos de confianza al 95% se estimaron para cada OR considerando:

y Zα=1.96, χ2 se estimó utilizando la siguiente forma

el valor OR indica la magnitud de asociación entre el componente de predisposición de un factor los casos de carne DFD positivos. La estimación del parámetro OR para muestras de datos se organiza en tablas de frecuencia 2x2 (Tabla 2).

Los componentes del lado derecho de la igualdad representan frecuencias observadas en cada una de las clases definidas en la tabla de contingencia 2x2. La valoración estadística de las asociaciones se realizó con los intervalos de confianza, de tal manera que los valores de OR>1 esto indica que las variables fueron asociadas. El paquete SAS versión 9.3 fue utilizado para todos los análisis estadísticos.

RESULTADOS

El estudio encontró una frecuencia de 38.99% de carne DFD n=(223/572). Los valores promedio para el pH color para carne normal y DFD se muestran en la tabla 3 y los resultados de la asociación entre los cambios en el manejo y la carne DFD se presentan en la tabla 4, se puede observar que durante el

Components on the right side of the equation represent frequencies observed in each class defined in the 2x2 contingency table. Statistical assessment of associations was performed using OR and its confidence intervals, so that if OR>1 and a lower interval value >1 it indicates that the variables are associated. The SAS software 9.3 was used for all the statistical analyses.

RESULTS

The study found a 38.99% frequency of DFD meat n=(223/572). The average values for pH and color for normal and DFD meat are showed on table 3 and the results of the association between the handling changes and DFD meat are presented in table 4, it can be seen that during the pre-slaughter period only two factors showed a significant association (p<0.05) to DFD meat this are: the time spent by the cattle on the waiting pens with an OR of 1.003 and a mean of 115.2±102.15


minutes and the waiting period to slaughter which showed a O.R.=1.130 and a mean of 31.58±12.42 minutes, the relative humidity in the waiting pens showed no statistical significance. In the slaughter stage none of the variables were found to be associated to DFD meat this was also the case for all the cold storage variables.

DISCUSSION

The frequency of DFD meat were two times higher than reported in a previous study (15.43%) (9), and are also much higher that what other researchers have reported (13.89% con pH>5.8 y 4.02% con pH >6.0) (15). Some studies have found a relation between both cold temperatures and hot temperatures and pre slaughter stress (13), cattle are considered more sensitive to hot than to cool temperatures. Therefore, during the hot seasonal temperatures (over 25oC) the ability of cattle to dissipate body heat to the environment is impaired imposing physiological stress on animals. Stressful conditions that lead to depletion of muscle glycogen reserves before slaughter may lead to higher meat ultimate pH values, and result in low residual levels of glucose (16). The results of this study suggest that it is better to transport and unload the animals during the morning and not to extend the lairage period before slaughter for more than 4 hours, this is recommended because both the temperature and the relative humidity have not reach the highest values that may be seen on summer in the region (50°C with a relative humidity of 50% de H.R. at midday). Although the resting period allows the animal to recuperate from the stress that results from transportation, during this time the high temperatures had an important effect on the presence of DFD meat an important factor for this was that in the lairage pens the only spaces where animal take shelter from the sun have metal sheet roofs and concrete floors which provide a microclimate that contributes to an increase in temperature. Hot enviroments disrupt animal bevahiour and impose physicological stress, which activate glycogenolysis in skeletal muscle (16).

Other factors that influence the welfare of the animals and have a direct efect on the percentage of DFD meat are: the rotation of personnel in charge of stunning, the reason for this is that is common to substitute a skilled operator for one with lesser experience

periodo antemortem sólo dos factores mostraron asociación significativa (p<0.05) con la carne DFD y son: tiempo que el ganado estuvo en los corrales de espera con un OR de 1.003 y una media de 115.2±102.15 minutos y tiempo de espera para el sacrificio que mostró un OR=1.130 y una media de 31.58±12.42 minutos, la humedad relativa en los corrales de espera no mostró diferencia significativa. En la fase de sacrificio ninguna de las variables fue asociada con carne DFD, al igual que con relación a las variables de almacenamiento en frío.

DISCUSIÓN

La frecuencia de carne DFD fue dos veces mayor que la reportada en el estudio anterior (15.43%) (9), y también mucho más alta que la reportada por otros investigadores (13.89% con pH>5.8 y 4.02% con pH >6.0). Algunos estudios han encontrado una relación entre las temperaturas frías y calientes y el estrés antemortem (13), el ganado se considera más sensible a temperaturas cálidas que frías. Por ende, durante las temperaturas de estación altas (más de 25°C) se deteriora la capacidad del ganado de disipar calor corporal al ambiente imponiendo estrés fisiológico sobre los animales. Las condiciones estresantes que llevan a la depleción de reservas de glicógeno muscular antes del sacrificio puedes llevar a valores finales de pH en la carne más altos, y resultar en valores residuales bajos de glucosa (16).

Los resultados de este estudio sugieren que es mejor transportar y descargar los animales en la mañana y no extender el periodo de descanso ante del sacrificio por más de cuatro horas, esto se recomienda debido a que la temperatura y la humedad relativa no han llegado a sus más altos valores, como se puede ver en la región durante el verano (50°C con una humedad relativa de 50% al mediodía). Aunque el periodo de descanso permite que el animal se recupere del estrés que resulta del transporte, durante este tiempo las altas temperaturas han tenido un efecto importante en la presencia del carne DFD; un importante factor para esto fue que en los corrales de descanso el único lugar donde el animal puede protegerse del sol tienen techos de metal y pisos de concreto que proporcionan un microclima que contribuye a incrementar la temperatura. Los ambientes cálidos afectan el comportamiento del animal e imponen estrés fisiológico, lo que activa lo glicogenólisis en el músculo esquelético (16).

Otros factores que afectan el bienestar de los animales y tienen un efecto directo en el porcentaje de carne DFD son: la rotación del personal a cargo de la aturdimiento, la razón para esto es que un sustituto común para un operador entrenado es el de un operador sin experiencia y sin entrenamiento

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and without adequate training in this specific activity and also because of problems with the maintenance of the stunning equipment (17). In this study it was observed that design deficiencies of the shutte that impede the trap door to shut all the way down, also lack of maintenance of the stunning equipment and things that distract the cattle when it being driven are important factor of stress (18), when the plant has a good stunning equipment and the personnel in charge of stunning and bleeding the animals is well trained the efficiency of the insensibilization process increases and as a result of this (19), the frequency of DFD meat is reduced.

Slaughter plants are designed taking in to account conventional arquitectural criteria and because of this the plants have a design that facilitate the work that is done by humans but do not consider the behavioral needs of the animals (20), for this reason the animals are exposed to a great quantity of stressing stimuli like crowding, fastening, noise and unknown smells (21) all of which are factor for DFD meat (22). In one of the feedlots that provided animals for this study it was found that after unloading the animals are mixed with others in new groups and as a result of this fights for dominance take place causing stress (23), this situation should be avoided because it is an additional stress factor. Although the average waiting time before slaughter was reduced from 18 to 4 hours, the results of the study suggest that this is due to an excessive use of the electric prod to drive the cattle from the lairage pens to the shutte entrance, causing the animals to react in different ways, one of them is to try to escape increasing the possibility of injury when the animal fall, collide with the installations or with each other (21), because of this situation it is necessary to apply a audit system, so that welfare problems may be detected more efficiently (17) and it also recommended to increase the training programs of the personnel (19).

Another finding was that the carcass temperature in the refrigerated room was notabily lower when the storage time increase and that by increasing the storage time to the recommended 48 hours (22) the carcass temperature was optimal, before the recommended changes were made the carcasses were sold after only between 8 and 10 hours of cold storage.

In conclusion, after the changes were implemented in the plants a drop in the percentage of DFD meat was expected, however what was seen was a unexpected increase of DFD meat, which led to think that it is possible that during the loading of


adecuado en esta actividad sin el entrenamiento adecuado a esta actividad específica y también debido a problemas con el mantenimiento adecuado del equipo de aturdimiento (17). En este estudio se observó que las deficiencias en el diseño del cajón de noqueo impide que la puerta cierre completamente, junto con un pobre mantenimiento al equipo de noqueo y cosas que distraen al ganado cuando éste es conducido son un importante factor de estrés (18), cuando la planta tiene un buen equipo de aturdimiento y el personal a cargo de aturdir y desangrar está bien entrenado, la eficiencia del proceso de aturdimiento incrementa (19), y como resultado disminuye la frecuencia de carne DFD.

Los mataderos se diseñan tomando cuenta criterios convencionales de arquitectura y es por esto que las plantas tienen un diseño que facilita el trabajo hecho por humanos pero que no considera las necesidades de comportamiento de los animales (20), por esta razón los animales están expuestos a una gran cantidad de estímulos estresantes como el amontonamiento, aseguramiento, ruidos y olores desconocidos (21), dos factores para carne DFD (22). Los animales en una de las unidades de engorda intensiva que fueron parte del estudio en el matadero que son parte de este estudio se encontró que después de descargar los animales estos son mezclados con otros nuevos grupos, como resultado de esto se causan peleas por dominancia que ocasionan estrés (23), esta situación debería evitarse ya que es un factor adicional de estrés. Aunque el tiempo promedio de espera antes del sacrificio se redujo de 18 a 4 horas, los resultados de este estudio sugieren que esto es debido a un uso excesivo de la picana eléctrica para llevar el ganado desde los corrales de descanso hasta la entrada del shutte, causando que los animales reaccionen en diferentes maneras, una de ellas es tratar de escapar incrementando la posibilidad de lesiones si el animal se estrella con las instalaciones o se estrellan entre sí (21), debido a esta situación es necesario aplicar un sistema de auditoría, para que los problemas de bienestar puedan detectarse de manera más eficiente (17) Y también se recomienda incrementar los programas de entrenamiento del personal (19).

Otro hallazgo fue que la temperatura de las canales en el cuarto frío fue notablemente disminuyendo cuando el tiempo de almacenamiento incrementó y por el incremento del tiempo de almacenamiento a las 48 horas recomendadas (22) la temperatura de la canal fue óptima. Antes de que se implementaran los cambios recomendados las canales eran vendidas sólo después de 8 a 10 horas de almacenamiento en frío.

En conclusión, después de que se implementaran los cambios en las plantas se esperaba que el porcentaje de carne DFD disminuyera, sin embargo, el aumento en la presencia de carne DFD tan inesperado indica que es posible que en el embarque de los animales


the animals in the feedlot and during transport other stressing factors are present. Because of the increase cases of DFD meat found by this study after the changes done in the handling system, it is recommended to extend the research and include the period between loading and arrival of the cattle to the slaughter plant, so that it is possible to determine which are the relevant handling factors that contribute to the problem of DFD meat and to also increase the welfare of animals that are going to be slaughter trough adaptations made in the facilities and better training of the personnel.

Acknowledgments

The authors which to thank the personnel of the TIF slaughter plant for all the aid given to carry out this study.

en las unidades de engorda intensiva y durante el transporte se presenten otros factores de estrés. Debido al incremento de casos de carne DFD en este estudio luego de realizar los cambios en el sistema de manejo, se recomienda extender la investigación e incluir el periodo entre el embarque y la llegada de los animales a la planta de sacrificio, esto hace posible determinar cuáles son otros factores de manejo relevantes que contribuyen al problema de la carne DFD y así, incrementar el bienestar de los animales que van a ser sacrificados a través de adecuaciones realizadas en las instalaciones y mejorando la capacitación al personal.

Agradecimientos

Los autores quisieron agradecer al personal del matadero TIF por toda la ayuda prestada durante este estudio.

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Effect of different levels of L-carnitine and lysine-methionine on broiler blood parameters

Efecto de suplementación con L-carnitina y lisina-metionina sobre parámetros de sangre de pollos de engorde

Babak Hosseintabar,1 M.Sc, Mohammad Dadashbeiki,2 DVM, Mehrdad Bouyeh,1 Ph.D, Alireza Seidavi,1* Ph.D, René van den Hoven,3 Ph.D, Sandra Gamboa,4,5, Ph.D.

1Islamic Azad University, Rasht Branch, Department of Animal Science, Rasht, Iran, 2Islamic Azad University, Rasht Branch, Department of Veterinary Science, Rasht, Iran, 3Vetmeduni Wien, Vienna, Austria, 4Polytechnic Institute, Agricultural School, Department of Zootechnic Sciences, Animal Reproduction Laboratory, Coimbra, Portugal, 5CERNAS- Centre for Studies on Natural Resources, Environment and Society, Polytechnic Institute, Coimbra, Portugal. *Correspondence: [email protected]

Received: June 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT

Objetive. In the present study a completely randomized 3×3 factorial design was used to analyze the effects of different levels of L-Carnitine, lysine(Lys) and methionine (Met) on the blood concentrations of energy, protein and lipid metabolites of male broiler chickens. Materials and methods. A total of 270 newly hatched male broiler chickens (Ross 308) were randomly assigned to 9 groups (ten broilers per replicate and three replicates per treatment). The control group was fed a basal diet, whereas the treatment groups were fed basal diets supplemented with L-Carnitine (0 mg/kg, 75 mg/kg and 150 mg/kg) and lysine-methionine (0, 15 and 30%) for 42 days. On day 42, one bird was randomly chosen per replication, a blood sample was taken and the blood concentrations of glucose (GLU), uric acid (UAc), triglyceride (TG), VLDL, HDL, LDL, total protein (TP), albumin (Alb) and total cholesterol (TC) were analyzed. Results. Dietary L-carnitine supplementation had a significant effect (p<0.05) on uric acid (UAc), HDL, LDL, and total cholesterol (TC). The birds feed L-carnitine plus Lys and Met presented the highest plasmatic UAc level and the lowest plasmatic TC and LDL level. Moreover, L-carnitine significantly reduced total cholesterol (TC) when compared with both the control group and the birds feed Lys and Met without L-carnitine. Conclusions. A diet with 150 mg/kg L-carnitine plus 15% Lys and Met seems to be enough to sustain low plasmatic TC, LDL and HDL concentrations on male broiler.

Key words: amino acids, broiler chicken,lipid profile, serum metabolites, supplementation (Source: CAB).

RESUMEN

Objetivo. Se realizó un estudio para determinar el efecto de la suplementación deL-carnitina, lisina (Lys) y metionina (Met) sobre los metabolitos sanguíneos de pollos de engorde. Materiales y métodos. Se utilizaran 270 pollos de la línea Ross 308 de un día de edad y se dividieron en 9 tratamientos en un diseño al azar con arreglo factorial 3x3: tres niveles de L-carnitina (0 mg/kg, 75 mg/kg y 150 mg/kg) y tres de lisina-metionina (0, 15 y 30%) durante 42 días. Cada tratamiento constó de 3 repeticiones con 10 pollos por repetición. El día 42 de edad, se tomaron muestras de sangre de tres aves por tratamiento para cuantificar niveles séricos de glucosa (GLU), ácido úrico (UAc), triglicéridos (TG), VLDL, HDL, LDL, proteínas totales (PT), albúmina (Alb) y colesterol total (TC). Resultados. La suplementación de L-carnitina en la dieta tuvo un efecto significativo (p<0.05) en los niveles de ácido úrico en suero (UAC), HDL, LDL y colesterol total (CT). Las aves alimentadas con L-carnitina más Lys y

ORIGINAL



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Met mostraron niveles séricos más altos de UAc y menor TCy LDL. Por otra parte, la L-carnitina redujó significativamente el colesterol total (CT), cuando se comparó con el grupo control y con los pollos alimentados con Lys y Met, sin L-carnitina. Conclusiones. Una dieta con 150 mg/kg de L-carnitina y 15% Lys y Met parece ser suficiente para mantener bajas concentraciones plasmáticas de TC, LDL y HDL en pollos de engorde.

Palabras clave: Aminoácidos, metabolitos séricos, perfil lipídico, pollos, suplementación (Fuente: CAB).

INTRODUCCIÓN

El incremento de la población mundial y el incremento del poder de compra de los hogares son factores que determinan el consumo futuro de carne. Per cápital, el consumo global de carne es de aproximadamente 14 kg por año y la tendencia es hacia arriba. Las aves son el tipo de carne que puede ser producido de manera relativamente eficiente con un bajo impacto ambiental (1). Más aún, la carne de aves ha mantenido un alto valor comparado con otras especies por varias razones incluyendo aspectos nutricionales como baja grasa con alto grado de saturación de ácidos grasos y bajo nivel de colesterol.

La demanda creciente por carne de aves ha resultado en presión sobre los criadores para incrementar la tasa de crecimiento de las aves, la eficiencia alimentación, la talla del músculo del pecho y la reducción en la grasa abdominal (2). Por esto, la investigación se dirige hacia cómo mejorar las técnicas de producción de carne de aves. La mejora en la composición de la carcasa con aditivos ha sido el foco de investigaciones nutricionales. La adición de aminoácidos e intermediarios metabólicos a las dietas puede reducir la deposición abdominal de grasa en aves. L-carnitine, la forma activa biológica de carnitine, es un compuesto cuaternario de amonio sintetizado en el hígado, riñones y cerebro (3), de aminoácidos esenciales lisina (Lys) y metionina (Met).

Los efectos de suplementos dietarios de L-carnitine, Lys y Met sobre el desempeño de crecimiento y composición del cuerpo de pollos De engorde son aún poco comprendidos. Algunos autores reportaron que la deposición de grasa abdominal en los pollos de engorde se reduce por suplementos de L-carnitine sin ningún efecto significativo sobre la ganancia diaria de la conversión de alimentación (4), mientras otros no encontraron ningún impacto dietario del suplemento de L-carnitine sobre la composición de grasa abdominal (5). Sin embargo, Bouyeh y Gevorgyan (6) y Celik et al (7) demostraron que el desempeño de crecimiento en pollos de engorde mejoró con el suplemento de L-carnitine. Con relación al suplemento de Lys y Met en exceso de las recomendaciones de la NRC, Mukhtar et al (8) encontró una mejora significativa en la ingestión de alimentos, la ganancia promedio de peso corporal y la tasa de conversión de

INTRODUCTION

The increase in world population and the increase in household purchasing power are the factors that determine the future consumption of meat. Per capita, the global meat consumption is around 14 kg per year and the trend is upwards. The poultry belongs to the types of meat which can be produced relatively efficiently with low environmental impact (1). Moreover, the poultry meat has maintained a higher value compared to other species for several reasons including nutritional aspects as low-fat with high unsaturation degree of fatty acids and low cholesterol level.

The growing demand for poultry meat has resulted in pressure on breeders to increase the growth rate of birds, feed efficiency, size of breast muscle and reduction in abdominal fatness (2). Therefore, research is being directed to further improve techniques of poultry meat production. The improvement in carcass composition with additives has become a focus on nutrition research. The addition of amino acids and metabolic intermediates to diets may lower the abdominal fat deposition in poultry. L-carnitine, the biological active form of carnitine, is a quaternary ammonium compound synthesized in the liver, kidney and brain (3), from the essential amino acids lysine (Lys) and methionine (Met).

The effects of dietary L-carnitine, Lys and Met supplementations on the growth performance and body composition of broiler chickens are still poorly understood. Some authors reported that abdominal fat deposition in broilers is reduced by L-carnitine supplementation without significant effect on daily gain or feed conversion (4), while others found no impact of dietary L-carnitine supplementation on abdominal fat composition (5). However, Bouyeh and Gevorgyan (6) and Celik et al (7) showed that growth performance of broilers was improved by L-carnitine supplementation. Regarding Lys and Met supplementation in excess of NRC recommendations, Mukhtar et al (8) found a significant improvement in feed intake, average body weight gain and feed conversion ratio, while Si et al (9) concluded that it should not be elevate the level of Met if Lys is in excess of its minimum needs.

Hosseintabar - Effects of L-carnitine, methionine-lysine on broiler blood


Corduk et al (10) have demonstrated that addition of L-carnitine to diet did not significantly affect body weight gain, feed intake, feed conversion ratio and blood parameters in broiler chickens. However, Parizadian et al (11) found that supplementing diet with L-carnitine will reduce blood triglyceride, cholesterol and improve egg quality in laying Japanese quail. Therefore, lower body fat deposition may be attributed to increased fat catabolism or diminished endogenous fatty acid synthesis or both processes (12).

The bioavailability of L-carnitine varies due to dietary composition but since it can be biosynthesized endogenously from methionine and lysine, these two amino acids are usually the more important limiting amino acids in poultry nutrition. Methionine and lysine are frequently supplemented in the formulated diets. Previous studies showed that methionine supplement during the early stages of chicken growth causes significant improvement in hematocrit, red blood cell count and related parameters (13,14).

Theoretically, supplementing the broiler diet with an adequate content of L-carnitine would facilitate the β-oxidation of fatty acids, and decrease esterification reactions and triacylglycerol storage in the adipose tissue (12). As blood biochemistry may monitor the quality of nutrition and health of birds (13,15), we have quantified serum markers of lipid and protein metabolism on 42 day older male broiler chickens feed extra levels of dietary Lys-Met with and without L-carnitine.

The objetive of this study was to evaluate the effects of different levels of L-carnitine, Lys and Met on the blood concentrations of energy proteins and lipid metabolites of male broiler chickens.


Study site. This study was developed in the poultry farm facilities of the Agriculture Faculty of Islamic Azad University, in Rasht, Iran. It is situated 7 m below sea level and located at latitude 37°15’ N and longitude 49°36’ E.

Facilities. The facilities (20×40 meters) included, other than the main compartment for chicken, a storage room, where the ingredients are grinded and mixed. Six ventilators were used to maintain an air discharge power of 1400 cubic meters per hour. During the experiments, room temperature was maintained applied according to the instructions of the Ross 208 strain rearing manual. The temperature was adjusted to approximately 33ºC on the day before day 1. The birds were housed in the main compartment, in

alimentación, mientras que Si et al (9) concluyó que no se debería elevar el nivel de Met si Lys está en exceso de sus necesidades mínimas.

Corduk et al (10) han demostrado que la adición de L-carnitine a la dieta no afectó de manera significativa la ganancia de peso corporal, ingesta de alimento, tasa de conversión de alimento y parámetros de sangre en pollos de engorde. Sin embargo, Parizadian et al (11) encontraron que suplementar la dieta con L-carnitine reduce los triglicéridos en la sangre, el colesterol y mejora la calidad de postura de huevos en codornices japonesas. Por lo tanto, una baja deposición de grasa corporal puede atribuirse a un incremento en el catabolismo de grasa o síntesis de ácidos grasos en disminuida o ambos procesos (12).

La biodisponibilidad de L-carnitine maría debido a la composición dietario pero cómo puede ser biosintetizada de manera endógena de metionina y lisina, estos dos aminoácidos son usualmente los aminoácidos en limitantes más importantes en la nutrición de pollos. La metionina y la lisina son frecuentemente suplementados en dietas formuladas. Estudios previos muestra que el suplemento de metionina durante Las primeras fases de crecimiento de pollos causa mejora significativa en hematocritos , conteo de glóbulos rojos y parámetros relacionados (13,14)

Teóricamente, suplementar la dieta del pollo de engorde con un contenido adecuado de L-carnitine podría facilitar la β-oxidación de ácidos grasos, y una disminución de reacciones de esterificación Y almacenamiento de traicilglicerol en el tejido adiposo (12). Ya que la bioquímica de la sangre puede monitorear la calidad de la nutrición y la salud de las aves (13,15), hemos cuantificado los marcadores de suero del metabolismo de lípidos y proteínas en pollos de engorde machos de alimentación de pollos de 42 días con niveles dietarios extra de Lys-Met sin L-carnitine.

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de distintos niveles de L-carnitine, Lys y Met en las concentraciones en sangre de proteínas de energía y metabolitos lípidos en pollos de engorde machos.


Locación de estudio. Este estudio se desarrolló en las instalaciones de cría de pollos de la facultad de Agricultura de la universidad islámica de Azad, en Rasht, Irán. Está ubicada 7 m bajo el nivel del mar y localizada a una latitud de 37°15’ norte y longitud de 49°36’ este.

Instalaciones. Las instalaciones (20×40 m) incluye, además del compartimiento principal

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27 pens with 1.0 x 2 m. Prior to the experiment the hall and all equipment was carefully cleaned and disinfected according to general bio-security procedures for broiler production. Temperature, light, ventilation, drinkers and feeders were all managed according to the Ross 208 manual for production and were equal for all treatments.

Animals and experimental design. A total of 270 newly hatched male Ross 308 broilers were used for the experiment. The birds had been sourced from the Ross hatchery in Iran. After sexing, animals were randomly allocated to the experimental units. A total of 9 treatments groups were formed (Table 1). Each group had 3 replicates with 10 birds per replicate. Animals were reared for 42 days:birds received starter diet from 1-21 d, grower diet from 22-35 d and finisher diet from 36-42 d of age, respectively. The L-carnitine, Lys and Met levels were according to NRC (16) recommendations for starter (1.1Lys and 0.9 Met), grower (1.0 Lys and 0.72 Met) and finisher (0.8 Lys and 0.9 Met) feed.

The control group ration was the basis of all other diets (Table 2). In the experimental diets, extra L-carnitine, Lys and Met were added in excess of NRC (16) recommendations according to table 2.

Sampling and blood parameters. At the end of the experiment, at42 days-of-age, one bird per group was randomly selected for blood collection. Blood samples (1 ml/bird) were collected using a 2 ml syringe and left to stand at 30°C to allow clotting and clot retraction. These rum that remained after clotting was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at room temperature. Blood parameters analyzed in serum were glucose (GLU), uric acid (UAc), total triglycerides (TG), total cholesterol (TC), total protein (TP), albumin (Alb), high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL)and very low density lipoprotein (VLDL).The concentrations for these parameters were determined by routine methods using commercial laboratory kits (Pars Azmoon Co., Tehran, Iran), according to the manufacturer’s instructions. GLU was measured with an enzymatic, colorimetric glucose oxidase-peroxidase (GOD-POD) method, while TC, TG, HDL, LDL and VLDL were determined by enzymatic CHOD-PAP assays. Alb was determined based on the bromocresol green method, whilst the UAc was determined by enzymatic methods

Table 1. The amount of L-carnitine, lysine (Lys) and methionine (Met) in each treatment.Treatments

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

L-carnitine NRC NRC NRC 75 mg/kg 75 mg/kg 75 mg/kg 150 mg/kg 150 mg/kg 150 mg/kg

Lysine NRC NRC +15% NRC +30% NRC NRC +15% NRC +30% NRC NRC +15% NRC +30%

Methionine NRC NRC +15% NRC +30% NRC NRC +15% NRC +30% NRC NRC +15% NRC +30%

para pollos, un cuarto de almacenamiento, donde los ingredientes fueron molidos y mezclados. Seis ventiladores fueron utilizados para mantener un poder de descarga de aire de 1400 m³ por hora. Durante los experimentos, la temperatura Del cuarto se mantuvo aplicada de acuerdo las instrucciones del manual de cría de cepa Ross 208. La temperatura sea justo aproximadamente 33°C el día antes del día uno. La sabes fueron alojadas en el compartimiento principal, en 27 corrales de 1 m por 2 m. Antes de iniciar el experimento el corredor y todo el equipo fue cuidadosamente limpiado y desinfectado de acuerdo a los procedimientos generales de bioseguridad para producción de pollos de engorde. La temperatura, luz, ventilación, bebederos y comederos fueron todos manejados de acuerdo al manual para producción Ross 208 Y fueron iguales para todos los tratamientos.

Animales y diseño de experimento. Un total de 270 pollos de engorde machos Ross 308 recién nacidos fueron utilizados para el experimento. Los pollos proceden del criadero Ross en Irán. Luego de determinar el sexo, los animales fueron asignados de manera aleatoria a las unidades experimentales. Un total de 9 grupos de tratamiento fueron formados (Tabla 1). Cada grupo tiene 3 replicados con 10 aves por replicado. Los animales fueron criados por 42 días; las aves recibieron una dieta de inicio desde el día 1 al 21, dieta de crecimiento del día 22 al 35 y dieta de terminación del día 36 al 42, respectivamente. Los niveles de L-carnitine, Lys y Met estuvieron de acuerdo a las recomendaciones de alimentación de NRC (16) para inicio (1.1 Lys y 0.9 Met), crecimiento (1.0 Lys y 0.72 Met) y terminación (0.8 Lys y 0.9 Met).

La ración del grupo de control fue la base de las otras dietas (Tabla 2). En las dietas experimentales, extra L-carnitine, Lys y Met fueron adicionados en exceso de las recomendaciones NRC (16) de acuerdo a la tabla 2.

Muestreo y parámetros de sangre. Al final del experimento, a los 42 días de edad, un ave por grupo fue seleccionada de manera aleatoria para recolección de sangre. Muestras de sangre (1 ml por ave) fueron recolectadas utilizando una jeringa de 2 ml Y se dejó reposar a 30°C para permitir coagulación y retracción de cuadros. El resultado después de la cual culo acción fue centrifugado a 3000 revoluciones por minuto por 10 minutos a temperatura ambiente. Los parámetros de sangre



analizados en el suero fueron glucosa (GLU), ácido úrico (UAc), triglicéridos totales (TG), colesterol total (TC), proteína total (TP), albúmina (Alb), lipoproteína de alta densidad (HDL), lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). Las concentraciones para estos parámetros se determinaron por métodos rutinarios utilizando kits comerciales de laboratorio (Pars Amonn Co., Teherán, Irán), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El GLU fue medido con el método enzimático, colorimétrico de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD), mientras que el TC, TG, HDL, LDL y VLDL fueron determinados por análisis enzimático CHOD-PAP. El Alb fue determinado con base en el método de bromocresol verde, mientras que el UAc se determinó con métodos enzimáticos utilizando el método uricasa-TOOS y el TP se analizó con el método Biuret.

Análisis Estadístico. Para el diseño factorial 3x3 se aplicó el modelo Yijk=µ+αj+βk+(αβ)jk+eijk , en el que el valor de cada observación (Y) depende en el promedio de efectos en la población (μ) más el efecto del factor A (nivel de αj, L-carnitine), el efecto del facto B (βk nivel de metionina lisina) y su interacción [(αβ)jk], y el error experimental (ε). Un modelo mixto general se escogió como la prueba estadística más robusta que respetaba las medidas repetidas. El replicado fue la unidad experimental (17).

RESULTADOS

Los resultados para la concentración de parámetros biomédicos en el día 42 en el plasma de pollos de engorde de acuerdo a los tratamientos de alimentación se resumen en la tabla 3.

En el día 42, no hubo cambios significativos en las concentraciones medias de parámetros de sangre entre aves sometidas a suplementación extra Lys-Met sin extra L-carnitine (T2 y T3) y el grupo de control (T1). Sin embargo, la suplementación con Lys-Met sola mostró una disminución discreta en el colesterol total (TC) plasmático y la lipoproteína de baja densidad (LDL) cuando se comparó con la dieta de control (T1)(Tabla 3). No hubo efectos principales evidentes para suplementación de Lys más Met a través de los tratamientos (T4).

La suplementación de la dieta con L-carnitine y Lys más Met no tuvo efecto (p>0.05) en glucosa plasmática (GLU), triglicéridos (TG), proteína total (TP), Albúmina (Alb) y lipoproteína de baja densidad (LDL). Por el contrario, el efecto en tratamientos sobre el ácido úrico plasmático (UAc), colesterol (TC), lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL) mue significativo (p<0.05) (Tabla 3). Efectos principales fueron evidentes para suplementación de L-carnitine

Table 2. The ingredients (%) and nutrient constitution of the basal diets used in this study for the starter (1st-21st days of age), grower (22nd-35th days of age), and finisher (36th-42nd days of age) periods.

Ingredient (%) Starter period

Finisher period

Finisher period

Corn 59.0 62.0 65.0

Soybean Meal 35.0 30.0 27.0

Soybean oil 2.0 3.5 3.5

Ca%22P%18 1.5 1.8 1.7

Mineral oysters 1.2 1.5 1.5

NaCl 0.3 0.2 0.2

Lysine-Hydro-Chloride 0.1 0.1 0.15

DL-Methionine 0.2 0.2 0.25

Mineral premix* 0.3 0.3 0.3

Vitamin premix** 0.3 0.3 0.3Sodium bicarbonate(NaHCO3) 0.1 0.1 0.1

Metabolizable energy (kcal/kg) 2897.8 2955 3058

Crude protein (%) 21.7 20.8 18.25

Crude fiber (%) 2.26 2.22 2.14

Calcium (%) 0.80 0.80 0.79

Available Potassium (%) 0.48 0.46 0.42

Sodium (%) 0.15 0.15 0.15

Lysine (%) 1.41 1.26 1.22

Methionine (%) 0.61 0.57 0.48

Energy: Protein ratio 133.58 142 167

Ca: P 1.66 1.75 1.88

Linoleic Acid (%) 2.46 2.73 2.95

Methionine+Cysteine (%) 0.97 0.91 0.77

*Calcium Pantothenate: 4 mg/g; Niacin: 15 mg/g; Vitamin B6: 13 mg/g; Cu: 3 mg/g; Zn: 15 mg/g; Mn: 20 mg/g; Fe: 10 mg/g; K: 0.3 mg/g **Vitamin A: 5000 IU/g; Vitamin D3: 500 IU/g; Vitamin E: 3 mg/g; Vitamin K3: 1.5 mg/g; Vitamin B2: 1 mg/g

using the uricase-TOOS method and TP was assayed by the Biuret method.

Statistical analysis. For the 3×3 factorial design the linear model Yijk=µ+αj+βk+(αβ)jk+eijk was applied, in which the value of each observation (Y) relies on the population effects average (μ) plus the effect of factor A (αj, L-carnitine level), the effect of factor B (βk, methionine-lysine level) and their interaction [(αβ)jk], and the experimental error (ε). A general mixed model was chosen as most robust statistical test that respected the repeated measures. The replicate was the experimental unit (17).

RESULTS

The results for the biochemical parameters concentration at day 42 in broilers plasma according to feed treatments are summarized in table 3.

4703

Table 3. Mean values (± s.e.m.) on blood parameters of broilers diets differing in dietary L-carnitine, lysine (Lys) and methionine (Met) levels.

Blood parameters

Treatments1

s.e.m. Sig.T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

Glucose [mg/dl]

235a

±4.35233.67 a

±8.32239.33a

±8.38248.67a

±28.20249a

±9.84240.67a

±4.72253.30a

±21.5254a

±24.24234a

±9.53 9.06 ns

Uric acid [mg/dl]

2.23a

±1.602.63 ab

±0.452.63ab

±1.173.26ab

±1.904.20ab

±0.524.70ab

±1.214.70ab

±1.864.63ab

±1.904.96b

±0.75 0.78 *

Triglyceride [mg/dl]

132a

±13.50149.67 a

±20.50106.67a

±22.36139.00a

±25.51142.00a

±17.05115.30a

±40.5135.3a

±12121.67a

±23.50137.33a

±17.15 13.17 ns

Protein [mg/dl]

3.03a

±0.373.16 a

±0.323.26a

±0.053.33a

±0.583.26a

±0.253.53a

±0.653.46a

±0.603.26a

±0.513.53a

±0.46 0.26 ns

Albumin [mg/dl]

1.36a

±0.251.36 a

±0.251.6a

±0.101.36a

±0.151.53a

±0.111.56a

±0.321.56a

±0.151.43a

±0.281.66a

±0.23 0.12 ns

Cholesterol [mg/dl]

293.30a

±6.10284 a

±61.53271a

±9.53185b

±49.86133bc

±10142bc

±12.70135.67bc

±4.90115.3c

±9.80131.30c

±20.8 16.35 *

LDL [mg/dl]

169.30a

±8.90165 a

±49.36158.33a

±14.6471.30b

±62.0481b

±6.2424.60c

±5.8521.00c

±5.2912.67c

±3.5015.67c

±15.14 16.01 **

HDL [mg/dl]

88a

±8.2389ab

±16.0991.60ab

±7.0985.60ab

±10.0186.60ab

±1.1094.30ab

±10.2087.33ab

±6.1178.30b

±10.497.3ab

±10.14 5.44 *

VLDL [mg/dl]

26.66a

±2.8030a

±4.3521a

±4.3528.00a

±5.2928.33a

±3.2127.66a

±8.0027.33a

±2.5124.33a

±5.0323a

±3.51 2.67 ns

a,b,cValues within a row with different superscripts differ significantly; * - p<0.05; ** - p<0.01; ns-not significant.1- T1 (L-carnitine NRC recommendations), T2 (L-carnitineNRC recommendations +15% Lys and 15% Met), T3 (L-carnitineNRC recommendations +15% Lys and 15% Met), T4 (75mg/Kg L-carnitine+Lys and MetNRC recommendations), T5 (75mg/Kg L-carnitine + 15% Lys and 15% Met), T6 (75mg/Kg L-carnitine + 30% Lys and 30% Met), T7 (150mg/Kg L-carnitine + Lys and Met NRC recommendations), T8 (150mg/Kg L-carnitine + 15% Lys and 15% Met), T9 (150mg/Kg L-carnitine + 30% Lys and 30% Met).

Table 4. Impact of the level of lysine (Lys) and methionine (Met) in the diet on blood parameters of broilers.

Blood parametersLys-Met

+0% +15% +30% Sig s.e.m.

Glucose [mg/dl] 245.66a

±19.71245.55a

±16.51238.00a

±7.43 ns 5.23

Uric acid [mg/dl] 3.40a

±1.833.82a

±1.384.10a

±1.44 ns 0.45

Triglyceride [mg/dl] 135.56a

±15.92137.78a

±21.78119.78a

±28.23 ns 7.60

Protein [mg/dl] 3.28a

±0.493.23a

±0.333.44a

±0.42 ns 0.15

Albumin [mg/dl] 1.43a

±0.191.44a

±0.211.61a

±0.20 ns 0.07

Cholesterol [mg/dl] 204.67a

±74.26177.44a

±86.26181.44a

±68.59 ns 9.44

LDL [mg/dl] 87.22a

±72.5065.22a

±78.9166.22a

±70.05 ns 9.24

HDL [mg/dl] 90.11a

±8.5784.66a

±10.7591.33a

±8.48 ns 3.14

VLDL [mg/dl] 27.33a

±3.3127.55a

±4.4723.88a

±5.71 ns 1.54

a,bValues within a row with different superscripts differ significantly; ns-not significant.

At day 42, no significant changes were found in the mean blood parameters concentrations between birds submitted to extra Lys-Met supplementation without extra L-carnitine (T2 and T3) and the control group (T1). However, extra Lys-Met supplementation alone showed a discreet decay in plasmatic total cholesterol (TC) and low density lipoprotein (LDL) when compared with the control diet (T1) (Table 3). No main effects were evident for Lys plus Met supplementation across treatments (Table 4).

a través de tratamientos para ácido úrico plasmático (UAc), colesterol (TC), y lipoproteína de baja densidad (LDL), (Tabla 5).

Las menores concentraciones de UAc plasmático y las mayores concentraciones de TC y LDL plasmático se observaron en tratamientos en los que no se adicionó L-carnitine (T2 y T3), mientras que las mayores concentraciones de UAc plasmático y menores concentraciones de TC y LDL plasmático se observaron en los grupos suplementados con 150mg/kg de L-carnitine (T7, T8 y T9).

Con relación a la concentración de ácido úrico plasmático (UAc), una diferencia significativa (p<0.05) se encontró entre aves alimentadas con 150 mg/kg de L-carnitine más 30% de Lys y Met (T9) y el grupo de control. Una diferencia estadística también se encontró para la concentración de lipoproteínas de alta densidad (HDL, p<0.01)entre el grupo de control y las aves alimentadas con 150 mg/kg de L-carnitine más 15% de Lys y Met (T8) (Tabla 3).

El colesterol total (TC) y la lipoproteína de baja densidad (LDL) disminuyeron de manera significativa (p<0.05) cuando se adicionó L-carnitine, con o sin Lys y Met. En grupos alimentados con 150mg/kg de L-carnitine más Lys y Met (T8 y T9), la concentración de colesterol plasmático (TC) fue significativamente menor (p<0.05) que en grupos sin suplementación de L-carnitine (T1, T2, y T3) y en animales alimentados con 75 mg/kg de L-carnitine más 30% de Lys y Met (T4). Con relación a la concentración de LDL en grupos sometidos a



The supplementation of the diet with L-carnitine and Lys plus Met had no effect (p>0.05) in plasmatic glucose (GLU), triglyceride (TG), total protein (TP), albumin (Alb) and low density lipoprotein (VLDL). In contrary, the effect of treatments on plasmatic uric acid (UAc), cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL) and high-density lipoprotein (HDL) levels was significant (p<0.05) (Table 3). Main effects were evident for L-carnitine supplementation across treatments for plasmatic uric acid (UAc), cholesterol (TC) and low density lipoprotein (LDL),(Table 5).

The lowest concentrations in plasmatic UAc and the highest concentrations in plasmatic TC and LDL were observed in treatments where no L-carnitine was added (T2 and T3), whereas the highest concentrations in plasmatic UAc and the lowest concentrations in plasmatic TC and LDL were seen in the groups supplemented with 150 mg/kg L-carnitine (T7, T8 and T9).

Concerning p lasmat ic ur ic ac id (UAc) concentration, a significant difference (p<0.05) was found between birds feed 150 mg/kg L-carnitine plus 30% Lys and Met (T9) and the control group. A statistical difference was also found for high density lipoproteins (HDL, p<0.01) concentration between the control group and the birds feed 150 mg/kg L-carnitine plus 15% Lys and Met (T8) (Table 3).

The total cholesterol (TC) and low density lipoprotein (LDL) were significantly reduced (p<0.05) when L-carnitine was added, with or without Lys and Met. In groups fed 150 mg/kg L-carnitine plus Lys and Met (T8 and T9), plasmatic cholesterol (TC) concentration was significant lower (p<0.05) than in groups without L-carnitine supplementation (T1, T2 and T3) and in birds feed 75mg/kg L-carnitine without Lys and Met (T4). As to, plasmatic LDL concentration in groups submitted to 75 mg/kg L-carnitine plus 30% Lys and Met (T6) and 150 mg/kg L-carnitine without and with Lys and Met (T7, T8 and T9), differed significantly (p<0.01) from groups without L-carnitine supplementation (T1, T2 and T3) and in birds feed 75mg/kg L-carnitine without and with 15% Lys and Met (T4 and T5) (Table 3).

DISCUSSION

An exact characterization of the metabolites’ profile in the birds of the various treatment groups is not possible since only one blood sample was collected at day 42. However, using some markers of energy, protein and lipid metabolism such as glucose, cholesterol, triglyceride, uric acid, albumin and total

75 mg/kg de L-carnitine más 30% de Lys y Met (T6) y 150mg/kg de L-carnitine con Lys y Met (T7, T8 y T9), difirieron significativamente (p<0.01) de grupos con suplementación de L-carnitine (T1, T2 y T3) y en aves alimentadas con 75mg/kg de L-carnitine sin y con 15% de Lys y Met (T4 y T5) (Tabla 3).

DISCUSIÓN

Una caracterización exacta del perfil de metabolitos en aves de los diversos grupos de tratamientos no se puede realizar debido a que sólo una muestra de sangre se recolecto en el día 42. Sin embargo, utilizando algunos marcadores de energía, proteína y metabolismo lípido como glucosa, colesterol, triglicéridos, ácido úrico, albúmina y proteína total, los cambios obvios en el metabolismo de carbohidratos, grasa y proteínas se pueden probablemente detectar. La interpretación de los resultados de la bioquímica de la sangre se deben combinar con el crecimiento total, peso de la carne, peso de la grasa y calidad de la carne para que sean útiles en el diseño de nuevas dietas. Sin embargo, los triglicéridos en suero (TG), colesterol total (TC), LDL y HDL son parámetro biométricos cruciales que reflejan el estatus del metabolismo lípido.

Es este estudio, la suplementación de Lys-Met per se, no tuvo efecto alguno en los parámetros de sangre en el día 42 pero en combinación con extra L-carnitine se observaron diferencias significativas entre los grupos para ácido úrico (UAc), colesterol total (TC), y concentraciones de LDL y HDL en plasma de pollos de engorde en el día 42.

Table 5. Impact of the level of L-carnitine in the diet on blood parameters of broilers.

Blood parametersL-carnitine

0 (mg/kg)

75 (mg/kg)

150 (mg/kg) Sig s.e.m.

Glucose[mg/dl] 236.00a

±6.80246.11a

±15.70247.11 a

±19.54 ns 5.23

Uric acid[mg/dl] 2.50a

±32.764.06b

±1.324.77b

±1.41 ** 0.45

Triglyceride[mg/dl] 129.56 a

±25.05132.11 a

±28.40131.44 a

±17.42 ns 7.60

Protein[mg/dl] 3.15 a

±0.263.37 a

±0.473.42 a

±0.47 ns 0.15

Albumin[mg/dl] 1.44 a

±0.211.48 a

±0.201.55a

±0.22 ns 0.07

Cholesterol[mg/dl] 282.78 a

±32.75153.33 b

±35.59127.44 b

±15.00 ** 9.44

LDL[mg/dl] 164.22 a

±26.5738.00 b

±40.1716.44 b

±8.98 ** 9.24

HDL[mg/dl] 92.66 a

±10.0188.89 a

±8.2784.55 a

±9.16 ns 3.14

VLDL[mg/dl] 25.88 a

±5.2026.44 a

±5.6826.44 a

±3.67 ns 1.54

a,bValues within a row with different superscripts differ significantly; ** - p<0.01; ns-not significant.

4705

protein, the obvious changes in carbohydrate, fat and protein metabolism are likely detected. The interpretation of results of the blood biochemistry must be combined with total growth, meat weight, fat weight and meat quality in order to be useful for designing new diets. Nevertheless, serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), LDL, and HDL are crucial biochemical parameters reflecting the status of lipid metabolism.

In this study, the Lys-Met supplementation per si had no effect on blood parameters at day 42 but in combination with extra L-carnitine significant differences were observed among groups for the uric acid (UAc), total cholesterol (TC), LDL and HDL concentrations in broiler plasma at day 42.

In broilers, uric acid (UAc) is produced as the main end product of nitrogen metabolism. The dietary protein level markedly affects uric acid production. Our results showed that UAc increase as dietary L-carnitine, Lys and Met intake increases. However, inconsistent results have been reported in the literature regarding the use of these amino acids in poultry diets. Donsbough et al (18) described a decrease in UAc when dietary Lys was increased in the diet while Xie et al (19) described a decrease in serum UAc concentrations followed by an increase as the dietary Met level increased.

In our study, concentration of protein and albumin were not affected by different levels of L-carnitine and Lys-Met. L-carnitine induced significant increases of serum albumin (Alb) concentrations in dietary energy depleted birds without affected total protein (20). Most studies on Met could not prove an effect on serum total protein and albumin in broilers (13,21).

The plasmatic glucose (GLU) and free fatty acids concentrations are good indicators of the energetic status. The dynamic interactions between these two major energy substrate pools, without hormonal mediation seems to indicate that the utilization of one nutrient (e.g. glucose) directly inhibits the use of the other (in this case fatty acids) in accordance with Arslan et al (22).

Mitochondrial fatty acid β-oxidation is an important system by which fatty acids are broken down by various tissues to produce energy. In this system, L-carnitine plays an important role by facilitating the transport of fatty acids from cytosol across the inner mitochondrial membrane.

In our study, the concentration of glucose (GLU) and triglyceride (TG) was not affected by different levels of L-carnitine and Lys-Met in the diet. These results are in accordance with the study of Taraz and Dastar (14) since they showed that the concentration of

En pollos de engorde, el ácido úrico (UAc) se produce como el producto final principal del metabolismo del nitrógeno. El nivel de proteína dietaria afecta marcadamente la producción de ácido úrico. Nuestros resultados mostraron que el UAc incrementó a medida que la ingesta de L-carnitine, Lys y Met disminuyó. Sin embargo, se han reportado resultados inconsistentes en la literatura con relación al uso de estos aminoácidos en las dietas de aves. Donsbough et al (18) describió una disminución en el UAc cuando se incrementó el Lys dietario en la dieta mientras que Xie et al (19) describió una disminución de las concentraciones de UAc en suero seguido de un incremento a medida que se incrementaba el nivel de Met.

En nuestro estudio, la concentración de proteína y albúmina no fue afectada por los diferentes niveles de L-carnitine y Lys-Met. L-carnitine indujo incrementos significativos de concentraciones de albúmina (Alb) en suero en aves con depleción de energía dietaria sin afectar la proteína total (20). La mayoría de los estudios sobre Met no pudieron probar un efecto de proteína total en suero y albúminas en pollos de engorde (13,21).

La glucosa plasmática (GLU) y concentraciones de ácidos grasos libres son buenos indicadores del estatus energético. Las interacciones dinámicas entre estos dos grupos de sustratos de energía principales, sin mediación hormonal, parece indicar que la utilización de un nutriente (ej. Glucosa) directamente inhibe el uso del otro (en este caso ácidos grasos) de acuerdo con Arslan et al (22).

La β-oxidación de ácidos grasos mitocondriales es un sistema importante mediante el cual se descomponen los ácidos grasos en distintos tejidos para producir energía. En este sistema, L-carnitine juega un rol importante facilitando el transporte de ácidos grasos de citosol a través de la membrana mitocondrial.

En nuestro estudio, la concentración de glucosa (GLU) y triglicéridos (TG) no fue afectada por los distintos niveles de L-carnitine y Lys-Met en la dieta. Estos resultados están de acuerdo con el estudio de Taraz y Dastar (14) ya que mostraron que la concentración de GLU y TG no era afectada por suplementación de L-carnitine y Lys-Met. Así mismo, Arslan et al (22) no pudo encontrar un efecto de L-carnitine sobre las concentraciones de GLU plasmático. Se reportaron resultados en conflicto de Bouyeh y Gevorgyan (6). Sin embargo, nuestros resultados están en contra de Xu et al (4). Estos autores describen que L-carnitine causa una disminución en la concentración plasmática de triglicéridos



GLU and TG was not affected by L-carnitine and Lys-Met supplementation. As well, Arslan et al (22) could neither find an effect of L-carnitine on plasmatic GLU concentrations. Conflicting results were reported by Bouyeh and Gevorgyan (6). However, our results are against the result of Xu et al (4). These authors described that L-carnitine causes the decrease of the plasmatic concentration of triglyceride (TG). Moreover, they found that by adding 50, 75, or 100 mg/kgL-carnitine to diets the total activities of NADPH-generating enzymes (G-6-PD, MDH, and ICD) in subcutaneous fat were decreased (p<0.05) and the synthesis of fatty acid in subcutaneous fat would accordingly be decreased.

In the present study, the concentration of TC, LDL and HDL were affected by different levels of L-carnitine and Lys-Met, whereas VLDL plasma concentrations were not affected. Bouyeh and Gevorgyan (6) observed a decrease followed by an increase in plasma cholesterol in birds feed Lys and Met above NRC recommendations. It is possible that this was caused by increased cholesterol storage in muscles. Cholesterol is probably less actively stored and need a longer period of ingestion before significant increase or decrease may show up (6). In this study, the plasmatic total cholesterol (TC) and LDL were significantly reduced when L-carnitine was added, with or without Lys and Met. These results agree with those from Murali et al (23). However, the data by Taraz and Dastar (14), Adabi et al (24) and Arslan et al (22) do not agree with our findings.

The very low density lipoprotein (VLDL) and LDL are closely related to one another. VLDL is formed in the liver and is converted to LDL in muscle and adipose tissues by losing fatty acids. The LDL thus produced supply the tissues with cholesterol. The TG accumulation in adipocytes depends mainly on the availability of plasma VLDL and genetically fat chickens presented high levels of VLDL. In this study, despite no differences were found between treatments, the plasmatic VLDL concentration were low.

Taken together, our data show that a diet containing 150 mg/kg L-carnitine with 15% Lys and 15% Met seems to be enough to sustain low levels of TC, LDL and HDL. Therefore, L-carnitine may decrease body fat content in broiler carcasses by decreasing the deposition of fatty acids in extra hepatic tissues, above all the adipose and muscle tissue.

Acknowledgments

Financial support by Rasht Branch, Islamic Azad University, grant number 4.5830 is gratefully acknowledged.

(TG). Más aún, encontraron que al adicionar 50,75, o 100 mg/kg de L-carnitine a las dietas las actividades de enzimas generadoras de NADPH (G-&-PF, MDH e ICD) en grasa subcutánea disminuían (p<0.05) y la síntesis de ácidos grasos en grasa subcutánea disminuía acordemente.

En este estudio, la concentración de TC, LDL y HDL fue afectada por los distintos niveles de L-carnitine y Lys-Met, mientras que las concentraciones de VLDL en plasma no fueron afectadas. Bouyeh y Gevorgyan (6) observaron una disminución seguida de un aumento en el colesterol en plasma en aves alimentadas con Lys y Met por encima de las recomendaciones de NRC. Es posible que esto haya sido causado por un incremento del almacenamiento de colesterol en los músculos. El colesterol es probablemente almacenado de manera menos activa y necesita un mayor periodo de ingestión antes que se evidencie una disminución o aumento significativo (6). En este estudio, el colesterol total plasmático (TC) y LDL disminuyeron significativamente cuando se adicionó L-carnitine, con o sin Lys y Met. Estos resultados están de acuerdo con aquellos de Murali et al (23). Sin embargo, los datos de Taraz y Dastar (14), Adabi et al (24) y Arslan et al (22) no están de acuerdo con nuestros hallazgos.

La lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y el LDL están relacionados de manera cercana entre sí. El VLDL se forma en el hígado y se convierte a LDL en el músculo y tejidos adiposos al perder ácidos grasos. El LDL producido proporciona a los tejidos con colesterol. La acumulación de TG en adipocitos depende principalmente de la disponibilidad de VLDL plasmático y pollos genéticamente gordos presentan altos niveles de VLDL. En este estudio, a pesar de que no se encontraron diferencias entre los tratamientos, las concentraciones de VLDL plasmático fueron bajas.

Tomados en conjunto, nuestros datos muestran que una dieta que contiene 150mg/kg de L-carnitine con 15% de Lys y Met parece ser suficiente para mantener bajos niveles de TC, LDL y HDL. Por ende, L-carnitine puede reducir el contenido de grasa del cuerpo en carcasas de pollos de engorde disminuyendo la deposición de ácidos grasos en tejidos hepáticos extra, por encima de todo el tejido adiposo y muscular.

Agradecimientos

Por el apoyo financiero por Rasht Branch, Universidad Islámica Azad, número de concesión 45830.

4707

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4709

Behavior of Murrah buffaloes under influence of strangers in the milk parlor during milk control

Análisis comportamental de búfalas Murrah bajo la influencia de personas extrañas en el control lechero

Maria Vanderly Andrea,¹* Ph.D, Cintia Righetti Marcondes,2 Ph.D, Adriana Bagaldo, 1 Ph.D, Kaliane Nascimento de Oliveira,¹ M.Sc, Evani de Oliveira-Strada,1 Ph.D,

Emanoela Souza-Conde,³ M.Sc, Sabrina Luzia G. de Souza,¹ Ph.D.

1Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Centro de Ciências Ambientais e Biológicas, Rua Rui Barbosa, 720, CEP 44380.000, Cruz das Almas, Bahia, Brazil.2Embrapa Pecuária Sudeste, Rodovia Washington Luiz, km 234, CEP 13560-970, São Carlos, São Paulo, Brazil. 3Instituto Federal de Educação, Ciências e Tecnologia Baiano Campus Teixeira de Freitas, Rodovia BR 101, Km 882, s/n, CEP 45.985-970, Teixeira de Freitas, Bahia, Brazil. *Correspondence: [email protected]

Received: February 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT

Objectives. The study was carried out in two farms, located in São Sebastião do Passé, Bahia, Brazil, during the three first months of lactation of 81 female buffaloes, to observe if stranger people at milk parlor could affect the milk production. Materials and methods. Four strangers were at the milking parlor during the milking time to observe the following parameters: Duration of Stay in the Milking Parlor; Milking Period; Rumination; Defecation; Urination Reactivity; Stress Level; Side Preference in the Milking Parlor ; Milk Yield, and Post Control Milk Yield. The females were categorized as 1=primiparous, 2=pluriparous, and 3=when information about calving number was not available. The data were analyzed using SAS Statistical Package. Results. During the presence of four strangers at the milking parlor, it was observed that the mean value for Duration of Stay in the Milking Parlor was 23 minutes (varying from 12 to 38 minutes). Average Milking Period was 8 minutes (varying from 4 to 13 minutes). Average Milk Yield during observation days (MY) varied from 2.30 kg to 14.70 kg, with an average value of 7.70±2.60 kg, while Mean Milk Yield after the observation days was 8.600±2.70 kg. Conclusions. As far as Post Control Milk Yield, since the animals presented increased milk yield in both farms on the days following the observations, it is possible to assert that the presence of strangers in the milk parlor during milk control reduced milk yield only during the day of observation, with no adverse effects on subsequent milk production. Key words: Animal production, animal welfare, Bubalus bubalis (Source: CAB, USDA).

RESUMEN

Objetivo. El estudio fue realizado en dos propiedades en el municipio de São Sebastião do Passé – Bahía, Brasil, durante los tres primeros meses de lactancia de 81 búfalas, para observar si las personas extrañas en sala de ordeño podrían afectar la producción de leche. Materiales y métodos. Cuatro personas extrañas estaban en la sala de ordeño durante el tiempo de ordeño para observar los siguientes parámetros: el Tiempo de Permanencia en la Sala de Ordeño; Tiempo de Ordeño; Rumiación; Defecación; Micción; Reactividad; Nivel de Estrés; Preferencia de Lado en la Sala de Ordeño; Producción de Leche y Producción de Leche Post – Control. Las búfalas fueron Categorizadas como 1, para las primíparas, 2 para las multíparas y 3 cuando la información del número de partos no fue obtenida en la

ORIGINAL


http://www.ufrb.edu.br/ccaab/index.php/corpo-docente/94?task=view



hacienda. Los análisis fueron realizados a través del Statistical Analysis System. Resultados. Durante la presencia de cuatro extraños en la sala de ordeño, se observó que el Tiempo de Permanencia en la Sala de Ordeño medio fue de 23 minutos (variando de 12 a 38 minutos) y el Tiempo de Ordeño medio de 08 minutos (variando de 4 a 13 minutos). La producción de leche media en el día de Control Lechero varió de 2.30 kg a 14.70 kg, con media igual a 7.70±2.60 kg. La producción de leche en los días siguientes fue igual a 8.60±2.70 kg. Conclusiones. Como los animales presentaron aumento de producción lechera después del control en ambas haciendas, es posible que la presencia de personas extrañas en la sala de ordeño durante el Control Lechero mensual redujera el rendimiento apenas durante los días de observación, sin efectos adversos sobre la posterior producción de leche.

Palabras clave: Bienestar animal, Bubalus bubalis, producción animal (Source: CAB, USDA).

INTRODUCTION

The world buffalo population is estimated in approximately 177.240 millions of animals, distributed throughout forty-two countries and an annual increase of around 18 million animals per year for the last ten years (1). In Brazil, the buffalo herd amounts to 1.2 million animals (2). Murrah buffaloes are successfully bred and raised all over the country, and are appreciated for their high quality products.

Buffaloes have become an economically feasible alternative for the production of animal protein, mainly due to their adaptability, precocity and longevity (3-5). In terms of animal production, behavioral studies are relevant to determine the importance of behaviors such as rumination, defecation, urination and reaction to milking, which are closely related to animal welfare, to significant zootechnical characteristics such as milk yield, for example. With the 1.80% cumulative growth of the Brazilian buffalo herds in the past few years (6), the analysis of behavioral data and methods of evaluation are useful tools in selective breeding and targeted mating.

The increase of 20% in milk yield, observed after changes on how the animals were managed, is a strong evidence of the importance of animal welfare, not only in ethical terms but also in increased productivity (7,9). In fact, some producers have already adopted raising systems based on ethological factors in order to increase animal welfare and production.

Several studies on human/animal interaction have been developed to determine the factors that negatively affect animal welfare in the milking parlor (8,10). Understanding the behavior of Murrah buffaloes is relevant for stockbreeders in order to reduce the stress factors affecting welfare and productivity. At the same time, actions taken to improve animal welfare and lessen stress levels are of extreme importance in

INTRODUCCIÓN

La población mundial de búfalos se estima en aproximadamente 177.240 millones de animales, distribuidos en 42 países y con un incremento anual de aproximadamente 18 millones de animales por año en los últimos 10 años (1). En Brasil, la manada de búfalos alcanza 1.2 millones de animales (2). Los cubanos Murrah son criados exitosamente en todo el país, y son apreciados por sus productos de alta calidad.

Los búfalos se han convertido en una alternativa económica factible para la producción de proteínas ni mal, principalmente debido a su adaptabilidad, precocidad y longevidad (3-5). En términos de producción animal, los estudios de comportamientos son relevantes para determinar la importancia de comportamientos como la rumiación, defecación, micción, y reacción A los den, las cuales están relacionadas de manera cercana al bienestar del animal, a características técnicas importantes como la producción de leche, por ejemplo. Con el 1.80% de crecimiento acumulado de manadas de búfalos en Brasil en los últimos años (6), el análisis de datos de comportamiento y métodos devaluación son importantes herramientas para la cría selectiva y el apareamiento dirigido.

El incremento del 20% en la producción de leche, observado luego de cambios en cómo los animales son manejados, es fuerte evidencia de la importancia del bienestar animal, no solo en términos éticos pero también en productividad incrementada (7,9). De hecho, algunos productores ya han adoptado sistemas de cría basados en factores etológicos para incrementar el bienestar y la producción del animal.

Varios estudios sobre la interacción entre humanos y animales se han desarrollado para determinar los factores que afectan negativamente el bienestar de los animales en la sala de ordeño (8,10). Entender el comportamiento de los búfalos Murrah es relevante para los criadores de manera que puedan reducir los factores de estrés que afectan el bienestar y la

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favoring the implantation of organic production systems.

Therefore, it is necessary to analyze set of behavioral elements, such as characterizing the development of an ethogram, which enables the assessment of animal welfare and its implications on productivity.

This study used an ethogram to evaluate the behavior of lactating Murrah buffaloes while exposed to the presence of strangers in the milk parlor during milk control for the first three months of lactation, and to verify the influence of people in the well-being of these animals in order to assess the variation in production performance during and after periods of milk control.


Location and production system. This study was conducted in two dairy farms located in the city Sebastião do Passé, in the state of Bahia, Brazil. Farms 1 and 2 were distant 30 km from each other. Climate in the region is rainy, hot and wet, with moderate winds and average rainfall of 1.65 mm. Both farms joined the Embrapa’s Buffalo Genetic Improvement Program (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária), established by Embrapa Eastern Amazon, in 2008. The study was based on the reality of the buffalo farms of the region rather than on experimental conditions and controlled environments.

Farm 1 consisted of 635 ha, with 535 ha being used for pasture rotation (20% of Brachiaria humidícula, 78% of Brachiaria decumbens, 2% of Brachiaria arrecta, sugar cane and Brachiaria mutica). The pastures were divided with electric fences, and water was made available at all times. Before milking, animals were transferred from pastures to an unpaved 100 m2 pre milking area without roof. The milking parlor has an automatic milking system with two lines and eight places on each side. Milk yield is automatically recorded. There were 250 lactating animals, divided into three milking groups. Calves remained with their mothers during first week of life. After this period, they only had access to the mothers during milking time, when they also received supplementary soybean meal. After milking, the females were fed a concentrate containing wheat bran, cotton seeds, soybean meal, mineral salts and barley. The amount of feed offered depended on individual milk yield. In both farms, dry cows grazed in pastures, and mineral salt was offered in feeders at all times.

Farm 2 had 600 ha, half of which were used for pasture rotation (60% of Brachiaria

Vanderly - Behavior of Murrah buffaloes under influence of strangers

productividad. Al mismo tiempo, los acciones tomadas para mejorar el bienestar del animal y reducir los niveles de estrés son de extrema importancia para favorecer el implante de sistemas de producción orgánica.

Por ende, es necesario analizar un grupo de elementos de comportamiento, como caracterizar el desarrollo de un etograma, que permite la oración del bienestar del animal y sus implicaciones en la productividad.

Este estudio programa para evaluar el comportamiento de búfalos Murrah lactantes mientras sean expuestos a la presencia de extraños en la sala de ordeño durante el control de la leche por los primeros tres meses de lactancia, y para verificar la influencia de las personas en el bienestar de estos animales de manera que se pueda evaluar la variación en el desempeño de producción durante los periodos posteriores al control de la leche.


Locación y Sistema de Producción. Este estudio se llevó a cabo en dos fincas de chelas localizadas en la ciudad Sebastião do Passé, en el Estado de Bahía, Brasil. Las fincas uno y dos están a 30 km de cada una. El clima de la región es lluvioso, caliente, con vientos moderados y precipitación promedio de 1.65mm. Ambas fincas se unieron al Programa de Mejora Genética de Búfalos de Embrapa, establecida por Embrapa Amazonas del Este, en 2008. El estudio se basó en la realidad de las fincas de búfalos en la región En lugar de condiciones experimentales y ambientes controlados.

La finca 1 consistió de 635 ha, de las cuales 535 ha están siendo usadas para rotación de pastos (20% de Brachiaria humidícula, 78% de Brachiaria decumbens, 2% de Brachiaria arrecta, caña de azúcar y Brachiaria mutica). Los pastizales se dividen con cercas eléctricas, y el agua está disponible en todo momento. Antes de ser ordenados, los animales son transferidos de los pastizales A un área de ordeño sin pavimentar, sin techo de 100 m². La sala de ordeño tiene un sistema automático de ordeño con dos líneas ocho posiciones en cada lado. La producción de leche se registra automáticamente. Hay 250 animales lactando, divididos en tres grupos de lactancia. Los terneros permanecen con sus madres durante la primera semana de vida. Después de este periodo, sólo tienen acceso a sus madres durante el tiempo de ordeño, cuando también reciben Una comida de soya suplementario. Luego del ordeño, las hembras son alimentadas con concentrado que contiene salvado de trigo, semillas de algodón, alimento de soya, sales minerales y cebada. La cantidad de alimento ofrecido depende en la producción individual de leche. En ambas fincas, vacas secas pastaron en los pastizales, y se les ofreció sal mineral en los alimentadores en todo tiempo.


humidícula, 20% of Brachiaria decumbens, 1% de Pennisetum purpureum; 1% of sugar cane and 18% of overflow tolerant grass forages Echinochloa pyramidalis and Leersia hexandra). As seen in Farm 1, pastures were divided by electric fences, and there was a river flowing throughout the property providing water to the different pastures. The corral had a roofed area of 700 m² and an area of 500m² without roof. It also had a scale, cattle chute and a mechanic bucket milking system with eight places into two milking lines. The farm had 140 lactating animals divided into two milking groups.

Reproductive management was similar in both farms, and the breeding season took place between the months of March and August. Timed Artificial Insemination was used from September to February. The average age for breeding varied from 18 to 25 months, and the first birthing occurred when animals were 30 to 36 months old. In both farms, all animals were vaccinated and dewormed regularly. The milking process occurred twice daily.

Management procedures such as the entry of the cows in the milking parlor, mastitis test, teat pre-dipping and drying, milking cup application and removal, post milking dipping and milk parlor exit were observed. The management in the parlor was the same for the both farms.

Data. During the morning milking, there were four strangers whose three were collecting data of milk production, and one person was observing the behavior of each buffalo at the milking line from beginning to the end of the period. Data were collected by the direct observation of 81 female buffaloes (52 in Farm 1, and 29 in Farm 2) during their stay in the milking parlor. Each animal were observed from its entrance and leaving the milking parlor. Animals were observed monthly during the first three lactating months, and the strangers arrived suddenly at the parlor to make sure that the animals would not be adapted to them. Milk weight was recorded twice daily (morning and afternoon). One week after these observations, a new milking observation was collected for further comparison with the Post Control Milk Yield (PCMY).

Females were categorized (CAT) as 1=primiparous, 2=pluriparous, and 3=when information about calving number was not available.

La finca 2 tenía 600 ha, De las cuales la mitad fue utilizada para rotación de pastos (60% de Brachiaria humidícula, 20% de Brachiaria decumbens, 1% de Pennisetum purpureum; 1% de caña de azúcar y 18% de forrajes de pasto tolerante al sobre flujo Echinochloa pyramidalis y Leersia hexandra). Como se vio en la finca número uno, los pastizales fueron divididos por cercas eléctricas , Y había un río que fluya a través de la propiedad proporcionando agua a los diferentes pastizales. El corral tenía un área techada de 700 m² y un área de 500 m² sin techo. También tenía una balanza, una rampa de ganado y un sistema de ordeño mecánico con ocho plazas en dos líneas de ordeño. La finca tenía 140 animales lactando divididos en dos grupos de ordeño.

El manejo reproductivo fue similar en ambas fincas, y la estación de cría lugar entre los meses de marzo y agosto. Inseminación artificial cronometrada fertilizada desde septiembre hasta febrero. La edad promedio para quilla varía entre 18 y 25 meses, y el primer nacimiento ocurrió cuando los animales tenían entre 30 y 36 meses. En ambas fincas, todos los animales fueron vacunados Y desparasitado regularmente. El proceso de ordeño ocurrió dos veces al día.

Los procedimientos de gestión tales como la entrada de las vacas en la sala de ordeño, las pruebas de mastitis, pre-goteo y secado del pezón, aplicación y remoción de la tasa de leche, inmersión posterior al ordeño Y salió de la sala fueron observados. La gestión en la sala fue la misma en ambas fincas. Datos. Durante el ordeño en la mañana, hubo cuatro extraños de los cuales tres recolectaban datos sobre la producción de leche, y una persona estaba observando el comportamiento de cada búfalo en la línea de ordeño desde el principio hasta el final del periodo. Los datos fueron recolectados por medio de observación directa de 81 búfalos hembra (52 en la finca uno, y 29 en la finca dos) durante su estadía en la sala de ordeño. Cada animal fue observado desde su entrada y salida de la sala de ordeño. Los animales fueron observados mensualmente durante los primeros tres meses de lactancia, y los extraños Llegaban de repente a la sala para asegurarse de que los animales no se hubieran adaptado a ellos. El peso de la leche era registrado dos veces al día (mañana y tarde cierro paréntesis. Una semana después de estas observaciones, una nueva observación de ordeño era recolectada para comparación adicional con el Post Control de Producción de Leche (PCMY por sus siglas en inglés).

Las hembras fueron categorizadas (CAT) como 1 = primíparas, 2 = pluríparas, y 3 = cuando la información sobre el número de terneros no estaba disponible.

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Continuous variables. The focal sampling and continuous collection followed a model adapted from ethogram of Paranhos da Costa and Broom (8), Hötzel (11) and Honorato (12). The behavioral variables bellows was observed:

Period in the Milking Parlor (PMP): measured as the time from entrance into the parlor until the animals were set free; Milking Period (MP): measured in minutes, from the moment of the milking cups were applied until their removal from animals; Milk Yield (MY): amount in kg of milk produced during observation days; Post Control Milk Yield (PCMY): amount in kg of milk produced one week later the first observation, without the presence of strangers in the milking parlor.

Discrete variables. The variables recorded as observed or not necessarily in the milking parlor (Rumination – RU, Defecation – DEF, Urination – UR).

Modal scores. Other measurements observed in the milking parlor:

Reactivity (REAC): defined as the actions or movements of the animal during milking (8): 1.) Yes or not leg movements; 2.) If there were legs movement: 2.1) lifted less than 15 cm above the ground; 2.2) lifted more than 15 cm above the ground.

Stress Level (SL): behavior of the animals in the milking parlor:1.) Agitated: eyes wide-open, raised ears; 2.) Slightly agitated: watchful, staring, ear movements towards the noise source, interruption of current activity;3.) Calm: head and ears down, drowsy;

Side Preference in the Milking Parlor (SPMP):1.) Right side of the line; 2.) Left side of the line.

Statistical analysis. The continuous variables PMP, MP, MY and PCMY were analyzed using the SAS Statistical Package (13). To determine if Farm had a fixed effect on the discrete variables RU, DEF and UR, the GENMOD procedure of SAS was used. The modal scores for REAC (REACMO), SL (SLMO) and SPMP (SPMPMO) were considered fixed effects using the GLM procedures in analysis models that also consider Farm and CAT as fixed effects on the variables MY and PCMY.

Mean comparison tests for significant effects were performed (Tukey´s test for CAT and SL or REACMO, and t-test for Farm and SPMP). For rank correlation in both farms between MY and


Variables Continuas. El muestreo focal y la recolección continua siguieron un modelo adaptado del etograma de Paranhos da Costa y Broom (8), Hotzel (11) y Honorato (12). Las variables de comportamiento a continuación se observaron:

Periodo en la sala de ordeño (PMP por sus siglas en inglés): medido Como el tiempo desde la entrada en la sala hasta que los animales eran liberados; periodo de ordeño (MP por sus siglas en inglés): Medido en minutos, desde el momento en que las copas eran aplicadas hasta su remoción de los animales ; Producción de leche (MP por sus siglas en inglés): cantidad en kilogramos de leche producida durante los días de observación; Post Control de Producción de Leche (PCMY por sus siglas en inglés): cantidad en kilogramos de leche producida una semana después de la primera observación, sin la presencia de extraños en la sala de ordeño.

Variables Discretas. Las variables registradas como se observaron o no necesarias en la sala de ordeño (Rumiación – RU, Defecación – DEF, Micción – UR).

Calificaciones Modales. Otras medidas observadas en la sala de ordeño:

Reactividad (REAC): definidas como las acciones son movimientos del animal durante el ordeño (8):1.) Movimientos de piernas si o no;2.) Si hubo movimiento de piernas: 2.1) Levantadas menos de 15 cm sobre el suelo; 2.2) Levantadas más de 15 cm sobre el suelo;

Nivel de Estrés (SL por sus siglas en inglés): comportamiento de los animales en la sala de ordeño:1.) Agitados: ojos abiertos, orejas levantadas;2.) Un poco agitados: vigilante, mirando, movimiento de las orejas hacia la fuente del ruido, interrupción de actividad actual;3.) Calmados: cabeza y orejas abajo, mareados;

Preferencia de lado de la sala de ordeño (SPMP por sus siglas en inglés):1.) Lado derecho de la línea:2.) Lado izquierdo de la línea.

Análisis Estadístico. Las variables continuas PMP, MP, MY y PCMY fueron analizadas utilizando el paquete estadístico SAS (13). Para determinar si la Finca tiene un efecto fijo en las variables discretas RU, DEF y UR, el procedimiento GENMOD de SAS fue utilizado. Las calificaciones modales para REAC (REACMO), SL (SLMO), y SPMP (SPMPMP) fueron consideradas efectos fijos utilizando los procedimientos GLM en modelos de análisis que también consideran Finca y CAT como efectos fijos en las variables MY y PCMY.


PCMY, the SAS PROC CORR SPEARMAN procedure was applied.

The chi-square test was used to test the following hypothesis: (alpha=0.05): H0 – rumination ratio is the same in both farms; H1- rumination ratio is not the same in both farms; H0 – defecation ratio is the same in both farms; H1- defecation ratio is not the same in both farms; H0 – urination ratio is the same in both farms; H1- urination ratio is not the same in both farms.

RESULTS

The mean value for the Period in Milking Parlor (PMP) was of 23 minutes (varying from 12 to 38 min), and the mean Milking Period was of 8 min (varying from 4 to 13 min). Average milk yield during observation days (MY) varied from 2.30 kg to 14.70 kg, with a mean value of 7.70±2.60 kg. Mean milk yield on the days after observations was 8.60±2.70 kg, varying from 3.70 kg to 17.30 kg (Table 1).

Table 1. Mean, standard deviation (SD), minimum (Min) and maximum (Max) of the continuous variables PMP, MP, MY and PCMYstudied in Murrah buffaloes.

Variables N Mean SD Min Max

PMP (min) 81 22.8 4.1 12.0 37.7

MP (min) 81 8.0 1.9 4.3 13.0

MY (kg) 81 7.7 2.6 2.3 14.7

PCMY (kg) 81 8.6 2.7 3.7 17.3

MP (Period in the Milking Parlor, measured as the time from entry into the parlor until the animals were set free); MP (Milking Period, measured in minutes from the moment the milking cups were applied until their removal from animals); MY (Milk Yield, amount in kg of milk obtained during observation days); PCMY (Post Control Milk Yield, values obtained one week after the first observations).

In the present study, animals could choose to be milked on the right or the left side of the milking lines. Overall, animals from Farm 1 preferred the left side of the line, while animals from Farm 2 preferred the right side of the milking line.

One hundred and fifty six observations from Farm 1 and eighty seven from Farm 2 were performed regarding the following behavioral parameters: Rumination, Urination and Defecation. The results, expressed as percentage, are shown in table 2.

Las comparaciones de pruebas de media para efectos significativos fueron realizadas (Prueba Tukey para CAT y SL o RACMO, prueba t para Finca y SPMP). Para correlación de rango en ambas fincas entre MY y PCMY, se aplicó el procedimiento de SAS PROC CORR SPEARMAN.

La prueba chi-cuadrado se utilizó para probar la siguiente hipótesis (alpha=0.05); HO–tasa de rumiación igual en ambas fincas; H1–tasa de rumiación no es la misma en ambas fincas; H0–tasa de defecación es la misma en ambas fincas; H1 – tasas de defecación no es la misma en ambas fincas; H0 = tasa de micción es la misma en ambas fincas; H1 = tasa de micción no es la misma en ambas fincas.

RESULTADOS

El valor medio para el Periodo en la Sala de Ordeño (PMP) fue de 23 minutos (variando entre 12 y 38 minutos9, y el Periodo de Ordeño medio fue de 8 minutos (variando entre 4 y 13 minutos). La producción promedio de leche durante los días de observación (MY) varió entre 2.30 kg y 14.60 kg, con un valor medio de 7.70±2.60 kg. La producción media de leche en los días de observación fue de 8.60±2.70 kg, variando entre 3.70 kg a 17.30 kg (Tabla 1).

El MP (Periodo en la Sala de ordeño, medido como el tiempo desde la entrada en la sala de ordeño hasta que los animales fueron liberados); MP (periodo de ordeño, medio en minutos desde el momento en que las copas de ordeño fueron aplicadas hasta su remoción de los animales); MY (producción de leche, cantidad en kilogramos de leche obtenida durante los días de observación); PCMY (Post Control Producción de Leche, valores obtenidos una semana después de las primeras observaciones).

En el estudio actual, los animales podían escoger ser ordeñados en el lado derecho o izquierdo de las líneas de ordeño. En general, los animales de la finca uno prefirieron el lado izquierdo de la línea, mientras que los animales de la finca dos prefirieron el lado derecho de la linea de ordeño.

Se realizaron Ciento cincuenta y seis observaciones de la finca 1 y ochenta y siete de la finca 2 con respecto a los siguientes parámetros de comportamiento: rumiación, orinar y defecación. Los resultados, expresados en porcentaje, se muestran en la tabla 2.

De acuerdo a los datos, las variables presentan diferentes tasas en ambas fincas. Las pruebas chi-cuadrado (p<0.05) indican que no hubo

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Table 2. Behavioral variables Rumination (RU), Urination (UR) and Defecation (DEF) expressed as percentage.

VariableFarm 1 Farm 2

Yes No Yes No

Rumination (RU) 34 66 14 86

Urination (UR) 23 77 10 90

Defecation (DEF) 11 89 8 92

According to the data, all variables presented different ratios in both farms. Chi-square tests (p<0.05) indicate that there were no equal ratios between farms for the variables urination and rumination (the expected χ2 were higher than the observed χ2 for 1d.f.), which is in agreement with the data in table 2.

Only six female buffaloes with Reactivity (REAC) index of 3 (legs lifted more than 15 cm above the ground) were observed in Farm 1. For the variable level of stress (SL), it was observed only one buffalo scoring in all observations. The same animal was classified as agitated and presented leg agitation.

According to the statistical model applied, the modal score of Stress Level (SLMO) for Milk Yield (MY) was significant (p<0.0001), i.e., farm, CAT and SLMO explained 44% of the MY variation. However, the characteristic “Farm” had no significant effect on MY (p>0.60). During milking control days, calm females produced 3 kg more than what was recorded on days after observation days. Pluriparous animals produced 1.60 kg more than the primiparous females. Older females produced 2.80 kg more milk in the absence of strangers. Therefore, the yield decreases more evident in this category (9.80 kg of milk compared to 7.00 kg during the milk control recording day). Reactivity modal scores (REACMO) for Milk Yield (MY) were significant (p<0.0001). Farm, Category (CAT) and REACMO explained for 34% of the Milk Yield (MY) variation. However, the characteristic “Farm” had no significant effect on MY (p>0.70), and no significant differences (p>0.05) among REAC 1, 2 and 3 were observed. In terms of PCMY, the statistical model explained for 35% of the variation and was significant (p<0.0001). The effect of CAT was not significant (p>0.09). Tukey’s test indicated that females within modal score 1 (motionless legs) produced 1.70 kg more than those in modal score 3 (legs 15 cm above the ground). Farm 1 had an statistically higher production than Farm 2 (p<0.05), with an average milk yield of 2.00 kg more per animal on the days after milk control observations with the presence of strangers (Figure 1).


tazas iguales entre las fincas para las variables de micción y rumiación (las χ2 esperadas fueron mayores que las χ2 observadas para 1d.f), lo cual está acorde con los datos de la tabla dos.

Sólo seis búfalos hembra con índice de reactividad (REAC) de 3 (patas levantadas más de 15 cm sobre el suelo) se observaron en la finca uno. Para la variable de nivel de estrés (SL), se observó sólo un búfalo calificando en todas las observaciones. El mismo animal fue clasificado como agitado y presento agitación de patas.

De acuerdo al modelo estadístico aplicado, la calificación modal de nivel de estrés (SLMO) la producción de leche (MY) fue significativa (p<0.0001), ej. Finca, CAT y SLMO explican 44% de la variación de MY. Sin embargo, la característica “finca” no tuvo ningún efecto significativo en MY (p>0.60). Durante los días de control de ordeño, las hembras calmadas produjeron 3 kg más que lo que fue registrado en días después de los días de observación. Los animales pluríparos produjeron 1.60 kilogramos más que las hembras primíparas. Las hembras más viejas produjeron: 30 kg + leche en ausencia de extraños. Por esto, la producción disminuye más evidentemente en esta categoría (9.80 kilogramos de leche comparados con 7.0 0 kg durante el día de registro de control de leche).

Las calificaciones modales de reactividad (REACMO) la producción de leche (MY) fueron significativas (p<0.0001). Finca, Categoría (CAT) y REACMO explican 34% de la variación en producción de leche (MY). Sin embargo, la característica “finca” no tuvo ningún efecto significativo en MY (p>0.70, Y no hubo diferencias significativas (p>0.05) entre REAC 1, 2, y 3 cuando se observaron. En términos de PCMY, el modelo estadístico explica 35% de la variación y fue significativo (p<0.0001). El efecto de CAT no fue significativo (p>0.09). La prueba de Tukey indicó que las hembras dentro de la calificación modal 1 (patas inmóviles) produjeron 1.70 kilogramos más que aquellas con calificación modal de 3 (patas 15 cm sobre el suelo). La finca uno tuvo una producción estadísticamente mayor que la finca 2 (p<0.05), con una producción promedio de leche de 2.0 0 kg más por animales en los días después de las observaciones de control de leche en la presencia de extraños (Figura 1).

De acuerdo al modelo estadístico aplicado, la calificación moral para preferencia de lado (SPMPMO) para Producción de Leche (MY) fue significativa (p<0.0001), con un R-cuadrado de 21%. Finca, CAT y SPMPMP explican 21% de la variación de MY observada. En ambas fincas,


According to the statistical model applied, the modal score of Side Preference (SPMPMO) for Milk Yield (MY) was significant (p<0.0001), with a R-square of 21%. Farm, CAT and SPMPMO explained for 21% of the observed MY variation. In both farms, side preference (SPMPMO) had no significant effect (p>0.70) on MY during milk control days. In terms of PCMY, the model was significant (p<0.009) with a low R-square of 16%. CAT, Farm and SPMPMO were not significant (p>0.15). Side preference in the milking parlor was not a significant source of variation in milk yield. The overall rank correlation between PLO and PLP was equal to 0.76. There was a 24% change in the ranking of the animals for the two periods studied. When the analysis was done by farm, the correlation rank of Farm 1 was equal to 0.74 (or 26% change in scoring), while Farm 2 was equal to 0.58 (ie 42% change in ranking). The change in rank may be an indicative of the influence of presence of strangers in the milk parlor in the buffalo’s milk production, because there were considerable changes in the classification of buffaloes between periods.

DISCUSSION

The mean value for period in Milking Parlor (PMP) was 23 minutes (ranging from 12 to 38 minutes), and the mean of the Milking Period was 8 minutes (ranging from 4 to 13 minutes). Average milk yield during observation days (MY) ranged from 2.30 kg to 14.70 kg, with a mean value of 7.70±2.60 kg. Mean milk yield one week after the observation days was 8.60±2.70 kg, ranging from 3.70 kg to 17.30 kg, which suggests the interference of stranger in the parlor on buffaloes milk production. Peters et al (14) observed higher values for PMP, with TOR being higher in cows that were not subjected to aversive handling (PCMY = 9.6 min and MP = 7.3

preferencia de lado (SPMPMO) no tuvo un efecto significativo (p>0.70) en MY durante los días de control de leche. En términos de PCMY, el modelo fue significativo (p<0.009) con un bajo R-cuadrado de 16%. CAT, Finca y SPMPMO no fueron significativos (p>0.15). La preferencia de lado en la sala de ordeño no fue una fuente significativa de variación en la producción de leche. El rango General de correlación entre PLO y PLP fue igual a 0.76. Hubo un 24% de cambio en el rango de los animales para los dos periodos estudiados. Cuando el análisis fue hecho por la finca, el rango de correlación para la finca uno fue igual a 0.74 (26% de cambio en la calificación), mientras que la finca dos fue igual a 0.58 (ej. 42% de cambio en rango). El cambio puede ser un indicativo de la influencia de la presencia de extraños en la sala de ordeño en la producción de leche de los búfalos , Porque no hubo cambios considerables en la clasificación de los búfalos que entre periodos.

DISCUSIÓN

El valor medio para el periodo en la sala de ordeño (PMP) fue de 23 minutos (oscilando entre 12 y 38 minutos), Y la media del periodo de ordeño fue ocho minutos (oscilando entre cuatro y 13 minutos). La producción promedio de leche durante los días de observación (MY) varió entre 2.30 kilogramos 14.70 kilogramos, con un valor medio de 7.70±2.60 kg. La producción media de leche una semana después de los días de observación fue de 8.60±2.70 kg, oscilando entre 3.70 kg y 17.30 kilogramos, lo que sugiere una interferencia del extraño en la sala de ordeño en la producción de leche de los búfalos. Peters et al. (14) observó mayores valores de MP, con TOR mayor en vacas que no estuvieron sujetas a manejo aversivo (PCMY=9.6 minutos y MP = 7.3 minutos para no aversivo y DSMP = 9.2 minutos y MP = 7.0 minutos para manejo aversivo). De acuerdo con los autores, el MP mayor en animales sometidos a manejo aversivo No puede deberse al manejo pacífico y el respeto por la velocidad del movimiento de los animales, el cual incremento el tiempo hasta que los animales se acomodaban en la sala.

Las vacas bajo estrés mostraron resistencia a entrar en la sala de ordeño, Obstaculizando el trabajo Del ordenador y, consecuentemente, presentando una reducción en la producción de leche (15, 16). La producción de leche afectó el PCMY y MP manera significativa. En consecuencia, el tiempo gastado en la sala de ordeño y el tiempo de ordeño interfirió en la eficiencia del proceso de ordeno.

Se conoce que el desempeño es afectado por los estímulos externos, que los animales

Figure 1. Milk production on daily Control (MY) and the Post Control Milk Yield (PCMY) in the two herds of Murrah buffaloes studied.

0,0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

MY PCMY

Milk (kg)

Farm 1 Farm 2

4717

min for non-aversive and DSMP = 9.2 min and MP=7.0 min for the aversive handling). According to the authors, the higher MP in animals submitted to aversive handling could not be due to the peaceful management and respect for the speed of movement of animals, which increased the time until the animals had settled in the parlor.

Cows under stress showed resistance to enter the milking parlor, hampering the work of the milkier and, consequently, presenting a reduction in milk production (15,16). Milk production affected the PCMY and MP significantly. Therefore, the time spent in the milking parlor and the milking time interfered at the efficiency of the milking process.

It is known that performance is affected by external stimuli, and that animals can perceive specific situations as pleasant or unpleasant in relation to previous experiences (17-19). The preferences of which side to be milked may be related to the way the spaces are used in both sides of the milking lines (passageway for calves and humans, for example). A research carried out by Marcondes et al (20), in Farm 1 with the observation of 248 animals, showed that 54.3% of the females chose the same side of the milking line. In a study performed by Grasso et al (19), focusing on the relation between entry of bovines in the milking parlor and milk yield, the authors observed a negative correlation for multiparous females and a positive correlation for primiparous females. However, Alves (21) observed no difference in milk production between different categories of females.

Although both Farms belonged to the same owner, daily management differed in terms of feeding and human-animal interactions. The presence of strangers in Farm 2 during Milk Control (MC) days does not affect animal comfort, as suggested by the data in table 2. High incidence of defecation, urination and reactive animals, with a higher frequency of negative actions in the milking parlor, may have reflected impaired animal welfare (9).

The low reactivity scores in categories 1 and 2 suggested that the behavioral interference was neutral, with the exception of Milk Production during observation days. Stress Level 1 (agitated) in all observations was found in only one female, which also presented leg movement. Such behavior can indicate that improvements in the routine procedures of the farm may be required (8). As reported by Lewis and Hurnik (22), previous negative experiences may increase animal reactivity. Harmonic human-animal interactions reduced stress reactions and reactivity to humans, thus facilitating handling (23-25) without impairing daily production.


pueden percibir situaciones específicas como agradables o desagradables en relación con experiencias previas (17-19). Las preferencias sobre el lado en el que van hacer ordeñados puede relacionarse con la manera en que los espacios son usados en ambos lados de las líneas de ordeño (corredores para terneros y humanos, por ejemplo). Una investigación hecha por Marcondes et al (20), en la finca uno con la observación de 248 animales, mostró que el 54.3 % de las hembras escogió el mismo lado de la línea de orden. En un estudio hecho por Grasso et al (19), enfocado en la relación entre la entrada de bovinos en la sala de ordeño y la producción de leche, Los autores observaron una correlación negativa para hembras multíparas y una correlación positiva para hembras primíparas. Sin embargo, Alves (21) no observo diferencias en la producción de leche entre las diferentes categorías de hembras.

Aunque ambas fincas que eran del mismo dueño, la gestión diaria de feria en términos de alimentación interacción entre animales y humanos. La presencia de extraños en la finca dos durante los días de control de leche (MC) no afecta el confort del animal, como lo sugieren los datos en la tabla dos. Una alta incidencia de defecación, micción y reactividad animal, con una mayor frecuencia de acciones negativas en la sala de ordeño puede a ver reflejado deterioro del bienestar de los animales (9).

Las bajas calificaciones de reactividad en las categorías 12 sugieren que la interferencia de comportamiento fue neutra, con la excepción de producción de leche durante los días de observación. El nivel de estrés uno (agitado) En todas las observaciones se encontró solo en una hembra, que también presentó movimiento de patas. Dicho comportamiento puede indicar que se pueden requerir mejoras en los procedimientos de rutina de la finca. Como lo reportaron Lewis y Hurnik (22), las experiencias negativas anteriores pueden incrementar la reactividad animal. Interacciones armónicas entre humanos y animales Redujeron las reacciones de estrés y reactividad a los humanos, facilitando el manejo (23-25) si no obstaculizar la producción diaria.

La presencia esporádica extraños en las líneas de ordeño no parece afectar el comportamiento animal y no es seguida por una reducción en la producción de leche (22). La presencia de humanos conocidos durante los procedimientos de control puede contribuir a reducir los efectos negativos de la presencia de extraños sobre comportamiento animal (10). Nuestros resultados también mostraron que la presencia de personas conocidas durante el control de


The sporadic presence of strangers in the milking lines does not seem to affect animal behavior and is not followed by a reduction in milk yield (22). The presence of known humans during the control procedures might contribute to reduce the negative effects of the presence of strangers on animal behavior (10). Our results also showed that the presence of known people during Milk Control (MC) does not contribute to reduce the negative effects of the presence of strangers on MY. It is well known that bovines like routine and, since they tend to have a good memory, they can discriminate humans involved in the interactions by reacting in specific ways (23), such as inhibiting milk ejection (26), and reducing daily milk yield (21).

Changes in the daily routine of the animals may cause discomfort and interfere with their daily production (14). This may be evidenced by changes in the ranking of the MY, and PCMY animals. The milk production of buffaloes on a farm may increase as changes are made in the management to meet the behavioral needs of animals (7,24).

In conclusion the results of the current study of the behavior of Murrah females in Bahia, Brazil, showed a reduction of milk yield on milk control days due to the presence of strangers in the milking parlor. The negative effects, however, subsided as soon as the observation was concluded and the presence of strangers in the milking parlor was removed, therefore, not affecting the subsequent milk yield of the animals.

Acknowledgements

The authors thank the farmer Urbano Antônio de Souza Filho for providing the animals and support research.

leche (MC) no contribuye a reducir los efectos negativos de la presencia de extraños sobre MY. Es de amplio conocimiento que los bovinos aprecia en la rutina, debido a que tienden a tener una buena memoria, pueden discriminar entre humanos involucrados en interacciones reaccionando en maneras específicas (23), tales como inhibiendo la eyección de leche (26) y reduciendo la producción diaria de leche (21).

Los cambios en la rutinas diarias de los animales pueden causar Malestar en interferir con su producción diaria (14). Esto se puede evidenciar por cambios en el rango de animales MY y PCMY. La producción de leche de búfalos en una finca puede incrementar a medida que se hacen cambios en la gestión para Satisfacer las necesidades de comportamiento de los animales (7, 24).

En conclusión los resultados del estudio actual sobre el comportamiento de hembras Murrah en Bahía, Brasil, mostró una reducción en la producción de leche en los días de control de leche debido a la presencia de extraños en la sala de ordeño. Los efectos negativos, sin embargo, subsiguieron tan pronto la observación fue concluida y la presencia de extraños en la sala de ordeño fue removida, entonces, no afectó la producción de leche subsiguiente en los animales.

Agradecimientos

Los autores agradecen al agricultor Urbano Antonio de Souza Filjo por proporcionar los animales y el apoyo en la investigación.

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4720

Concordance between otic cytology and culture in diagnosis of external otitis canine by Malassezia spp

Concordancia entre citología ótica y cultivo en el diagnóstico de otitis externa canina por Malassezia spp

Adriana Pulido-Villamarín,1* M.Sc, Rubiela Castañeda-Salazar,1 M.Sc, Melva Linares-Linares,1 M.Sc, Marcela Mercado-Reyes,2 M.Sc.

1Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología, Unidad de Investigaciones Agropecuarias -UNIDIA-. Carrera 7 No. 43-82. Bogotá- Colombia. 2Instituto Nacional de Salud, Dirección de Vigilancia y Análisis de Riesgo en Salud Pública, Subdirección de Prevención y Análisis de Riesgo. Avenida Calle 26 #51-20. Bogotá- Colombia. *Correspondence: [email protected]

Received: March 2014; Accepted: December 2014.

ABSTRACT

Objective. To determine the correlation between microbiological culture and otic cytology for diagnoses of external otitis by Malassezia in dogs. Materials and methods. 158 ear swabs of dogs with clinical diagnosis of external otitis were analyzed by cytology, mycological culture and metabolic tests. Results. Were obtained a positive results by cytology of 62% and 75.3% by culture. The 31.1% of isolates were identified as M. pachydermatis, 12.6% as M. furfur and 56.3% were classified as Malassezia spp., because was not possible to define the species. We found a positive concordance between cytology and culture for Malassezia spp., of 0.76 with a kappa index of 0.448 (95% CI 0.30 to 0.60) which represents a moderate strength of concordance between the two techniques, without regard the identified species. Conclusions. The use of a diagnostic test is not enough to establish the participation of Malassezia spp., as a causal disease agent.

Key words: Canis familiaris, diagnostic techniques, Malassezia, otitis externa (Source: CAB).

RESUMEN

Objetivo. Determinar la concordancia entre el cultivo microbiológico y la citología ótica para el diagnóstico de otitis externa causada por Malassezia spp. en caninos. Materiales y métodos. Se analizaron 158 muestras de hisopados de caninos con diagnóstico clínico de otitis externa, todas las muestras fueron analizadas mediante citología, cultivo micológico y pruebas metabólicas. Resultados. Se obtuvo una positividad mediante citología del 62% y por cultivo del 75.3%. El 31.1% de los aislamientos fueron identificados como M. pachydermatis, el 12.6% como M. furfur y un 56.3% se clasificó como Malassezia spp., dado que bioquímicamente no fue posible hallar su especie. Se determinó una concordancia observada entre técnicas positivas para Malassezia spp. de 0.76 con índice Kappa de 0.448 IC 95% (0.30 – 0.60) lo que representa una fuerza de concordancia moderada entre las dos técnicas, sin tener en cuenta la especie identificada. Conclusiones. El uso de una prueba diagnóstica no es suficiente para establecer la participación de Malassezia pachydermatis como agente causal de enfermedad.

Palabras clave: Canis familiaris, técnicas diagnósticas, Malassezia, otitis externa (Fuente: CAB).

ORIGINAL




4721

INTRODUCTION

One of the most common causes of veterinary consult in dogs are ear diseases which must be diagnosed and treated. One of these conditions is external otitis whose reported prevalence is 10-20% (1,2), with a wide variety of causative agents. Malassezia spp., is the predominant organism in 50 - 83% of cases (3, 4), presenting themselves alone or in association with other infectious agents (5,6). Malassezia spp., has been recognized as commensal of the skin and mucous membranes on humans and animals (7), however it has been implicated in disease processes that go from either superficial infections to systemic processes, which are favored by exogenous host factors (environmental conditions) or endogenous (skin integrity, immunological conditions)(8-10).

Malassezia spp., are lipophilic yeasts; from which 14 species, have been recognized: Malassezia furfur, M. pachydermatis, M. globosa, M. restricta, M. obtusa, M. slooffiae, M. sympodialis, M. dermatis, M. yamatoensis, M. nana, M. caprae, M. cuniculi sp. nov, M. dermatis, M. japonica, M. equina (11-16) which have been identified by morphology, metabolic profile and molecular tests (3,4).

The laboratory diagnosis of external otitis is made by Wright staining cytology, Giemsa and Gram, that look for the presence of yeast structures whose ratio ≥5 cells per microscopic field (40X) is considered as indicator of pathology, while the presence of lesser amount of yeast indicates of commensal microorganism (2–4,8,17,18), on the other hand, the Malassezia cultivation is hard to do due to its strict nutritional requirements and morphological variability making difficult its isolation and identification, therefore, microbiological characterization is done only for epidemiological purposes or in cases of chronic external otitis and media otitis (1), but it should be noted that the identification of the etiologic agent by culture confirms the clinical suspicion and achieves therapeutic success (5).

Given that laboratory diagnosis is done by cytology and/or culture, the objective of this study was to determine the correlation of these techniques for the analyzed cases.


Study population. 158 ear swabs of dogs with clinical diagnosis of external otitis were submitted by four veterinary clinics in Bogotá. All samples were analyzed by cytology and culture.

INTRODUCCIÓN

Una de las causas más comunes en consulta veterinaria en caninos son las enfermedades óticas las cuales deben diagnosticarse y tratarse. Una de estas condiciones es la otitis externa cuya prevalencia reportada es de 10–20% (1,2), con una amplia variedad de agentes causales. Malassezia spp., es el organismo predominante en 50 -83% de los casos (3,4) presentándose sola o en asociación con otros agentes infecciosos (5,6). Malassezia spp., ha sido reconocida como microbiota comensal de la piel y membranas mucosas en humanos y animales (7), sin embargo ha sido implicada en procesos de enfermedad que van desde infecciones superficiales a procesos sistémicos, que han sido favorecidos por factores exógenos (condiciones ambientales) o endógenos (integridad de la piel, condiciones inmunológicas) al hospedero (8-10).

Malassezia spp., son levaduras lipofílicas; de las cuales se han reconocido 14 especies: Malassezia furfur, M. pachydermatis, M. globosa, M. restricta, M. obtusa, M. slooffiae, M. sympodialis, M. dermatis, M. yamatoensis, M. nana, M. caprae, M. cuniculi sp. nov, M. dermatis, M. japonica, M. equina (11-16) que han sido identificadas por morfología, perfil metabólico y pruebas moleculares (3,4).

El diagnóstico de laboratorio de otitis externa se realiza mediante citología con tinción de Wright, Giemsa y Gram, que buscan la presencia de estructuras levaduriformes cuya presencia ≥5 células por campo microscópico (40x) es considerada un indicador de patología, mientras la presencia de una menor cantidad de levaduras indica microbiota comensal (2-4,8,17,18), por otra parte, el cultivo de Malassezia es difícil de hacer debido a los requerimientos nutricionales estrictos y a la variabilidad morfológica que hace difícil su aislamiento e identificación, por ende, la caracterización microbiológica se lleva a cabo para efectos epidemiológicos o en casos de otitis crónica externa y otitis media (1), pero debe tenerse en cuenta que la identificación del agente etiológico por cultivo confirma la sospecha clínica y permite el éxito terapéutico (5).

Dado que el diagnóstico de laboratorio se da por citología y/o cultivo, el objetivo de este estudio fue determinar la correlación entre estas técnicas para los casos analizados.


Población de estudio. 158 hisopados óticos de caninos con diagnóstico clínico de otitis externa remitidos por cuatro clínicas veterinarias en

Pulido-Villamarín - Diagnosis of Malassezia external otitis


Cytology. Wright staining was performed to determine the presence of yeast, by semi-quantitative scale by crosses, thus: 1 to 5 cells/field (+), 6 to 10 cells/field (+ +), 10 to 19 cells/field (+++) and> 19 cells/field (++++)(1,3,4,18,19).

Culture and identification. Samples were cultured in Sabouraud agar (Oxoid, Wade Road, Basingstoke, UK.) and Dixon’s (Mycosell 36 g/L Malt extract 36 g/L, OxBil 20 g/L, Ac Oleic 2 ml/L, glycerol 2 ml/L, Tween 40 10 ml/L, Chloramphenicol 0.5 g/L) and incubated at 32°C for one week. Positive cultures were evaluated microscopically by Gram stain and identified by biochemical tests (urease activity, bile esculin hydrolysis, growth on agar Sabouraud assimilation of Tween 20, 40, 60, 80 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) and cremophor (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) (11,12), using reference strains: M. furfur CBS 7019, M. pachydermatis CBS 1879, M. symphodialis CBS 7222, M. restricta CBS 7877, M. slooffiae CBS 7956 and M. globosa CBS 7966.

Statistical Analysis. A prospective study was performed to determine the diagnostic value of cytology and culture for diagnosis of external otitis caused by Malassezia spp. Data were analyzed in SPSS 1.9; for quantitative variables descriptive statistics were done and for the ratio of diagnostic tests were analyzed for consistency of agreement by Kappa index.

RESULTS Of the 158 samples analyzed by cytology, 62% (98/158) had the presence of yeast in different degrees as shown in table 1.

Table 1. Semi-quantitative cytology in otic samples.Semicuantitative scale n %

Presence of yeast

Negative 60 38

+ 37 23.4

++ 23 14.6

+++ 27 17

++++ 11 7

The microbiological culture for Malassezia was positive in 75.3% (119/158), of which by biochemical characterization, 31.1% (37/119) were classified as M. pachydermatis, 12.6% (15/119) as M. furfur and 56.3% (67/119) corresponded to Malassezia spp. In the corresponding smears were observed different cytological findings (Table 2).

Table 2. Cytological findings according to Malassezia species isolated.

Semicuantitative scale

Malassezia species

M. pachydermatisn

M. furfurn

Malassezia spp.n

Negative 10 4 16

+ 11 2 16

++ 4 5 13

+++ 11 2 13

++++ 1 2 9

Bogotá. Todas las muestras fueron analizadas por citología y cultivo.

Citología. Se llevó a cabo tinción de Wright para determinar la presencia de levaduras, mediante escala semicuantitativa por cruces, así: 1 a 5 células/campo (+), 6 a 10 células/campo (++), 10 a 19 células/campo (+++) y > 19 células/campo (++++)(1,3,4,18,19).

Cultivo e identificación. Las muestras fueron cultivadas en Agar Sabouraud (Oxoid, Wade Road, Basingstoke, UK.) y Dixon’s (Mycosell 36 g/L Extracto de Malta 36 g/L, OxBil 20 g/L, Ac Oleic 2 ml/L, glicerol 2ml/L, Tween 40 10 ml/L, Cloramfenicol 0.5 g/L) e incubadas a 32°C por una semana. Los cultivos positivos fueron evaluados microscópicamente por tinción de Gram e identificados por pruebas bioquímicas (actividad ureasa, hidrólisis de bilis esculina, crecimiento en Agar Sabouraud, asimilación de Tween 20, 40, 60, 80 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y cremofor (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) (11,12), utilizando las cepas de referencia: M. furfur CBS 7019, M. pachydermatis CBS 1879, M. symphodialis CBS 7222, M. restricta CBS 7877, M. slooffiae CBS 7956 y M. globosa CBS 7966.

Análisis Estadístico. Se realizó un estudio prospectivo para determinar el valor diagnóstico de la citología y cultivo para el diagnóstico de la otitis externa causada por Malassezia spp. Los datos fueron analizados en SPSS 1.9; para las variables cuantitativas y para la relación de las pruebas diagnósticas se realizó un análisis de concordancia por consistencia mediante el índice Kappa.

RESULTADOS De las 158 muestras analizadas por citología, en el 62% (98/158) se evidenció la presencia de levaduras en diferentes grados como se observa en la tabla 1.

El cultivo microbiológico de Malassezia fue positivo en el 75.3% (119/158), de los cuales mediante caracterización bioquímica el 31.1%

4723

The observed concordance between positive otic cytology for Malassezia Vs positive culture was 0.76 and the Kappa index was 0.448 (95% CI 0.30 to 0.60) which represents a moderate strength of agreement between the two techniques.

DISCUSSION

Of the 158 evaluated samples the detected cytology positivity was 62% and 75.3% for culture of all Malassezia species.

The semi-quantitative evaluation of otic cytology is controversial, especially regarding the amount of yeast per field associated with disease, some authors (19) suggest counts greater than 10 cells per field as indicative of disease, while others propose counts less than 5 cells per field (8,18,20,21), however other researchers indicate that the amount of yeast is directly related to the severity of the otitis (2). Given that the samples analyzed in this study were from animals clinically diagnosed with external otitis, these were considered positive if cytology showed 1 + and were correlated with positive cultures.

Although M. pachydermatis is frequently isolated from external otitis processes, there is not consensous regarding its prevalence as an etiologic agent of the same, being reported between 5.12% and 76.5% (5,19,20). In studies done by Boehriger (22) they reported a prevalence of 62% for cytology and 49% by culture (morphological macro/ microscopic and Sabouraud agar growth without lipid supplement), the difference between these data could be due to the methodology used in this study, since specific metabolic test were performed which allowed to identify M. pachydermatis by 31.1% and M. furfur in 12.6%.

Other Malassezia species reported in external otitis processes in dogs have been M. furfur with 3% and M. obtusa by 1.5% (8) which differs from the findings in this study where the prevalence of the first was 12.6%, while 56.3% of isolates could not be classified to species level because of atypical reactions in biochemical tests as stated by Crespo et al (9). It is important to note that most studies aimed to the identification of the etiologic agent of otitis processes were performed in dogs using culture media without lipidic supplements, limiting the grow of lipid-dependant species.

(37/119) fue clasificado como M. pachydermatis, 12.6% (15/119) como M. furfur y el 56.3% (67/119) correspondió a Malassezia spp. En los frotis correspondientes se observaron diferentes hallazgos citológicos (Tabla 2)

La concordancia observada entre citología ótica positiva para Malassezia Vs. Cultivo positivo fue de 0.76 y el índice Kappa fue 0.448 (95% CI 0.30 a 0.60) lo cual representa una fuerza moderada de acuerdo entre las dos técnicas.

DISCUSIÓN

De las 158 muestras evaluadas, la positividad detectada mediante citología fue de 62% y 75.3% por cultivo para todas las especies de Malassezia.

La evaluación semicuantitativa de la citología ótica es controversial, especialmente en cuanto a la cantidad de levaduras por campo asociadas a enfermedad, algunos autores (19) sugieren recuentos mayores a 10 células por campo como indicativo de enfermedad, mientras otros proponen conteos inferiores a 5 células por campo (8,18,20,21), sin embargo otros investigadores indican que la cantidad de levaduras está directamente relacionada con la severidad de la otitis (2). Dado que las muestras analizadas en este estudio fueron de animales diagnosticados clínicamente con otitis externa, éstos fueron considerados positivos si la citología presentó 1+ y se correlacionaron con cultivos positivos.

Aunque M. pachydermatis es frecuentemente aislada de procesos de otitis externa, no hay consenso respecto a su prevalencia como agente etiológico de la misma, encontrándose reportes entre 5.12% y 76.5% (5,19,20). En estudios realizados por Boehriger (22) se reportó una prevalencia de 62% para citología y 49% para cultivo (caracterización morfológica macro/microscópica y crecimiento en agar sabouraud sin suplemento lipídico), la diferencia entre estos datos puede deberse a la metodología utilizada en este estudio, dado que se llevaron acabo pruebas metabólicas específicas para identificar M. pachydermatis en un 31.1% y M. furfur en el 12.6%.

Otras especies de Malassezia reportadas en procesos de otitis externa en caninos han sido del 3% para M. furfur y para M. obtusa de 1.5% (8) lo que difiere de lo encontrado en este estudio donde la prevalencia para la primera fue de 12.6%, mientras el 56.3% de los aislamientos no pudieron ser clasificados hasta especie debido a las reacciones atípicas en las pruebas bioquímicas como lo establecen Crespo et al (9). Es importante tener en cuenta que la mayoría de los estudios orientados a la identificación de este agente etiológico en los procesos de otitis en



Concerning the two techniques, the results of the test showed that Kappa value and concordance test were similar to the ones reported by Boehringer (22), who found a concordance of 0.78, with a kappa of 0.56 (0.40-0.50), indicating that the tests have moderate agreement.

In conclusion, due to the complexity to identify the etiological agents involved in external otitis and considering that Malassezia is a commensal organism potentially pathogen, the use of a diagnostic test is not enough (9, 22) to establish its participation as a cause of disease, especially when there is no response to therapy (8).

Conflict of interest

The authors declare that they have no conflict of interest.

Acknowledgements

Authors would like to thank to research vice-rectory of the Pontificia Universidad Javeriana for funding.

caninos se realizan utilizando medios de cultivo sin los suplementos lipídicos limitando el crecimiento de especies lipodependientes.

Con relación a las dos técnicas, los resultados de la prueba mostraron que el valor Kappa y la prueba de concordancia fueron similares a los reportados por Boehringer (22) quien encontró una concordancia de 0.78, con Kappa de 0.56 (0.40–0.50), indicando que las pruebas tienen un acuerdo moderado.

En conclusión, debido a la complejidad para identificar los agentes etiológicos involucrados en otitis externa y considerando que Malassezia es un organismo comensal potencialmente patógeno, el uso de una prueba diagnóstica no es suficiente (9,22) para establecer su participación como agente causal de la enfermedad, especialmente cuando no hay respuesta a la terapia (8).

Conflicto de interés

Los autores declaran que no tiene conflicto de interés.

Agradecimiento

Los autores quisieran agradecer a la vicerrectoría de investigación de la Pontificia Universidad Javeriana por su financiamiento.

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ORIGINAL


Effects of Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) age and different forage: concentrate ratios on methanogenesis

Efecto de la edad del pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) y la relación forraje: concentrado sobre la metanogénesis

John Ramírez,1 M.Sc, Sandra Posada O,1* Ph.D, Ricardo Noguera,1 Ph.D.

1Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Grupo de Investigación en Ciencias Agrarias-GRICA, AA 1226, Medellín, Colombia. *Correspondencia: [email protected]


ABSTRACT

Objective: To evaluate the effect of Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) harvested at two different ages and three forage: concentrate supplement ratios (F/C) on methane (CH4) production, dry matter digestibility (DMD), and fermentation profile using the in vitro gas production technique. Materials and methods: six treatments, resulting from the combination of pasture age (30 or 60 days) and F/C (100/0, 75/25, or 50/50) were evaluated using a 2x3 factorial design. The response variables were measured 6, 12, 24 and 48 hours after incubation. A repeated-measure over time design was used to analyze the data, and differences between means were determined with the LSMEANS procedure of SAS. Results: the youngest grass (30 days) was more digestible, produced less CH4 per gram of digestible dry matter (dDM) and more total volatile fatty acids (VFA) compared to the oldest grass (60 days; p <0.05). Reductions of the F/C ratio increased DMD and CH4 production per gram of dDM (p<0.05) but had no significant effect on VFA concentration (p>0.05). Conclusions: under in vitro conditions and pH close to neutrality, the older grass reduces DMD and increases CH4 production per gram of dDM, while a F/C reduction increases DMD and CH4 production per gram of dDM, which differs with reports conducted in vivo.

Key words: Carbohydrates, in vitro digestibility, grass maturity, methane production (Sources: CAB, USDA).

RESUMEN

Objetivo. Evaluar el efecto de la edad del pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) y de la relación forraje/suplemento (F/S) sobre la producción de metano (CH4), la digestibilidad de la materia seca (DMS) y el perfil de fermentación mediante la técnica in vitro de producción de gas. Materiales y métodos. Seis tratamientos, resultantes de la combinación de los factores edad del pasto (30 y 60 días) y relación F/S (100/0, 75/25 y 50/50), fueron evaluados bajo un diseño factorial 2x3. Las variables respuesta se midieron a las 6, 12, 24 y 48 horas de incubación. Para el análisis de los datos se empleó un diseño de medidas repetidas en el tiempo y las diferencias entre medias se determinaron con el procedimiento LSMEANS de SAS. Resultados. El pasto de menor edad (30 días) fue más digestible, produjo menos CH4 por gramo de materia seca digestible (MSd) y más ácidos grasos volátiles totales (AGV) que el pasto de mayor edad (60 días, p<0.05). La reducción en la relación F/S aumentó la DMS y la producción de CH4 por gramo de MSd (p<0.05), pero no tuvo efecto estadístico


4727

sobre la concentración de AGV (p>0.05). Conclusiones. Bajo condiciones in vitro, con pH próximo a la neutralidad, la mayor edad del pasto reduce la DMS y aumenta la producción de CH4 por gramo de MSd, mientras que la reducción en la relación F/S aumenta la DMS y la producción de CH4 por gramo de MSd, último hallazgo que contrasta con los reportes in vivo.

Palabras clave: Carbohidratos, digestibilidad in vitro, estado de madurez, producción de metano (Fuentes: CAB, USDA).

INTRODUCCIÓN

El metano (CH4) es uno de los principales productos de la fermentación ruminal y además de contribuir a las emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) representa entre 2 y 15% de la energía consumida por el rumiante (1). El CH4 es producido en el rumen por un grupo particular de microorganismos pertenecientes al dominio Archaea, los cuales usan hidrógeno (H2) para reducir el dióxido de carbono (CO2) a CH4, manteniendo una presión baja de H2 que favorece la fermentación de los alimentos (2).

En la mayoría de los sistemas especializados de producción lechera en Colombia se utiliza el pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) como base forrajera para la alimentación de los animales. Correa et al (3), reportaron que el pasto kikuyo posee contenidos medios de fibra detergente neutra (FDN), carbohidratos no estructurales (CNE) y proteína bruta (PB) de 58.1, 13.4 y 20.5% de la materia seca (MS), respectivamente, valores que fluctúan en función del manejo agronómico. Esta composición química hace que el pasto kikuyo presente limitaciones nutricionales que afectan la producción y calidad de la leche, siendo necesaria la utilización de suplementos que mejoren la disponibilidad de CNE y de energía en el rumen.

La utilización de suplementos concentrados en las dietas para rumiantes, las cuales están basadas en forrajes, está asociada con reducción en la emisión de CH4, lo cual fue evidenciado en el trabajo de Aguerre et al (4), donde el cambio en la relación forraje:concentrado (con base en la materia seca) de 47:53 a 68:32 incrementó la emisión de CH4 de 538 a 648 g/vaca/día. Diferentes tipos de carbohidratos modifican el perfil de ácidos grasos volátiles (AGV) y, por tanto, la producción de CH4. La degradación de la celulosa y el almidón conduce a la formación de glucosa, la cual se fermenta por diferentes vías, resultando en variable cantidad de H2. La producción de CH4 por unidad de alimento digerido depende de la cantidad de H2 formado, con base en la relación estequiométrica 4H2+CO2gCH4+2H2O. La formación de acetato y butirato resulta en la producción de 1 y 0.5 moles de CH4 por mol de glucosa fermentada, respectivamente; mientras que la formación de propionato requiere un ingreso neto de equivalentes reducidos, disminuyendo la producción de CH4. La fermentación de la fibra resulta en la producción preferente de acetato,

INTRODUCTION

Methane (CH4) is one of the main products of ruminal fermentation. It is considered a greenhouse gas (GHG) and represents between 2 and 15% of the energy consumed by ruminants (1). CH4 is produced in the rumen by a group of microorganisms of the Archaea domain, which use hydrogen (H2) to reduce carbon dioxide (CO2) to CH4, maintaining a low H2 pressure that favors fermentation processes (2).

Most dairy farms in Colombia are based on Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) as the main grazing grass for the animals. Average levels of neutral detergent fiber (NDF), nonstructural carbohydrates (NSC) and crude protein (CP) in Kikuyu are 58.1, 13.4, and 20.5%, respectively (on a dry matter bases (DM)) and fluctuate depending on the agronomic management (3). Because of its composition, Kikuyu grass presents nutritional constraints affecting milk yield and quality. Thus, supplements are commonly offered to improve the availability of NSC and energy in the rumen.

Feeding concentrate supplements to grazing ruminants is associated with a reduction of CH4 emissions. A change in the relationship feed: concentrate (DM bases) from 47: 53 to 68: 32 increased CH4 emissions from 538 to 648 g/cow/day (4). Different carbohydrates change the volatile fatty acids (VFA) profile and the production of CH4. Cellulose and starch degradation leads to glucose formation, which can be fermented in different pathways resulting in varying amounts of H2. The production of CH4 per unit of food digested depends on the amount of H2 formed, according to the stoichiometric ratio 4H2+CO2gCH4+2H2O. The formation of acetate and butyrate results in 1 and 0.5 moles of CH4 per mole of fermented glucose, respectively. On the other hand, propionate formation requires a net input of reduced equivalents, decreasing CH4 production. Fiber fermentation results in the preferential production of acetate, while feeding NSC increases the proportion of propionate (2). The objective of this study was to determine the effect of Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) harvested at two different ages and three forage: concentrate

Ramírez - Grass age and forage: concentrate ratio on methanogenesis


en tanto la alimentación con CNE aumenta la proporción de propionato (2). El objetivo del presente trabajo fue determinar como la producción de CH4, la digestibilidad de la MS (DMS) y el perfil de fermentación son afectados por la edad del pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) y la relación forraje:suplemento (F/S).


Localización. Las pruebas se realizaron en el Laboratorio de Investigación en Nutrición y Alimentación Animal de la Universidad de Antioquia, Medellín-Colombia.

Sustratos incubados y análisis químico. Los sustratos fueron pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), y un suplemento comercial para vacas en producción. El pasto fue cosechado en estadio vegetativo, a 10 cm sobre el nivel del suelo, a los 30 y 60 días de edad en la hacienda Betania, propiedad de la empresa SOLLA, S.A. Esta hacienda se encuentra ubicada en el municipio de Santa Rosa de Osos (Ant., Colombia), a 2460 msnm, presenta temperatura promedio de 18°C, variando entre 4°C y 27°C, humedad relativa correspondiente al 70% y precipitación media anual de 2400 mm, características correspondientes a un bosque muy húmedo montano bajo (bmh-MB). El pasto fue manejado bajo un sistema de pastoreo rotacional con fertilización química (190, 54,16 y 9 kg de N, P, K y S/Ha/año).

Las muestras de pasto fueron secadas en estufa de ventilación forzada a 65°C por 48 horas. Estas muestras y las de suplemento fueron molidas a 1 mm para su análisis químico, que incluyó MS, PB, extracto etéreo (EE), cenizas (Ce) (5), FDN (6), fibra detergente ácida (FDA), lignina detergente ácida (LDA) (7) y energía bruta (EB), última determinación realizada en bomba calorimétrica adiabática (IKA C5000, Rhys International, Ltd., United Kingdom). Los valores de CNE fueron obtenidos por la ecuación, CNE= 100-(%PB+%EE+%Ce+%FDN) (8). La descripción química de los sustratos se presenta en la tabla 1.

Tratamientos experimentales. Se evaluaron seis tratamientos, resultantes de la combinación de los factores edad del pasto (30 y 60 días) y nivel de inclusión de suplemento concentrado (0, 25 y 50%), en un diseño factorial 2x3. Los tratamientos fueron: K30-100/0, K30-75/25, K30-50/50, K60-100/0, K60-75/25 y K60-50/50. K30 y K60 corresponden a la edad del pasto kikuyo y 100/0, 75/25 y 50/50 a la relación F/S (con base en la materia seca). Cada tratamiento contó con tres repeticiones, correspondientes a tres fuentes de inóculo ruminal, cada uno obtenido de un animal diferente.

supplement ratios (F/C) on methane (CH4) production, dry matter digestibility (DMD), and fermentation profile using the in vitro gas production technique.


Location. The study was conducted at the Nutrition and Animal Feeding Laboratory facilities of Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia.

Substrates and chemical analysis. The substrates tested were Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) and a commercial concentrate supplement formulated for dairy cows. The grass was harvested at Betania farm, owned by Solla SA Company, during vegetative stage by cutting it 10 cm above the ground at 30 and 60 days of age. This farm is located in Santa Rosa de Osos municipality (Ant., Colombia) at 2460 m.a.s.l., with 18°C average temperature (range: 4 to 27°C), 70% relative humidity and 2400 mm average annual precipitation, corresponding to a lower montane wet forest (LMWF). The pasture was managed under a rotational grazing system with chemical fertilization (190, 54, 16, and 9 kg N, P, K, and S/ha/year).

Grass samples were dried in forced air oven at 65°C for 48 hours. Grass and supplement samples were ground to 1 mm for chemical analysis including DM, CP, ether extract (EE), ash (5), NDF (6), acid detergent fiber (ADF), acid detergent lignin (ADL) (7) and gross energy (GE). The GE was assessed in an adiabatic bomb calorimeter (IKA C5000, Rhys International Ltd., United Kingdom). NSC values were obtained by the equation, NSC=100-(%CP+%EE+%Ash %NDF) (8). The chemical description of substrates is presented in table 1.

Table 1. Chemical composition of Kikuyo grass (Pennisetum clandestinum) concentrate supplement used in the study.

Fraction (% DM) Kikuyo (30 d) Kikuyo (60 d) Supplement

CPEEAshNDFADFADLNSCNSC/NDFGE Mcal/kg DM

25.44.19.053.829.75.47.70.144.4

17.03.212.061.634.06.56.20.104.1

16.13.05.111.16.91.364.75.834.3

4729

Técnica de producción de gases. La técnica de producción de gases fue realizada siguiendo los protocolos de Posada et al (9). En cada frasco (de 100 ml) se adicionó 0.5 g de sustrato molido a 1 mm (pasto y/o suplemento), de acuerdo con la participación porcentual de cada alimento en los tratamientos experimentales.

Los inóculos fueron obtenidos de tres vacas Holstein Fresian adultas pertenecientes a la hacienda La Montaña, propiedad de la Universidad de Antioquia (San Pedro de los Milagros, Ant., Colombia). La dieta de los animales donadores consistió de pasto kikuyo de 42 días de edad, sal mineralizada y agua a voluntad. Los inóculos se colectaron en la mañana (6:00 am) y su transporte hasta el laboratorio se realizó en termos precalentados con agua a 40ºC. En el laboratorio, los inóculos fueron filtrados a través de una malla de algodón, gaseados con CO2 y conservados en baño maría durante el proceso de inoculación.

La solución tampón (buffer) se preparó de acuerdo con las recomendaciones de McDougall (10), se utilizó una relación buffer/inóculo de 9/1 (45/5 ml/ml) y la mezcla fue acidificada con ácido cítrico (1M) hasta obtener pH 6.5 (11). Los frascos fueron cerrados con tapones de caucho y almacenados en estufa de ventilación forzada a 39°C durante todo el proceso fermentativo.

Determinación de la producción de gas y de CH4. La producción total de gas y de CH4 fue determinada luego de 6, 12, 24 y 48 h de incubación. La presión generada en los frascos de incubación se midió con un transductor digital (Ashcroft 2089QG - Precision Digital Test Gauges, USA) y el valor obtenido (psi) fue transformado a volumen (ml) con la ecuación.

Y = -0.1833+5.2098X+0.0598X2 (9).

Luego de la lectura de presión, el gas generado fue retirado de los frascos usando jeringa plástica y almacenado en bolsas plásticas para posterior análisis de CH4. Para tal efecto, muestras de 100 µl de gas fueron tomadas con una jeringa hermética para gas e inyectadas manualmente en un cromatógrafo de gases (Thermo TRACE GC UltraTM, Thermo Scientific, USA) equipado con un detector de ionización de llama (FID). Las condiciones cromatográficas correspondieron a una columna apolar de 30 m, 0.32 mm y 0.25 μm, temperatura del puerto de inyección 200°C, modo de inyección split (división) 50:1, temperatura del detector 250°C, temperatura del horno 30°C (5 min) hasta alcanzar 200°C (30°C/min) y helio como gas de arrastre (1.0 ml/min). Los datos de concentración de metano fueron procesados de acuerdo con la descripción de López y Newbold (12). La producción de CH4 (ml) fue calculada a partir del volumen total de gas (ml) y la concentración de CH4. La producción de gas y de CH4 (ml) se expresó por gramo de materia seca incubada (MSi) y por gramo de materia seca

Experimental treatments. Six treatments, resulting from the combination of pasture age (30 to 60 days) and inclusion level of concentrate supplement (0, 25 and 50%) were evaluated in a 2x3 factorial design. The treatments were: K30-100/0, K30-75/25, K30-50/50, K60-100/0, K60-75/25, and K60-50/50. Descriptors K30 and K60 correspond to Kikuyu age, while 100/0, 75/25 and 50/50 to the F/C ratio (DM basis). Treatments were replicated three times, corresponding to three sources of ruminal inoculum, each obtained from a different animal.

Gas production technique. This technique was conducted following protocols by Posada et al (9). Grass and concentrate supplement were ground to 1 mm and added (0.5 g) to each flask (100 ml) according to the percentages set for each treatment.

The inocula were obtained from three Holstein Friesian adult cows from La Montaña farm, owned by Universidad de Antioquia (San Pedro de los Milagros, Ant., Colombia). The cows were grazing on 42 days old Kikuyu and were provided mineralized salt and water ad libitum. The inocula were collected in the morning (6:00 AM) and transported in thermos preheated with 40°C water to the laboratory, where they were filtered through a cotton mesh, gassed with CO2 and kept in a warm water bath during inoculation.

Preparation of the buffer solution followed recommendations by McDougall (10), using a 9/1 (45/5 ml/ml) buffer/inoculum ratio and (1M) citric acid was added to the mixture to obtain pH 6.5 (11). The flasks were sealed with rubber stoppers and stored in a forced-air oven at 39 °C throughout the fermentation process.

Total gas and CH4. Total gas and CH4 production was determined at 6, 12, 24 and 48 h of incubation. Gas pressure generated in the incubation flasks was measured with a digital transducer (Ashcroft 2089QG - Precision Digital Test Gauges, Stratford, CT, USA) and the PSI readings were converted to volume (ml) using the equation

Y = -0.1833 + 0.0598 X2 (9).

After reading the pressure, the generated gas was removed from the flasks using a plastic syringe and then stored in plastic bags for later CH4 analysis. For this purpose, gas samples (100 µl) were taken with a gas-tight syringe and manually injected into a gas chromatograph (Thermo TRACE GC UltraTM, Thermo Scientific, USA) equipped with a flame

Ramírez - Grass age and forage/concentrate on methanogenesis


digestible (MSd). La producción de CH4 fue también expresada como porcentaje de la EB incubada (EBi) y energía digestible incubada (EDi), asignando al CH4 un valor calórico de 9.45 Kcal/L (13).

Determinación de la digestibilidad de la materia seca. En los horarios definidos para las lecturas de presión de gas, se determinó la DMS por gravimetría. Para esto, el contenido de los frascos de incubación se filtró utilizando crisoles de vidrio (porosidad 1, 100 – 160 μm) con ayuda de bomba de vacío. El conjunto crisol-residuo fue secado a 60°C durante 48 horas en estufa de ventilación forzada y posteriomente pesado.

Determinación del perfil de fermentación y pH. El valor de pH y la concentración de los ácidos acético, propiónico y butírico se determinaron en el líquido resultante de la filtración. Este líquido se preservó mediante la adición de ácido sulfúrico (98% v/v) hasta alcanzar un pH 2. Antes de la acidificación, se determinó el pH con pH-metro digital (Handylab pH 1, Schott® Instruments, SI Analytics GmbH, Germany).

Para la determinación de AGV, muestras de 1 μl de líquido se inyectaron en un cromatógrafo de gases (Thermo TRACE GC UltraTM, Thermo Scientific, USA) equipado con una columna de 30 m, 0.32 mm y 0.25 μm. La temperaturas fueron 300°C (detector FID), 210°C (inyector) y 68°C (1 min), rampa de 10°C/min hasta 140°C (1 min), rampa de 40°C/min hasta 200°C (1 min) (horno). El modo de inyección fue split y como gas de arrastre se utilizó helio (2.5 ml/min).

Análisis estadístico. Se realizó un análisis de medidas repetidas en el tiempo a través de PROC MIXED de SAS (14). Los efectos fijos en el modelo correspondieron a la edad del pasto, la relación F/S y el tiempo de incubación; el efecto aleatorio estuvo representado por el inoculo ruminal. Las medias de tratamientos fueron comparadas con el procedimiento PROC LSMEANS de SAS (14).

RESULTADOS

En la tabla 2 se presenta la composición química de los diferentes tratamientos. Aquellos que incluyeron el pasto de 30 días de edad, respecto al de 60 días, presentaron mayor contenido de PB y CNE y menor porcentaje de FDN, FDA y LDA. A medida que se incrementó la participación de suplemento en la mezcla, aumentó la relación CNE/FDN.

En las tablas 3 y 4 se observa que la edad del pasto afectó significativamente (p<0.05) la DMS, la producción acumulada de gas y de CH4 por gramo de MSd y el porcentaje de ED

ionization detector (FID). The chromatographic conditions corresponded to a 30 m nonpolar column, 0.32 mm and 0.25 μm, 200°C injection port temperature, 50: 1 split injection mode, 250°C detector temperature, 30°C (5 min) up to 200°C (30°C/min) oven temperature, and helium as a carrier gas (1.0 ml/min). CH4 data were processed according to Lopez and Newbold (12). CH4 production (ml) was calculated from total gas volume (ml) and CH4 concentration. Gas and CH4 production (ml) was expressed per gram of incubated dry matter (iDM) and per gram of digestible dry matter (dDM). CH4 production was also expressed as a percentage of the incubated GE (iGE) and incubated digestible energy (iDE), giving CH4 a caloric value of 9.45 kcal/L (13).

Dry matter digestibility. DMD was determined gravimetrically at the times of gas pressure readings by filtering the incubation flasks contents using glass crucibles (porosity 1, 100-160 μm) and a vacuum pump. The residues were dried in the crucibles at 60°C for 48 hours in a forced-air oven and weighed.

Fermentation profile and pH. The pH and concentration of acetic, propionic and butyric acids were determined in the liquid after filtration. This liquid was preserved by adding sulfuric acid (98% v/v) until pH 2 was reached. The pH was determined with digital pH meter (Handylab pH 1, Schott® Instruments, SI Analytics GmbH, Germany) before acidification.

To determine VFA, liquid samples (1 μl) were injected into a gas chromatograph (Thermo TRACE GC UltraTM, Thermo Scientific, USA) equipped with a 30 m, 0.32 mm and 0.25 microns column. Temperatures were 300°C (FID), 210°C (inlet), and 68°C (1 min), ramp 10°C/min until reaching 140°C (1 min), ramp 40°C/min until reaching 200°C (1 min) (oven). The mode of injection was split and helium was used as a carrier gas (2.5 ml/min).

Statistical analysis. A repeated measures analysis was performed using PROC MIXED of SAS (14). The fixed effects of the model were grass, F/C, and incubation time; the random effect was the ruminal inoculum. Treatment means were compared using PROC LSMEANS of SAS (14).

RESULTS

Table 2 shows the chemical composition of the treatments. The 30 days-old grass had higher CP and NSC content, but lower NDF, ADF and ADL compared to 60 days. The NSC/NDF ratio increased as concentrate increased in the mix.

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incubada que se transformó en CH4. Al término de las 48 horas de incubación, el pasto de 30 días de edad, respecto el de 60 días, presentó mayor DMS (68.97 vs. 65.30%), menor producción de gas (463.56 vs. 499.27 ml) y de CH4 (101.37 vs. 109.97 ml) por gramo de MSd y menor producción de CH4 como porcentaje de la ED incubada (22.83 vs. 24.70%).

La relación F/S afectó significativamente (p<0.05) todas las variables analizadas. En el intervalo entre 0 y 48 horas de incubación el factor relación F/S presentó un comportamiento creciente en las medias conforme se redujo la participación de forraje y se aumentó la de suplemento. La producción media de CH4 en este intervalo (con independencia de la edad del pasto) fue 57.40, 73.70 y 81.85 ml (por cada gramo de MSi) y 96.15, 107.15 y 113.70 ml (por cada gramo de MSd) para relaciones F/S de 100/0, 75/25 y 50/50, respectivamente. Para estas mismas proporciones, la producción media de CH4 correspondió a 12.50, 16.50 y 18.80% de la EB incubada y, 21.30, 23.80 y 26.20% de la ED incubada, respectivamente. Al término de la incubación la DMS fue 60.55, 68.85 y 72.00% para las relaciones F/S 100/0, 75/25 y 50/50, respectivamente. El comportamiento expresado por estas variables también se observó cuando se contrastaron las medias correspondientes a las diferentes proporciones F/S al interior del factor edad del pasto (pasto de la misma edad).

En la tabla 5 se observa que la edad del pasto afectó significativamente (p<0.05) la concentración de acético, propiónico y butírico,

Tables 3 and 4 show that grass age significantly (p<0.05) affected DMD, cumulative production of gas and CH4 per gram of dDM, and the percentage of iDE transformed into CH4. Following 48 hours of incubation, the 30 days old grass showed greater DMD (68.97 vs. 65.30%), decreased production of gas (463.56 vs. 499.27 ml) and CH4 (101.37 ml vs. 109.97) per gram of dDM, and lower production of CH4 as a percentage of iDE (22.83 vs. 24.70%) compared with the 60 days grass.

The F/C ratio significantly affected all variables (p<0.05). The F/C presented a growing trend as grass was reduced and concentrate increased between 0 and 48 hours of incubation. The average

Table 2. Chem i c a l c ompos i t i o n o f k i k uyo grass(Pennisetum clandestinum) aged 30 or 60 days and mixed with a concentrate supplement 1.

Fraction (% DM)K30 K60

100/0 75/25 50/50 100/0 75/25 50/50

CP 25.4 23.1 20.6 17.0 16.7 16.5

EE 4.1 3.8 3.6 3.2 3.2 3.1

Ash 9.0 8.0 7.1 12.0 10.3 8.6

NDF 53.8 43.1 32.5 61.6 49.0 36.4

ADF 29.7 24.0 18.3 34.0 27.2 20.5

ADL 5,4 4.4 3.4 6.5 5.2 3.9

NSC 7.7 22.0 36.2 6.2 20.8 35.4

NSC/NDF 0.14 0.51 1.11 0.10 0.42 0.97

GE Mcal/kg DM 4.4 4.4 4.4 4.1 4.2 4.2

1Ingredients: Corn, malt germ, wheat bran, rice flour, sunflower meal, soybean meal, molasses, salt, premix, and calcium carbonate.

Table 3. Cumulative gas production (hours post-incubation) and dry matter digestibility of mixtures between 30 or 60 days old Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) with concentrate for three forage: concentrate proportions. Values in parentheses are standard deviations.

VariableInterval K30 K60(hours) 100/0 75/25 50/50 100/0 75/25 50/50

Gas production (ml/g iDM)0-6 48.7 (2.3)b 61.4 (4.8)a 69.5 (2.5)a 52.9 (1.6)b 64.3 (1.4)ab 71.1 (4.1)a

0-12 104.9 (8.2)c 126.1 (8.9)b 151.8 (6.5)a 99.7 (2.4)c 123.7 (4.1)b 145.9 (3.2)a

0-24 197.8 (10.9)c 240.1 (5.7)b 275.4 (10)a 188.4 (8.1)c 232.1 (5)b 269.1 (5.5)a

0-48 281 (14)c 325 (2.1)b 354.3 (6)a 283 (17.4)c 332.2 (9.8)b 358.2 (3.3)a

Dry matter digestibility (%)0-6 20.5 (0.6) 23.0 (5.4) 25.6 (2,8) 20,3 (1,5) 20,9 (2.3) 25.7 (5.6)

0-12 30.8 (1.7)bA 35,9 (1.8)ab 40.1 (1.4)a 25 (0.4)bB 31.4 (2.4)a 35.9 (2.5)a

0-24 52.4 (5.9)bA 61.6 (4.9)aA 66 (3.9)a 42.2 (2.8)cB 52.5 (1.3)bB 61.9 (1.7)a

0-48 65.9 (0.5)bA 69.1 (3.2)ab 71.9 (3.7)a 55.2 (7.2)bB 68.6 (1.2)a 72.1 (1.7)a

Gas production (ml/g dDM)0-6 237.7 (18.1) 275.3 (54.6) 273.5 (29.2) 261.0 (12) 309.4 (30.3) 288.1 (78.1)

0-12 342.4 (46.3)B 351.9 (34.3) 379.6 (26.6) 398.4 (15)A 394.9 (23.2) 408.0 (33.9)

0-24 380.7 (48.8)B 390.9 (22.5) 417.6 (14.4) 447.4 (19.5)A 442.5 (20.4) 434.5 (9.6)

0-48 426.1 (21.6)bB 471.1 (20.6)a 493.5 (21)a 516.5 (39.1)A 484.4 (21.2) 496.9 (16.1)

abc, lowercase letters in the same row indicate significant difference between means of different F/S ratio for a same grass age (p<0.05).AB, capital letters in the same row indicate significant difference between grass age means for the same F/S ratio (p<0.05).iDM= incubated dry matter; dDM = digestible dry matter.



con valores más altos para el pasto de 30 días de edad, 117.87, 36.83 y 23.60 mmol/L, respectivamente, comparado con el pasto de 60 días, 104.67, 33.40 y 22.47 mmol/L, respectivamente. La relación F/S no tuvo efecto estadístico (p>0.05) sobre la concentración de AGV y la relación acetato/propionato (A/P), pero sí afectó significativamente el pH (p<0.05). Se observó que los tratamientos con mayor adición de suplemento presentaron menores valores de pH, 6.50 y 6.52 para relaciones 50/50 y 75/25, respectivamente, en contraste con 6.58 para la relación 100/0. Para las variables que se presentan en las tablas 3, 4 y 5, la interacción E*F/S no fue significativa (p >0.05).

DISCUSIÓN

Efecto de la edad del pasto sobre la DMS y la producción de gas y de CH4. Caro y Correa (15) reportaron un incremento de 7.8% en la concentración de FDN y una reducción de 2.7% en el contenido de CNE cuando compararon pasto kikuyo cosechado a los 32 y 58 días de rebrote. En el pasto del presente estudio, el aumento en la concentración de FDN y la reducción en el contenido de CNE superó el reporte de los autores (Tabla 1). Es de esperarse que la calidad de los forrajes disminuya con la madurez, lo cual fue verificado por Caro y Correa (15), quienes encontraron que los cambios en la composición química afectaron la digestibilidad in situ a las 24h de incubación; siendo 6.7% más alta para el pasto

CH4 production in this time frame, regardless of grass age, was 57.40, 73.70, and 81.85 ml (per gram of iDM) and 96.15, 107.15 and 113.70 ml (per gram of dDM) for 100/0, 75/25, and 50/50 F/C ratios, respectively. For the same ratios, the average CH4 production corresponded to 12.50, 16.50 and 18.80% of the iGE, and 21.30, 23.80 and 26.20% of the iDE, respectively. After incubation, DMD was 60.55, 68.85 and 72.00% for 100/0, 75/25 and 50/50 F/C ratios, respectively. Results behaved in a similar way when the means of different F/C rates were compared inside each grass age.

Table 5 shows that grass age significantly affected (p<0.05) acetic, propionic and butyric acid concentration, with the highest values for the young (30 days) compared with the 60 days old grass (117.87, 36.83 and 23.60 vs. 104.67, 33.40 and 22.47 mmol/L, respectively). The F/C ratio had no statistical effect on VFA concentration or the acetate/propionate ratio (A/P) (p>0.05), but it significantly affected pH (p<0.05). Treatments including more concentrate had lower pH values (6.50 and 6.52 for 50/50 and 75/25 ratios, respectively, compared with 6.58 for the 100/0 ratio). The grass age*F/C interaction was not significant (p>0.05) for the variables presented in tables 3, 4 and 5.

DISCUSSION

Effect of grass age on production of gas, CH4, and DMD. Caro and Correa (15) reported a 7.8% increase in NDF and 2.7% reduction

Table 4. Cumulative production of methane (hours post-incubation) from mixtures of 30 and 60 days old Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) with concentrate supplement in three forage/supplement proportions. Values in parentheses are standard deviations.

VariableInterval K30 K60(hours) 100/0 75/25 50/50 100/0 75/25 50/50

CH4 Production (ml/g DMi) 0-6 5.6 (0.5)b 8.3 (1.1)ab 10.4 (0.4)a 7.0 (1.6)b 10.1 (1.3)ab 11.4 (1.8)a

0-12 18.9 (2.3)b 25.4 (1.2)a 29.0 (3.3)a 17.0 (1.8)c 25.9 (1.2)b 32.1 (2.6)a

0-24 41.1 (1.9)c 53.9 (1.3)b 60.4 (2.8)aB 40.2 (3.4)c 54.3 (1.8)b 65.6 (2.4)aA

0-48 57.8 (2.8)c 73.2 (1.6)b 79.2 (3.2)a 57.0 (3.5)c 74.2 (2)b 84.5 (4.6)a

CH4 production (ml/g dDM)0-6 27.5 (1.5)b 36.6 (3.3)ab 40.9 (3.7)a 34.0 (5.9)b 48.7 (7.2)a 46.2 (13.8)ab

0-12 61.9 (11.2) 71.0 (6.6) 72.2 (7.3)B 68.0 (8)b 82.6 (2.5)a 89.5 (7.6)aA

0-24 79.2 (9.9)B 87.8 (5.4)B 91.8 (8.1)B 95.3 (4.9)A 103.5 (5.6)A 105.9 (5.2)A

0-48 87.6 (4.6)bB 106.2 (6.6)a 110.3 (7.9)a 104.7 (17.6)A 108.1 (3.7) 117.1 (6.3)iGE transformed into CH4 (%) 0-6 1.2 (0.1)b 1.9 (0.3)ab 2.4 (0.1)a 1.5 (0.4)b 2.3 (0.3)ab 2.6 (0.4)a

0-12 4.1 (0.5)c 5.7 (0.3)b 6.7 (0.8)a 3.7 (0.4)c 5.8 (0.3)b 7.4 (0.6)a

0-24 8.9 (0.4)c 12.0 (0.3)b 13.9 (0.6)aB 8.8 (0.7)c 12.2 (0.4)b 15.1 (0.6)aA

0-48 12.6 (0.6)c 16.4 (0.4)b 18.2 (0.7)aB 12.4 (0.8)c 16.6 (0.4)b 19.4 (1.1)aA

iDE transformed into CH4 (%) 0-6 5.8 (0.3) 8.2 (0.9) 9.7 (0.8) 7.4 (1.1) 11.1 (2) 10.5 (2.8)

0-12 13.3 (2.9) 16.0 (1.7) 13.2 (5.9)B 15 (2)b 17.8 (0.3)ab 20.6 (2.6)aA

0-24 17.5 (2.5)b 19.9 (1.6)ab 22.1 (3.2)a 20.6 (1.7) 23.0 (1.6) 23.8 (0.8)

0-48 19.7 (0.9)b 23.5 (0.9)ab 25.3 (1.9)a 22.9 (4.8)b 24.1 (1.4)ab 27.1 (1.9)a

abc, lowercase letters in the same row indicate significant difference between means of different F/S ratios for a same grass age (p<0.05).AB, capital letters in the same row indicate significant difference between grass age means for the same F/S ratio (p<0.05).iDM= incubated dry matter; dDM = digestible dry matter; iGE= incubated gross energy; iDE= incubated digestible energy.

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de 32 días de rebrote en comparación con el de 58 días. Los resultados del presente trabajo confirman los hallazgos de los autores, toda vez que a las 24 horas de incubación la DMS fue superior para el pasto de menor edad (Tabla 3). Dentro de una misma especie, el aumento en la edad de cosecha se asocia con mayor contenido de FDN, FDA y LDA, menor contenido de PB (Tabla 1) y reducción en la DMS. Chaves et al (16) concluyeron que la producción de CH4 de novillas en pastoreo fue afectada significativamente por el tipo de pasto, como reflejo de las diferencias en madurez y composición química de los forrajes analizados, confirmando el concepto que la producción de CH4 es, principalmente, una función de la cantidad de pared celular digerida en el rumen. En el presente trabajo, la edad del pasto afectó significativamente la producción de gas y de CH4 cuando estas variables fueron expresadas por gramo de MSd y el CH4 como porcentaje de la EDi (Tabla 3 y 4). La importancia de expresar la producción de CH4 en relación con la MSd, y no con la MSi, se confirmó en el trabajo de Sun et al (17), quienes reportaron que los forrajes Cichorium intybus y Lolium perenne tuvieron similar producción de CH4 en función de la MSi, a pesar de sus diferencias en el contendido de FDN, 28.1 y 49.9% respectivamente, y la mayor digestibilidad del primero. En el presente trabajo, el tratamiento K30-100/0 tuvo menor FDN, FDA y LDA (Tabla 2), mayor digestibilidad acumulada a las 48 horas (p<0.05), e igual producción de gas y CH4 por

in NSC for Kikuyu grass harvested at 32 vs. 58 days of regrowth. In the present study, NDF increase and NSC reduction exceeded the figures reported by those researchers (Table 1). It is expected that forage quality decrease with maturity, which was verified by Caro and Correa (15), who found that changes in the chemical composition affect in situ digestibility at 24h incubation. They reported a 6.7% increase in grass digestibility after 32 days of regrowth compared to 58 days. This is in agreement with the present study, where DMD at 24 hours of incubation was higher for the younger grass (Table 3). Within species, increased harvest age is associated with higher NDF, ADF and ADL levels, and lower CP content (Table 1) as well as DMD reduction. Chaves et al (16) concluded that CH4 produced by grazing heifers was significantly affected by the type of grass, reflecting differences in maturity and chemical composition and confirming that CH4 production is primarily a function of the amount of cell wall digested in the rumen. In the present study, pasture age significantly affected gas and CH4 production (per gram of dDM) and CH4 (as percent of iDE) (Tables 3 and 4). According to Sun et al (17), CH4 production should be expressed in relation to dDM, instead of iDM. They reported that Cichorium intybus and Lolium perenne fodder had similar CH4 production on iDM basis despite their differences in NDF (28.1

Table 5. Fermentation profile and pH from mixtures of 30 and 60 days old Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) with concentrate supplement in three forage/supplement proportions. Values in parentheses are standard deviations.

Interval K30 K60

(hours) 100/0 75/25 50/50 100/0 75/25 50/50Acetate (mmol/L) 0-6 110.7 (7)A 94.9 (6.2) 102.8 (12.7)A 86.6 (14.9)B 92.7 (4.6) 76.5 (14.9)B

0-12 102.1 (4.6) 99.8 (7.1) 86.7 (15.6) 84.2 (25.7) 79.0 (16.2) 87.2 (6.4)0-24 96.6 (13) 90.6 (27.6) 108.8 (14.5) 92.7 (9.8) 83.2 (20.4) 98.2 (10)0-48 121.1 (6) 101.8 (21.3) 120.7 (20.4) 108.2 (17.1) 107.4 (7.7) 98.4 (8)

Propionate (mmol/L) 0-6 33.4 (0.5) 31 (1.8) 32.1 (2.9)A 29.7 (3.7) 29.0 (0.2) 27.5 (3.1)B

0-12 32.8 (0.5) 32.6 (1.5)A 30.1 (3.5) 28.6 (4.2) 27.2 (1.8)B 29.1 (1.4)0-24 32.6 (2.2) 32.0 (4.7) 35.5 (2.8) 30.7 (2.1) 29.2 (3) 33.1 (1.9)0-48 39.2 (0.6)A 33.7 (4) 37.6 (3.8)A 34.3 (3.8)B 32.9 (1.7) 33 (0.7)B

Butyrate (mmol/L) 0-6 22.1 (0.5) 21.0 (0.9) 22.3 (1.5)A 20.9 (2.4) 20.9 (0.1) 19.6 (1.5)B

0-12 22.6 (0.8) 22.3 (0.4)A 20.0 (1) 20.3 (2.5) 19.8 (1.2)B 20.6 (1)0-24 21.6 (2.2) 22.3 (2.7) 23.5 (1.3) 20.4 (1.1) 20.6 (1.6) 22.9 (1.5)0-48 23.1 (0.5) 22.0 (1.4) 25.7 (1.9)A 22.2 (1.7) 22.3 (0.7) 22.9 (0.8)B

Acetate/Propionate0-6 3.3 (0.2) 3.1 (0) 3.2 (0.1) 2.9 (0.1) 3.2 (0.1) 2.8 (0.2)0-12 3.1 (0.1) 3.1 (0.2) 2.9 (0.2) 2.9 (0.6) 2.9 (0.4) 3.0 (0.1)0-24 3.0 (0.2) 2.8 (0.5) 3.1 (0.2) 3.0 (0.2) 2.8 (0.4) 3.0 (0.2)0-48 3.3 (0.1) 3.0 (0.3) 3.2 (0.2) 3.1 (0.2) 3.3 (0.1) 3.0 (0.2)

pH 0-6 7.04 (0.03) 7 (0.04) 7.02 (0.05)A 6.99 (0.02) 6.99 (0.04) 6.95 (0.08)B

0-12 6.75 (0.02)a 6.71 (0.03)ab 6.67 (0.02)b 6.75 (0.03)a 6.72 (0.02)ab 6.67 (0.02)b

0-24 6.67 (0.06)a 6.58 (0.01)b 6.53 (0.01)b 6.64 (0.03)a 6.57 (0.03)b 6.52 (0.03)b

0-48 6.59 (0.02)a 6.54 (0.02)ab 6.51 (0.02)b 6.57 (0.03)a 6.5 (0.01)b 6.48 (0.01)b

abc, lowercase letters in the same row indicate significant difference between means of different F/S ratios for a same grass age (p<0.05).AB, capital letters in the same row indicate significant difference between grass age means for the same F/S ratio (p<0.05).



gramo de MSi que el tratamiento K60-100/0. No obstante, cuando la producción de gas y de CH4 fue expresada por gramo de MSd (Tabla 3 y 4), los valores fueron estadísticamente mayores para el pasto de 60 días de edad (p<0.05). Lo anterior confirma que un forraje de mayor digestibilidad puede producir igual gas y CH4 por gramo de MSi, efecto que se revierte cuando la producción de ambos se expresa por gramo de MSd. La mayor digestibilidad del sustrato matemáticamente reduce la producción de gas y de CH4 y, biológicamente aumenta el YATP. Van Soest et al (18) definieron la eficiencia microbiana como la proporción de energía contenida en el sustrato que es fijada en las células y, por tanto, está inversamente relacionada con la producción de AGV y de CH4.

Efecto de la relación F/S sobre la DMS y la producción de gas y de CH4. El incremento en la producción de gas y de CH4 por gramo de MSi que se observó con la disminución de la relación F/S (Tablas 3 y 4) puede atribuirse a la mayor concentración de CNE respecto la FDN en el sustrato incubado (Tabla 2). La alta proporción de CNE en el suplemento (Tabla 1) explicó el comportamiento creciente que este nutriente registró a medida que disminuyó la relación F/S, conllevando a una mayor relación CNE/FDN (Tabla 2). Pellikaan et al (19) también encontraron mayor producción de gas y de CH4 in vitro en sustratos con menor contenido de FDN y mayor contenido de almidones. Para el almidón de papa, los autores reportaron producciones de gas y de CH4, por gramo de materia orgánica incubada, de 399.9 y 66.8 ml, respectivamente, mientras para el ensilaje de pasto los valores fueron 273.3 y 47.6 ml, correspondientemente. Navarro-Villa et al (11) igualmente evidenciaron mayor producción de gas y de CH4 cuando incubaron grano de cebada, respecto a paja de cebada y ensilaje de pasto.

En el presente estudio, la mayor producción de gas y de CH4 en los sustratos que incluyeron suplemento puede ser explicada por su mayor DMS (Tabla 3). Sin embargo, es importante señalar que esta mayor digestibilidad no fue suficiente para generar una tendencia decreciente en los resultados de producción de gas y de CH4 (a las 48 horas de incubación), cuando estas variables fueron expresadas por gramo de MSd, conforme disminuyó la relación F/S. La única excepción a este comportamiento se observó para la producción de gas por gramo de MSd en el pasto cosechado a los 60 días de edad (Tablas 3 y 4). Los menores niveles de proteína incubada conforme se redujo la relación F/S, especialmente en los tratamientos que incluyeron el pasto kikuyo de 30 días de edad, pueden estar asociados con reducción en la producción de CH4. De acuerdo con los hallazgos de Inthapanya y Preston (20), una menor degradación de la proteína en el sustrato incubado reduce

and 49.9%, respectively) and the higher digestibility of Cichorium intybus. In the present study, treatment K30-100/0 resulted in lower NDF, ADF and ADL (Table 2), higher accumulated digestibility at 48 hours (p<0.05), and similar gas and CH4 production (per gram of iDM) compared to treatment K60-100/0. However, when gas production and CH4 were expressed per gram of dDM (Tables 3 and 4) the values were statistically higher for the older grass (60 days) (p<0.05). Accordingly, highly digestible forage can produce the same gas and CH4 per gram of iDM; which switches when production of both is expressed as per gram of dDM. The higher digestibility of the substrate mathematically reduces gas and CH4 production and biologically increases YATP. Van Soest et al (18) defined microbial efficiency as the proportion of the substrate energy fixed by the cells and, thus, it is inversely related to VFA and CH4 production.

Effect of F/C ratio on DMD, CH4, and gas production. The increase in gas production and CH4 per gram of iDM observed with decreasing F/C ratios (Tables 3 and 4) can be attributed to higher NSC vs. NDF in the incubated substrate (Table 2). The high NSC proportion in the concentrate supplement (Table 1) explains its upward trend as F/C decreased, resulting in a higher NSC/NDF ratio (Table 2). Pellikaan et al (19) also found increased in vitro CH4 and gas production from substrates with low NDF and high starch content. They obtained 399.9 and 66.8 ml for gas and CH4, respectively, from potato starch (per gram of incubated organic matter); while values were 273.3 and 47.6 ml, respectively, from grass silage. Navarro-Villa et al (11) also reported increased production of gas and CH4 for incubated barley grain compared with barley straw and grass silage. In the present study, the increased gas and CH4 production from substrates with concentrate supplement can be explained by their higher DMD (Table 3). However, it is important to note that this increased digestibility was not sufficient to generate a downward trend in gas and CH4 output (at 48 hours of incubation) as F/C decreased when they were expressed as per gram of dDM. The only exception to this was gas production per gram of dDM from grass harvested at 60 days (Tables 3 and 4). Lower levels of incubated protein as F/C decreased -especial ly for 30 days grass- may be associated with reductions in CH4. According Inthapanya and Preston (20), less protein degradation in the incubated substrate decreases CH4 production. However, this

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la producción de este gas. En este trabajo, no obstante, este efecto fue menor frente al generado por la mayor relación CNE/FDN, como previamente fue indicado.

La mayor producción in vitro de CH4, por gramo de MSi y MSd, en los tratamientos con menor relación F/S (Tabla 4) no es consistente con los resultados encontrados in vivo (21), donde es aceptado que la utilización de dietas de rápida fermentación reduce la producción de CH4. El efecto de este tipo de dietas sobre la producción in vivo de CH4 se explica por la disminución del pH ruminal, que afecta el crecimiento de metanógenos, protozoos (22) y bacterias celulolíticas (23), y por el aumento en la tasa de pasaje, que reduce el número de protozoarios y con ello la transferencia interespecie de H2 y la metanogénesis (24). En la técnica in vitro de producción de gas, metodología empleada en este trabajo, no es posible el recambio de la fracción líquida y/o sólida y se incluye una solución buffer que garantiza la estabilidad del pH en un rango entre 6.5 a 7.0 (Tabla 5). Ambos conceptos posiblemente expliquen la divergencia entre la producción de CH4 in vitro y los reportes in vivo cuando se evalúan niveles crecientes de CNE en el sustrato fermentado. Esta situación fue reportada por Navarro-Villa et al (11), quienes obtuvieron producciones de CH4 70% mayores para los granos respecto a los forrajes incubados in vitro, en tanto McGeough et al (25) registraron menor producción de CH4 en rumiantes alimentados con dietas basadas en cereales.

El aumento en la producción de CH4, expresado como porcentaje de la EB y ED es consistente con las emisiones de CH4 por gramo de MSi y MSd (Tabla 4). A las 24 horas de incubación los valores fluctuaron entre 8.8 (K60-100/0) y 15.1% (K60-50/50) de la EBi, superando el reporte de Bhatta et al (26) evaluando dietas mixtas, entre 4.4 y 7.8% de la EB, igualmente a las 24 horas de incubación.

Efecto de la edad del pasto sobre el perfil de fermentación. La glucosa es un intermediario común entre los carbohidratos degradados en el rumen y sus productos finales (AGV, CO2 y CH4). El mecanismo que controla la partición de la glucosa entre los diferentes AGV está en función de la composición de los alimentos ingeridos (2). Los pastos tropicales generalmente crecen y maduran rápido, lo cual los convierte en alimentos más fibrosos y menos digestibles en un corto período de tiempo. El menor contenido de FDN (Tabla 2) y la mayor DMS (Tabla 3) para los tratamientos que incluyeron el pasto de 30 días es consistente con la mayor concentración de AGV que se reporta en la tabla 5, explicando el efecto significativo (p<0.05) del factor edad sobre la producción de acetato, propionato y butirato.

effect was smaller in the present study compared to that generated by a higher NSC/NDF ratio, as previously stated.

Increased in vitro CH4 production per gram of iDM and dDM in treatments with low F/C (Table 4) is not in agreement with in vivo results (21), where it is accepted that rapidly fermenting diets decrease CH4 production. The effect of these diets on in vivo CH4 production is explained by a decrease in ruminal pH, affecting the growth of methanogens, protozoa (22) and cellulolytic bacteria (23), and increasing passage rate, which reduces the number of protozoa and thus interspecies transfer of H2 and methanogenesis (24). The in vitro gas technique does not allow replacing the liquid and/or solid fractions, and a buffer solution is added to guarantee pH stability between 6.5 to 7.0 (Table 5). Both things may explain the divergence between in vitro and in vivo results regarding CH4 for increasing NSC levels. This was reported by Navarro-Villa et al (11), who measured 70% higher CH4 for grains compared with forages incubated in vitro, while McGeough et al (25) reported lower CH4 production from ruminants fed cereal based diets.

The CH4 increase, as a percentage of the iGE and iDE, is consistent with CH4 emissions per gram of iDM and dDM (Table 4). Values ranged from 8.8 (K60-100/0) and 15.1% (K60-50/50) of iGE after 24 hours of incubation, surpassing the results by Bhatta et al (26) who evaluated mixed diets also at 24 hours of incubation and obtained between 4.4 and 7.8% of GE.

Effect of grass age on fermentation profile. Glucose is a common intermediary among carbohydrates degraded in the rumen and their f inal products (VFA, CO2 and CH4). The mechanism that controls glucose partition between different VFA depends on food composition (2). Tropical grasses usually grow and mature faster, rapidly turning into fibrous and less digestible. The lower NDF content (Table 2) and the larger DMD (Table 3) of 30-day grass treatments is consistent with the higher VFA concentrat ion, as reported in Table 5, explaining the significant effect of age on acetate, propionate and butyrate production (p<0.05).



Efecto de la relación F/S sobre el perfil de fermentación. Cambios en la alimentación, desde dietas altas en fibra a dietas basadas en suplemento concentrado disminuyen el pH ruminal (27), el número de bacterias fibrolíticas (23) y la relación A/P (28). Si bien, en el presente trabajo la relación F/S afectó significativamente el pH, los valores tendieron a mantenerse altos y estables gracias al equilibrio HCO3

−/CO2 de la solución buffer, lo que puede explicar la ausencia de efecto estadístico de la relación F/S sobre la relación A/P (Tabla 5). Para superar el efecto de la solución buffer y realizar evaluaciones in vitro a bajo pH (<6) se ha propuesto la utilización de ácido cítrico (11), no obstante, en el presente trabajo esta estrategia no fue eficiente, y las lecturas de pH a las 6 horas de incubación (Tabla 5) mostraron valores superiores a los registrados al inicio (pH 6.5). Esto pudo deberse a que el ácido cítrico es rápidamente fermentado por los microorganismos ruminales hasta CO2 y ácido acético (29).

En la técnica in vitro de producción de gas no existe remoción de los AGV vía absorción, por lo que su concentración depende de la tasa de fermentación. Dado que la DMS aumenta con el tiempo de incubación, es de esperarse una mayor concentración de AGV a medida que transcurre la fermentación, sin embargo, este comportamiento no fue observado en el presente trabajo (Tabla 5). Es posible suponer que los microorganismos degradaron los AGV para obtener energía, fenómeno observado por Wang et al (30), lo cual estaría explicando la estabilidad en su concentración con el transcurso del tiempo de incubación.

Los resultados del presente experimento corroboran que la edad del pasto afecta la DMS, la producción de gas y de CH4 y el perfil de fermentación debido a su mayor proporción de pared celular. La reducción en la relación F/S, concomitante con una mayor proporción CNE/FDN, mejora la digestibilidad del sustrato y aumenta la producción de gas y de CH4, esto último contradiciendo los reportes in vivo. El valor de pH, que es controlado por la solución buffer, representa una limitante para estudiar el efecto de la relación F/S sobre la metanogénesis en sistemas in vitro. Por lo tanto, para futuros trabajos se sugiere realizar modificaciones en la formulación de la solución buffer que permitan realizar evaluaciones de dietas mixtas en un pH cercano al observado in vivo.

Effect of F/C ratio on fermentation profile. When fiber-rich diets change to diets based on concentrates, a decrease can be expected in ruminal pH (27), number of fibrolytic bacteria (23) and the A/P ratio (28). Although in the present study F/C significantly affected the pH, it tended to remain high and stable due to the HCO3

−/CO2 balance of the buffer solution, which could explain the lack of significant effect of the F/C ratio on the A/P ratio (Table 5). Citric acid has been suggested to overcome the buffer effect and perform in vitro evaluations at pH lower than 6 (11). However, that strategy did not work in the present study; pH readings at 6 hours of incubation (Table 5) were higher than those recorded at the beginning (pH 6.5). This could be explained by citric acid being rapidly fermented by rumen microorganisms to CO2 and acetic acid (29).

The in vitro gas technique does not remove VFA via absorption, so its concentration depends on the fermentation rate. Since DMD increases with incubation time, a higher VFA concentration is expected as fermentation continues. However, this was not observed in this study (Table 5). It can be assumed that microorganisms degraded VFA to obtain energy, as observed by Wang et al (30), which would explain the stability of its concentration over the incubation time.

The results of this study confirm that grass age affects DMD, CH4, gas production, and fermentation profile due to a higher proportion of cell wall. A reduction of F/C ratio simultaneous with a high NSC/NDF ratio improves substrate digestibility and increases CH4 and gas production, contradicting the in vivo reports. The pH, which is controlled by the buffer solution, hinders the study of the effect of F/C ratio on methanogenesis in in vitro systems. Therefore, for future studies we suggest to change the formulation of the buffer solution to enable the assessments of mixed diets at a pH close to in vivo.

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ORIGINAL


Estimation and comparison of conventional and genomic breeding values in Holstein cattle of Antioquia, Colombia

Estimación y comparación de valores de cría convencionales y genómicos en ganado Holstein de Antioquia, Colombia

Juan Zambrano A,1* M.Sc, Juan Rincón F,2 M.Sc, Albeiro López H,2 Dr.Sci, Julián Echeverri Z,2 Ph.D.

1Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Facultad de Ciencias, Posgrado en Biotecnología, Grupo de Investigación BIOGEM, A.A. Nro. 3840, Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de producción Animal, Grupo de Investigación BIOGEM, A.A. Nro. 1779, Medellín, Colombia.*Correspondencia: [email protected]

Received: July 2014; Acecpted: February 2015.

ABSTRACT

Objetive. To estimate and compare breeding values (EBV) using the conventional method (BLUP) and genomic breeding values (MEBV and GEBV) estimated through bayes C method for milk yield and milk quality traits in dairy cattle in Antioquia, Colombia. Materials and methods. Two methods were used to estimate breeding values: BLUP to estimate conventional breeding value (EBV) and bayes C to estimate genomic values (MEBV and GEBV). The traits evaluated were: milk yield (PL), protein percentage (PPRO), fat percentage (PGRA) and score somatic cell (SCS). The methods (BLUP and bayes C) were compared using Person correlation (rp), Spearman rank correlation (rs) and linear regression coefficient (b). Results. The Pearson and Spearman correlations among EBVs and genomic values (MEBV and GEBV) (rpMEBV;EBV and rsGEBV;EBV) were greater than 0.93 and the linear regression coefficients of EBVs on genomic values (MEBV and GEBV) (bMEBV;EBV, and bGEBV;EBV) ranged between 0.954 and 1.051 in all traits evaluated. Conclusions. The predictions of genomic values (MEBV and GEBV), using bayes C method were consistent with the predictions of the EBVs estimate through the conventional method (BLUP) in conditions of high Colombian tropic, allowing to obtain high associations between the breeding values.

Key words: BLUP, genotypes, genomic selection, single nucleotide polymorphism (Source: CAB, NAL).

RESUMEN Objetivo. Estimar y comparar valores genéticos (EBV) usando el método convencional (BLUP) y valores genómicos (MEBV y GEBV) mediante el método bayes C en características de producción y calidad de la leche en ganado Holstein de Antioquia, Colombia. Materiales y métodos. Fueron empleados dos métodos para estimar valores genéticos: BLUP para estimar valores genéticos (EBV) y Bayes C para estimar valores genómicos (MEBV y GEBV). Las características evaluadas fueron: producción de leche (PL), porcentaje de proteína (PPRO), porcentaje de grasa (PGRA) y puntaje de células somáticas (SCS). Los métodos BLUP y bayes C fueron comparadas usando correlación de Pearson (rp), correlación por rangos de Spearman (rs) y regresión lineal (b). Resultados. Las correlaciones de Pearson y Spearman entre los EBVs y los valores genómicos (MEBV y GEBV) (rpMEBV;EBV y rsGEBV;EBV) fueron mayores de 0.93 y los coeficientes de regresión entre los EBVs y los valores genómicos (MEBV y GEBV) (bMEBV;EBV, y


bGEBV;EBV) oscilaron entre 0.954 y 1.051 en todas las características evaluadas. Conclusiones. La predicción de valores genómicos (MEBV y GEBV) usando el método Bayes C fue consistente con los EBVs estimados mediante el método BLUP en condiciones del trópico alto colombiano, permitiendo obtener altas asociaciones entre los valores genéticos.

Palabras clave: BLUP, genotipos, polimorfismo de nucleótido simple, selección genómica (Fuente: CAB, NAL).

INTRODUCCIÓN

El mejoramiento genético de plantas y animales domésticos incluye dentro de sus etapas, la predicción de valores estimados de cría (EBV), con el objetivo de mejorar el potencial genético de las siguientes generaciones. Tradicionalmente los EBVs, son obtenidos usando el mejor estimador lineal insesgado (BLUP) (1). Este método está basado en los supuestos del modelo infinitesimal, el cual asume que las características cuantitativas son determinadas por un número infinito de loci que actúan en forma aditiva, sin ligamiento entre ellos, cada uno con un efecto muy pequeño sobre la expresión fenotípica de la característica (2, 3). Si bien, el método BLUP ha sido ampliamente usado en el mejoramiento genético de especies domésticas, su principal limitación es la estricta dependencia de registros productivos para obtener altas confiabilidades en las evaluaciones genéticas (4).

Con los avances de la genética, la biología molecular y otras áreas de la ciencia, se ha demostrado que las características cuantitativas son afectadas por un número finito de loci, algunos con gran efecto, otros con efecto pequeño y otros sin efecto sobre la característica (modelo finitesimal) (3,5,6). Desde este enfoque, la selección asistida por marcadores moleculares (MAS) fue inicialmente incorporada en aplicaciones comerciales, pero con poco éxito, ya que fue orientada al uso de genes individuales o unos pocos QTL (loci de caracteres cuantitativos) ligados a marcadores, que permiten capturar sólo una pequeña proporción de la varianza genética (7).

Gracias al desarrollo de las tecnologías de secuenciación de ADN, se ha logrado la identificación de un gran número de marcadores genéticos y entre los más abundantes, los polimorfismos de nucleótido simple (SNP). En la actualidad, varios tipos de microarreglos que permiten la identificación de miles de SNPs y que son utilizados en la genotipificación de algunas especies domésticas, están disponibles comercialmente y a bajo costo (8). Estos microarreglos que incluyen paneles de múltiples SNPs y que cubren uniformemente todo el genoma, han sido de gran utilidad en la genotipificación de animales (9). Mediante

INTRODUCTION

The genetic improvement of plants and domestic animals includes among its stages, the prediction of estimated breeding values (EBV) with the objective of improving the genetic potential of next generations. Traditionally, EBVs are obtained by using the best linear unbiased prediction (BLUP) (1). This method is based on assumptions of the infinitesimal model, which assumes that the quantitative traits are determined by an infinite number of loci that act in an additive form, with no linkage among them. Each one with a very small effect on phenotypical expression of the traits (2,3). Although the BLUP method has been widely used for genetic progress of domestic species, its main limitation is the strict dependency on productive records to obtain high reliability in genetic evaluations (4).

Advances in genetics, molecular biology and other scientific areas have demonstrated that the quantitative traits are affected by an infinite number of loci, some with great effect, others with small effect and others with no effect on the traits (finitesimal model) (3,5,6). With this approach, the termed marker-assisted selection (MAS) was initially incorporated in commercial applications, but with little success since it was directed to the use of individual genes or a small amount of QTL (quantitative trait loci) linked to markers that allow to capture only a small part of the genetic variance (7).

Thanks to the development of DNA sequencing technologies, a large number of genetic markers have been identified, being the single nucleotide polymorphism (SNP) among the highest. Currently, several types of microarrays allow for the identification of thousands of SNPs and are used in genotyping of some domestic species that are commercially available and at low cost (8). These microarray that include multiple SNP panels and cover all the genome in a uniform distribution, have been of great use in animal genotyping (9). Through the genomic selection methodology (SG) devised by Meuwissen et al (6), genomic information from genotyped animals with multiple SNPs can be used efficiently to estimate genomic values (GEBVs), which are SG’s main point, given that selection decisions are based on these values. The genomic value

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la metodología de selección genómica (SG), ideada por Meuwissen et al (6), puede utilizarse eficientemente la información genómica de animales genotipificados con múltiples SNPs, para estimar valores genómicos (GEBVs), que son el punto central de la SG, dado que las decisiones de selección son basadas en estos valores. El valor genómico (GEBV), es el resultado de la suma de los efectos de sustitución alélica de todos los marcadores (SNP) asociados a una característica fenotípica. Estos efectos, son estimados en poblaciones de referencia que portan información fenotípica y genealógica y que luego son utilizados en la estimación de GEBVs en animales jóvenes (8). Considerando estos argumentos, varios métodos de estimación de valores genéticos que incluyen marcadores moleculares han sido propuestos, como bayes A, bayes B, bayes C, bayes Cpi, bayes lasso, bayes R, GBLUP, entre otros y la principal diferencia entre estos métodos se da en la información a priori incluida en el modelo genómico, con respecto la distribución de los efectos de los marcadores (6,10-12).

La gran ventaja de incorporar la información genómica en eva luac iones genét i cas convencionales es el incremento de la confiabilidad de los valores genéticos en animales jóvenes y la disminución del intervalo generacional (13). Esto, ha llevado a que muchos programas de mejoramiento genético desarrollados en varios países alrededor del mundo, incluyan información genómica en sus evaluaciones genéticas; estrategia que ha funcionado y que ha permitido doblar la tasa de ganancia genética en muchas características de importancia económica (8,14).

En Colombia han sido desarrolladas escasas evaluaciones genéticas, en ganado de leche, pero debido al bajo número de animales evaluados y a la limitada cantidad de observaciones fenotípicas, las confiabilidades de los EBVs han sido bajas. En cuanto a evaluaciones genómicas, aún no han sido incorporadas en ganado de leche, aunque han sido realizados algunos estudios previos (15). El objetivo de esta investigación fue estimar y comparar valores genéticos (EBV) usando el método convencional (BLUP) y valores genómicos (MEBV y GEBV) mediante el método bayes C en características de producción y calidad de la leche en ganado Holstein de Antioquia, Colombia.


Población. Esta investigación fue realizada con base en la información de 124 hatos lecheros de raza Holstein ubicados en 18 municipios del departamento de Antioquia (Colombia) que cubre zonas de bosque muy húmedo montano bajo

(GEBV), is the result of the sum of the effects of allelic substitution of all markers (SNP) associated with a phenotypic trait. These effects are estimated in selected populations that carry phenotypic and genealogical information and are later used in the estimation of GEBVs in young animals (8). Considering these arguments, several genetic value estimation methods that include molecular markers have been propose, such as bayes A, bayes B, bayes C, bayes Cpi, bayes lasso, bayes R, GBLUP. The main difference between these methods is in the a priori information included in the genomic model with respect to the distribution of the marker’s effects (6,10-12).

A big advantage in incorporating genomic information in conventional genetic evaluations is the increase in the reliability of genetic values in young animals and the decrease of the generation interval (13). This has led to many genetic improvement programs developed in several countries worldwide to include genomic information in their genetic evaluations; this strategy has worked and has allowed doubling the genetic gain in many characteristics of economic importance (8,14).

In Colombia, few genetic evaluations have been developed in dairy cattle. But due to the low number of animals evaluated and the limited amount of phenotypic observations, the reliability of EBVs has been low. Genomic evaluations have not yet been incorporated into dairy cattle, although some previous studies have been conducted (15). The objective of this research was to estimate and compare genetic values (EBV) using the conventional method (BLUP) and genomic breeding value (MEBV and GEBV) estimated through bayes C method for milk yield and milk quality traits in dairy cattle in Antioquia, Colombia.


Population. This research was conducted based on information from 124 dairy herds of Holstein breed located in 18 municipalities of the department of Antioquia (Colombia), which covers very wet low mountain (bmh-mb) areas, with a temperature that ranges between 12 and 18ºC and a yearly average of rain between 2000 and 4000 mm. These dairy herds are normally located at an altitude of between 1800 to 2800 msnm above sea level. The specific conditions of handling, feeding and sanity, as well as their topography and geographic location varied in all dairy herds. The Ethics Research Committee of the National University of Colombia in Medellin supported this research, because it complied with

Zambrano - Conventional and genomic breeding values


(bmh-mb), con una temperatura que oscila entre 12 y 18ºC y un promedio anual de lluvias entre 2000 y 4000 mm. Normalmente se extienden en una faja altimétrica de 1800 a 2800 msnm. Las condiciones específicas de manejo, alimentación y sanidad fueron variables en todos los hatos, así como su topografía y ubicación geográfica. Esta investigación fue avalada por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, considerando que cumplió con los estándares para este tipo de investigación (Número de la carta de aprobación: CEMED-015 Mayo, 2012).

El número de registros utilizados para los análisis fue variable, de acuerdo con la característica dependiente analizada: 8772, 6624, 6595 y 6426 para PL, PGRA, PPRO y recuento de células somáticas (RCS) respectivamente. El RCS fue transformado a puntaje de células somáticas (SCS) mediante la siguiente ecuación: SCS = [log2 (RCS/100000)] + 3, con el fin de mejorar la normalidad de los datos, como lo describe Ali y Shook (16). El número de animales en el pedigrí para la evaluación genética convencional fue de 9090 individuos y para evaluación genómica fue de 260, que corresponde a los animales genotipificados y sus parientes. La totalidad de la información fue administrada y analizada en el Software Control 1, versión 1.0 (17).

De acuerdo con el análisis descriptivo inicial, valores de PL superiores a 12000 e inferiores a 1500 litros/lactancia fueron descartados, niveles inferiores a 2.00% y superiores a 5.00% para PPRO y menores a 1.60% y mayores a 6.00% para PGRA igualmente fueron descartados, por considerarse posibles errores de muestreo o errores de procedimientos de laboratorio.

Genotipificación de animales con chips de alta densidad. Fueron genotipificados 144 animales con chips de Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA) para múltiples SNPs: 31 con el chip Bovine LD, 65 con el chip Bovine SNP50v2 y 48 con el chip Bovine HD, los cuales proveen información de 6.909, 54.609 y 777.972 SNPs respectivamente. En la edición de los genotipos, se removieron los alelos de menor frecuencia cuando esta era inferior a 0.02, también fueron declarados como datos perdidos los genotipos con errores mendelianos. Finalmente, después de editar la información, se obtuvieron 6716 SNPs comunes a los tres chips (LD, SNP50 y HD) para todos los animales genotipificados. La edición de los genotipos fue realizada con los programas SAS v9.1 (18) y Plink v1.07 (19).

Análisis estadístico.Estimación de EBVs usando BLUP. Mediante

the standards for this type of research (Approval number: CEMED-015 May, 2012).

The number of records used for the analysis varied according to the dependent variables analyzed: 8772, 6624, 6595 and 6426 for PL, PGRA, PPRO y and somatic cell count (RCS) respectively. RCS was transformed to a somatic cell score (SCS) using the following equation: SCS = [log2 (RCS/100000)] + 3, in order to improve the normality of the data, as described by Ali and Shook (16). The number of animals in the pedigree for the conventional genetic evaluation was 9090 individuals and for the genomic evaluation the number was 260, which corresponds to the genotyped animals and their relatives. All the information was administered and analyzed in Control 1 Software, version 1.0 (17).

According to the initial descriptive analysis, PL values greater than 12000 and less than 1500 liters/lactation were discarded. Levels lower than 2.00% and greater than 5.00% for PPRO and less than 1.60% and greater than 6.00% for PGRA were also discarded since they are considered possible sampling errors or errors in the lab’s procedures.

Animal genotyping with high-density beadchips. 144 animals were genotyped with Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA) beadchips for multiple SNPs: 31 with the Bovine LD beadchip, 65 with the Bovine SNP50v2 beadchip and 48 with the Bovine HD beadchip, which provide information of 6.909, 54.609 and 777.972 SNPs respectively. During the handling of the genotypes, the alleles with the lowest frequency were removed when these were lower than 0.02. Genotypes with mendelian errors were also declared as lost data. Finally, after editing the information, 6716 SNPs common to all three types of beadchips (LD, SNP50 and HD) were obtained for all the genotyped animals. The edition of genotypes was conducted with the programs SAS v9.1 (18) and Plink v1.07 (19).

Statistical analysis.EBVs Estimation by BLUP. Through preliminary analysis, several statistical models were proven that included significant fixed effects for each trait in order to determine the models that were best adjusted to the estimation of the genetic parameters. variance components and heritability were estimated using an independent univariate animal model for each characteristic (20). The matrix notation of the model was described as follows:

Where: y = observation vector, b = solution vector for fixed effects of the herd, number

4743

análisis preliminares se probaron varios modelos estadísticos que incluyeron efectos fijos significativos para cada característica, con el fin de determinar los modelos que mejor se ajustaban en la estimación de los parámetros genéticos. Los componentes de varianza y la heredabilidad fueron estimados usando un modelo animal univariado independiente para cada una de las características (20). La notación matricial del modelo fue descrita de la siguiente manera:

Donde: y = vector de observaciones, b = vector de solución para los efectos fijos hato, número de parto (vacas entre 1 y 8 partos), covariables duración de la lactancia para PL, y producción de leche (PL) para las características PPRO y PGRA, a = vector de soluciones para el efecto aleatorio genético aditivo, X y Z = matrices de incidencia que relacionan los registros con los efectos fijos y aleatorios y e = residual.

Se asume que los e fectos a leator ios genético aditivo y residual son distribuidos independientemente con media cero y varianzas:

Considerando que A = matriz de parentesco y

, se tiene que:

Las ecuaciones del modelo mixto para el estimador lineal insesgado (BLUE) de las funciones estimables de b y para el mejor predictor lineal insesgado (BLUP) de a se describen como:

Donde: a es la relación entre la varianza del error y la varianza genética aditiva: .

El modelo para cada característica fue resuelto usando el programa MTDFREML descrito por Boldman et al (21) y que determina las soluciones para cada efecto fijo (b) y efecto aleatorio genético aditivo (a) de las ecuaciones del modelo mixto (MME), descrito por Henderson (1), empleando el método de máxima verosimilitud restricta libre de derivadas.

La heredabilidad se estimó directamente del programa MTDFREML y se consideró como la

of calving (cows between 1 and 8 calving), covariates: lactation length for PL and milk yield (PL) for PPRO and PGRA traits, a= solution vector for random additive genetic effect, X and Z = incidence matrix that relate the records with fixed and random effects and e = residual.

It is assumed that the random and residual additive genetic effects are distributed independently with zero medium and variances:

Considering that A = relationship matrix and:

, you have to:

The mixed model equations for the best linear unbiased estimator (BLUE) of the estimated functions for b for the best linear unbiased predictor (BLUP) of a are describe as:

Where: a is the relationship between the residual variance and the additive genetic variance:

.

The model for each characteristic was resolved by using the MTDFREML program described by Boldman et al (21), which determined the solutions for each fixed effect (b) and the additive genetic random effect (a) from the mixed model equations (MME), described by Henderson (1), by using a multiple trait derivative-free restricted maximum likelihood.

The traits were estimated directly from the MTDFREML program and were considered as the proportion of the additive genetic variance over the phenotype variance.

Estimation of marker effects and genomic values. The estimation of the effects of the SNPs and the genomic breeding values (MEBV and GEBV) was conducted using the Bayes C method (22). The general statistical model is describe as:

Where: y is the phenotype value vector corrected for fixed effects (corresponding to EBVs obtained through the BLUP method) for PL, SCS, PPRO, and PGRA traits, µ is the general mean, 1n is the



proporción de la varianza genética aditiva sobre la varianza fenotípica.

Estimación de los efectos de los marcadores y valores genómicos. La estimación de los efectos de los SNPs y de los valores de cría genómicos (MEBV y GEBV) fue realizada empleando el método Bayes C (22). El modelo estadístico general se describe como:

Donde: y es el vector de valores fenotípicos corregidos por efectos fijos (que corresponde a los EBVs obtenidos mediante el método BLUP) para las características PL, SCS, PPRO y PGRA, µ es la media general, 1n es el vector de unos de longitud n, Xij es el vector columna que representa la covariable del marcador (SNP) en el locus j en el animal i. En cada jth marcador son tres posibles combinaciones de dos alelos (A o B), el homocigótico de un alelo (AA), el heterocigótico (AB) y el homocigótico del otro alelo (BB). Estas combinaciones de alelos (genotipos) son representados cuantitativamente como 0, 1 y 2 respectivamente (es decir; Xij=0, 1 o 2), gj es el efecto aleatorio de sustitución alélica para el marcador j, el cual es condicional sobre 2

gσ y se asume normalmente distribuido

N~(0, 2gσ ) cuando δj=1, pero gj=0 cuando

δj=0, δj es una variable aleatoria 0/1 que indica ausencia (con probabilidad P) o presencia (con probabilidad 1-P) del locus j en el modelo, u es el vector de efectos aleatorios poligénicos de longitud n (Z es la matriz de diseño asociada) y puede ser considerado como el ajuste de los genes no tenidos en cuenta por los efectos de los jth SNPs en g, u es asumido estar distribuido normalmente, u~N(0, ), donde A es la matriz de parentesco derivada del pedigrí de los animales genotipificados, e es el residual y también se asume estar distribuido normalmente, e~N(0, 2

eIσ ), donde I es una matriz identidad nxn.

De esta manera, el método bayes C asume una mezcla de dos distribuciones para los efectos de los SNPs. En la primera, (con probabilidad π) establece que muchos marcadores no tienen efecto ni varianza y para la segunda, (con probabilidad 1-π) existen marcadores con efecto y varianza, la cual es común para todos los SNPs (23).

Así, los efectos de los SNPs (gj) siguen una distribución apriori normal con media cero y varianza 2

gσ , mientras que las varianzas de los efectos de los marcadores ( 2

gσ ) siguen una distribución apriori chi cuadrada invertida escalada con parámetros Vg (grados de libertad)

2uAσ

vector of ones of n length, Xij is the column vector that represents the covariates of the marker (SNP) in locus j and animal i. In each jth marker, there are three possible combinations of two alleles (A or B), the homozygote of an allele (AA), the heterozygote (AB) and the homozygote of the other allele (BB). These combinations of alleles (genotypes) are represented quantitatively as 0, 1 and 2 respectively (that is; Xij=0, 1 o 2); gj is the random effect of allelic substitution for the marker j, which is conditional on

2gσ and is

normally distributed N~(0, 2gσ ) when δj=1, but

gj=0 when δj=0; δj is a random variable 0/1 that indicates absence (with probability P) or presence (with probability 1-P) of locus j in the model; u is the polygenic random effect vector of length n (Z is the related design matrix) and can be considered as the adjustment of the genes not considered due to the effects of jth SNPs in g; u is assumed to be normally distributed, u~N(0,

2uAσ ), where A is the relationship matrix

derived from the pedigree of the genotyped animals; e is the residual and also is assumed to be normally distributed e~N(0, 2

eIσ ), where I is an nxn identity matrix.

With this approach, the bayes C method assumes a combination of two distributions for the effects of the marker SNPs. The first distribution, (with π probability) established that many markers do not have effect nor variance; and the second distribution, (with 1-π probability) there are markers with effect and variance, which common for all SNPs (23).

Therefore, the effects of SNPs(gj) follow an apriori normal distribution with zero mean and variance 2

gσ , while the variances of the effects of the markers ( 2

gσ ) follow an apriori inverse scaled chi squared-distribution with parameters Vg (degrees of freedom) and 2

gS (scale parameters). On the other hand, π is treated as a uniform apriori distribution with zero mean and variance 1 (23), as follows:

The genomic value of animals whose genotype is known was determined as:

Where: y is the genomic estimated breeding value (GEBV), corresponds to the estimated molecular breeding value (MEBV)

4745

y 2gS (parámetro de escala). Por otra parte, π es

tratada como una distribución apriori uniforme con media cero y varianza 1 (23), de la siguiente manera:

El valor genómico de los animales cuyo genotipo es conocido, se determinó como:

Donde: y es el valor genómico (GEBV), corresponde al valor estimado de cría molecular (MEBV) obtenido como la suma de todos los efectos estimados (ĝj) de los SNPs, û es el efecto poligénico.

El programa utilizado para la estimación de los efectos de los SNPs y de los valores genómicos (MEBV y GEBV) fue GS3 (24).

Metodologías de comparación de valores genéticos. Los valores genómicos (MEBV y MEBV) estimados mediante el método bayes C fueron comparados con los valores genéticos convencionales (EBV), estimados mediante el método BLUP, usando tres métodos: correlación por rangos de Spearman, correlación de Pearson y regresión lineal simple:

a) El coeficiente de correlación por rangos de Spearman fue usado para determinar el grado de similitud entre las clasificaciones o ranking de los animales por sus valores genómicos (MEBV o GEBV) y clasificación de los mismos animales por el EBV convencional. La ecuación empleada fue:

Dónde: D = diferencia entre los correspondientes valores genéticos de orden (x–y), x = valor genómico (GEBV o MEBV), y = EBV convencional, N = número de parejas (x,y) y rs = coeficiente de correlación de Spearman.Un valor de correlación de 1 indica que la clasificación o ranking de los animales por sus valores genómicos (MEBV y GEBV) es similar en los EBVs convencionales.

b) El coeficiente de correlación de Pearson fue usado para determinar la asociación entre los valores genómicos (MEBV o GEBV) y el EBV convencional. La ecuación empleada fue:

obtained as the sum of all estimated effects (ĝj) of the SNPs; û is the polygenic effect.

The program used for the estimation of the effects of SNPs and the genomic values (MEBV and GEBV) was GS3 (24).

Methods for comparing genetic values. Genomic values (MEBV and MEBV) estimated with the bayes C method were compared to conventional genetic values (EBV), estimated with the BLUP method, using three methods: Spearman rank correlation, Pearson correlation and simple linear regression:

a) Spearman’s rank correlation coefficient was used to determine the degree of similarity between the classifications or rankings of the animals by their genomic values (MEBV or GEBV) and the classification of the same animals by the conventional EBV. The equation used was:

Where: D = difference between the corresponding genetic values of (x–y) order, x = genomic value (GEBV or MEBV), y = conventional EBV, N = number of pairs (x,y) and rs = Spearman correlation coefficient.A value of correlation 1 indicates that the classification or ranking of the animals by their genomic values (MEBV or GEBV) is similar than in the conventional EBV.

b) The Pearson correlation coefficient was used to determine the relationship between genomic values (MEBV or GEBV) and the conventional EBV. The equation used was:

Where, rp = Pearson correlation coefficient; x=genomic value (GEBV or MEBV) for i trait; y=conventional EBV for i trait. A correlation value of 1 indicates that the methods for estimation of genetic values have the same precision and that the estimation errors are very similar.

c) The simple linear regression coefficient was used to determine the change in magnitude of the genomic values (MEBV and GEBV) with respect to conventional EBVs and allow evaluate the bias in the estimation of the genomic selection model with respect to the traditional model, according to Mäntysaari et al (25). Linear regression was defined as:



Donde, rp = coeficiente de correlación de Pearson, x = valor genómico (GEBV o MEBV) para la característica i, y = EBV convencional para la característica i. Un valor de correlación de 1 indica que los métodos de estimación de valores genéticos tienen la misma precisión y que los errores de estimación son muy similares.

c) El coeficiente de regresión lineal simple fue usado para determinar el cambio en magnitud de los valores genómicos (MEBV y GEBV) con respecto a los EBVs convencionales y permite evaluar e sesgo en la estimación del modelo de selección genómica con respecto al modelo tradicional, según Mäntysaari et al (25). La regresión lineal fue definida como:

exbboy ii ++= 1

Donde yi = variable dependiente que corresponde EBV convencional para la característica i, xi=valor genómico (GEBV o MEBV) para la característica i, b1=coeficiente de regresión del EBV convencional sobre el valor genómico (GEBV o MEBV), b0=intercepto y e=residual.

RESULTADOS

Análisis descriptivo. Las medias para las características productivas y de calidad composicional de la leche presentaron valores normales para la raza Holstein en el trópico alto colombiano, con valores de 5400 litros/lactancia, 3.10%, 3.97% y 4.72 para PL, PPRO, PGRA y SCS respectivamente. La característica más variable según el coeficiente de variación fue PL con 39.9%, mientras que la característica que presentó menor variabilidad fue PPRO con 9.9% (Tabla 1). Los efectos de los SNPs para las mismas características también fueron determinados. Para PL los efectos oscilaron entre -43.3 y 34.5 litros/lactancia, para PPRO entre -0.019 y 0.022%, para PGRA entre -0.022 y 0.025% y para SCS entre -0.055 y 0.054 (Tabla 2).

Parámetros genéticos, EBVs convencionales y genómicos (MEBV y GEBV). Las heredabilidades estimadas por el método bayes C para PGRA y SCS estuvieron dentro del rango normal y fueron cercanas a las estimadas por el método BLUP. Sin embargo, la heredabilidad para PPRO fue alta, comparada con las heredabilidad obtenida por el método BLUP. Las medias de los valores genéticos (EBV) obtenidos por BLUP para PL, PPRO, PGRA y SCS fueron: 138 litros/lactancia, 0.002%, -0.011% y -0.019

exbboy ii ++= 1

Where yi = dependent variable that corresponds to conventional EBV for i trait; xi=genomic value (GEBV or MEBV) for i characteristic; b1=EBV regression coefficient on the genomic value (GEBV or MEBV); b0 = intercept and e=residual.

RESULTS

Descriptive analysis. The averages for the milk yield and quality traits presented normal values for the Holstein breed in the Colombian high tropic, with values of 5400 liters/lactation, 3.10%, 3.97% and 4.72 for PL, PPRO, PGRA and SCS respectively. The most variable trait according to the coefficiente of variation was PL with 39.9%, while the trait with the lowest variance was PPRO with 9.9% (Table 1). The effects of the SNPs for the same trait were also determined. For PL, the effects varied between -43.3 and 34.5 liters/lactation; for PPRO between -0.019 and 0.022%; for PGRA between -0.022 and 0.025% and for SCS between -0.055 and

Table 1. Descriptive analysis for milk yield (PL), protein percentage (PPRO), fat percentage (PGRA) and score somatic cells (SCS) in Holstein cattle in Antioquia, Colombia.

Traits N Mean±DE CV(%)

PL(liters/lactation) 670 5400±2126 39.4

PPRO(%) 457 3.10±0.31 9.9

PGRA(%) 455 3.97±0.55 13.9

SCS 452 4.62±1.37 29.7

N: Number of records, DE: Standard deviation, CV: Coefficiente of variation.

Table 2. Descriptive statistical analysis of the effects of SNP’s for milk yield (PL), protein percentage (PPRO), fat percentage (PGRA) and score somatic cells (SCS) in Holstein cattle in Antioquia, Colombia.

Traits N Mean±DE EE MinimumMaximum

PL (liters/lactation) 6716 -0.033

±5.49 8.23 -43.3 34.5

PPRO(%) 6716 0.00003±0.002 0.003 -0.019 0.022

PGRA(%) 6716 0.00005±0.003 0.003 -0.022 0.025

SCS 6716 0.00008±0.007 0.007 -0.055 0.054

N: Number of SNPs, DE: Standard deviation, EE: Average standard error for SNP effects.

0.054 (Table 2).

Genetic parameters, conventional EBVs and genomics (MEBV and GEBV). The heritability estimates for the bayes C method for PGRA and SCS were within the normal range and were

4747

respectivamente. Para los GEBVs, las medias fueron: -38 litros/lactancia, -0.008%, -0.012% y -0.023 y para los MEBV, que fueron calculados como la sumatoria de los efectos de los SNPs fueron: 51 litros/lactancia, -0.01%, -0.015% y -0.025 respectivamente (Tabla 3).

Comparación de valores genéticos. Las correlaciones de Pearson entre los valores genómicos (GEBV y MEBV) y el EBV convencional (rpMEBV;EBV, rpGEBV;EBV) para PL, PPRO, PGRA y SCS fueron superiores a 0.94 y las correlaciones de Spearman (rsMEBV;EBV, rsGEBV;EBV) obtenidas para las mismas características fueron superiores a 0.93 y en la gran mayoría muy cercanas a 1, indicando asociaciones altas entre valores genéticos. En todos los casos, las correlaciones obtenidas fueron altamente significativas (p≤0.01), (Tabla 4).

Por su parte, los coeficientes de regresión (bMEBV;EBV y bGEBV;EBV) obtenidos para PL, PPRO, PGRA y SCS oscilaron entre 0.954 y 1.051. Estos resultados indican que la estimación de valores genéticos en la población evaluada, usando los métodos BLUP y Bayes C no alteró significativamente la magnitud de los valores genómicos (GEBV y MEBV) con respecto al EBV convencional. De igual manera, los coeficientes de determinación (R2) para las características evaluadas (PL, PPRO, PGRA y SCS fueron cercanos a 1 (mayor de 0.89 para las regresiones lineales entre EBV y MEBV y mayor de 0.97 para las regresiones lineales entre EBV y GEBV), lo cual muestra una relación lineal alta entre los valores genéticos (los datos se ajustan a una línea recta), (Tabla 5).

DISCUSIÓN

La selección genómica (SG), es una variante de la selección asistida por marcadores moleculares

close to the heritabilities estimates by the BLUP method. But, the heritability for PPRO was high compared to the heritability obtained with the BLUP method. The averages of the genetic values (EBV) obtained by BLUP for PL, PPRO, PGRA and SCS were: 138 liters/lactation, 0.002%, -0.011% and -0.019 respectively. For GEBVs, the averages were: -38 liters/lactation, -0.008%, -0.012% and -0.023 and for MEBVs, which were calculated as the sum of the effects of the SNPS, the averages

Table 4. Pearson correlation coefficients and Spearman correlation coefficients between genomic values (GEBV and MEBV) and conventional EBV’s.

Trait

Pearson Correlation Coefficient

Spearman Correlation Coefficient

rp MEBV;EBV±EE

rp GEBV;EBV±EE

rs MEBV;EBV±EE

rs GEBV;EBV±EE

PL 0.984±0.0026

0.993±0.0012

0.981±0.0006

0.991±0.0005

PPRO 0.947±0.0086

0.989±0.0019

0.932±0.020

0.983±0.0040

PGRA 0.967±0.0055

0.995±0.0009

0.959±0.005

0.989±0.00008

SCS 0.979±0.0035

0.989±0.0018

0.972±0.029

0.986±0.0020

rpMEBV;EBV: Pearson correlation between MEBV and EBV, rpGEBV;EBV: Pearson correlation between GEBV and EBV, rsMEBV;EBV: Spearman correlation between MEBV and EBV, rsGEBV;EBV: Spearman correlation between GEBV and EBV, EE: standard error.

were: 51 liters/lactation, -0.01%, -0.015% and -0.025 respectively (Table 3).

Comparison of genetic values. Pearson correlations between genomic values (GEBV and MEBV) and the conventional EBV (rpMEBV;EBV, rpGEBV;EBV) for PL, PPRO, PGRA y SCS were greater than 0.94 and Spearman correlations (rsMEBV;EBV, rsGEBV;EBV) obtained for the same trait were greater than 0.93 and in most cases close to 1, indicating high relationship between genetic values. In all cases, the correlations obtained were highly significant (p≤0.01), (Table 4).

Regression coefficients (bMEBV;EBV y bGEBV;EBV) obtained for PL, PPRO, PGRA y SCS varied between 0.954 and

Table 5. Regression coefficients between genomic values (GEBV and MEBV) and conventional EBVs for milk yield (PL), protein percentage (PPRO), fat percentage (PGRA) and score somatic cells (SCS) in Holstein cattle in Antioquia, Colombia.

TraitRegression coefficient

bMEBV;EBV ±EE R2 bGEBV;EBV±EE R2

PL 1.051±0.016 0.969 1.008

±0.010 0.985

PPRO 0.960±0.027 0.898 1.002

±0.012 0.978

PGRA 1.015.±0.023 0.934 0.988

±0.009 0.989

SCS 0.954±0.018 0.958 0.979

±0.012 0.978

bMEBV;EBV: regression coefficient between MEBV and EBV, bGEBV;EBV: regression coefficient between GEBV and EBV, EE: standard deviation, R2: Coefficient of determination.

Table 3. Heritabilities, conventional genetic value (EBVs) mean and genomic values (MEBV and GEBV) mean for milk yield (PL), protein percentage (PPRO), fat percentage (PGRA) and score somatic cells (SCS) in Holstein cattle in Antioquia, Colombia.

Trait h2_ BLUPh2_bayesC EBV±DE MEBV±DE GEBV±DE

PL 0.30±0.06 0.13 138

±558-51

±522-38

±549

PPRO 0.33±0.02 0.64 0.002

±0.089-0.01

±0.087-0.008±0.087

PGRA 0.41±0.02 0.31 -0.011

±0.153-0.015±0.146

-0.012±0.154

SCS 0.27±0.02 0.25 -0.019

±0.311-0.025±0.319

-0.023±0.314

DE: standard deviation, h2_BLUP: traits obtained using BLUP, h2_bayesC: traits obtained by the bayes C method.



(MAS), pero a diferencia de otras metodologías MAS, incluye marcadores de forma masiva, que cubren todo el genoma, de tal manera que todos los QTL estén en desequilibrio de ligamiento con al menos un marcador (5). La SG permite la selección favorable de individuos basada en el valor de cría genómico (GEBV) y comparada con el BLUP convencional (1), provee valores de cría más exactos en animales jóvenes; pero el método BLUP provee valores de cría con mayor exactitud en animales adultos que van envejeciendo y que poseen pruebas de progenie (26). Además, la SG, a diferencia del método BLUP, puede ser más eficiente tanto en características de baja como de alta heredabilidad (27, 28).

En esta investigación se determinó la heredabilidad para PL, PGRA, PPRO y SCS, mediante los métodos BLUP y bayes C. Las heredabilidades para PL, PGRA y SCS fueron mayores cuando se usó el método BLUP con valores de 0.30, 0.41 y 0.27, comparadas con las estimadas usando bayes C, con valores de 0.13, 0.41 y 0.25 respectivamente. Para PPRO la heredabilidad fue mayor usando el método bayes C con un valor de 0.64 y usando BLUP fue 0.33. VanRaden et al (13), estimaron las heredabilidades para características productivas usando predicciones lineales genómicas y obtuvieron valores de 0.30 para PL, 0.50 para PPRO y PGRA y 0.12 para SCS. En las dos investigaciones las heredabilidades están dentro de los rangos normales, excepto que en la investigación actual, la heredabilidad para PPRO (estimada con bayes C), fue el doble de la estimada con BLUP. Según Visscher et al (29), falsas asociaciones pueden inflar la heredabilidad cuando se usan métodos genómicos.

En esta investigación, también fueron estimados valores de cría convencionales (EBV) mediante el método BLUP y valores genómicos (MEBV y GEBV), obtenidos mediante el método Bayes C, para las características productivas PL, PPRO, PGRA y SCS. Los valores genómicos (MEBV y GEBV), fueron comparados con el EBV convencional, usando como medida las correlaciones de Pearson (rpMEBV;EBV y rpGEBV;EBV) y Spearman (rsMEBV;EBV y rsGEBV;EBV) y el coeficiente de regresión lineal (bMEBV;EBV y bGEBV;EBV). Las correlaciones de Pearson y Spearman entre el GEBV y el EBV fueron altas en todos los casos (mayores de 0.98) y los coeficientes de regresión lineal del EBV sobre el GEBV fueron cercanos a 1 (oscilaron entre 0.979 y 1.008) como se indica en las tablas 4 y 5. Estos coeficientes son elevados dado que se utiliza un modelo que combina un primer efecto aleatorio asociado con los marcadores y un segundo efecto denominado efecto poligénico que tiene en cuenta la matriz de parentesco de los animales genotipificados (BLUP

1.051. These results indicate that the estimation of genetic values in the population evaluated using BLUP and Bayes C methods, did not alter significantly the magnitude of the genomic values (GEBV and MEBV) with respect to the conventional EBV. Likewise, the determination coefficients (R2) for the trait evaluated (PL, PPRO, PGRA and SCS were close to 1 (greater than 0.89 for linear regressions between EBV and MEBV and greater than 0.97 for linear regressions between EBV and GEBV). This shows a high linear relationship between genetic values (the data adjusts to a straight line), (Table 5).

DISCUSSION

The genomic selection (SG), is a type of marker- assisted selection (MAS), but unlike other methodologies, includes molecular markers massively, which cover all the entire genome, in such a way that all QTL’s are in linkage disequilibrium with at least one marker (5). SG allows a favorable selection of individuals based on the breeding genomic value (GEBV) and compared with conventional BLUP (1), provides breeding values more acurate in young animals; but the BLUP method provides breeding value more acurate in older animals that have progeny tests (26). Also, SG, unlike the BLUP method, can be more efficient in both low heritability as well as in high heritability traits (27,28).

This research determined that heritabilitys for PL, PGRA, PPRO and SCS, through the BLUP and bayes C methods. Heritabilities for PL, PGRA y SCS were higher when the BLUP method was used with values between 0.30, 0.41 and 0.27, compared to the estimated using the bayes C method, with values of 0.13, 0.41 and 0.25 respectively. For PPRO, the heritability was higher using the bayes C method with a value of 0.64 and using the BLUP method the value was 0.33. VanRaden et al (13) estimated the heritabilities for milk production traits using genomic linear predictions and obtained values of 0.30 for PL, 0.50 for PPRO and PGRA and 0.12 for SCS. In both research, heritabilities are within normal ranges, except in the current research, traits for PPRO (estimated with bayes C), was two-times the heritability estimated with BLUP. According to Visscher et al (29), false associations can inflate the heritability when genomic methods are used.

In this research, conventional breeding values (EBV) were also estimated with the BLUP method and genomic values (MEBV and GEBV), obtained with the Bayes C method for milk productions and quality traits PL, PPRO, PGRA and SCS. The genomic values (MEBV and GEBV) were compared with conventional EBV using as

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convencional). Según Muir et al (28), la selección fenotípica clásica (BLUP) puede capturar QTL independientemente de que haya desequilibrio de ligamiento entre QTL y marcadores, es decir que no necesita del uso de marcadores moleculares. Esto favorece el modelo empleado en el método bayes C, ya que puede capturar la varianza genética de los QTL en desequilibrio de ligamiento con los marcadores evaluados y la varianza genética restante a través del efecto poligénico.

Moser et al (11) usaron los genotipos de 7372 SNPs y los EBVs (confiabilidad promedio 89%) de 1945 toros Holstein para predecir el valor de cría molecular (MEBV) en PGRA, usando el método bayes R. La precisión y el sesgo de predicción del MEBV fue calculada mediante validación cruzada usando un grupo de entrenamiento de 706 toros jóvenes en los cuales se estimó el MEBV, que fue comparado con el EBV convencional.

La correlación entre el MEBV y el EBV convencional para PGRA fue moderada (rpMEBV;EBV = 0.56). No obstante, cuando se combina el MEBV con el efecto poligénico obtenido del pedigrí para obtener el GEBV, el coeficiente de correlación fue mayor (rpEBV;GEBV = 0.62). Estos resultados corroboran los obtenidos en la presente investigación para la característica PGRA (rMEBV,EBV = 0.967 ; rGEBV,EBV = 0.995), indicando la importancia de incluir el efecto poligénico en las evaluaciones genómicas, dado que el GEBV considera la proporción de la varianza genética capturada por los marcadores y la varianza poligénica no capturada por estos. Sin embargo, en las dos investigaciones, las correlaciones son diferentes, siendo mayores en la actual investigación. La explicación de esta diferencia en los resultados, se debe a que en la presente investigación, los valores genómicos (MEBV y GEBV) fueron estimados en una población de referencia, mientras que en la investigación de Moser et al (11), fueron estimados en una población de validación.

También debe considerarse la diferencia en los supuestos que usa cada método de estimación. Bayes C asume una fracción (π) de SNPs sin efecto ni varianza y la fracción restante (1- π) con efectos, los cuales se distribuyen como una normal, mientras que en Bayes R, aunque es una extensión de bayes C; los efectos de los SNPs se asumen con múltiples distribuciones normales (12).

De igual manera, Moser et al (11), determinaron el coeficiente de regresión del EBV sobre el MEBV (bMEBV;EBV) para PPRO y obtuvieron un valor 1.06 para el método de estimación bayes R. En la presente investigación, el coeficiente de regresión

measure the Pearson correlations (rpMEBV;EBV and rpGEBV;EBV) and Spearman correlations (rsMEBV;EBV and rsGEBV;EBV) and the linear regression coefficient (bMEBV;EBV and bGEBV;EBV). Pearson and Spearman correlations between the GEBV and the EBV were high in all cases (greater than 0.98) and linear regression coefficients of EBV on GEBV were close to 1 (ranged between 0.979 and 1.008) as indicated in tables 4 and 5. These coefficients are high since a model that combines a first random effect associated with the markers and a second effect called polygenic effect that considers the relationship matrix of genotyped animals. According to Muir et al (28), the phenotype classical selection (BLUP) can capture QTL regardless of if there is a linkage disequilibrium between QTL and the markers, meaning that it does not use molecular markers. This favors the model used in the bayes C method, since it can capture the genetic variance of QTL’s in the linkage disequilibrium with the evaluated markers and the remaining genetic variance through the polygenic effect.

Moser et al (11) used 7372 SNP genotypes and EBV’s (average reliability 89%) from 1945 Holstein bulls to predict the molecular estimated breeding value (MEBV) in PGRA, using the bayes R method. The precision and the bias of the prediction of the MEBV were calculated through a cross validation using a training group of 706 young bulls in which the MEBV was estimated and compared to the conventional EBV.

The correlation between the MEBV and the conventional EBV for PGRA was moderate (rpMEBV;EBV=0.56). Notwithstanding, when MEBV is combined with the polygenic effect obtained from the pedigree to obtain the GEBV, the correlation coefficient was higher (rpEBV;GEBV=0.62). These results corroborated the results obtained in this research for PGRA (rMEBV,EBV=0.967; rGEBV,EBV=0.995), indicating the importance of including the polygenic effect in genomic evaluations since GEBV considers a portion of the genetic variance captured for the markers and the polygenic variance not captured by the markers. However, in both investigations, the correlations are different, being higher in the investigation herein. The explanation for this difference in the results is because in this investigation, the genomic values (MEBV and GEBV) were estimated in a reference population, while in Moser et al (11) investigation, the genomic values were estimated in a validation population.

The difference between the assumptions used for each estimation method must also be considered. Bayes C assumes a fraction (π) of SNP’s without



(bMEBV;EBV) fue de 1.015, muy similar al obtenido por los autores mencionados. Estos resultados indican que el cambio en magnitud de los MEBVs con respecto a los EBVs convencionales es muy pequeño. Un valor mayor de uno sugiere que los marcadores no capturaron toda la varianza genética, mientras que un valor menor de 1 indica que la predicción genómica sería inflada con respecto al método convencional (BLUP) y de ser así, los valores genómicos serían sesgados con respecto a los EBVs convencionales. Por otra parte, el coeficiente de regresión del EBV sobre el GEBV para PGRA fue levemente menor de 1 (bGEBV;EBV = 0.988), dado que al combinar los efectos de los marcadores y el efecto poligénico, el GEBV captura mayor proporción de la varianza genética y por tanto será más cercano a 1 comparado con el MEBV.

Verbyla et al (23), en un estudio de simulación, evaluaron 4 métodos bayesianos; Bayes BLUP, Bayes A, Bayes A/B y Bayes C, los cuales fueron empleados para estimar GEBVs. Los GEBVs fueron comparados con los valores genéticos verdaderos (TEBV) que fueron obtenidos por simulación. Los resultados de correlación entre TEBV y GEBV, (rGEBV;TEBV) fueron 0.885, 0.857, 0.889 y 0.861 y Los coeficientes de regresión (bGEBV:TEBV) fueron: 0.979, 1.162, 1.081 y 1.024 respectivamente para cada método. Estos resultados muestran ver que el uso de una información a priori relevante en regresiones bayesianas es de gran importancia en la estimación de valores genómicos, permitiendo obtener predicciones más precisas y menos sesgadas.

En la presente investigación, se obtuvieron correlaciones (rpGEBV,EBV) mayores de 0.98 para PL, PPRO, PGRA y SCS y coeficientes de regresión (bGEBV;EBV) que oscilaron entre 0.979 y 1.008 para las mismas características. Sin embargo, aunque las correlaciones entre los MEBV y los EBVs convencionales fueron ligeramente más bajas en todas las características evaluadas (rpMEBV;EBV mayores de 0.93). Estos resultados son similares que los obtenidos por Verbyla et al (23), quienes sugieren que los métodos bayesianos son consistentes en datos simulados y datos reales.

Verbyla et al (23), también determinaron la correlación por rangos para 100 animales y obtuvieron valores altos (0.691, 0.696, 0.73 y 0.71) para cada método respectivamente. En la presente investigación también fue determinada la correlación de Spearman (rsGEBV,EBV). Los valores de correlación para PL, PPRO, PGRA y PL fueron: 0.991, 0.983, 0.989 y 0.986 y se consideran altos, lo que indica que no hay cambios significativos en la clasificación o ranking de los animales. Las correlaciones por rango de Spearman entre el

effect or variance and the remaining fraction (1- π) with effects, which are distributed as a normal fraction; while in Bayes R, although an extension of bayes C, the effects of SNP’s are assumed as multiple normal distributions (12).

Likewise, Moser et al (11), determined the regression coefficient of the EBV on the MEBV (bMEBV;EBV) for PPRO and they obtained a value of 1.06 for the bayes R estimation method. In this investigation, the regression coefficient (bMEBV;EBV) was 1.015, very similar to that obtained by the mentioned authors. These results indicate that the change in magnitude of the MEBV’s with respect to conventional EBV’s is very small. A value greater than one suggests that the markers do not capture the whole genetic variance, while a value less than 1 indicates that the genomic prediction would be inflated with respect to the conventional method (BLUP) and if such is the case, the genomic values would be biased with respect to the conventional EBV’s. On the other hand, the regression coefficient of EBV on GEBV for PGRA was slightly less than 1 (bGEBV;EBV = 0.988), because when combining the effects of the markers and the polygenic effect, the GEBV captures a greater portion of the genetic variance and therefore, it will be closer than 1 compared to the MEBV.

Verbyla et al (23), in a simulation study, evaluated 4 bayesian methods; Bayes BLUP, Bayes A, Bayes A/B and Bayes C, which were used to estimate GEBVs. GEBVs were compared to true estimated breeding value (TEBV), which were obtained by simulation. The correlation results between TEBV and GEBV, (rGEBV;TEBV) were 0.885, 0.857, 0.889 and 0.861 and the regression coefficients (bGEBV:TEBV) were: 0.979, 1.162, 1.081 and 1.024 respectively for each method. These results show that the use of relevant a priori information in bayesian regressions is of great importance in the estimation of genomic values, allowing obtaining more precise and less biased predictions.

In this investigation, correlations (rpGEBV,EBV) greater than 0.98 were obtained for PL, PPRO, PGRA and SCS and regression coefficients (bGEBV;EBV) that range between 0.979 and 1.008 for the same traits. However, although the correlations between MEBV’s and conventional EBV’s were slightly lower in all of the evaluated characteristics (rpMEBV;EBV greater than 0.93). These results are similar to those obtained by Verbyla et al (23), whom suggest that the bayesian methods are consistent in simulated data and real data.

Verbyla et al (23), also determined that the correlation by ranges for 100 animals and

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MEBV y el EBV (rsMEBV,EBV) también fueron altas (mayores de 0.93), pero levemente inferiores que las obtenidos entre el GEBV y el EBV.

En otro estudio, Legarra et al (30), usaron los genotipos de 51325 SNPs y los 2DYDs (doble producción de las hijas) de 1756 toros Holstein para predecir valores genómicos (GEBV) para PL, PPRO y PGRA. Los efectos de los marcadores fueron estimados usando el método Bayes LASSO (BL2Var). La estimación de los GEBVs fue realizada mediante validación cruzada usando un grupo de entrenamiento de 1216 toros jóvenes y fueron comparados con el 2DYD. Las correlaciones (rGEBV;2DYD) para PL, PGRA y PPRO fueron: 0.41, 0.73 y 0.48 y los coeficientes de regresión (bGEBV,2DYD) fueron: 0.67, 1.18 y 1.10 respectivamente. Los resultados mostraron que las correlaciones (rGEBV;2DYD) fueron más altas en PPRO y PGRA comparadas con producción de leche. Los autores sugieren que un coeficiente de regresión menor de 1 (b<1), indica una inflación de la varianza genética en características de producción como es el caso de PL, mientras que en características composicionales, la mayor parte de la variación genética es capturada por grandes efectos QTL, por los cual, los coeficientes de regresión tienden a ser mayores de 1 (b>1), como es el caso de PPRO y PGRA. En la presente investigación puede considerarse un comportamiento similar en PGRA, en la cual se obtuvo un coeficiente de regresión mayores que 1 (bMEBV;EBV = 1.015), mientras que en SCS fue menor de 1 (bMEBV;EBV = 0.95).

En conclusión, se considera que la estimación de valores genómicos (GEBV) y valores moleculares (MEBV) usando el método Bayes C fue consistente con los EBVs convencionales estimados mediante el método BLUP; permitiendo obtener altas asociaciones entre los valores genéticos en todas las características evaluadas y una alta asociación en el ranking o clasificación de los animales establecida por sus valores genómicos (MEBV y GEBV) y EBVs convencionales. Por su parte, teniendo en cuenta los coeficiente de regresión (bGEBV;EBV), no se dió un cambio significativo en la magnitud entre los valores genómicos (MEBV y GEBV) y los EBVs convencionales, dado que los coeficientes de regresión fueron muy cercanos a uno.

Sin embargo, debe considerase que en la presente investigación fueron estimados los efectos de los marcadores en una población de referencia pequeña, como punto de partida de la implementación de selección genómica y se trata de abordar la metodología presentando algunos resultados iniciales de comparación entre un modelo de selección genómica y

obtained high values (0.691, 0.696, 0.73 and 0.71) for each method, respectively. In this investigation a Spearman correlation (rsGEBV,EBV) was also determined. The correlation values for PL, PPRO, PGRA and PL were: 0.991, 0.983, 0.989 and 0.986 and they are considered high, which indicates that there are no significant changes in the classification or ranking of animals. Spearman correlation by ranges between the MEBV and the EBV (rsMEBV,EBV) were also high (greater than 0.93), but slightly less than those obtained between the GEBV and the EBV.

In another study, Legarra et al (30) used 51325 SNPs and 2DYDs (double production of daughters) from 1756 Holstein bulls to predict genomic values (GEBV) for PL, PPRO and PGRA. The effects of the markers were estimated using the Bayes LASSO method (BL2Var). The estimation of the GEBVs was conducted through cross validation using a training group of 1216 young bulls and was compared with the 2DYD. The correlations (rGEBV;2DYD) for PL, PGRA and PPRO were: 0.41, 0.73 y 0.48 and the regression coefficients (bGEBV,2DYD) were: 0.67, 1.18 and 1.10 respectively. The results showed that the correlations (rGEBV;2DYD) were higher in PPRO and PGRA compared to the production of milk. The authors suggest that a regression coefficient less than 1 (b<1), indicates an inflation in the genetic variance in milk production traits like in the case of PL; while in the milk quality traits, the largest part of the genetic variation is captured by large QTL effects; therefore, the regression coefficients tend to be greater than 1 (b>1), like in the case of PPRO and PGRA. In this investigation it can be considered a similar behavior in PGRA, in which a regression coefficient greater than 1 (bMEBV;EBV = 1.015) was obtained, while in SCS it was less than 1 (bMEBV;EBV = 0.95).

In conclusion, the predictions of genomic values (GEBV) and molecular values (MEBV) using bayes C method were consistent with the predictions of the EBVs estimate through the conventional method (BLUP); allowing to obtain high associations between all evaluated traits and a high association in the ranking or classification of the animals established by their genomic values (MEBV and GEBV) and conventional EBV’s. On the other hand, considering the regression coefficient (bGEBV;EBV), a significant change in the magnitude between the genomic values (MEBV and GEBV) and conventional EBVs did not occur, given that the regression coefficients were close to one.

However, in this investigation it must be considered that the effects of the markers were estimated in a small reference population



el modelo convencional. No obstante, es indispensable incrementar el número de animales genotipificados y el número de SNPs para lograr consolidar una población referencia de la cual se pueda realizar evaluaciones genómicas más confiables.

as a starting point in the implementation for the genomic selection and the methodology addressed presents some initial comparison results between the genomic selection model and the conventional model. Notwithstanding, it is indispensable to increase the number of genotyped animals and the number of SNPs in order to consolidate a reference population on which more reliable genomic evaluations can be conducted.

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ORIGINAL


Total mercury concentrations in fish from Urrá reservoir (Sinú river, Colombia). Six years of monitoring

Concentraciones de mercurio total en peces del embalse Urrá (río Sinú, Colombia). Seis años de monitoreo

José Marrugo-Negrete,1* Ph.D, Amado Navarro-Frómeta,2 Ph.D, Javier Ruiz-Guzmán,1 M.Sc.

1University of Córdoba, Facult of Basic Sciences, Water Applied and Environmental Chemistry Group, Cra 6 # 76-103, Monteria, Colombia. 2Technological University of Izúcar Matamoros. Prolongación Reforma # 168, neighborhood Santiago Mihuacán, Izúcar of Matamoros, México. *Correspondence: [email protected]

Received: September 2014; Accepted: February 2015. ABSTRACT

Objective. The aim of this study was to monitor the total mercury (T-Hg) concentrations in fish from the Urrá reservoir, after impoundment. Materials and methods. Five fish species at different trophic levels were sampled from 2004 to 2009 and analyzed by cold-vapor atomic absorption spectroscopy for T-Hg concentrations in muscle tissue. Water quality parameters were evaluated. Results. The highest (1.39±0.69 µg/g ww) and lowest (0.15±0.02 µg/g ww) T-Hg concentrations were detected in Hoplias malabaricus (piscivorous) and Cyphocharax magdalenae (iliophagous/detritivorous) respectively, whereas Leporinus muyscorum (omnivorous) had an intermediate level (0.40±0.11 µg/g ww). The organic matter content in the water increased with time and depth, whereas dissolved oxygen and pH decreased. A covariance analysis (with fish length as a covariate) shows a steady increase of T-Hg levels in all the studied species after impoundment. Conclusions. The T-Hg concentrations in the evaluated fish species, increased after impoundment. The water quality variables showed conditions favoring Hg methylation and its biomagnification, this last was evident in the fish food chain of the reservoir.

Key words: Bioaccumulation, food chain, food habits (Source: CAB).

RESUMEN

Objetivo. El objetivo de este estudio fue monitorear las concentraciones de mercurio total (Hg-T) en peces del embalse Urrá después del represamiento. Materiales y métodos. Cinco especies de peces de diferentes niveles tróficos fueron muestreadas de 2004 a 2009 y analizadas por espectroscopia de absorción atómica para las concentraciones de Hg-T en tejido muscular. Se evaluaron parámetros de calidad de agua. Resultados. Las mayores (1.39±0.69 μg/g ph) y menores (0.15±0.02 μg/g ph) concentraciones de Hg-T fueron detectadas en Hoplias malabaricus (piscívoro) y Cyphocharax magdalenae (iliófago/detritívoro) respectivamente, mientras que Leporinus muyscurum (omnívoro) tuvo un nivel intermedio (0.40±0.11 μg/g ph). El contenido de materia orgánica en el agua se incrementó con el tiempo y la profundidad, mientras que el oxígeno disuelto y el pH disminuyeron. Un análisis de covarianza (con la longitud del pez como covariante) mostró un incremento sostenido de los niveles de Hg-T en todas las especies evaluadas después del represamiento. Conclusiones. Las concentraciones de Hg-T en las especies de peces evaluadas, incrementaron después del represamiento. Las variables de calidad de agua mostraron condiciones favorables para la metilación del Hg y su biomagnificación, estos último fue evidente en la cadena alimenticia de los peces del embalse.

Palabras clave: Bioacumulación, cadena alimenticia, hábitos alimenticios (Fuente: CAB).

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INTRODUCTION

Among the metals of environmental concern, mercury (Hg) is considered a priority pollutant due to its ubiquity, persistency, accumulation, and toxicity. Monomethylmercury (MeHg) is an important form of Hg because it is a potent neurotoxin with lipophilic characteristics and is able to bind proteins, causing severe damage to vertebrates (1). Hg uptake by humans occurs through the contaminated food ingestion and is the main route of uptake for populations that depend on fishing because Hg transferred to the biotic compartment is bioaccumulated and biomagnified by fish (2).

Reservoirs are created for various purposes, including hydropower generation, irrigation, flood control, water supply, fishery production, navigation and recreation. Although reservoirs provide significant benefits, they also have potential socioeconomic and environmental impacts (3). It has been demonstrated that the transfer of Hg to the aquatic food chain, increases in freshwater impoundments (4). Indeed, increased Hg levels in fish from hydroelectric reservoirs have been frequently reported, and these findings also show that fish species at high trophic levels have the highest Hg concentrations (5,6).

The main source of Hg in reservoirs is the soil cover, which retains Hg bonded to organic matter. Other sources of Hg, such as dry deposition and watershed runoff, may be important. The timing and magnitude of the response in fish to Hg concentrations will vary depending on ecosystem-specific variables such as sulfur and iron levels, pH, the amount of flooded terrestrial carbon and Hg speciation (7). Given that the creation of hydroelectric reservoirs in the tropics generally involves the flooding of large areas of dense forest and the occurrence of high water temperatures, an increase in the activity of sulfate-reducing bacteria and plankton microorganisms in anoxic conditions, favored by the decomposition of submerged organic matter, also enhances MeHg production, primarily from sediments but also in the water column (6, 8).

In Colombia, there is evidence of Hg contamination in fish from sites traditionally dedicated to and/or influenced by gold mining (9-11). However, although there are currently 24 active reservoirs in Colombia (12), with 10 more planned over the years 2010 – 2024 (13), only there are published studies about the potential impact of dams on Hg concentrations in fish and the potential risk for human health resulting from continuing consumption of fish, for one reservoir (14, 15). In

INTRODUCCIÓN

Entre los metales de preocupación ambiental, el mercurio (Hg) es considerado un contaminante prioritario debido a su ubicuidad, persistencia, acumulación y toxicidad. El Monometilmercurio (MeHg) es una forma importante de Hg debido a que es una potente neurotoxina con características lipofílicas y es capaz de unirse a las proteínas, causando daños severos a los vertebrados (1). La captación de Hg por los humanos ocurre a través de la ingesta de alimentos contaminados y es la principal ruta de exposición para poblaciones que dependen de la pesca debido a que el Hg transferido al compartimento biótico es bioacumulado y biomagnificado por los peces (2).

Los embalses son creados por varias razones, incluyendo generación de energía hidroeléctrica, irrigación, control de inundaciones, suministro de agua, producción pesquera, navegación y recreación. Aunque los embalses ofrecen beneficios significativos, también tienen potenciales impactos socioeconómicos y ambientales (3). Se ha demostrado que la transferencia de Hg a la cadena alimenticia acuática, incrementa en embalses de agua dulce (4). De hecho, niveles incrementados de Hg en peces de embalses hidroeléctricos son frecuentemente reportados, y estos hallazgos también muestran que las especies de peces de altos niveles tróficos tienen las mayores concentraciones de Hg (5,6).

La principal fuente de Hg en los embalses es la capa de suelo, que retiene Hg unido a la materia orgánica. Otras fuentes de Hg, como la deposición seca y escorrentía de cuencas hidrográficas, pueden ser importantes. Los tiempos y la magnitud de la respuesta en los peces a las concentraciones de mercurio varían dependiendo de variables específicas del ecosistema tales como niveles de azufre y hierro, pH, la cantidad de carbón terrestre inundado y la especiación de Hg (7). Dado que la creación de embalses hidroeléctricos en el trópico generalmente incluye la inundación de grandes áreas de bosque denso y la ocurrencia de altas temperaturas del agua, un incremento en la actividad de bacterias sulfatoreductoras y microorganismos del plancton en condiciones anóxicas, favorecida por la descomposición de la materia orgánica sumergida, también aumenta la producción de MeHg, principalmente de los sedimentos pero también en la columna de agua (6,8).

En Colombia, hay evidencia de contaminación de Hg en peces de sitios tradicionalmente dedicados a y/o influenciados por la minería de oro (9-11). Sin embargo, aunque existen actualmente 24 embalses activos en Colombia (12), con 10 más planeados entre los años 2010 y 2024 (13), sólo

Marrugo-Negrete - Total mercury in fish from Urrá reservoir


this regard, the aim of this study was to monitor the total mercury (T-Hg) concentrations in fish from the Urrá reservoir after impoundment.


Study site. The Urrá hydroelectric power station is located on the Sinú River, in northwestern Colombia (N 7°49′51″ – 8°00′56″, W 76°12′45″ – 76°18′55″) (Figure 1). The station is situated 30 km south of the municipality of Tierralta, Department of Córdoba, Colombia. The reservoir is fed by the Sinú River (average inflow 350 m3/s) and its tributaries. Several of these tributaries are located in the Paramillo Nature Reserve catchment area, part of which was flooded in the year 2000 with the filling the reservoir. The flood area covers 7400 ha of tropical rain forest, with a monthly rainfall range from 20 to 350 mm, with an annual average of 2212 mm. A maximum temperature of 37.5, a mean of 28.2 and a minimum of 18.7°C have been recorded (16, 17).

Sample collection and treatment. Five fish species with different food habits were investigated in this study. These species included the carnivorous-piscivorous Hoplias malabaricus (Moncholo) and Caquetaia kraussii (Mojarra amarilla), the omnivorous Leporinus muyscorum (Liseta) and the detritivore-iliophagous Prochilodus magdalenae (Bocachico) and Cyphocharax magdalenae (Yalúa). Specimens of each of the study species were caught during

76°12’ W 76°08’ W 76°16’ W 76°20’ W

8°00

’ N

7°56

’ N

7°52

’ N

7°44

’ N

7°48

’ N

COLOMBIA

Córdoba

Dam Sinú River

W * S1*

*

*

Road

Manso River

Sinú

River

Emerald River

Green River

8 km 0

N

S3

* S4

S2

Figure 1. Study area: Urrá reservoir and sampling stations for water and sediments (S) and water (W). S1=Chivogadó Village, S2=Km 40 Village, S3=Lourdes Stream, S4=Las Claras Stream. The fish samples were collected in the station S3 and S4. Adapted from Valderrama et al (16).

hay estudios publicados con relación al potencial impacto de los embalses en las concentraciones de Hg en peces y el riesgo potencial para la salud humana resultado del consumo continuo de pescado, para un embalse (14, 15). En este sentido, el objetivo de este estudio fue monitorear las concentraciones de mercurio total (Hg-T) en peces del embalse Urrá después del represamiento.


Sitio de estudio. La estación hidroeléctrica de Urrá está ubicada en el río Sinú, en el noreste de Colombia (N 7°49′51″ – 8°00′56″, W 76°12′45″ – 76°18′55″) (Figura 1). La estación está ubicada 30 km al sur del municipio de Tierralta, Departamento de Córdoba, Colombia. El embalse es alimentado por el río Sinú (caudal promedio de 350 m³/s) y sus afluentes. Varios de estos afluentes están ubicados en las zonas de captación de la reserva natural Paramillo, una parte de la cual fue inundada en el año 2000 para llenar el embalse. El área de inundación cubre 7400 ha de bosque tropical húmedo, con una precipitación mensual entre 20 y 350 mm, con un promedio anual de 2212 mm. Una temperatura máxima de 37.5°C, media de 28.2°C y mínima de 18.7°C ha sido registrada en el área (16,17).Recolección y tratamiento de muestras. En este estudio se investigaron cinco especies de peces con diferentes hábitos alimenticios. Esas especies incluyeron los carnívoros - piscívoros Hoplias malabaricus (Moncholo) y Caquetaia kraussii (Mojarra amarilla), el

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six yearly sampling periods in January from 2004 to 2009, that is between four and nine years after filling the reservoir. The samples were collected with the help of local fishermen with a gill net. For each species, 3 - 6 samples were collected annually within the reservoir, 3 samples approximately 3 km downstream from the reservoir and 3 samples at a comparison site located approximately 60 km downstream from the reservoir. The fishes were individually packed, stored in iceboxes at 4°C and shipped to the laboratory, where they were immediately measured (standard length, from the nose to the caudal fin base: (±0.5 cm)). One piece of white muscle was removed from below the dorsal fin for the determination of T-Hg. The muscle samples were kept frozen at -20°C until analysis.

From 2004 to 2008, water samples were collected at different depths (0, 5 and 32 m) using a Van Dorn bottle from a boat at one of the sites of maximum water depth of the reservoir (W station, Figure 1). The samples were used for the determination of water pH, dissolved oxygen (DO) and total organic matter (OM). In 2009, water and sediment samples were collected at different stations on the reservoir (S stations, Figure 1) for the analysis of T-Hg. The water samples (2 L per station) were collected with a polycarbonate Van Dorn bottle to 1 m below the surface of the water and then poured into clean, acid-washed polyethylene (HDPE) containers. The samples were acidified with HNO3 to pH<2 and were kept refrigerated until analysis within 1 week after collection. Sediment samples were obtained by lowering a Van Veen grab from a boat. At each station, four sediment subsamples were collected at all cardinal points within a 2 m radius from the reference point. The samples were placed in plastic bags, labeled and packed in ice, transported to the laboratory, and dried at 40ºC in a drying oven.

Mercury determination. The T-Hg in the unfiltered water samples was measured using cold vapor atomic absorption spectroscopy (CVAAS) after digestion with a diluted KMnO4-K2S2O8 solution for 2 h at 95°C (18). The detection limit (3 times the standard deviation of 10 blank samples) was 0.1 µg/L. The sediments were digested with H2SO4-HNO3 (7:3, v/v) and KMnO4 (5%, w/v) at 100°C for 1 h (19), whereas the fish samples were treated with H2SO4-HNO3 (2:1, v/v) at 100–110°C for 3 h (14). The detection limits for the sediments and fish were 26.4 µg/kg dry weight (dw) and 13.1 µg/kg wet weight (ww), respectively. Quality control was performed with certified materials and spiked samples. The T-Hg concentration for water (NIST, Standard Reference Material 1641d) was

omnívoro Leporinus muyscorum (Liseta) y los detritívoros Prochilodus magdalenae (Bocachico) y Cyphocharax magdalenae (Yalúa). Especímenes de cada una de las especies del estudio fueron capturadas durante seis periodos de muestreo (uno por año) en enero de 2004 a 2009, esto es entre cuatro y nueve años después del llenado del embalse. Las muestras fueron recolectadas con la ayuda de pescadores locales con un trasmallo. Para cada especie, tres a seis muestras fueron recolectadas anualmente dentro del embalse, tres muestras aproximadamente 3 km río abajo del embalse y tres muestras en un sitio de comparación ubicado aproximadamente a 60 km río abajo del embalse. Los peces fueron individualmente empacados, almacenados en cajas con hielo a 4°C y enviados al laboratorio, donde fueron inmediatamente medidos (longitud estándar, desde la nariz hasta la base de la aleta caudal: (±0.5 cm)). Un pedazo de músculo blanco fue removido de la parte inferior de la aleta dorsal para la determinación de Hg-T. Las muestras de músculo se mantuvieron congeladas a -20°C hasta su análisis.

Entre 2004 y 2008, se recolectaron muestras de agua a diferentes profundidades (0.5 y 32 m) utilizando una botella Van Dorn desde una embarcación en uno de los sitios de máxima profundidad del embalse (Estación W, Figura 1). Las muestras fueron utilizadas para determinar el pH del agua, oxígeno disuelto (OD) y materia orgánica total (MO). En 2009, se recolectaron muestras de agua y sedimentos en diferentes estaciones del embalse (Estaciones S, Figura 1) para el análisis de Hg-T. Las muestras de agua (2L por estación) fueron recolectadas con una botella de policarbonato Van Dorn a 1 m debajo de la superficie y luego vertidas en contenedores de polietileno (HDPE) limpios, lavados con ácido. Las muestras fueron acidificadas con HNO3 a pH<2 y se mantuvieron refrigeradas hasta su análisis una semana después de su recolección. Las muestras de sedimentos se obtuvieron con una draga Van Veen desde una embarcación. En cada estación, cuatro sub muestras de sedimento fueron recolectadas en puntos cardinales en un radio de 2 m del punto de referencia. Las muestras fueron colocadas en bolsas plásticas, rotuladas y empacadas en hielo, transportadas al laboratorio y secadas a 40°C en un horno de secado.

Determinación de mercurio. El Hg-T en muestras sin filtrar de agua fue medido utilizando espectrometría de absorción atómica de vapor frío (CVAAS) luego de la digestión con una solución diluida de KMnO4-K2S2O8 a 95°C (18). El límite de detección (tres veces la desviación estándar de 10 muestras testigo) fue 0.1 μg/L.



1.581±0.022 mg/L (certified value, 1.590±0.018 mg/L). The T-Hg concentration for the biological material (DORM-2, dogfish muscle; National Research Council Canada) was 4.46 ± 0.25 µg/g dw (certified value, 4.64 ± 0.26 µg/g dw), and the concentration for sediments (CRM008-050; Resource Technology Corp.) was 0.74 ± 0.02 µg/g dw (certified value, 0.72 ± 0.03 µg/g dw). The Hg recovery percentages from the spiked samples were 98.0 ± 4.2% and 95.2 ± 4.3% (n = 6) for sediments and fish, respectively. In both methods, the RSD was <10%. The T-Hg concentrations in the sediments are reported on a dry weight basis, whereas those in fish are expressed on a fresh or wet weight basis. All mercury determinations were conducted in an S-Series 4 Atomic Absorption Spectrophotometer (Thermo Electron Corporation, United Kindom).

pH, DO and OM determination. DO and pH were measured in situ using a portable multi-meter (Thermo Scientific, Orion 3STAR and Orion 4STAR models, respectively). The instrument for measuring dissolved oxygen was calibrated at the laboratory, and the pH meter was calibrated at each sampling site with two buffer solutions. The organic matter content was estimated based on standard methods of APHA (20).

Statistical treatment of data. To study the effects of site, species and year on T-Hg concentrations, an analysis of variance (ANOVA) and an analysis of covariance (ANCOVA) were performed after checking the normality and homoscedasticity (Shapiro-Wilk and Bartlett tests) of the error term. The length of the fish was used as a covariate in the ANCOVA. If the null hypothesis (no factor effect) was rejected, a Duncan test was used to evaluate the differences between pairs of treatment means. For all statistical tests, p<0.05 was considered significant. The slopes of the changes in T-Hg with length for each species and year were determined by linear regression. The computations were performed with Statistica V 7.0 software.

RESULTS

T-Hg concentrations in fish. For all species, the T-Hg levels in the fish collected in the reservoir were higher than were those at the comparison site during all sampling years (Table 1). In decreasing order of T-Hg levels (and differences from the comparison site values), the species may be arranged in the order H. malabaricus > C. kraussii > L. muyscorum > P. magdalenae ≥ C. magdalenae. The degree of contamination increased from detritivorous to piscivorous species, with omnivorous fish showing intermediate T-Hg concentrations.

Los sedimentos fueron digeridos con H2SO4-HNO3 (7:3, v/v) y KMnO4 (5%, p/v) a 100°C por una hora (19), mientras que las muestras de peces fueron tratadas con H2SO4-HNO3 (2:1, v/v) a 100-110°C por tres horas (14). Los límites de detección para los sedimentos y los peces fueron 26.4 μg/kg peso seco (ps) y 13.1 μg/kg peso húmedo (ph), respectivamente. El control de calidad se realizó con materiales certificados y muestras enriquecidas. La concentración de Hg-T para el agua (NIST, Material Estándar de Referencia 1641d) fue 1.581±0.022 mg/L (valor certificado, 1.590±0.018 mg/L). La concentración de Hg-T para material biológico (DORM-2, músculo dogfish; Concejo Nacional de Investigación de Canadá) fue de 4.46 ± 0.25 μg/g ps (valor certificado, 4.64±0.26 μg/g ps), y la concentración para sedimentos (CRM008-050; Resource Technology Corp.) fue de 0.74±0.02 μg/g ps (Valor certificado, 0.72±0.03 μg/g ps). Los porcentajes de recuperación de Hg para las muestras enriquecidas fueron de 98.0±4.2% y 95.2±4.3% (n=6) para sedimentos y peces, respectivamente. En ambos métodos, la desviación estándar relativa fue <10%. Las concentraciones de Hg-T en los sedimentos se reportaron con base en su peso seco, mientras que en los peces se expresan con base en su peso freso o húmedo. Todas las determinaciones de Hg se realizaron con un Espectrómetro de Absorción Atómica S-Serie 4 (Thermo Electron Corporation, Reino Unido).

Determinación de pH, OD y MO. El pH y OD fueron medidos en el sitio utilizando un multímetro portátil (modelos Thermo Scientific, Orion 3STAR y Orion 4STAR, respectivamente). El instrumento para medir el oxígeno disuelto fue calibrado en el laboratorio, y el medidor de pH fue calibrado en cada sitio de muestreo con 2 soluciones buffer. El contenido de materia orgánica fue estimado con base en métodos estándar APHA (20).

Tratamiento estadístico de los datos. Para estudiar los efectos del sitio, especie y años sobre las concentraciones de Hg-T, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y un análisis de covarianza (ANCOVA) luego de verificar la normalidad y homosedasticidad (pruebas de Shapiro-Wilk y Bartlett) del término de error. La longitud del pez fue utilizada como covariable en el ANCOVA. Si la hipótesis nula (ningún efecto del factor) fue rechazad, una prueba de Duncan se utilizó para evaluar las diferencias entre pares de medias de tratamiento. Para todas las pruebas estadísticas, p<0.05 se consideró significativo. Las pendientes del cambio del Hg-T con longitud para cada especie y años se determinaron por regresión linear. Los cómputos se realizaron con el software Statistica V 7.0

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T-Hg concentrations of fish from Urrá reservoir were normalized with the length for evaluate their evolution during the study period (Figure 2). The concentrations increased from 2004 to 2008 in the carnivorous fish, and from 2004 to 2007 in the omnivorous and detritivoruos fish. Subsequently, the T-Hg levels showed a tendency to decrease.

Water parameters and T-Hg in fish. The changes in the water parameters from 2004 to 2008 showed an increase in the OM content

Table 1. T-Hg concentrations (µg/g ww) in fish from Urrá reservoir.

Specie FHa YearUrrá Reservoir Comparison site

UR/CSb

n Mean±SD Interval n Mean±SD IntervalH. malabaricus

C

2004 9 0.626±0.192 0.412-0.991 3 0.125±0.025 0.100-0.150 5.0

2005 10 0.814±0.537 0.403-1.960 3 0.121±0.035 0.086-0.156 6.7

2006 10 1.380±0.759 0.583-2.530 3 0.128±0.048 0.080-0.176 10.8

2007 10 1.388±0.687 0.424-2.377 3 0.149±0.051 0.098-0.200 9.3

2008 10 1.339±0.601 0.647-2.248 3 0.161±0.102 0.059-0.263 8.3

2009 8 1.324±0.430 0.634-1.932 3 0.161±0.044 0.117-0.205 8.2

C. kraussii

C

2004 6 0.450±0.087 0.345-0.570 3 0.115±0.028 0.087-0.143 3.9

2005 6 0.562±0.144 0.338-0.683 3 0.131±0.018 0.113-0.149 4.3

2006 6 0.570±0.123 0.432-0.730 3 0.118±0.036 0.082-0.154 4.8

2007 5 1.062±0.249 0.738-1.405 3 0.117±0.038 0.079-0.155 9.1

2008 5 0.989±0.334 0.688-1.385 3 0.127±0.045 0.082-0.172 7.8

L. muyscorum

O

2004 10 0.282±0.060 0.198-0.383 3 0.084±0.018 0.066-0.102 3.4

2005 10 0.344±0.057 0.255-0.430 ns ns ns -

2006 9 0.389±0.059 0.320-0.498 ns ns ns -

2007 8 0.405±0.111 0.212-0.548 3 0.077±0.023 0.054-0.100 5.3

2008 8 0.376±0.082 0.278-0.537 3 0.082±0.034 0.048-0.116 4.6

2009 9 0.362±0.075 0.226-0.465 3 0.098±0.019 0.079-0.117 3.7

P. magdalenae

DI

2004 9 0.183±0.014 0.163-0.208 3 0.055±0.008 0.047-0.063 3.3

2005 10 0.208±0.026 0.178-0.267 3 0.061±0.012 0.049-0.073 3.4

2006 9 0.221±0.026 0.190-0.254 3 0.052±0.008 0.044-0.060 4.3

2007 10 0.233±0.035 0.178-0.284 3 0.052±0.011 0.041-0.063 4.5

2008 7 0.203±0.028 0.167-0.251 3 0.060±0.009 0.051-0.069 3.4

2009 9 0.206±0.034 0.174-0.275 3 0.063±0.017 0.046-0.080 3.3

C. magdalenae

DI

2004 6 0.151±0.019 0.128-0.174 3 0.054±0.012 0.042-0.066 2.8

2005 5 0.178±0.016 0.161-0.197 ns ns ns -

2006 4 0.180±0.012 0.169-0.194 3 0.057±0.009 0.048-0.066 3.2

2007 4 0.207±0.019 0.178-0.220 ns ns ns -

2008 3 0.180±0.025 0.156-0.206 3 0.065±0.012 0.053-0.077 2.8

a Food habit: C = Carnivorous, O = Omnivorous, DI = Detritivore iliophagousb Ratio T-Hg in Urrá/T-Hg at comparison site; ns = no specimens caught

RESULTADOS

Concentraciones de Hg-T en peces. Para todas las especies, los niveles de Hg-T de los peces recolectados dentro del embalse fueron mayores que los del sitio de comparación durante todos los años de muestreo (Tabla 1). En orden decreciente de niveles de Hg-T (y con diferencias respecto al sitio de comparación), las especies pueden organizarse en el siguiente orden H. malabaricus > C. kraussii > L. muyscorum > P. magdalenae ≥ C. magdalenae. El grado de



and decrease in DO and pH with time and depth (Figure 3). All variables were strongly and significantly correlated (R ≥ 0.991). The T-Hg concentrations of samples collected in 2009 were 173.2 ± 14.1 µg/kg dw in sediment and 0.14 ± 0.04 µg/L in water. The analysis of correlation between T-Hg concentration of fish with OM, pH

Figure 2. Values of T-Hg concentrations in fish from the Urrá reservoir normalized to unit length (cm) vs year.

Figure 3. Measured water parameters from 2004 to 2008 in the Urrá reservoir at different depths (0, 5 y 32 m). OM = Organic matter, DO = Dissolved oxygen.

contaminación incrementó de especies detritívora a piscívora, con los peces omnívoros mostrando concentraciones intermedias de Hg-T.Las concentraciones de Hg-T de los peces del ensamble Urrá fueron normalizadas con la longitud para evaluar su evolución durante el periodo de estudio (Figura 2). Las concentraciones incrementaron entre 2004 y 2008 en los peces carnívoros, y entre 2004 y 2007 en los peces omnívoros y detritívoros. Subsiguientemente, los niveles de Hg-T mostrar una tendencia a disminuir.

Parámetros del agua y Hg-T en peces. Los cambios en los parámetros de agua entre 2004 y 2008 mostraron un incremento del contenido de MO y una disminución del OD y pH con el tiempo y la profundidad (Figura 3). Todas las variables fueron fuertemente y significativamente correlacionadas (R≥0.991). Las concentraciones de Hg-T de las muestras recolectadas en 2009 fueron 173.2 ± 14.1 μg/kg ps en sedimento y 0.14 ± 0.04 μg/ kg en agua. El análisis de correlación entre la concentración de Hg-T en peces con los valores de MO, OD y pH del agua, se presentan en la tabla 2. Con base en los valores medios anuales, las concentraciones de Hg-T para C. Kraussii fueron positiva y significativamente (p<0.05) correlacionadas con la MO y negativamente correlacionadas con el OD y pH. Para las otras especies, aunque las correlaciones no fueron significativas (p>0.05), siguieron el mismo patrón.

Hg-T y longitud de los peces. Un modelo lineal ajustado de la concentración de Hg-T como función de la longitud de los peces (Tabla 3) mostró una correlación significativa (p<0.05) entre estas variables para los peces piscívoros en todos los años analizados y al menos en un año para las especies omnívoras y detritívoras. Los peces piscívoros mostraron las pendientes más agudas, seguidos por los peces omnívoros y detritívoros. Las pendientes incrementaron durante el periodo de estudio para todas las especies.

Los resultados del ANCOVA (modelo de pendientes separadas, con la longitud como covariable) se presentan en la tabla 4. Los resultados confirman en general la dependencia de las concentraciones de Hg-T, de los hábitos dietarios de los peces y el año. Se encontraron excepciones a este patrón, luego de remover la influencia de la longitud, de especies omnívoras y detritívoras, donde marcados descensos en las concentraciones de Hg-T después del 2007 están ausentes. C. Kraussii mostró un incremento sostenido en los niveles de Hg a lo largo del periodo de estudio, alcanzando valores mayores que los de H. malabaricus en 2007 y 2008.

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and DO values of water, is presented in table 2. Based on the annual mean values, the T-Hg concentrations for C. kraussii was positive and significantly (p<0.05) correlated with OM and negatively correlated with DO and pH. For other species, although the correlations were not significant (p>0.05), they followed the same pattern.

T-Hg and fish length. A fitted linear model

Table 2. Correlation coefficients of T-Hg concentrations of fish with organic matter (OM), dissolved oxygen (DO) and pH of water.

Specie OM DO pH

H. malabaricus a 0.8410 -0.8729 -0.8504

C. kraussii 0.9408 -0.8862 -0.9261

L. muyscorum 0.7666 -0.8185 -0.7885

P. magdalenae 0.5139 -0.5525 -0.5309

C. magdalenae 0.6910 -0.6983 -0.7006

Significant correlations at p<0.05 in bold; a significant at p<0.074

Table 3. Results of linear fitting of T-Hg concentrations vs length of fish.

Specie FH ParameterYear

2004 2005 2006 2007 2008 2009

H. malabaricus Cslope 0.0227 0.0590 0.0896 0.0851 0.0906 0.0667

R 0.9011 0.8429 0.9469 0.9839 0.9455 0.9488

C. kraussii Cslope 0.0150 0.0224 0.0240 0.0609 0.1136 ns

R 0.9439 0.9772 0.9807 0.9638 0.8848 ns

P. magdalenae DIslope 0.0068 0.0081 0.0097 0.0185 0.0129 0.0253

R 0.7858 0.9200 0.8592 0.9754 0.5187 0.9338

L. muyscorum Oslope 0.0010 0.0015 0.0021 0.0061 0.0022 0.0044

R 0.4329 0.2802 0.3775 0.6851 0.1977 0.3961

C. magdalenae DIslope 0.0038 0.0043 0.0046 0.0038 0.0059 ns

R 0.9353 0.9379 0.6721 0.9488 0.9642 ns

a Food habit: C = Carnivorous, O = Omnivorous, DI = Detritivore iliophagousNote: Significant (p<0.05) sum of squares of whole model/sum of squares of residuals are indicated in bold. ns = no specimens caught

Table 5. Comparison of T-Hg levels found in fish in this study (in bold) with values from other studies in Colombia (Col) and Brazil (Br).

Species/Dieta Trophic Levelb Location T-Hg (µg/g ww) ALg

H. malabaricus/CP

4.5

0.40 - 2.53 29

Mojana, Colc 0.11 - 0.67 23

Ayapel, Cold 0.12 - 0.58 22

Mojana, Cole 0.21 - 0.43 28

P. surinamensis/C

4.5Ayapel, Cold 0.12 - 0.65 26

Mojana, Colc 0.14 - 0.44 24

P. fasciatum/C4.38 L. Manso, Brf 1.20 - 1.27 81

S. lima/C4.1 Mojana, Cole 0.20 - 0.51 35

A. caucanus/C

3.86Mojana, Colc 0.27 - 1.00 28

Mojana, Cole 0.23 - 0.54 25

S. brasiliensis/P3.79 L. Manso, Brf 0.50 - 1.62 80

S. spilopleura and S. marginatus/C 3.16/3.55 L. Manso,

Brf. 0.29 - 2.00 14

C. kraussii/CP

3.360.34 - 1.41 20

Mojana, Cole 0.02 - 0.56 17

L. muyscorum/O

2.1

0.20 - 0.55 24

Mojana, Colc 0.07 - 0.58 22

Ayapel, Cold 0.10 - 0.48 24

B. hilarii2 L. Manso, Brf 0.07 - 1.03 40

P. magdalenae/D

2.07

0.16 - 0.28 28

Mojana, Colc 0.04 - 0.22 22

Ayapel, Cold 0.04 - 0.23 24

Mojana, Cole 0.01 - 0.17 18

C. magdalenae/D2 0.13 - 0.22 22

a C = Carnivorous, P = Piscivorous, O = Omnivorous, D = Detritivorous; b Data from Fishbase (21); c = (9); d = (10); e = (11); f = (6); g = Average length, cm.

of the T-Hg concentration as a function of fish length (Table 3) showed a significant correlation (p<0.05) between these variables for the piscivorous fish in all years analyzed and at least one year for omnivorous and detritivorous species. The piscivorous fish showed the steepest slopes, followed by the omnivorous fish and detritivorous fish. The slopes increased during the study period for all species.

The ANCOVA results (separate-slopes model, length – covariate) is presented in table 4. The results generally confirm the observed dependence of T-Hg concentrations on fish dietary habits and year. Exceptions to this pattern were



founded, after the removal of length influence, for omnivorous and detritivorous species, where sharp decreases in T-Hg concentrations after 2007 are absent. C. kraussii showed a steady increase in Hg levels throughout the study period, reaching values higher than H. malabaricus in 2007 and 2008.

DISCUSSION

The higher T-Hg concentrations of fish from the Urrá reservoir than in the comparison site (Table 1) show the Hg accumulation in reservoir, and their increase with the length of fish (Table 3) suggest an Hg biomagnification process within the aquatic food web. These results are remarkable because the levels of T-Hg detected in the fish samples of Urrá reservoir, are generally higher for the same trophic level than those reported in other regions of Colombia and Brazil in the presence of strong mining activity (Table 5). Note that the carnivorous and piscivorous fish investigated in Lago Manso, Brazil, had on average, twice the length of those evaluated in the present study.

Is important to note that average T-Hg concentration of H. malabaricus in the years 2006 to 2009 and C. kraussii in the years 2007 and 2008, exceeded the guideline level for carnivorous fish (1 µg/g) suggested in the codex alimentarius for human consumption (22). The addition of factors as the high T-Hg concentration, the high fish consumption reported in the study zone [148 g/day in 2005 (16) and 76.3 – 228.8 g/day in 2010 (15)], the fact that H. malabaricus represented the 32.2% of fish total catch in the reservoir in 2005 (16) and the first and second place in the fish consumption into diet of children and women of childbearing age of the riverside population from Urrá reservoir in 2010 (15), suggest an increased risk for mercury exposure, which must be studied promptly. Although there are no punctual sources of Hg in the study area, a diffuse source exists in a nearby watershed (San Jorge River basin), where ferronickel, coal and gold mining occur. This activity has expanded

DISCUSIÓN

Las mayores concentraciones de Hg-T de los peces del embalse Urrá que las del sitio de comparación (Tabla 1) muestran la acumulación de Hg en el embalse, y su incremento con la longitud del pez (Tabla 3) sugiere un proceso de biomagnificación de Hg dentro de la red alimenticia acuática. Éstos resultados son importantes porque los niveles de Hg-T detectados en las muestras de peces del embalse Urrá, son generalmente mayores para el mismo nivel trófico que las reportadas en otras regiones de Colombia y Brasil en presencia de fuerte actividad minera (Tabla 5). Se debe notar que los peces carnívoros y piscívoros investigados en Lago Manso, Brasil, tenían en promedio, el doble de longitud que los evaluados en el presente estudio.

Es importante tener en cuenta que la concentración promedio de Hg-T en H. malabaricus en los años 2006 a 2009 y C. Kraussii en los años 2007 y 2008, excedió el nivel de referencia en peces carnívoros para consumo humano (1 μg/g) sugerido en el Códex alimentarius (22). La adición de factor como alta concentración de Hg-T, el alto consumo de peces reportado en la zona de estudio (148 g/día en 2005 (16) y 76.3 – 228.8 g/día en 2010), el hecho que H. malabaricus representó un 32.2% de la captura total del ensamble en 2005 (16) y el primer y segundo lugar en el consumo de peces en la dieta de niños y mujeres en edad fértil de la población ribereña del embalse Urrá en 2010 (15), sugiere un riesgo incrementado de exposición a mercurio, que debe ser estudiado prontamente.

Aunque no hay fuentes puntuales de Hg en el área de estudio, una fuente difusa existe en una cuenca cercana (Cuenca del Río San Jorge), donde ocurre minería de ferroníquel, carbón y oro. Esta actividad se ha expandido en años recientes debido al incremento en la producción de ferroníquel, la construcción de una planta termoeléctrica a base de carbón (23) y la apertura de muchos frentes artesanales de minería de oro. Investigaciones recientes en esta área han mostrado altas concentraciones atmosféricas de Hg que son transportadas a otras áreas diferentes del área de explotación minera (24). Entonces, los altos niveles de Hg-T en peces podrían reflejar el transporte atmosférico de áreas mineras cerca al embalse, o podría simplemente resultar de una mayor movilidad de Hg en el área investigada.

En este sentido, los datos sobre parámetros de agua recolectados del embalse Urrá, mostraron un incremento de las condiciones anóxicas, acidificación y productividad con base en la

Table 4. ANCOVA T-Hg least squares means, µg/ga.

SpeciesYear

2004 2005 2006 2007 2008 2009

H. malabaricus 0.524 0.635 0.746 1.116 1.171 0.997

C. kraussii 0.553 0.702 0.746 1.165 1.418 ns

L. muyscorum 0.301 0.353 0.392 0.412 0.375 0.354

P. magdalenae 0.182 0.203 0.215 0.226 0.201 0.183

C. magdalenae 0.185 0.209 0.217 0.231 0.222 ns

a Computed for covariate at its means. Current effect: F (18, 159)=2.2406, p=0.00424. ns=no specimens caught

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concentración de MO (Figura 3); condiciones que aumentan las tasas de metilación de Hg (8) y la subsiguiente biomagnificación en la cadena alimenticia. De hecho, se ha reportado que valores ácidos de pH incrementan la captación de Hg por algas unicelulares de agua dulce, principales productores en la cadenas alimenticias acuáticas (25). En el mismo sentido, se resaltan las correlaciones significativas (p<0.05) registradas en este estudio entre las concentraciones de Hg-T de C. kraussii con los valores de MO, pH y OD del agua (Tabla 2).

Por otro lado, la concentración de Hg-T en agua (0.14 ± 0.04 μg/L) medida en 2009 en el embalse Urrá fue mayor que los valores de base (background) (0.003 μg/L) reportados para el embalse Lago Manso en Brasil (6). Posiblemente, esta diferencia resulta de fuentes locales de contaminación de Hg. Este resultado podría reflejar el transporte atmosférico de áreas de minería de oro no lejos del embalse, o podría simplemente resultar de una mayor movilidad de Hg en las áreas investigadas como se describió anteriormente. Sin embargo, los resultados obtenidos fueron menores que los reportados en ciénagas o ríos de áreas altamente contaminadas, tales como la Ciénaga Grande en Colombia (promedio 0.33 ± 0.03 μg/L) (26) y ríos de Indonesia (hasta 0.25 μg/L) (27), ubicados alrededor de áreas de minería de oro.

Las concentraciones de Hg en las muestras de sedimentos recolectadas en este estudio (173.2 ± 13.1 μg/kg ps) fueron menores que los valores de Hg en sedimentos de otras áreas contaminadas en Colombia, como la Ciénaga de Ayapel (243 ± 62 μg/kg ps) (28) y las ciénagas de mina Santa Cruz (hasta 335 μg/kg ps) (29), pero mayores que las reportadas en áreas como las ciénagas del poblado El Caimito en la cuenca del Río San Jorge, Colombia (155 ± 16 μg/kg ps) (11), que también son impactadas por la minería de oro.

De acuerdo con lo antes descrito, las concentraciones de Hg en el agua y las características fisicoquímicas favorables presentes en el embalse Urrá, pueden producir una mayor eficiencia de captación del metal por los peces y causar mayores concentraciones comparadas con otros ecosistemas.

En conclusión, las concentraciones de Hg-T en las especies de peces evaluadas en el embalse Urrá incrementaron después del represamiento. Las variables de calidad de agua mostraron condiciones que favorecen la metilación del Hg y su biomagnificación, esta última fue evidente en la cadena alimenticia de los peces del embalse, lo

in recent years due to an increase in the ferronickel production, the building of the new coal-based thermoelectric plant (23) and the opening of many artisanal fronts of gold mining. Recent research in this area has shown high atmospheric Hg concentrations that are transported to other areas outside the mining areas (24). Thus, the high T-Hg levels in fish could reflect atmospheric transport from mining areas near the reservoir, or could simply result from a higher mobility of Hg in the area investigated.

In this regard, the data about to water parameters collected from the Urrá reservoir, showed an increase in the anoxic conditions, acidification and productivity based on OM concentration (Figure 3); conditions that enhance the rates of Hg methylation (8) and subsequent biomagnification in food chain. Indeed, it has been reported that acidic pH values increase mercury uptake by freshwater unicellular algae, primary producers in aquatic food chains (25). In the same direction, are highlighted the significant (p<0.05) correlations recorded in this study between T-Hg concentrations of C. kraussii with OM, pH and DO values of water (Table 2).

On the other hand, the T-Hg concentration in water (0.14 ± 0.04 µg/L) measured in 2009 in the Urrá reservoir was higher than the background values (0.003 µg/L) reported for Lago Manso reservoir in Brazil (6). Most likely, this difference results from local sources of Hg contamination. This result could reflect atmospheric transport from gold mining areas not far from the reservoir, or it could simply result from higher mobility of Hg in the areas investigated as was describe above. However, the results obtained were lower than those reported in marshes or rivers of heavily contaminated areas, such as the Grande marsh in Colombia (average 0.33 ± 0.03 µg/L) (26) and rivers from Indonesia (up to 0.25 µg/L) (27), which are located around gold mining areas.

The Hg concentrations in the sediment samples collected in this study (173.2 ± 14.1 µg/kg dw) were lower than the values of Hg in sediment for other contaminated areas in Colombia, such as Ayapel marsh (243 ± 62 µg/kg dw) (28) and marshes of Mina Santa Cruz (up to 355 µg/kg dw) (29), but greater than those reported in areas such as the marshes from Caimito village in the San Jorge River basin, Colombia (155 ± 16 ug/kg dw) (11), which are also impacted by gold mining.

According to the above description, The Hg concentrations in the waters and favorable physicochemical characteristics present in the Urrá reservoir, may produce a greater efficiency of metal uptake by the fish and cause higher concentrations compared with other ecosystems.



cual supone un riesgo para la población ribereña que consume estos peces. Este estudio ilustra una de las potenciales consecuencias negativas de la construcción de embalses hidroeléctricos y muestra la necesidad de incluir estos potenciales costos ambientales en la evaluación del impacto de futuros proyectos de este tipo.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Universidad de Córdoba, Montería (Colombia), por su apoyo financiero (Aportes FCB-03-2007), y a los pescadores del embalse de Urrá por su colaboración con la captura de los peces.

In conclusions, the T-Hg concentrations in the evaluated fish species of the Urrá reservoir increased after impoundment. The water quality variables showed conditions favoring the Hg methylation and its biomagnification, this last was evident in the fish food chain of the reservoir, which poses a risk for riverside population that consume these fish. This study illustrates one of the potentially negative consequences of the construction of hydroelectric reservoirs and shows the need to include these potential environmental costs in the assessment of the impact of future projects of this type.

Acknowledgments

The authors thank the University of Cordoba, Montería (Colombia), for financial support (Grant FCB-03-2007), and the fishermen from Urrá reservoir for their help in catching fish.

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ORIGINAL


Environmental characterization of the reproductive season of migratory fish of the Sinú river (Córdoba, Colombia)

Caracterización ambiental de la temporada reproductiva de los peces migradores del río Sinú (Córdoba, Colombia)

Eduardo Kerguelén-Durango,1 M.Sc, Víctor Atencio-García,1* M.Sc.

1Universidad de Córdoba, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Departamento de Ciencias Acuícolas, Centro de Investigación Piscícola CINPIC, Montería, Colombia. *Correspondencia: [email protected].

Received: October 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT

Objective. To characterize some abiotic factors during the reproductive season of migratory fish (bocachico Prochilodus magdalenae, dorada Brycon sinuensis, bagre blanco Sorubim cuspicaudus and barbul Pimelodus blochii) in the Sinú River. Materials and methods. From April to October, 2008, in Carrizola (Tierralta, 36.31 km from the Urrá hydroelectric plant) factors such as flow=Qrío, daily flow difference =ΔQrío, velocity=Vrío, temperature=Trío, electrical conductivity=CE, total dissolved solids=STD, turbidity=Turb, cloudiness=Nub, rainfall=Pluv and solar brightness=Bs were measured daily three times/day (07:00 h, 12:00 h, 17:00 h). Also, on the same schedule, ichthyoplankton was collected as an indicator of reproductive activity, assessed by reproductive frequency (Fr=number of days with presence of ichthyoplankton/number of days in the period evaluated X 100) and larval density (Dl=larval/m3). Results. The daily values of Qrío ranged between 278.7 and 838.5 m3/s, ΔQrío between 0.0 and 100.7 m3/s, Vrío between 1.40 and 1.53 m/s, Pluv between 0.0 and 88.2 mm, Trío between 27.0 and 28.7°C, STD between 73.0 and 302.3 mg/L, Turb between 9.7 and 679.7 NTU, CE between 81.0 and 361.7 mS/cm, Bs between 0.0 and 11.2 hours, Nub between 2.0 and 7.3 octaves. The Fr was 30.4%, with April (40.0%) and May (74.2%) as the higher activity reproductive months, while the Dl in the season was 4.9 larvae/m3, with the larvae group other species (2.9 larvae/m3) and bocachico (1.8 larvae/m3) as the most abundant. Conclusions. Most reproductive activity was recorded early in the season (April and May) and parameters such as Qrío, Trío, Vrío, Pluv, STD and Nub may be considered final factors associated with migratory fish reproduction.

Key words: Abiotic factors, ichthyoplankton, fluvial, reproduction (Source: MeSH, DeCS, NLM).

RESUMEN

Objetivo. Caracterizar algunos factores abióticos durante la temporada reproductiva de los peces migratorios (bocachico Prochilodus magdalenae, dorada Brycon sinuensis, bagre blanco Sorubim cuspicaudus y barbul Pimelodus blochii) en el río Sinú. Materiales y métodos. Entre abril y octubre de 2008, en Carrizola (Tierralta, 36.31 km de la Hidroeléctrica Urrá) se midieron diariamente tres veces/día (07:00h, 12:00h, 17:00h) factores como caudal=Qrío, diferencia de caudal=ΔQrío, velocidad=Vrío, temperatura=Trío, conductividad eléctrica=CE, sólidos totales disueltos=STD, turbidez=Turb, nubosidad=Nub, pluviosidad=Pluv y brillo solar=Bs; también, en el mismo horario, se recolectó ictioplancton como indicador de actividad reproductiva, evaluada mediante frecuencia reproductiva

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INTRODUCTION

In fish, reproduction is a process controlled by external and internal factors; the external factors, which are of biotic type (predation, competition, sex ratio, population density, among other) and abiotic (flow, photoperiod, temperature, pH, dissolved oxygen, electrical conductivity, among others) act in different moments and spaces of the reproductive cycle (1).

The abiotic factors can trigger and extend spawning and generate favorable conditions for the development of larva (2). Such conditions are considered environmental factors that stimulate spawning of migratory fish. In rivers that have been intervened by hydroelectric constructions, these incentives could be altered and thus, could affect the reproduction of fish (3).

In tropical atmospheres, the increase in water level, precipitation and electrical conductivity are considered key factors in fish reproduction (4). Jimenez-Segura et al (4) found that in the Magdalena river, the initial and proximate stimuli, which determine the start of the gonad maturity, were high solar illumination and high water temperatures during shallow water periods; while final or last factors, which determined the courtship and mating, were the reduction of solar illumination, as a result of the increase in cloudiness and the reduction of the temperature during high and rising water periods.

In the Sinu river basin there is little information about the abiotic factor characteristics during the reproductive season of migratory fish and which of these can be considered as final factors for reproduction incentives (mating and spawning); therefore, the objective of this study was to characterize some environmental abiotic factors and which are associated to the final stimuli for the reproduction of migratory fish such as the bocachico, dorada, bagre blanco and barbul in the Sinu river.

Kerguelén-Durango - Environmental characterization of the reproductive season

(Fr=número de días con presencia de ictioplancton/número de días del período evaluadoX100) y la densidad larval (Dl=larvas/m3). Resultados. Valores diarios de Qrío oscilaron entre 278.7 y 838.5 m3/s, ΔQrío entre 0.0 y 100.7 m3/s, Vrío entre 1.40 y 1.53 m/s, Pluv entre 0.0 y 88.2 mm, Trío entre 27.0 y 28.7°C, STD entre 73.0 y 302.3 mg/L, Turb entre 9.7 y 679.7 NTU, CE entre 81.0 y 361.7 µS/cm, Bs entre 0.0 y 11.2 horas, Nub entre 2.0 y 7.3 octas. La Fr en el período fue de 30.4%, con abril (40.0%) y mayo (74.2%) como los meses de mayor actividad reproductiva; la Dl en el período fue de 4.9 larvas/m3, con el grupo otras especies (2.9 larvas/m3) y bocachico (1.8 larvas/m3) más abundantes.

Conclusiones. Mayor actividad reproductiva se registró al inicio de la temporada de lluvias (abril y mayo); con Qrío, Trío, Vrío, Pluv, STD y Nub como factores finales asociados a la reproducción de los peces migradores. Palabras clave: Factores abióticos, fluvial, ictioplancton, reproducción (Fuente: MeSH, DeCS, NLM).

INTRODUCCIÓN

En peces, la reproducción es un proceso controlado por factores externos e internos; donde los externos, de tipo biótico (predación, competición, proporción de sexo, densidad de población, entre otros) y abióticos (caudal, fotoperíodo, temperatura, pH, oxígeno disuelto, conductividad eléctrica, entre otros) actúan en diferentes momentos y espacios del ciclo reproductivo (1).

Los factores abióticos pueden desencadenar y prolongar el desove y proporcionar condiciones favorables para el desarrollo de las larvas (2), los cuales son considerados factores ambientales que estimulan el desove de los peces migratorios. En los ríos intervenidos por la construcción de hidroeléctricas estos estímulos pueden estar alterados y por ende afectar la reproducción de los peces (3).

En ambientes tropicales, el aumento del nivel del agua, la precipitación y la conductividad eléctrica son considerados factores determinantes en la reproducción de los peces (4). Jiménez-Segura et al (4) encontraron que en el río Magdalena, los estímulos iniciales o proximales, que determinan el inicio de la maduración de las gónadas, fueron la alta iluminación solar y las altas temperaturas del agua durante el período de aguas bajas; mientras que los factores finales o últimos, que determinaron el cortejo y apareamiento, fueron la reducción del brillo solar, como resultado del incremento en la nubosidad y la reducción de la temperatura en el período de aguas en ascenso y altas.

En la cuenca del río Sinú no existe mayor información sobre las características de los factores abióticos durante la temporada reproductiva de los peces migratorios y cuáles de estos pueden ser considerados como factores finales para el estímulo de la reproducción (apareamiento y desove); por lo tanto, el objetivo de este estudio fue caracterizar algunos factores ambientales abióticos y cuáles están asociados al estímulo final para la reproducción de peces migradores como bocachico, dorada, bagre blanco y barbul en el río Sinú.



Study location. The Sinu river begins in the town of Ituango, Antioch (Paramillo Massif), crosses the towns of Tierralta, Valencia, Montería, Cereté, San Pelayo, Cotorra, Lorica and San Bernardo del Viento, in the department of Cordoba, and ends at the Caribbean Sea, in the Tinajones delta area. The total length of the river is 437.97 km, from its source until its mouth. At 267 km from its mouth, the Urra (HU) hydroelectric power plant was built, and therefore, the river is regulated by the operation of the hydroelectric plant.

In order to verify the presence of reophilic fish spawning, ichthyoplankton was collected daily between April 15 and October 15, 2008 (184 days), in the upper part of the Sinu river, at 36.3 km (North latitude 8°09´40.8” and West longitude 76°05´44.8”) downstream from the HU (Carrizola, Tierralta, Cordoba). The period evaluated corresponded to the rainy season in the Sinu river basin. The ichthyoplankton was collected three times per day at 7:00, 12:00 and 17:00 hours, at a distance between 5 and 10 m from the right margin of the river, with superficial samples of 1 minute, using a simple conical plankton net with a mouth diameter of 50 cm and a 0.5 mm mesh opening; the samples were fixed in formalin 1% (v/v) neutralized with monobasic and dibasic sodium phosphate and labeled in 50 ml plastic jars. The ichthyoplankton were separated by species (bocachico, liseta, bagre blanco, barbul, and other species) at the Fish Research Center of the University of Cordoba (CINPIC) and their state of development was determined (blastomeration, blastulation, gastrulation, segmentation, pharyngulation). The identification was made based on embryonic and larva characteristics of the fish (5). To the embryos that were not identified, a development stage was determined, and they were counted and registered as other species (other spp.)

Larval density and reproductive frequency. The estimation of the amount of larva collected from each sample was expressed as larval density per day (Dl, larvae/m3) using the following equation:

Where:

Dl = larval Density by sampling (larvae/m3)n = Number of ichthyoplankton collected by sampling Vriver = Speed of the river (m3/s)t = collection Time (60 s)Ared = Area of the net (m2).


Sitio de estudio. El río Sinú nace en el municipio de Ituango, Antioquia (Nudo de Paramillo), atraviesa los municipios de Tierralta, Valencia, Montería, Cereté, San Pelayo, Cotorra, Lorica y San Bernardo del Viento, en el departamento de Córdoba, y desemboca en el mar Caribe, en la zona del delta de Tinajones. Tiene una longitud total de cauce de 437.97 km, desde su nacimiento hasta su desembocadura. A 267 km de la desembocadura se construyó la hidroeléctrica Urrá (HU) por lo cual es un río regulado por la operación de la hidroeléctrica.

Con el fin de verificar la presencia de desoves de peces reofílicos, diariamente, entre el 15 de abril y 15 de octubre de 2008 (184 días), se recolectó ictioplancton en la parte alta del río Sinú, a 36.3 km (latitud Norte 8°09´40.8” y longitud Oeste 76°05´44.8”) aguas abajo de la HU (Carrizola, Tierralta, Córdoba). El período evaluado correspondió a la temporada lluviosa en la cuenca del río Sinú. El ictioplancton fue recolectado tres veces al día en horarios de 07:00; 12:00 y 17:00 horas, a una distancia entre 5 y 10 m de la margen derecha del río, con muestreos superficiales de 1 minuto, utilizando una red de plancton cónica simple con diámetro de boca de 50 cm y ojo de malla de 0.5 mm; las muestras se fijaron en formol 1% (v/v) neutralizado con fosfato de sodio monobásico y dibásico y rotuladas en frascos plásticos de 50 mL. En el Centro de Investigación Piscícola de la Universidad de Córdoba (CINPIC), el ictioplancton fue separado por especie (bocachico, liseta, bagre blanco, barbul, otras especies) y se determinó su estado de desarrollo (blastomeración, blastulación, gastrulación, segmentación, faringulación). La identificación se realizó con base en las características embrionarias y larvarias de los peces (5). A los embriones que no fueron identificados, se les determinó su estado de desarrollo, se contaron y registraron como otras especies (otras spp.).

Densidad larval y frecuencia reproductiva. La estimación de la cantidad de larvas colectada en cada muestreo se expresó como densidad larval día (Dl, larvas/m3) utilizando la siguiente ecuación:

Dónde:

Dl = Densidad larval por muestreo (larvas/m3)n = Número de ictioplancton colectado por muestreo Vrío = Velocidad del río (m3/s)

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Based on the three Dl samplings, the average larva per day (Dld) was estimated and based on this, the larva density per month (Dlm) was estimated, only considering the days with presence of spawning (icthyoplankton).

The amount of days with reproductive activity of the migratory fish in the Sinu river during the reproductive season was called reproductive frequency (Rf), which was calculated by dividing the number of days with ichthyoplankton presence over the total number of days analyzed x 100. Rf was estimated per month and for the whole evaluated period.

Hydraulic characteristics of the river during the reproductive period. The daily estimation of the river flow was conducted (Qriver), flow difference (ΔQriver) and river velocity (Vriver). The Qriver and the Vrio were estimated three times per day (07: 00; 12:00 and 17:00 hours) based on the reading of the water level of the river, obtained at the IDEAM water level gauging Station in Carrizola (Tierralta, Cordoba); the river flow and an average velocity per day were calculated as well. The ΔQriver was estimated from the river flow differences from one day to the next. The Qriver, Vriver and water level gauging readings were adjusted through eight hydraulic gauging (two times per month during six months) which considered the measure of Vriver and the Qriver at different depths (superficial, 20% and 80% depth) every eight meters in a section of the river at Carrizola (Tierralta) with the aid of flowmeters (A.OTT Kempten, C31-00, Germany) with propeller (2-38798, Germany), flow meter (A.OTT Kemptem, Typ 12,400, Germany) and winch (65645PKS, Germany).

Physicochemical characteristics of the river. The temperatures of the river (Triver), the turbidity (Turb), the total dissolved solids (STD) and the electrical conductivity (CE), were measured during each collection of ichthyoplankton. The Triver was measured with a mercury thermometer with a precision of ±0.5°C (BRIXCO, United Kingdom). Turb was measured with a portable digital turbidimeter (Orbeco-Hellige, the USA); whereas CE and STD were measured using a digital conductimeter (WTW, LF538, the USA). An average value per day for each one of these parameters was estimated from the three daily readings.

Characterization of rainfall (Pluv), solar brightness (Bs) and cloudiness (Nub). The daily records of Pluv, Bs and Nub, were obtained from the URRA I Weather Center Station, located at the dam (Tierralta, Córdoba).


t = Tiempo recolección (60 s)Ared = Área de la red (m2).

Con base en los tres muestreos de Dl se estimó la densidad larval promedio día (Dld) y con base en esta se estimó la densidad larval mensual (Dlm), sólo considerando los días con presencia de desoves (ictioplancton).

La cantidad de días con actividad reproductiva de los peces migradores en el río Sinú en la temporada reproductiva se denominó frecuencia reproductiva (Fr), la cual se calculó dividiendo el número de días con presencia de ictioplancton sobre el número total de días analizados x 100. La Fr se estimó por mes y para todo el período evaluado.

Características hidráulicas del río en el período reproductivo. Se realizó la estimación diaria de caudal (Qrío), diferencia de caudal (ΔQrío) y velocidad del río (Vrío). El Qrío y la Vrío fueron estimados tres veces al día (07:00; 12:00 y 17:00 horas) con base en la lectura del nivel del agua del río, obtenida de la Estación limnimétrica del IDEAM en Carrizola (Tierralta, Córdoba) y calculado un caudal y velocidad promedio por día. La ΔQrío fue estimada de las diferencias de caudal de un día para otro. El Qrío, Vrío y lecturas limnimétricas fueron ajustadas mediante la realización de ocho aforos hidráulicos (dos veces por mes durante seis meses) que consistieron en medir la Vrío y el Qrío a diferentes profundidades (superficial, 20% y 80% de la profundidad) cada ocho metros en una sección del río a la altura de Carrizola (Tierralta) con la ayuda de un flujómetro (A.OTT Kempten, C31-00, Alemania) con hélice (2–38798, Alemania), contador de flujo (A.OTT Kemptem, Typ 12.400, Alemania) y un malacate (65645PKS, Alemania).

Características físico-químicas del río. Durante cada recolección de ictioplancton fueron medidas la temperatura del río (Trío), la turbidez (Turb), los sólidos totales disueltos (STD) y la conductividad eléctrica (CE). La Trío se midió con un termómetro de mercurio con precisión de ±0.5°C (BRIXCO, United Kingdom). La Turb con un turbidímetro digital portátil (Orbeco-Hellige, USA); mientras que CE y STD fueron medidos con ayuda de un conductímetro digital (WTW, LF538, USA). De las tres lecturas diarias se estimó un valor promedio por día para cada uno de estos parámetros.

Caracterización de pluviosidad (Pluv), brillo solar (Bs) y nubosidad (Nub). Los registros diarios de Pluv, Bs y Nub, fueron obtenidos de la Estación Meteorológica Central URRA I, localizada en el embalse (Tierralta, Córdoba).


Statistical analysis. No environmental variable studied (Qriver, ΔQriver, Vriver, Triver, Turb, EC, STD, Pluv, Bs and Nub) or Dl met the assumptions of normality (Shapiro-Wilk test) and homogeneity (Levene test). A descriptive statistic (average±standard deviation) of all environmental variables considered during every day of the study (184 days) and the days in which spawning presence (ichthyoplankton) was detected, was carried out. During the studied period, Dl of the different species was compared though a non-parametric ANOVA (Kruskal-Wallis test) and when differences were observed, Dunnett’s multiple comparison per pairs test was used (p<0.05). To determine the association between the studied environmental variables and the reproduction of the fish (presence of ichthyoplankton), a correlation analysis (Spearman Coefficient) and a Main Component Analysis (ACP) was conducted. The data was transformed through Log (Xi+1) before their analysis. The statistical analysis was conducted with using of the Statgraphic Centurion (6) and XLSTAT (vs. 2011) programs.

RESULTS

Identification of ichthyoplankton by species. During the study period, 8284 embryos were captured, of which the most common reophilic species found were bocachico (36.3%), dorada (0.5%), bagre blanco (1.6%) and barbul (0.6%). Embryos of bocachico, barbul, bagre blanco and other species were captured predominantly in blastomeration stage; whereas the dorada was collected, mainly, in pharyngulation stage (Table 1). This group of species represented 61.1% of the total ichthyoplankton captured.

Reproductive frequency and larval density. In 30.4% of the days of the evaluated period (184

Table 1. Composition and stage of development of ichthyoplankton in the Sinu river in Carrizola (Tierralta) during April-October of 2008.

SpeciesBlas Gastru Segmen Pharyng

Total(%)

Bocachico 63.5 26.9 9.6. 0.0 100.0

Dorada 0.0 0.0 25.0 75.0 100.0

Bagre b. 72.4 27.6 0.0 0.0 100.0

Barbul 82.9 0.0 14.7 2.4 100.0

Other spp. 68.7 27.1 4.2. 0.0 100.0

Blas= Blastomeration; Gastru= Gastrulation; Segmen=Segmentation; Pharyng=Pharyngulation spp.= Species.

Análisis estadístico. Ninguna variable ambiental estudiada (Qrío, ΔQrío, Vrío, Trío, Turb, CE, STD, Pluv, Bs y Nub) o Dl cumplió los supuestos de normalidad (Shapiro-Wilk test) y homocedasticidad (Levene test). Se realizó estadística descriptiva (promedio±desviación estándar) de todas las variables ambientales considerando todos los días del estudio (184 días) y los días en los que se detectó presencia de desove (ictioplancton). La Dl, en el período estudiado, de las diferentes especies fue comparada mediante un ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis test) y cuando se observaron diferencias se utilizó la prueba de comparación múltiple por pares de Dunnett (p<0.05). Para determinar la asociación entre las variables ambientales estudiadas y la reproducción de los peces (presencia de ictioplancton) se realizó un análisis de correlación (Coeficiente de Spearman) y un Análisis de Componentes Principales (ACP). Los datos, antes de ser analizados, fueron transformados mediante Log (Xi+1). El análisis estadístico fue realizado con la ayuda del programa Statgraphic Centurion (6) y XLSTAT (ver. 2011).

RESULTADOS

Identificación del ictioplancton por especie. Durante el período de estudio fueron capturados 8284 embriones, de los cuales las especies reofílicas más comunes encontradas fueron bocachico (36.3%), dorada (0.5%), bagre blanco (1.6%) y barbul (0.6%). Embriones de bocachico, barbul, bagre blanco y otras especies se capturaron predominantemente en estado de blastomeración; mientras que la dorada se colectó, principalmente, en estado de faringulación (Tabla 1). El grupo otras especies representó 61.1% del total del ictioplancton capturado.

Frecuencia reproductiva y densidad larval. En 30.4% de los días del período evaluado (184 días) se observó presencia de ictioplancton; siendo abril y mayo los meses con mayor Fr. Junio y julio mostraron una disminución de la Fr; mientras que en agosto (22.6%), septiembre (26.7%) y octubre (53.3%) se observó un leve incremento de la Fr (Tabla 2). Por especie se observó que en 30.4% del total de días estudiados se registró presencia de desoves del grupo otras especies, seguido por bocachico (21.7%); mientras que bagre blanco (5.4%), dorada (3.8%) y barbul (1.6%) registraron una baja Fr.

La mayor Dlm se registró en abril (19.8 larvas/m3), la cual disminuyó con el transcurrir de los meses, alcanzando valores mínimos al final de la

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days), a presence of ichthyoplankton was observed; April and May were the months with more Fr. June and July showed a reduction in FR; while a slight increase of Fr was observed in August (22.6%), September (26.7%) and October(53.3%) (Table 2). In 30.4% of the total studied days, a presence of spawning of the other group of species was observed, followed by the bocachico (21.7%); while bagre blanco (5.4%), dorada (3.8%) and barbul (1.6%) registered a decrease in Fr.

The highest Dlm was registered in April (19.8 larvae/m3), which diminished with the passing of the months, reaching minimum values at the end of the reproductive season (September and October with 0.7±0.3 and 1.2±0.3 larvae/m3, respectively). The highest Dlm per species was registered for the group of other species (2.9±1.7 larvae/m3) and bocachico (1.8±1.7 larvae/m3). Ichthyoplankton from the other group of species was registered during the whole reproductive period; in September, no spawning of bocachico was registered. Dorada was observed during the first two months and during the fourth month of the study; while the bagre blanco was observed during the first four months of the study. Barbul was only registered in May (Table 3).

Environmental characteristic of the reproductive season of migratory fish. The daily Qriver during the study’s period presented values that ranged between 278.7 and 838.5 m3/s, with averages of 651.0 m3/s. But when fish spawning appeared, the maximum values were 792.7 m3/s for the bocachico, dorada, bagre blanco and barbul species; and minimums values of 543.1 3 m3/s for the group other species (Figure 1).

Table 2. Monthly reproductive frequency of spawning of migratory fish in the Sinu river in Carrizola (Tierralta) during April-October of 2008 (184 days).

MonthsBocachico Dorada Bagre b. Barbul Other spp.

Total(%)

April (16) 40.0 13.3 6.7 0.0 40.0 40.0

May 58.1 6.5 16.1. 9.7 74.2 74.2

June 6.7 0.0 6.7 0.0 16.7 13.3

July 12.9 6.5 6.5 0.0 12.9 12.9

August 9.7 0.0 0.0 0.0 22.6 22.6

September 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 26.7

October (15) 46.7 6.7 0.0 0.0 53.3 53.3

Total period 21.7 3.8 5.4. 1.6 30.4 30.4

spp.= Species.

Table 3. Monthly larval density of spawning of migratory fish in the Sinu river in Carrizola (Tierralta) during April-October of 2008 (184 days).

MonthsBocachico Dorada B. White Barbul Other

spp. TotalL/m3

April (16)

7.7±7.7

0.2±0.3

0.1±0.1

0.0±0.0

11.8±6.4

19.8.±5.5

May 2.1±2.8

0.1±0.2

0.1±0.1

0.1±0.1

2.6±1.8

5.0±1.2

June 0.1±0.1

0.0±0.0

0.1±0.1

0.0±0.0

2.2±1.7

2.4±0.9

July 1.2.±0.8

0.1±0.1

0.2±0.1

0.0±0.0

1.5±0.9

3.0±0.7

August 0.9±0.3

0.0±0.0

0.0±0.0

0.0±0.0

1.1±0.3

2.0±0.6

September 0.0±0.0

0.0±0.0

0.0±0.0

0.0±0.0

0.7±0.4

0.7±0.3

October (15)

0.6±0.4

0.0±0.0

0.0±0.0

0.0±0.0

0.5±0.2

1.2.±0.3

Avg 1.8±1.7a

0.1±0.1b

0.1±0.1b

0.1±0.1b

2.9±1.7a

4.9±1.4

Different letters in the same row indicate significant differences (p<0.05).L= larvae. spp.= Species.


temporada reproductiva (septiembre y octubre con 0.7±0.3 y 1.2±0.3 larvas/m3, respectivamente). Las mayores Dlm por especie se registraron para el grupo otras especies (2.9±1.7 larvas/m3) y bocachico (1.8±1.7 larvas/m3). El Ictioplancton del grupo otras especies fue registrado durante todo el período reproductivo; no se registraron desoves de bocachico en septiembre. Dorada se observó en los dos primeros meses y en el cuarto; mientras que bagre blanco se observó durante los primeros cuatro meses del estudio. Barbul sólo se registró en mayo (Tabla 3).

Característica ambiental de la temporada reproductiva de los peces migradores. El Qrío diario durante el período de estudio, presentó valores que oscilaron entre 278.7 y 838.5 m3/s, con promedios de 651.0 m3/s. Pero cuando se presentaron desoves de peces los valores máximos fueron de 792.7 m3/s para las especies bocachico, dorada, bagre blanco y barbul; y mínimos de 543.1 m3/s para el grupo otras especies (Figura 1).

La ΔQrío, durante el período osciló entre 0.0 y 100.7 m3/s. Cuando se presentaron desoves de especies como bocachico y bagre blanco, oscilaron entre 1.0 y 88.3 m3/s; mientras que los desoves de dorada sucedieron con valores que oscilaron entre 1.0 y 92.1 m3/s. Los desoves de barbul sucedieron con valores que oscilaron entre 1.0 y 100.7 m3/s (Figura 1).

La Vrío durante el período, mostró valores que oscilaron entre 1.40 y 1.53 m/s y en ese intervalo se presentaron los desoves de los peces (Figura 1).


Figure 1. Variation of environmental factors in the Sinu river at Carrizola (Tierralta) during the 2008 reproductive season. a) River flow, b) river flow difference, c) river flow velocity, d) rainfall, e) temperature, f) total dissolved solids, g) turbidity, h) electric conductivity, i) solar brilliance and j) cloudiness. Black dots indicate days with spawning of migratory fish.

A B

C D

E F

GH

I J

4773

ΔQriver during the period ranged between 0.0 and 100.7 m3/s. When spawning of species like bocachico and bagre blanco appeared, the values ranged between 1.0 and 88.3 m3/s; while the dorada spawning occurred with values that ranged between 1.0 and 92.1 m3/s. Barbul spawning appeared with values that ranged between 1.0 and 100.7 m3/s (Figure 1).

Vriver during the period showed values that ranged between 1.40 and 1.53 m/s and fish spawning appeared during this period (Figure 1).

Pluv during the period of the study showed values that ranged between 0.0 and 1.53 and 88.2 mm; during this same interval, migratory fish spawning appeared.

Triver during the reproductive season showed values that ranged between 26.7 and 29.0°C; while spawning appeared in the interval between 27.0 and 28.7°C (Figure 1).

STD values during the period ranged between 73.0 and 302.3 mg/L; dorada, bagre blanco and bocachico spawning appeared in this interval; while barbul spawning appeared in the interval between 99.3 and 119.0 mg/L (Figure 1).

Turb during the reproductive period ranged between 9.7 and 679.7 NTU (mean=139.1 NTU); bocachico, dorada (22.6-679.7 NTU) and bagre blanco (53.5-679.7 NTU) spawned in similar intervals; while barbul spawning appeared in the interval between 112.1 and 659.3 NTU (Figure 1).

CE during the reproductive period showed values that ranged between 81.0 and 361.7 µS/cm. Bocachico, dorada and bagre blanco spawning appeared in a similar interval (81.0-325.7 µS/cm); while barbul spawning appeared in an interval between 99.7-128.5 µS/cm (Figure 1).

Bs values during the reproductive period ranged between 0.0 and 11.2 hours. The values were similar to those values of the period where the bocachico, dorada, bagre blanco and other species were recorded. Barbul spawning occurred with minimum values of 1.6 and maximum values of 7.5 hours (Figure 1).

Nub values during the period ranged between 2.0 and 7.3 octave; bochachico and barbul spawning appeared (2.0-7.0 octave) and dorada and bagre blanco (2.0-6.3 octave) in similar intervals (Figure 1).


La Pluv, durante el período de estudio mostró valores que oscilaron entre 0.0 y 88.2 mm; en ese mismo intervalo se presentaron los desoves de los peces migratorios (Figura 1).

La Trío, durante la temporada reproductiva mostró valores que oscilaron entre 26.7 y 29.0°C; mientras que los desoves se presentaron en el intervalo de 27.0 y 28.7°C (Figura 1).

Los valores de STD durante el período oscilaron entre 73.0 y 302.3 mg/L, en este intervalo se presentaron los desoves de dorada, bagre blanco y bocachico; mientras los desoves de barbul se presentaron entre 99.3 y 119.0 mg/L (Figura 1).

La Turb durante el período reproductivo osciló entre 9.7 y 679.7 NTU (media=139.1 NTU); bocachico, dorada (22.6-679.7 NTU) y bagre blanco (53.5-679.7 NTU) desovaron en intervalos similares; mientras que los desoves de barbul se presentaron entre 112.1 y 659.3 NTU (Figura 1).

La CE durante el período reproductivo mostró valores que oscilaron entre 81.0 y 361.7 µS/cm. Los desoves de bocachico, dorada y bagre blanco sucedieron en un intervalo similar (81.0-325.7 µS/cm); mientras que barbul desovó en un intervalo entre 99.7-128.5 µS/cm (Figura 1).

Los valores de Bs, durante el período reproductivo fluctuaron entre 0.0 y 11.2 horas. Estos valores fueron similares a los del período cuando se registraron desoves de bocachico, dorada, bagre blanco y otras especies. Los desoves de barbul sucedieron con valores mínimos de 1.6 y máximos de 7.5 horas (Figura 1).

Los valores de Nub durante el período oscilaron entre 2.0 y 7.3 octas; en intervalos similares se presentaron los desoves de bocachico y barbul (2.0-7.0 octas), y dorada y bagre blanco (2.0-6.3 octas), (Figura 1).

Correlación entre las variables ambientales y desoves de los peces migradores. El Qrío, Vrío, Trío y Pluv, fueron las variables que mayor número de relaciones significativas presentaron. Los desoves de bocachico están relacionados con Qrío, Vrío y Trío, así como los STD y la Pluv (p<0.05). Los desoves de bagre blanco, al igual que bocachico, se correlacionaron directamente con Qrío, Vrío y Trío, e inversamente con Bs. Los desoves de dorada y barbul estuvieron asociados con la Pluv y Nub, respectivamente. El grupo otras especies tuvo un comportamiento similar al bocachico correlacionándose con las Qrío, Vrío, Trío y Pluv (Tabla 4).


Correlation between environmental variables and migratory fish spawning. Qriver, Vriver, Triver and Pluv, were the variables that showed the highest number of significant relations. Bocachico spawning is related to Qriver, Vriver and Triver, as well as STD and Pluv (p<0.05). Bagre blanco spawning, as well as bocachico spawning, were directly correlated to Qriver, Vriver and Triver, and inversely correlated to Bs. Dorada and barbul spawning were associated with Pluv and Nub, respectively. The other species group had a similar behavior to the bocachico species correlating with Qriver, Vriver, Triver and Pluv (Table 4).

Table 4. Correlation between the environmental factors and the reproductive activity of the rheophilic fish in the Sinu river in Carrizola, Tierralta (April-October 2008).

ENVIRONMENTAL VARIABLES

Spawning Qriver ΔQriver Vriver Triver CE STD Turb Nub Pluv Bs

Bocachico 0.31 0.07 0.28 0.19 0.04 0.17 -0.04 0.09 0.27 -0.06

Dorada 0.12 0.05 0.11 0.04 0.07 0.11 -0.10 0.14 0.21 0.00

Bagre b. 0.18 0.02 0.17 0.18 -0.03 0.00 0.03 -0.01 0.06 -0.15

Barbul 0.06 0.01 0.06 0.13 0.11 0.14 0.13 0.15 0.12 -0.09

Other spp. 0.27 0.10 0.24 0.23 0.03 0.14 -0.01 0.10 0.26 -0.08

Qriver= Rive flow; ΔQriver= Difference of river flow; Vriver=River velocity; Triver= River temperature; CE= electrical Conductivity; Total dissolved solids STD=; Turb= Turbidity; Nub= Cloudiness; Pluv= Rainfall; Bs= Solar brilliance. Significant relations emphasized in bold. spp.= Species.

Analysis of Main Components. In figure 2, the formation of two big groups can be observed: the first group is composed by the environmental variables Qriver, Vriver, Triver, STD, Nub and Pluv, that showed a high relation with spawning of all type of reophilic species of the Sinu river; while the second group was composed by the environmental variables ΔQriver, CE, Turb and BS, which are not related with the main species of reophilic spawning in this river.

DISCUSSION

The collection of ichthyoplankton was composed, mainly, by migratory fish embryos of the Characiformes order (Prochilodus magdalenae and Brycon sinuensis) and the Siluriformes order (Sorubim cuspicaudus and Pimelodus blochii). According to Maldonado-Ocampo et al (7) of the 1435 fish species that live in Colombia’s fresh water systems, the orders that make up the most species of the continent’s ichthyofauna are Characiformes, with 637 species (44%)

Figure 2. Biplot of the analysis of the main components for environmental variables and spawning in the Sinu river, Carrizola (Tierralta), during the 2008 reproductive season (April-October).

Análisis de Componentes Principales. En la figura 2, se observa la formación de dos grandes grupos: el primero conformado por las variables ambientales Qrío, Vrío, Trío, STD, Nub y Pluv, que evidenciaron una alta asociación con los desoves de todas las especies reofílicas en el río Sinú; mientras que el segundo grupo estuvo conformado por las variables ambientales ΔQrío, CE, Turb y Bs, las cuales no están asociadas con los desoves de las principales especies reofílicas en este río.

DISCUSIÓN

El ictioplancton colectado estuvo compuesto, principalmente, por embriones de peces migratorios de los órdenes Characiformes (Prochilodus magdalenae y Brycon sinuensis) y Siluriformes (Sorubim cuspicaudus y Pimelodus blochii). Según Maldonado-Ocampo et al (7) de las 1435 especies de peces que habitan los sistemas de agua dulce en Colombia, los órdenes que comprenden la mayoría de las especies de la ictiofauna continental son Characiformes con 637 especies (44%) y Siluriformes con 524 especies (37%). Jiménez-Segura et al (4), también reportaron que el 64% del ictioplancton en el río Magdalena, pertenece al grupo de peces migratorios de los órdenes Characiformes (P. magdalenae, Leporinus muyscorum, Curimata mivartii, Salminus affinis y Brycon sp.) y Siluriformes (Pimelodus spp., Pseudoplatystoma magdaleniatum, S. cuspicaudus). Asimismo en otros ríos de Suramérica, como en el río Uruguay, se encontró que la mayor abundancia de larvas colectadas pertenece al orden Characiformes (3).

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and Siluriformes, with 524 species (37%). Jimenez-Segura et al (4), also reported that 64% of the ichthyoplankton of the Magdalena river belong to the migratory fish group of the Characiformes order (P. magdalenae, Leporinus muyscorum, Curimata mivartii, Salminus affinis and Brycon sp.) and Siluriformes (Pimelodus spp., Pseudoplatystoma magdaleniatum, S. cuspicaudus). Also, in other South American rivers, such as the Uruguay river, it was found that the largest abundance of larva collected belongs to the Characiformes order (3).

When analyzing the results by species, it was observed that the highest Dl in the Sinu river was shown by Prochilodus magdalenae, which is the most important species of the Colombian continental fisheries and the Prochilodus genus, which is the most abundant in species in the South American continental waters (7). Pimelodids S. cuspicaudus and P. blochii, showed the lowest larval abundance during the studies reproductive season.

Fr during the study’s period indicated that the presence of ichthyoplankton was observed (reproductive activity) in only in 30.4% of the days . The months of April and May were the months with the most reproductive activity while in terms of frequency, like the Dl (which suggests that despite spawning appearing during the studied period (April-October), the first two months (April-May) are the months of highest reproductive activity and of highest larval density when compared to the rest of the period. These results suggest that in the Sinu river basin the highest reproductive activity of migratory fish occurs at the beginning of the rainy season, stimulated by the variations of abiotic factors caused by the start of the first rainy period of the year.

The Dl average of the estimated ichthyoplankton in Carrizola (Tierralta) as an indicator of the abundance of larval was 4.9 larvae/m3, which is higher than the records reported in the Magdalena river (2.5 larvae/m3) (4). It’s possible that the difference between these numbers is due to the sampling structure; in this study, an estimated average for the entire reproductive season is presented (184 days), considering only the days with spawning presence; while in the Magdalena rive, the amount of days evaluated was 72 days in two years of study. Salete-Daga et al (8) reported larval densities of 2.9 individuals/m3 in to floodable plains with different degrees of connection with the Parana river, Brazil; while Reynalte-Tatage et al (9) reported densities of 0.1 larvae/m3 in the Ivinhema river, Brazil.


Al analizar los resultados por especie, se observó que la mayor Dl en el río Sinú la presentó Prochilodus magdalenae, la cual es la especie más importante de la pesquería continental colombiana y el género Prochilodus el más abundante de las aguas continentales suramericanas (7). Los pimelódidos S. cuspicaudus y P. blochii, presentaron la menor abundancia larval durante la temporada reproductiva estudiada.

La Fr durante el período de estudio, señala que solamente en 30.4% de los días se observó presencia de ictioplancton (actividad reproductiva), con los meses de abril y mayo como los de mayor actividad reproductiva tanto en términos de frecuencia como de Dl, lo cual permite sugerir que a pesar de presentarse desoves durante el período evaluado (abril-octubre), los dos primeros meses (abril-mayo) son los de mayor actividad reproductiva y los de mayor densidades larvales cuando se le compara con el resto del período. Estos resultados sugieren que en la cuenca del río Sinú la mayor actividad reproductiva de los peces migradores ocurre al inicio de la temporada de lluvias, estimulado por las variaciones de los factores abióticos ocasionadas por el inicio del primer período lluvioso del año.

La Dl promedio del ictioplancton estimada en Carrizola (Tierralta), como indicador de abundancia larval fue de 4.9 larvas/m3, que está por encima de los registros reportados en el río Magdalena (2.5 larvas/m3) (4). Es posible que la diferencia entre estas cifras esté asociada a la estructura de muestreo; en el presente estudio se presenta un promedio estimado para toda la temporada reproductiva (184 días), considerando sólo los días con presencia de desoves; mientras que en el río Magdalena, la cantidad de días evaluados correspondió a 72 días en dos años de estudio. Salete-Daga et al (8), reportaron densidades larvales de 2.9 individuos/m3 en dos planos inundables con diferentes grados de conexión con el río Paraná, Brasil, mientras que Reynalte-Tatage et al (9), reportaron densidades de 0.1 larvas/m3 en el río Ivinhema, Brasil.

El río Sinú, a pesar de ser un río intervenido por la construcción de la HU, presentó una fuerte variabilidad en los valores de los parámetros que describen la masa de agua, generado por la estacionalidad pluviométrica, que se caracteriza por desórdenes cíclicos y temporales durante la transición de aguas bajas a altas y viceversa. Las alteraciones ocasionadas por el aumento de los niveles de las aguas, se caracterizaron por incremento en el caudal del río, velocidad, conductividad eléctrica, turbidez y sólidos totales disueltos y reducción en la temperatura. Iguales


The Sinu river, despite being a river intervened by the construction of the HU, presented a strong variation in the values of the parameters that describe water mass caused by rainfall season, which is characterized by cyclical and temporary disorders during the transition between shallow and high waters and vice versa. The alterations caused by the increase in water levels are characterized by the increase in the river’s flow, velocity, electric conductivity, turbidity and total dissolved solids and by the reduction of temperature. Similar conditions were reported for the Magdalena river with the difference that this river showed stronger daily fluctuations(4).

In this study, it was observed that spawning appeared when the river flows were above 790 ms3/s; agreeing with Baumgartner et al’s proposal (2), who considered that this condition was the only way for these species’ larva to reach floodable plains that are not connected to the rivers during dry season. Both in the upper part of the Parana river as well as in the floodable plains, a higher Dl of Pimelodus, Auchenipterus osteomystax and Iheringichthys labrosus was reported when the water level was high (2,10).

In the Sinu river, the results suggest that the variables associated to the spawning of reophilic fish were the river’s flow, velocity, temperature, rainfall, total dissolved solids, cloudiness and solar brilliance. Jiménez-Safe et al (4) suggest that in the Magdalena river during both annual hydrologic cycles (2004-2005), Dl increased when a reduction in solar brilliant, an increase in cloudiness, an increase in rainfall and a fluctuation of synchronized water appeared with specific moments of low lunar brightness (4). In the upper part of the Uruguay river (Brazil), the abundance of eggs and larva showed a strong seasonal variation related to the higher flow values and water temperature as well as lower dissolved oxygen values, pH and transparency (3).

In the Sinu river, spawning of P. magdalenae, S. cuspicaudus and other species are related to more than three parameters, being the river’s flow, velocity, temperature, and rainfall common factors in these species; while B. sinuensis and P. blochii were only correlated to rainfall and cloudiness, respectively. In the Magdalena river, Dl of S. cuspicaudus, Pimelodus spp. and P. magdalenae was increased before the start of the currents when some reduction in solar brilliance was evident and the stability index began to decrease due to changes in the increase of rainfall and total dissolved solids (4).

In the high plains of the Portuguesa river (Venezuela), the presence of eggs between three

condiciones fueron reportadas para el río Magdalena con la diferencia que este río presenta fluctuaciones diarias más marcadas (4).

En este estudio se observó que los desoves se presentaron cuando los caudales del río estuvieron por encima de 790 m3/s; coincidiendo con lo propuesto por Baumgartner et al. (2), quienes consideraron esta condición como la única manera para que las larvas de estas especies lleguen a los planos inundables que no tienen conexión con los ríos durante la época seca. Tanto en la parte alta del río Paraná como en las planicies de inundación, fue reportada mayor Dl de Pimelodus maculatus, Auchenipterus osteomystax y Iheringichthys labrosus cuando el nivel del agua se mantuvo alto (2,10).

En el río Sinú, los resultados sugieren que las variables que estuvieron asociadas a los desoves de los peces reofílicos fueron caudal del río, velocidad, temperatura, pluviosidad, sólidos totales disueltos, nubosidad y brillo solar. Jiménez-Segura et al (4) sugieren que en el río Magdalena durante los dos ciclos hidrológicos anuales (2004-2005) la Dl se incrementó cuando se presentó reducción del brillo solar, incremento de la nubosidad, incremento de la pluviosidad y fluctuación del nivel del agua sincronizados con momentos específicos de bajo brillo lunar (4). En el alto río Uruguay (Brasil), la abundancia de huevos y larvas presentó una marcada variación estacional, relacionada con los mayores valores de flujo y temperatura del agua y los menores valores de oxígeno disuelto, pH y transparencia (3).

En el río Sinú, los desoves de P. magdalenae, S. cuspicaudus y otras especies están relacionados con más de tres parámetros, donde caudal del río, velocidad, temperatura, pluviosidad son factores comunes en estas especies; mientras que B. sinuensis y P. blochii sólo se correlacionaron con pluviosidad y nubosidad respectivamente. En el río Magdalena, la Dl de S. cuspicaudus, Pimelodus spp. y P. magdalenae se incrementó antes del comienzo de las crecientes, cuando se hizo evidente alguna reducción en el brillo solar y el índice de estabilidad comenzó a disminuir asociado a cambios en el incremento de pluviosidad y sólidos totales disueltos (4).

En los llanos altos del río Portuguesa (Venezuela), se registró la presencia de huevos entre tres y cinco veces por año, sólo cuando se observó aumento del nivel del río, con velocidades de las aguas entre 0.59 a 1.06 m/s y generalmente luego del máximo nivel de inundación (11). En el alto río Uruguay (Brasil), se observaron huevos y larvas vitelínicas en los rápidos y desembocadura del río, con velocidades promedios entre 0.84 y 0.50 m/s

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and five times per year was recorded only when an increase in the river’s level was observed with water speeds between 0.59 to 1.06 m/s and generally, after the maximum flood level (11). In the upper Uruguay river (Brazil), eggs and yolk-sac larvae in the river rapids and mouth, with average speeds between 0.84 and 0.50 m/s were observed (3). In the Sinu river, these events were observed with average speeds above 1.41 m/s.

In the Sinu river, the electric conductivity was not related to spawning of migratory fish, but they were related to the temperature. In the Cuiba, Mato Gross river (Brazil), the higher densities of embryos and larvae are related to the places with low concentrations of dissolved oxygen, electric conductivity and transparency, larger width of the river and intermediate depths (12). In the flood plain of the upper Parana river, the electric conductivity was positively correlated with the ichthyoplankton density (8); likewise, a positive linear ratio was observed between the abundance of total larvae and the environmental conditions; which suggests that the higher abundance of larvae was related to higher values of electric conductivity and temperature (near 30ºC) (8).

In this study, the highest spawning of reophilic fish in the Sinu river appeared between April and May, when the temperature showed values between 27.0 and 28.7°C. The highest reproductive intensity of many species of the Upper Parana river occurs between October and January (13), when the water temperatures are higher. Bialetzki et al (10) found strong relations between the ichthyoplankton community and the environmental variables in the Bahia river, mainly related with the temperature, the dissolved oxygen, the rainfall and the velocity. According to Jimenez-Segura (4) the photoperiod and the temperature are related to physicochemical processes associated with rainfall, such as the reduction in the intensity of solar brilliance, the increase in clouds and the increase in the water level, causing the reduction of the temperature.

In the Sinu river, the total dissolved solids were only correlated with P. magdalenae dissolves. In the Magdalena rive, the migratory fish spawning were related to total dissolved solids and the turbulence that characterizes the river currents period (4).

In the Sinu river, solar brilliance was only correlated inversely to S. cuspicaudus, spawning; whereas, in the river Magdalena, the change in maximum number of hours of solar brilliance between the months with higher and lower precipitation (about 2 hours), defined by temporary cloudiness patters, seem to define the chronology in the reproduction of reophilic fish (4).


(3). En el río Sinú, estos eventos se observaron con velocidades promedio por encima de 1.41 m/s.

En el río Sinú, la conductividad eléctrica no estuvo relacionada con los desoves de los peces migradores, pero sí la temperatura. En el río Cuiabá, Mato Grosso (Brasil), las mayores densidades de embriones y larvas están relacionadas con los sitios que presentan bajas concentraciones de oxígeno disuelto, conductividad eléctrica y transparencia, mayor ancho del río y profundidades intermedias (12). En la llanura aluvial del río Paraná superior, la conductividad eléctrica se correlacionó positivamente con la densidad del ictioplancton (8); de igual modo, se observó una relación lineal positiva entre la abundancia total de larvas y condiciones ambientales; sugiriendo que la mayor abundancia de larvas se asoció con altos valores de conductividad eléctrica y temperatura (cerca de 30ºC), (8).

En el presente estudio, los mayores desoves de los peces reofílicos en el río Sinú se presentaron entre abril y mayo, cuando la temperatura mostró valores entre 27.0 y 28.7°C. La mayor intensidad reproductiva de muchas especies de peces en el río Paraná Superior ocurren entre octubre y enero (13), cuando las temperaturas del agua son más altas. Bialetzki et al (10), encontraron fuertes relaciones entre la comunidad del ictioplancton y las variables ambientales en el río Bahia, relacionados principalmente con la temperatura, oxígeno disuelto, pluviosidad y velocidad. Según Jimenez-Segura (4) el fotoperíodo y la temperatura están relacionados con procesos físico-químicos asociados con la pluviosidad, como reducción de la intensidad del brillo solar, incremento de las nubes e incremento del nivel del agua trayendo como consecuencia la reducción de la temperatura.

En el río Sinú, los sólidos totales disueltos estuvieron correlacionados, únicamente, con los desoves de P. magdalenae. En el río Magdalena, los desoves de los peces migratorios se relacionaron con los sólidos totales disueltos y la turbulencia que caracteriza el período de crecientes (4).

En el río Sinú, el brillo solar estuvo correlacionado de manera inversa, solamente, con los desoves de S. cuspicaudus, mientras que en el río Magdalena, el cambio de número de horas de máximo brillo solar entre los meses de mayor y menor precipitación (cercano a las 2 horas), definida por los patrones de nubosidad temporal, parecen definir la cronología en la reproducción de los peces reofílicos (4).

Los resultados del presente trabajo permiten concluir que la mayor actividad reproductiva, en términos de Fr y Dl, se presentó al inicio de la temporada de lluvias (abril y mayo).


The results of this work allow to conclude that the highest reproductive activity, in terms of Fr and Dl, was at the beginning of the rainy season (April and May). The abiotic parameters of the river’s flow, temperature, velocity, rainfall, total dissolved solids and cloudiness can be considered as final factors that stimulate the reproduction of reophilic fish. The spawning of P. magdalenae and S. cuspicaudus were stimulated by the river’s flow, velocity and temperature; while the rainfall and the total dissolved solids stimulated the spawning of P. magdalenae. The spawning of B. sinuensis was stimulated only by rainfall; while the spawning of P. blochii was stimulated only by cloudiness.

Acknowledgments

To the Urra SA-ESP Hydroelectric for financing this study.

Los parámetros abióticos como caudal del río, temperatura, velocidad, pluviosidad, sólidos totales disueltos y nubosidad se pueden considerar factores finales que estimulan la reproducción de los peces reofílicos. Los desoves de P. magdalenae y S. cuspicaudus estuvieron estimulados por caudal del río, velocidad y temperatura; mientras que pluviosidad y sólidos totales disueltos estimularon los desoves de P. magdalenae. Los desoves de B. sinuensis estuvieron estimulados únicamente por la pluviosidad, mientras que los desoves de P. blochii estuvieron estimulados solo por la nubosidad.

Agradecimientos

A la empresa Hidroeléctrica Urrá SA-ESP por la financiación del presente estudio.

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Genetic diversity detection of the domestic horse (Equus caballus) by genes associated with coat color

Detección de la diversidad genética del caballo doméstico (Equus caballus) mediante genes asociados al color del pelaje

Luz Correa A,1* Biol, Cindy Reyes E,1 Biol, Enrique Pardo P,1 Ph.D, Teodora Cavadia M,1 M.Sc.

1Universidad de Córdoba, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Biología, Grupo de Investigación Genes. Carrera 6 No. 76-103. Montería, Colombia. *Correspondencia: [email protected]


ABSTRACT Objective. To assess the population structure and genetic diversity in populations of domestic horse (Equus caballus) in the municipality Cienaga de Oro-Córdoba (Colombia). Materials and methods. Random sampling were conducted between August and October 2013, in adult animals on farms seven districts, which was carried out phenotypic characterization of each animal, based on autosomal markers encoding morphological Extension (E) , Agouti (A), Cream (C), White (W), Gray (G), Tobiano (TO), Overo (O) and Roan (RN). Population genetic parameters: allele frequency, genetic diversity, gene flow, Hardy-Weinberg equilibrium and genetic distance were calculated through the program POPGENE 1.31; the genetic structure was assessed using the program FSTAT v. 2.9.3.2. Results. 341 individuals were analyzed in the seven populations studied, where the Extension gene Was the MOST faq frequently as the Overo and Tobiano genes showed the lowest values. Insignificant values of genetic variability and population recorded a global level, likewise, low genetic differentiation among populations, accompanied by a high gene flow was obtained; an excess of heterozygotes at population and global level was observed; to this is added the presence of Hardy-Weinberg equilibrium in all populations relative to the markers studied and low genetic distance values were reported. Conclusions. The populations are highly genetically related, a situation that may result from the existing geographical proximity between them, favoring genetic exchange and the establishment of a metapopulation.

Key words: Horse, Ciénaga de Oro, Córdoba, heterozygosity (Source: MeSH).

RESUMEN

Objetivo. Evaluar la estructura poblacional y la diversidad genética en poblaciones de caballo doméstico (Equus caballus), en el municipio Ciénaga de Oro, Córdoba (Colombia). Materiales y métodos. Se realizaron muestreos aleatorios entre los meses de Agosto y Octubre del año 2013, en animales adultos presentes en las fincas de siete corregimientos, donde se llevó a cabo la caracterización fenotípica a cada animal, atendiendo a los marcadores autosómicos de codificación morfológica Extension (E), Agouti (A), Cream (C), White (W), Gris (G), Tobiano (TO), Overo (O) y Roan (RN). Los parámetros genéticos poblacionales: frecuencia alélica, diversidad genética, flujo génico, equilibrio Hardy-Weinberg y distancia génica, fueron calculados a través del programa PopGene 1.31; la estructura genética se evaluó mediante el programa FSTAT v. 2.9.3.2. Resultados. Se analizaron

ORIGINAL



341 individuos en las siete poblaciones estudiadas, donde El marcador Extensión fue el de mayor frecuencia mientras los genes Overo y Tobiano presentaron los menores valores. Se registraron cifras poco significativas de variabilidad genética a nivel global y poblacional, así mismo, se obtuvo una escasa diferenciación genética entre las poblaciones, acompañado de un elevado flujo génico; se observó un exceso de heterocigotos a nivel poblacional y a nivel total, a esto se le suma la presencia de equilibrio Hardy-Weinberg en todas las poblaciones con relación a los marcadores estudiados y se reportaron valores bajos de distancia genética. Conclusiones. Las poblaciones se encuentran muy relacionadas genéticamente, situación que puede obedecer a la cercanía geográfica existente entre ellas, favoreciendo el intercambio genético y la constitución de una metapoblación.

Palabras clave: Caballo, Ciénaga de Oro, Córdoba, heterocigosidad (Fuente: MeSH).

INTRODUCCIÓN

El caballo doméstico (Equus caballus) es un mamífero del orden Perissodactyla y familia Equiidae; esta especie se caracteriza por tener extremidades largas y fuertes, cuerpo en forma de barril cubierto de pelos cortos, además de cuello largo que soporta la cabeza moderadamente grande y la cola se extiende hasta la mitad de las extremidades posteriores (1). Este animal es considerado como uno de los principales recursos domésticos a lo largo de la historia de la humanidad, pues la fuerza, nobleza y fidelidad que lo caracterizan, han sido fundamentales en la lucha del hombre por la libertad y el desarrollo de los pueblos. Colombia históricamente ha sido un país con vocación equina, por lo que se ha avanzado en el conocimiento de este importante recurso doméstico, con especial énfasis en aspectos relacionados con el mejoramiento de los esquemas sanitarios preventivos y de diagnóstico, pero con un gran vacío en el campo de la investigación genética, lo que ameritan la profundización en este tipo de estudios como complemento al conocimiento íntegro del caballo doméstico (2).

La diversidad de las especies domésticas es considerada un importante componente de la biodiversidad global (3,4), especialmente la variabilidad de los recursos zoogenéticos, considerada elemento clave en todos los sistemas de producción, ya que proporciona la materia prima para la mejora genética y la adaptación a las circunstancias cambiantes, siendo las razas de origen criollo un reservorio natural e irremplazable de variabilidad genética; por lo tanto, el conocimiento de ellas es clave para la posible planificación de estrategias de conservación sustentables a largo plazo (5), situación que se ha visto reflejada con la realización de estudios genético poblacionales en ganado bovino (6,7) y equino (8) de raza criolla, con el fin de diseñar planes de manejo, orientados hacia su protección y mejoramiento.Los marcadores fenotípicos, constituyen una valiosa herramienta a la hora de analizar la

INTRODUCTION

The domestic horse (Equus caballus) is a mammal of the Perissodactyla order and the Equiidae family; this species is characterized by having long and strong limbs, barrel type body covered by short hair, as well as a long neck that supports the moderately large head and a tail that extends until half the hindlimbs (1). This animal has been considered as one of the main domestic resources throughout human history, because its force, nobility and fidelity characteristics have been fundamental in the fight for freedom of mankind and the development of nations. Historically, Colombia has been a country with equine interest, and as such, there has been progress in understanding this important domestic resource with special emphasis in species related to the development of preventive sanitary and diagnostic schemes. However, there is a large gap in the genetic research field of the animal; therefore, a deeper study of this type should be conducted as a complement to the complete knowledge of the domestic horse (2).

The diversity of domestic species is considered an important component of the global biodiversity (3,4), specially the variability of zoogenetic resources, which is considered a key element of all production systems since it provides the raw material for genetic improvement and the adaptation of changing circumstances, being local breeds a natural and irreplaceable reservoir of genetic variability. Therefore, their understanding is key for the possible planning of long-term sustainable conservation strategies (5). This situation has been reflected in the undertaking of genetic population studies in local breeds cattle (6,7) and equine (8) in order to design management plans oriented towards their protection and improvement.

Phenotypic markers are a valuable tool when analyzing the genetic structure of populations due to their large data contents, easy manipulation and identification and fast results (9). Important

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estructura genética de las poblaciones, debido a su gran contenido informativo, fácil manipulación e identificación y rápida obtención de resultados (9), llevándose a cabo importantes estudios en poblaciones domésticas de gatos (9) y palomas (10), mediante el empleo de genes relacionados con el color la capa.

A raíz de lo anteriormente expuesto la presente investigación tuvo como finalidad conocer el grado de diversidad y estructura genética en poblaciones de caballos domésticos (Equus caballus) en el municipio de Ciénaga de Oro, Córdoba, Colombia.


Sitio de estudio. El estudio se realizó en el municipio de Ciénaga de Oro (Córdoba), localizado a 8°53’ de latitud norte y 75°37’ de longitud al oeste del meridiano de Greenwich, presenta una altitud de 13 msnm, y una temperatura promedio de 27°C, con una extensión de 751 Km2, de los cuales 368 Km2 corresponden a la zona rural, donde se muestrearon los corregimientos Berástegui, El Siglo, Los Mimbres, Pijiguayal, Las Palmitas, Punta de Yánez y San Antonio del Táchira.

Obtención de datos. Se realizaron muestreos aleatorios entre los meses de Agosto a Octubre del año 2013, a 341 animales adultos presentes en las fincas de cada población estudiada, donde se caracterizó fenotípicamente cada animal atendiendo a los marcadores autosómicos de codificación morfológica (Extensión, Agouti, Cream, Gris, White, Tobiano, Overo, Roan), por último se tomaron registros fotográficos de cada individuo.

Marcadores del pelajeExtension (E). Este gen origina el color negro en el caballo cuando se expresa de forma dominante (E), mientras que en condición recesiva (e) el pelaje no adquiere este color (11).

Agouti (A). En condición dominante (A) el gen provoca que la coloración negra se extienda a la crin, cola y parte inferior de las patas, de forma recesiva (a) no causa ningún cambio en el color de los caballos (11).

Cream (C). El gen de forma dominante (C) propicia la dilución del color sólido, lo que conlleva a un esclarecimiento del mismo, mientras que su representación recesiva (c), no causa dilución en el color (11).

Gris (G). En carácter dominante el gen provoca (G) una mezcla de pelos blancos y negros, dando

studies in domestic populations of cats (9) and pigeons (10) have been conducted through the use of genes related to their coat color.

In light of the above, this research had the purpose of assessing the genetic degree of diversity and structure of populations in domestic horses (Equus caballus) in the municipality of Cienaga de Oro, Colombia.


Study location. The study was conducted at the municipality of Cienaga de Oro (Cordoba), located at 8°53’ latitude north and 75°37’ latitude west of the Greenwich meridian. The town has an altitude of 13 m above sea level and an average temperature of 27°C, with an area of 751 km2, of which 368 km2 are in rural areas. The town includes the villages of Berastegui, El Siglo, Los Mimbres, Pijiguayal, Las Palmitas, Punta de Yañez and San Antonio del Tachira.

Obtaining of data. Random sampling was conducted between August and October 2013 in adult animals that are the property of the farms in each of the studied populations. Phenotypic characterization of each animal was conducted, based on encoding morphological autosomal markers (Extension, Agouti, Cream, Gray, White, Tobiano, Overo, Roan). Lastly, photographic records were taken of each individual.

Coat markers.Extension (E). This gene originates the black color in the horse when it is expressed in a dominant form (E), while in the recessive condition (e), the coat does not acquire this color (11).

Agouti (A). In this dominant condition (A), the gene causes the black coloring to extend to the hair, the tail and the lower part of the legs; in a recessive (a) form it does not cause any change in the horse’s color (11).

Cream (C). The dominant gene (C) causes the solid color to dilute, which causes the color to clarify; while in its recessive presentation (c), it does not cause the color to dilute (11).

Gray (G). The dominant characteristic of the gene causes (G) to mix the white and black hair, giving a gray image; in its recessive condition (g), the horse does not show this coat color (11).

White (W). When the (W) gene appears the horse is totally white. This marker should be in a heterozygote condition (Ww) since the homozygosis is lethal; while in its recessive trait

Correa - Genetic diversity domestic horse


una imagen general de gris, en condición recesiva (g) el caballo no presenta esta coloración en su capa (11).

White (W). Al expresarse el gen (W) el caballo es totalmente blanco, este marcador debe encontrarse en condición heterocigoto (Ww) ya que en homocigosis es letal, mientras que de manera recesiva (w) el caballo puede ser de otro color (11,12).

Tobiano (TO). En condición dominante (TO) el caballo posee una serie de manchas blancas que se extienden desde la región dorsal hasta llegar al vientre, e incluso pueden posarse en las patas, en condición recesiva (to) no se expresa esta característica (11).

Overo (O). Al ser dominante este gen (O) se producen manchas blancas orientadas desde la región ventral hacia la dorsal, generalmente son pequeñas y pueden localizarse en las patas y la cara, este gen en forma recesiva (o) no causa cambios en el color normal de los caballos (11).

Roan (RN). El caballo portador del gen dominante (RN) presenta en el cuerpo una mezcla de pelos blancos en cualquier color de fondo, a excepción de la cabeza y las patas, en condición recesiva (rn) no se produce esta característica (11).

Diseño estadístico. La estimación de las frecuencias alélicas de cada marcador a nivel poblacional y global, así como las medidas de diversidad genética establecidas por Nei correspondientes a la heterocigosidad esperada (He), heterocigosidad esperada de la población total (HT), coeficiente de diferenciación genética (GST), flujo génico (Nm), equilibrio Hardy- Weinberg y la distancia genética entre las poblaciones, se estimaron a través del programa PopGene 1.31 (13), la estructura genética de las poblaciones, atendiendo a los índices de fijación propuestos por Wright: FIS, FIT y FST, se calculó mediante el programa FSTAT v. 2.9.3.2 (14).

La elaboración del dendrograma que representa los valores estimados de distancia genética se realizó a través del método UPGMA (Unweighted Pair Group Methodwith Arithmetic Mean) empleando el programa MEGA 5.2 (15).

RESULTADOS

En las siete poblaciones estudiadas se analizaron un total de 341 individuos distribuidos de la siguiente forma: Berástegui (n=68), El Siglo (n=67), Pijiguayal (n=54), Punta de Yánez

(w), the horse can have another color (11,12).

Tobiano (TO). In the dominant condition (TO), the horse has a series of white spots that cross the dorsal region until the belly, and even on the legs; in its recessive condition (to), this characteristic is not present (11).

Overo (O). Given that the (O) gen is dominant, white spots are present from the ventral region towards the dorsal region; the spots are usually small and can be present on the legs and the case; in its recessive form (o) this gene does not cause changes in the normal color of the horses (11).

Roan (RN). The horse that carries the dominant gene (RN) presents in the body a mix of white hairs in any base color, except on the hair and the legs; in its recessive condition (rn), this characteristic is not present (11).

Statistical design. The estimation of allele frequency of each marker at a population and at a global level, as well as the genetic diversity measures established by Nei corresponding to the expected heterozygosis (He), expected heterozygosis of the total population (HT), genetic differentiation coefficient (GST), genetic flow (Nm), Hardy-Weinberg equilibrium and genetic distance among the populations, were estimated with the PopGene 1.31 program (13). The genetic structure of the population, observing the fixation indexes proposed by Wright: FIS, FIT and FST, was calculated using the FSTAT v. 2.9.3.2 program (14).

The dendrogram that represents the estimated values of the genetic distance was elaborated with the UPGMA (Unweighted Pair Group Methodwith Arithmetic Mean) method using the MEGA 5,2 program (15).

RESULTS

In the seven population studies a total of 341 individuals were analyzed and distributed as follows: Berástegui (n=68), El Siglo (n=67), Pijiguayal (n=54), Punta de Yánez (n=47), Las Palmitas (n=46), Los Mimbres (n=41) and San Antonio del Táchira (n=18).

Allele frequencies. When calculating allelic frequencies for each population (Table 1), the Extension gene was the most frequent, especially in municipalities like San Antonio (p=1.000), Las Palmitas (p=0.744) and Los Mimbres (p=0.729); in the first two municipalities the Agouti gene frequency was significant, being the second marker in terms of frequency. On the other hand,

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(n=47), Las Palmitas (n=46), Los Mimbres (n=41) y San Antonio del Táchira (n=18).

Frecuencias alélicas. Al calcular las frecuencias alélicas para cada población (Tabla 1) se obtuvo que el gen Extensión fue el más frecuente, especialmente en las poblaciones de San Antonio (p=1.000), Las Palmitas (p=0.744) y Los Mimbres (p=0.729), en las dos primeras el gen Agouti se encontró de manera significativa, ubicándose como el segundo marcador en términos de frecuencia. Por otra parte, el marcador White, responsable de la capa blanca, no se encontró en ninguna de las poblaciones, mientras que en algunas de ellas los marcadores Tobiano, Overo y Roan fueron encontrados en frecuencias muy bajas. Por otro lado, la población Los Mimbres fue la zona con el menor número de genes reportados (sólo 3 de los 8) seguido de Las Palmitas y Punta de Yánez, quienes presentaron sólo la mitad, mientras que la población de El siglo sobresale, al contener la mayor parte de los marcadores.

A nivel global, el gen Extensión se ubicó como el marcador con la mayor frecuencia, seguido de Agouti y Gris (Tabla 2), en contraste, los genes Cream, Tobiano, Overo y Roan presentaron las menores frecuencias.

Diversidad genética. En cada una de las poblaciones el nivel medio de variabilidad genética fue bajo (Tabla 3) siendo la población de San Antonio la de menor heterocigosidad (He=0.0958), por otro lado, a nivel de marcadores, las poblaciones El Siglo y Pijiguayal resultaron ser las de mayores índices de diversidad génica con respecto al gen Extension; sin embargo, la población de Las Palmitas para el marcador Agouti, se ubicó como la zona con el mayor grado de diversidad génica a nivel general, al presentar un valor correspondiente a 0.4977, seguido de Berástegui (He=0.4964) y Punta de Yánez (He=0.4958) para el marcador antes mencionado, quien además presentó los niveles más altos de variabilidad genética en todas las poblaciones a excepción de El Siglo. En conjunto, el marcador Agouti presentó el mayor valor de diversidad genética seguido del gen Extensión, cuyo índice fue significativamente superior a los registrados por el resto de los marcadores (Tabla 4), en promedio el nivel de variabilidad genética en la población total fue de 0.1542. Con relación al test de equilibrio Hardy-Weinberg, a nivel general las poblaciones reportaron equilibrio, de igual manera sucedió para todos los marcadores.

Diferenciación genética y flujo génico. El nivel de diferenciación genética en la población de Ciénaga de Oro fue muy bajo (0.0452), lo

the White marker, responsible for the white coat, was not found in any municipality; while the Tobiano, Overo and Roan markers were found in some municipalities in very low frequencies. On the other hand, Los Mimbres was the area with the less number of genes reported (only 3 and 8) followed by Las Palmitas and Punta de Yánez, which presented only half the reported genes; while that El Siglo had the most number of markers.

At global level, the Extension gene was the marker with the most frequency, followed by Agouti and Gray (Table 2); by contrast, the Cream, Tobiano, Overo and Roan genes presented the markers with the least frequency.

Table 1. Allele frequency of each marker in the studied populations.

PopulationsLocus

E A C W G TO O RN

Pijiguayal 0.66 0.38 0.09 0.00 0.15 0.00 0.00 0.03

Mimbres 0.72 0.36 0.00 0.00 0.19 0.00 0.00 0.00

El Siglo 0.59 0.36 0.05 0.00 0.13 0.00 0.01 0.01

Las Palmitas 0.74 0.53 0.07 0.00 0.08 0.00 0.00 0.00

San Antonio 1.00 0.66 0.09 0.00 0.06 0.00 0.00 0.03

Punta de Yánez 0.67 0.45 0.04 0.00 0.10 0.00 0.00 0.00

Berástegui 0.68 0.46 0.07 0.00 0.08 0.01 0.00 0.01

E: Extension; A: Agouti; C: Cream; W: White; G: Gray; TO: Tobiano; O: Overo; RN: Roan

Table 2. Total allele frequency of each phenotypic marker in the municipality of Cienaga de Oro.

Locus

Total PopulationE A C W G TO O RN

0.69 0.43 0.06 0.00 0.11 0.00 0.00 0.01

E: Extension; A: Agouti; C: Cream; W: White; G: Gray; TO: Tobiano; O: Overo; RN: Roan.

Genetic diversity. In each one of the populations, the medium level of genetic variability was low (Table 3), being San Antonio the municipality with the least heterozygosis (Hand=0.0958). On the other hand, at the marker level, El Siglo and Pijiguayal were the municipalities that resulted having the largest diversity indexes with respect to the Extension gene. However, for the Agouti marker, Las Palmitas was the area with the largest degree of genetic diversity at a general level by obtaining a value of 0.4977, followed by Berástegui (Hand=0.4964) and Punta de Yánez (Hand=0.4958) for the marker previously mentioned, which also presented the highest levels of genetic variability in all municipalities, except in El Siglo. Altogether, the Agouti marker presented the largest genetic diversity



cual indica que aproximadamente el 4.5% de la variación detectada se debe a diferencias entre las poblaciones, por lo tanto, las siete poblaciones no fueron significativamente diferentes para los marcadores estudiados y sugiere que todas ellas se mantienen como una sola población.

En contraste, el elevado valor de flujo génico (10.5569) permite suponer que las poblaciones mantienen un grado considerable de intercambio genético, asumiéndose un total de diez migrantes por generación, además la cifra obtenida resultó ser mayor que 1 y 4, lo que indica que las poblaciones se comportan como una metapoblación.

Estructura poblacional. Las cifras negativas en cada marcador y en promedio (-0.0733) para el coeficiente FIS (Tabla 5) reflejan un exceso de heterocigotos de los individuos con respecto a cada población y por lo tanto se asume ausencia de consanguinidad, con valores de -0.0064 para el marcador Cream hasta -0.3968 para el gen Tobiano, con relación al estadístico FIT, el valor promedio (-0.0246) refleja un exceso de heterocigotos de los individuos con respecto a la población total, abarcando valores de -0.026 a -0.3809 para los marcadores Gris y Overo respectivamente. Es importante resaltar que los valores promedio de FIS y FIT no se alejan demasiado de cero, por lo que se asume que la población global está cerca del equilibrio Hardy-Weinberg. Por otro lado el valor promedio de FST resultó ser bajo, lo que indica la escasa diferenciación génica existente entre las poblaciones, cabe resaltar que un valor similar se registró para el coeficiente GST.

Distancia genética. La distancia genética entre las poblaciones fue baja, siendo Punta de Yánez y Berástegui las poblaciones más cercanas (Tabla 6), mientras que El Siglo y San Antonio resultaron ser las de mayor diferencia génica; cifra poco significativa, pues no superó el 4%, en este contexto, la población de San Antonio presentó los mayores valores de distancia genética en comparación con el resto de las poblaciones.

value followed by the Extension plan, whose index was significantly higher than the indexes registered by the rest of the markers (Table 4). On average, the genetic variability level on the total population was 0.1542. With respect to the Hardy-Weinberg equilibrium test, at a general level the municipalities reported equilibrium. This also happened for all markers.

Genetic differentiation and genic flow. The genetic differentiation level in Cienaga de Oro was very low (0.0452), which indicates that approximately 4.5% of the variation detected is due to differences between the populations; therefore, the seven populations were not significantly different for the studied markers and suggest that all these are considered as a single population.

In contrast, the higher value of the genetic flow (10.5569) indicates that the populations keep a considerable degree of genetic exchange, assuming a total of ten migrants per generation. Also, the number obtained is higher than 1 and 4, which indicates that the populations behave like a metapopulation.

Population structure. The negative numbers in each marker and in average (-0.0733) for the FIS coefficient (Table 5), show an excess of heterozygotes of the individuals with respect to each population and therefore, the absence of consanguinity is assumed. With values of -0.0064 for the Cream marker up to -0,3968 for the Tobiano gene, in relation to the FIT statistical, the average value (- 0.0246) reflects an excess of heterozygotes of the individuals with respect to the total population, covering values of -0.026 to -0.3809 for the Gray and Overo markers, respectively. It is important to highlight that the average FIS and FIT values do not move away too

Table 3. Nei’s (1973) genetic diversity index in each population through expected Heterozygosis (He) for each marker.

PopulationsLocus

Average E A C G TO O RN

Pijiguayal 0.44 0.47 0.16 0.25 0.00 0.00 0.05 0.17

Mimbres 0.39 0.46 0.00 0.30 0.00 0.00 0.00 0.14

El Siglo 0.48 0.46 0.10 0.22 0.01 0.01 0.03 0.17

Las Palmitas 0.38 0.50 0.13 0.15 0.00 0.00 0.00 0.14

San Antonio 0.00 0.44 0.16 0.11 0.00 0.00 0.05 0.09

Punta de Yánez 0.44 0.49 0.08 0.18 0.00 0.00 0.00 0.15

Berástegui 0.43 0.50 0.13 0.15 0.03 0.00 0.01 0.16


Table 4. Total Heterozygosis and Hardy-Weinberg equilibrium test for each marker in the municipality of Ciénaga de Oro.

Locus E A C G TO O RN Average

HT 0.39 0.49 0.11 0.191 0.001 0.00 0.02 0.15

H-W 0.00 0.00 0.001 0.001 0.00 0.00 0.00


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Atendiendo a los valores de distancia genética reportados en el dendrograma (Figura 1) puede apreciarse que las poblaciones de Punta de Yánez y Berástegui se ubicaron como las menos lejanas y a las cuales se asocia la población de las Palmitas. Con relación a las poblaciones de Pijiguayal y El Siglo, se destaca entre ellas una considerable cercanía, quienes a la vez, mantienen una estrecha relación con Los Mimbres. Por otro lado, la población de San Antonio se mantuvo alejada de las demás, pero con un valor de distancia poco significativo, que permite deducir que las poblaciones en conjunto están muy relacionadas.

much from zero; therefore, it is assumed that the global population is close to the Hardy-Weinberg equilibrium. On the other hand, the average FST value was low, which indicates the minor genetic differentiation that exists in other populations. It is worth noting that a similar value was recorded for the GST coefficient.

Genetic distance. The genetic distance between populations was low, being Punta de Yánez and Berástegui the closest populations (Table 6), while El Siglo and San Antonio were the populations with the highest genetic differentiation; the number was not very significant since it did not surpass 4%. In this context, San Antonio presented the highest genetic distance values in comparison with the rest of the populations.

Considering the reported genetic distance values in the dendrogram (Figure 1), it can be observed that Punta de Yánez and Berástegui were the populations that were the closest and to which Las Palmitas is associated to. In relation to Pijiguayal and El Siglo, there is a considerable proximity, and also, they have a close relation with Los Mimbres. On the other hand, San Antonio was the farthest population from the other populations, but with an insignificant distance value, which allows to deduce that the populations altogether are very related.

DISCUSSION

The elevated frequency of the Extension gene in all populations can be due to the hypothesis proposed by several authors (16), which is based on the fact that the allele variations that make more melanin colors (dark) possible, are favored in the comparison with those colors with lighter tones. Also, it has been demonstrated that the absorption capacity of calorie radiation is more frequent in animals with dark coat than in those animals with lighter coats (17). This allows assuming that darker horses are better adapted to prevailing conditions in tropical climates, considering

Table 5. Statistical F values for each marker in a global population.

Markers FIS FIT FST

Extension -0.1586 -0.0743 0.0728

Agouti -0.0345 0.0101 0.0431

Cream -0.0064 0.0073 0.0136

Gray -0.0448 -0.026 0.0181

Tobiano -0.3968 -0.375 0.0156

Overo -0.3809 -0.3809 0

Roan 0.0681 0.0807 0.0134

Average -0.0733 -0.0246 0.0453

Table 6. Genetic distance matrix (Nei, 1972) among populations.

Population 1 2 3 4 5 6 7

1 -----------

2 0.0020 -----------

3 0.0011 0.0037 -----------

4 0.0054 0.0071 0.0079 -----------

5 0.0289 0.0277 0.0375 0.0117 -----------

6 0.0016 0.0033 0.0022 0.0018 0.0220 -----------

7 0.0018 0.0042 0.0027 0.0015 0.0208 0.0002 -----------

1: Pijiguayal; 2: Los Mimbres; 3: El Siglo; 4: Las Palmitas; 5: San Antonio; 6: Punta de Yánez; 7: Berástegui.

Figure 1. Dendrogram based in genetic distances (Nei, 1972) among the municipalities of the town of Cienaga de Oro, obtained by the UPGMA method.

DISCUSIÓN

La elevada frecuencia del gen Extension en todas las poblaciones puede obedecer a la hipótesis propuesta por varios autores (16) la cual se fundamenta en el hecho de que las variantes alélicas que posibilitan las coloraciones más melánicas (oscuras) se ven favorecidas en comparación con aquellas responsables de las tonalidades claras, además se ha demostrado que la capacidad de absorción de radiación calórica es más eficiente en animales de capa oscura que en aquellos de tonalidades claras (17), lo que permite suponer que los caballos oscuros, están mejor adaptados a las condiciones imperantes en el clima tropical, teniendo en cuenta que los equinos son animales que por lo general pastan la mayor parte del día.



Por otro lado, la ausencia de caballos blancos, pudo deberse a la particular condición que caracteriza al marcador White, pues en homocigosis propicia la muerte del animal (12), hecho que explica la reducción sustancial en el número de individuos portadores del gen.

La presencia de la mayoría de los marcadores en la población de El Siglo, demuestra la gran variedad de genes disponibles en la zona, situación que posiblemente se atribuye a la cercanía geográfica existente entre las poblaciones en estudio y las aledañas al municipio, favoreciendo el movimiento de migrantes de una población a otra y por consiguiente, un considerable intercambio génico, esto explicaría el reducido número de genes reportados en la población de Los Mimbres, pues, es la única que no sostiene un contacto directo con las poblaciones fronterizas. Es conveniente precisar que aunque las poblaciones estudiadas se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg, no se puede asumir la completa ausencia de migración, mutación y selección, debido a que los cambios producidos por estas fuerzas evolutivas en las frecuencias génicas, toman largos períodos de tiempo, por lo tanto relacionar adaptación y color del pelaje, así como destacar la importancia de migración, son criterios aceptables en esta investigación.

La baja diversidad genética en cada una de las poblaciones y a nivel global, acompañado del elevado flujo génico (Nm=10.5), refleja la estrecha relación que existe entre las poblaciones, pues un alto intercambio genético supera los efectos de la deriva génica y previene la distinción local (18), razón por la cual, el grado de diferenciación genética entre las poblaciones fue bajo (GST=0.0452). La diversidad genética además de la estrecha relación que sostiene con el nivel de flujo génico en las poblaciones, también influye de manera significativa en las distancias génicas (19), de tal modo que los valores de distancia serán pequeños mientras menor sea la diversidad entre las poblaciones, lo cual indica una relación directa entre estas variables, esto permite inferir que los bajos niveles de diversidad génica encontrados fueron determinantes sobre los valores de distancia registrados.

El exceso de heterocigotos obtenidos a través de los distintos índices de fijación (FIS y FIT) en cada una de las poblaciones, conduce a la suposición de que éstas presentan una estructura casi homogénea, hecho que sería atribuible al elevado flujo génico que hay entre ellas, dado que la existencia de un alto intercambio de genes previene eventos de endogamia al interior de las poblaciones (20), provocando por lo tanto una reducción de genotipos homocigotos, esto además, estaría relacionado con la probable aleatorización de los apareamientos,

that equines are animals that usually spend the most part of the day grazing. On the other hand, the absence of white horses could be due to a particular condition that characterizes the White marker, but in homozygosis it causes the death of the animal (12). This fact explains the substantial reduction in the number of individuals that carry the gene.

The presence of the majority of markers in El Siglo, shows a large variety of genes available in the area. This situation is possibly due to geographic proximity between the studied populations and the surrounding municipalities, which favored the movement of migrants from one population to another and therefore, a considerable genetic exchange. This would explain the reduced number of genes reported in Los Mimbres, since this is the only population that does not have a direct contact with border populations. It’s convenient to specify that even though the studied populations are in the Hardy-Weinberg equilibrium, the total absence of migration, mutation and selection cannot be assumed because the changes produced by these evolutionary forces in genetic frequencies take long periods of time. Therefore, to relate the adaptation and the coat color, as well as to highlight the importance of migration, are acceptable criteria in this research.

The low genetic diversity in each one of the populations and at a global level, together with a elevated genetic flow (Nm=10.5), reflects a close relationship that exists among populations since a high genetic exchange exceeds the effects of the genetic drift and prevents the local distinction (18). For this reason, the genetic differentiation degree between populations was low (GST=0.0452). Genetic diversity as well as its close relationship with the genetic flow level in populations also influences significantly in genetic distances (19). Therefore, the distance values will be low as the diversity between populations is low. This indicates a direct relationship between these variables, which indicates that the low genetic diversity levels found were determining on the distance values recorded.

The excess of heterozygotes obtained through different fixation indexes (FIS and FIT) in each one of the populations, indicates that these present an almost homogeneous structure, which is a fact that would be attributable to the high genetic flow among them since the existence of a high exchange of genes prevents endogamy events within the populations (20) and provokes a reduction of homozygotes genotype. Also, this would be related to the

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escenario esperado en las poblaciones con equilibrio Hardy-Weinberg y que facilitaría la presencia de niveles nulos de consanguinidad (21).

Un hecho considerado crucial en términos de distancia genética, es el tamaño de la población, pues estos dos parámetros tienen una relación indirecta, en la cual, a medida que decrece el tamaño de una población mayor será la distancia genética de ésta con el resto de las poblaciones (19), en este contexto podría decirse que la población de San Antonio por ser la de menor tamaño poblacional, resulto ser la más distante desde el punto de vista genético, una posible respuesta al reducido número de individuos registrados, obedece a las características topográficas de la zona, pues esta población se encuentra en medio de una serranía acompañada de vegetación boscosa, condiciones que limitarían la tenencia de caballos, si se tiene en cuenta que son animales que por lo general pastan en lugares planos y desprovistos de vegetación exuberante (1). Retomando lo concerniente a distancias génicas, es oportuno resaltar que el modelo de distancia empleado en este estudio se basa en el propuesto por Nei, donde la variación es atribuida principalmente a la acción de la mutación y la deriva génica, asumiendo un equilibrio entre estas dos fuerzas evolutivas (19); sin embargo, por tratarse de poblaciones pertenecientes a una misma especie y que además se desenvuelven en un mismo ámbito geográfico, los fenómenos mutacionales no son tenidos en cuenta, considerándose la deriva génica como la principal causa de diferenciación (20), cuyos efectos como se mencionó anteriormente, son reducidos al existir un alto grado de flujo génico entre las poblaciones.

Por otro lado, la gran cercanía génica resultante entre las poblaciones de Punta de Yánez y Berástegui, concuerda con lo expuesto por Lara et al (22) en su trabajo con Psychotria acuminata, en donde la distancia genética resultó ser directamente proporcional a la geográfica, pues las poblaciones antes mencionadas mantienen una considerable cercanía geográfica, esta situación ocurre en igual medida para la población de Las palmitas, quien estuvo estrechamente relacionada con las poblaciones previamente descritas, en especial con Berástegui, de la cual es muy próxima en términos espaciales; para las poblaciones de Pijiguayal y El Siglo, a pesar de no ser muy cercanas geográficamente, si lo fueron desde el punto de vista genético, lo que pudo obedecer al desplazamiento masivo de los caballos a través de la carretera troncal, la cual constituye un importante centro de conexión entre ambas poblaciones. Es oportuno recordar que la ejecución de este estudio se centró sólo a nivel municipal, por tal motivo no puede hablarse de una marcada distancia

probable randomization of mating, a scenario expected in populations with Hardy-Weinberg equilibrium and that would facilitate the presence of null levels of consanguinity (21).

A crucial fact in terms of genetic distance is the size of the population since these two parameters have an indirect relation in which, as the population size decreases the higher the genetic distance with the rest of the populations (19). In this context, it could be said that San Antonio, the population with the smallest size, resulted in the most distance population from a genetic point of view. A possible response to the reduced number of recorded individuals is due to the topographic characteristics of the area, since this municipality is located in between a mountain chain with a woody vegetation, conditions that would limit the keeping of horses and considering that these horses usually graze in plain areas without exuberant vegetation (1). Resuming the issue of genetic distances, it is important to note that the distance model used in this study is based on Nei’s proposal were the variation is attributed mainly to mutation and genetic drift, assuming an equilibrium in the two evolutionary forces (19); however, since these are populations that belong to a same species and that are developed in a same geographic area, the mutational phenomena is considered, being the genetic drift as the main cause for differentiation (20) of which effects, as mentioned before, are reduced when there is a high degree of genetic flow among the populations.

On the other hand, the great genetic proximity between Punta de Yánez and Berástegui corresponds to Lara et al (22) proposals in their work Psychotria acuminata, in which the genetic distance resulted to be directly proportional to the geography, since the populations mentioned herein are very close geographically, this situation is similar to Las Palmitas, which was closely related to the previously mentioned populations, specially with Berástegui, of which is very close in spatial terms; for Pijiguayal and El Siglo, although not close geographically, they were close from a genetic point of view, which could be due to the massive movement of horses through the main highway that is an important point of connection between both populations. It is worth remembering that this study was only conducted at a municipal level; therefore, a marked geographic distance as such cannot be considered since the most part of the genetic distance values does not exceed 1%, which would indicate that the populations behave as one.



geográfica como tal, teniendo en cuenta además, que la mayor parte de los valores de distancia genética no superaron el 1%, lo que indicaría que las poblaciones se comportan como una sola.

Los valores poco significativos de variabilidad genética, acompañado del elevado grado de flujo génico, permite inferir que las poblaciones se encuentran muy relacionadas genéticamente y se comportan como una metapoblación, situación a la cual se atribuye la aproximación de todas las poblaciones desde el punto de vista estructural, lo que indica la necesidad de introducir nuevos individuos provenientes de poblaciones externas, con el fin de aumentar los niveles de diversidad genética y facilitar la heterogeneidad en términos de estructura poblacional.

The insignificant values of genetic variability, together with a high degree of genetic flow, allow to infer that the populations that are genetically very related and that behave as a metapopulation is situation that is attributed to geographic proximity of all the populations from a structural point of view and indicates the need to introduce new individuals from external populations, in order to increase the genetic diversity levels and to facilitate the heterogeneity in terms of the population’s structure.

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Anti-leptospiral agglutinins in marmosets (Saguinus oedipus and Saguinus leucopus) from illegal trade

Aglutininas anti-leptospira en monos tití (Saguinus oedipus y Saguinus leucopus) de comercio ilegal

Viviana Gonzalez-Astudillo,1* M.Sc, Juliana Peña-Stadlin,2 MV, Miryam Astudillo-Hernandez,3 M.Sc.

1University of Queensland, School of Veterinary Science, Gatton QLD, 4343, Australia. 2Fundación Zoológica de Cali, Unidad de Bienestar Animal, Cra. 2 Oeste Cll. 14, Cali, Colombia. 3Universidad del Valle, Departamento de Microbiología, Av. 1N No. 3N-03, Sede Centenario, Cali, Colombia. *Correspondence: [email protected]


ABSTRACT

Objective. Determine the infection status with pathogenic Leptospira of one Saguinus oedipus and nine Saguinus leucopus at the Cali Zoo that had been confiscated in Colombia from illegal trade. Materials and methods. A full physical examination, blood work, urinalysis were conducted in all individuals during the reception health check-up, in addition to running the microagglutination test with a pool of 19 serovars, with a starting dilution of 1:50. Results. A high positive titer (≥1:3200) to Leptospira alexanderi serovar manhao in an asymptomatic S. oedipus was detected. All S. leucopus tested negative or less than 1:50. Conclusions. Captive locations have been documented to artificially enhance opportunities to come into contact with contaminated bodily fluids from peridomestic rodents. However, infectious diseases acquired during the illegal transport of wildlife to major metropolitan centers are rarely considered a wildlife conservation or public health threat. Infection with zoonotic pathogens should also be considered an additional threat to endangered wild primates involved in illegal trade, which could hamper reintroduction efforts or other population management procedures for primate species with restricted and fragmented distributions.

Key words: Illegal trade, primate, serology, spirochete, zoonosis (Source: MeSH).

RESUMEN

Objetivo. Determinar el estado de infección con Leptospira patógena en un Saguinus oedipus y nueve Saguinus leucopus en el Zoológico de Cali tras haber sido decomisados de tráfico ilegal en Colombia. Materiales y métodos. Se procedió a realizar un examen físico, cuadro hemático y bioquímica, urianálisis, y adicionalmente se realizó la prueba de microaglutinación con un pool de 19 serovares, en una dilución inicial de 1:50. Resultados. Se detectó una respuesta elevada en títulos (≥1:3200) a Leptospira alexanderi serovar manhao en un S. oedipus. Todos los S. leucopus resultaron negativos o

SHORT COMMUNICATION



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con títulos menores de 1:50. Conclusiones. Se ha documentado que el cautiverio puede incrementar artificialmente las oportunidades para que los animales en encierros entren en contacto con fluidos corporales contaminados de roedores peridomésticos. Sin embargo, las enfermedades infecciosas adquiridas durante el transporte ilegal de la fauna silvestre a los principales centros metropolitanos son rara vez consideradas amenazas a la conservación de la fauna o para la salud pública. La infección con patógenos zoonóticos se debería también considerar como un riesgo adicional para primates en peligro de extinción involucrados en tráfico ilegal, lo que podría afectar esfuerzos de reintroducción u otras medidas de manejo de poblaciones de primates con distribuciones fragmentadas y restringidas.

Palabras clave: Espiroqueta, primate, serología, tráfico ilegal, zoonosis (Fuente: MeSH).

INTRODUCTION

Leptospirosis is a bacterial zoonosis primarily linked to the humid and warm climates of tropical regions (1). The etiological agent, Leptospira, is transmitted directly or indirectly to humans when excreted in the urine or other contaminated bodily fluids by reservoirs (mainly peridomestic rodents) (1). Epidemiologically, humans are considered dead-end hosts; however, different studies endeavor to determine the potential role of wild or zoo mammals (primarily non-human primates) as reservoirs of infection (1). Leptospira has been identified as an important and widespread pathogen detected in wildlife imported to the U.S. (1); this bacterium is of particular concern due to its capability of infecting several vertebrate genera and zoonotic risk (2). However, few studies have identified pathogens of zoonotic potential in wild animals traded i l legally in Colombia. Wild animals are brought into major metropol itan areas in Colombia to be sold illegally as pets and when confiscated by environmental authorities (Environmental Police), they are brought into wildlife rehabilitation facilities, in which the final fate of the animal is to be decided (e.g. re-introduction, euthanasia, zoo collection, etc.). During their transient captivity period, wild animals can acquire infections that would be unlikely to occur in natural conditions. This has been particularly studied in non-human primates due to their generic relatedness to humans. Primates in zoological collections are spatially restricted and are brought into closer contact to maintenance hosts of zoonotic pathogens such as Leptospira spp., (1) when attracted by e.g. odors or feeding material.

Mos t Neo t r op i c a l p r ima te s , su ch a s callitrichids, are nearly strictly arboreal and disperse their feed; activities that have been suggested to decrease opportunities for Leptospira transmission from ground-dwelling rodents (3). However, the role of illegal trade, which has spiked over the

Gonzalez-Astudillo - Anti-Leptospira agglutinins in Saguinus

INTRODUCCIÓN

Leptospirosis es una zoonosis bacteriana principalmente relacionada con climas húmedos y cálidos de las regiones tropicales (1). El agente etiológico, Leptospira, se transmite directa o indirectamente a los humanos cuando se excreta en la orina u otros fluidos corporales contaminados por reservorios (principalmente roedores peridomésticos)(1). Epidemiológicamente, los humanos son considerados hospederos terminales; sin embargo, diferentes estudios pretenden determinar el rol potencial de mamíferos silvestres o de zoológicos (principalmente primates no humanos) como reservorios de infección (1). La Leptospira se puede identificar como un patógeno importante y ampliamente difundido detectado en vida silvestre importada a los EE.UU. (1); este patógeno es de particular preocupación debido a su capacidad de infectar varios géneros de vertebrados y por su riesgo zoonótico. (2). Sin embargo, pocos estudios han identificado patógenos con potencial zoonótico en animales silvestres comercializados ilegalmente en Colombia. Los animales silvestres son introducidos a áreas metropolitanas importantes en Colombia para ser vendidos ilegalmente como mascotas y luego confiscados por las autoridades ambientales (Policía Ambiental), son llevados a instalaciones de rehabilitación de vida silvestre, en donde el destino final del animal se decide (ej. reintroducción, eutanasia, colección de zoológico, etc.). Durante este periodo transitorio en cautiverio, los animales silvestres adquieren infecciones que no ocurrirían en condiciones naturales. Esto se ha estudiado particularmente en primates no humanos debido a su relación genética con los humanos. Los primates en colecciones de zoológico están restringidos en espacio y son llevados a un contacto más cercano con los hospederos de patógenos zoonóticos como la Leptospira spp., (1) cuando son atraídos por ej. olores y restos de comida.

La mayoría de los primates Neotropicales, como los calitrícidos, son estrictamente arbóreos y dispersan los restos de comida; se ha sugerido que estas actividades disminuyen las oportunidades de transmisión de Leptospira de roedores terrestres (3). Sin embargo, el rol del comercio ilegal, que ha incrementado de manera significativa en las últimas décadas (4) y cómo este puede


last decades (4) and how it may enhance zoonotic pathogen transmission in wildlife in Colombia, a biodiversity hotspot, has not been thoroughly studied. Both Saguinus oedipus and Saguinus leucopus are endemic to Colombia, and are two of the most commonly trafficked primate species.

Both species are placed in conservation categories of concern (critically endangered and endangered, respectively (5)) due to the negative interplay of illegal trade, forest cover loss due to intensive colonization, and restricted geographical distribution. In fect ious d iseases are not current ly considered as a threat to wild populations of this species, nor there have been a reported case of zoonotic pathogen transmission between trafficked animals and humans in Colombia.


Study site. Cali Zoo is located in Cali, a major metropolitan center in the southwest of Colombia. Its coordinates are 3.4486° and 76.5586° in the northern and western latitude respectively, with an altitude of 1014 m. The local climate is defined as a tropical savanna, with an annual prec ip i tat ion between 900 to 1.800 mm and an average temperature of 25°C and relative humidity of ~70% (6).

Study population, sample collection and processing . One adult female S. oedipus arrived to the Cali Zoo after being surrendered by his possessor in July 2013 to environmental authorities (Figure 1a). In February 2014 a group of nine S. leucopus arrived to the Cali Zoo after being seized by the Environmental Police (Figure 1b, 1c). All individuals from both species were chemical ly immobil ized using ketamine (3 mg/kg IM) and midazolam (0.05 mg/kg IM) in order to receive a health check-up consisting of full physical examination, blood (CBC, biochemistry) and urine testing. Special consideration was made to detect clinical signs that have been associated with zoonotic diseases such as leptospirosis (e.g., such as weight loss, diarrhea, dehydration, anorexia, jaundice and anemia).

Hand l ing and sample co l l ec t ion were performed by a veterinarian with extensive exper ience in Colombian capt ive non-domest i c fauna. Th i s s tudy compl ied with the Zoological Foundation of Cal i veterinary protocols, which adhere to the legal requirements of zoological collections dictated by the Colombian Associat ion of Zoo log ica l Parks and Aquar iums –ACOPAZOA, the Latin American Association of Zoological Parks and Aquariums – ALPZA,

aumentar la transmisión de patógenos zoonóticos en la vida silvestre en Colombia, un “hotspot” de biodiversidad, no ha sido discutido a fondo. Saguinus oedipus y Saguinus leucopus son endémicos de Colombia, y son dos de las especies de primates más comúnmente traficadas.

Ambas especies se encuentran en importantes categorías de conservación (en peligro crítico y en peligro, respectivamente (5)) debido a la interacción negativa entre comercio ilegal, pérdida de cubierta forestal debido a colonización intensiva y distribución geográfica restringida. Las enfermedades infecciosas no se consideran actualmente como una amenaza a las poblaciones silvestre de estas especies, ni se ha reportado un caso de transmisión de patógenos zoonóticos entre animales traficados y humanos en Colombia.


Locación de Estudio. El Zoológico está ubicado en Cali, un centro metropolitano importante en el suroeste de Colombia. Sus coordenadas son 3.4486° y 76.5586° en latitud norte y oeste respectivamente, con una altitud de 1014 m. El clima local se define como sabana tropical con una precipitación anual entre 900 y 1.800 mm y una temperatura promedio de 25°C y humedad relativa de ~70% (6).

Población de estudio, recolección y procesamiento de muestras. Una hembra adulta de S. oedipus llegó al Zoológico de Cali luego de ser entregada por su posesor en Julio 2013 a las autoridades ambientales (Figura 1a). En febrero de 2014 un grupo de nueve S. seucopus llegó al Zoológico de Cali luego de ser decomisados por la Policía Ambiental (Figura 1b, 1c). Todos los individuos de ambas especies fueron inmovilizados químicamente utilizando ketamina (3 mg/kg IM) y midazolam (0.05 mg/kg IM) para recibir un chequeo de salud que consistió en un examen físico completo, pruebas de sangre (CBC, bioquímica) y de orina. Se tomó especial consideración en detectar señales clínicas asociadas con enfermedades zoonóticas como la leptospirosis (por ej. pérdida de peso, diarrea, deshidratación, anorexia, ictericia y anemia).

El manejo y recolección de muestras se llevó a cabo por un veterinario con amplia experiencia en fauna Colombiana no doméstica en cautiverio. El estudio cumplió con los protocolos veterinarios de la Fundación del Zoológico de Cali, los cuales se adhieren a los requerimientos legales de colecciones de zoológico según los dicta la Asociación Colombiana de Parques Zoológicos y Acuarios – ACOPAZOA, la Asociación Latinoamericana de Parques Zoológicos y Acuarios – ALPZA, y el departamento local de

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and the local department of natural resources (Autonomous Regional Corporation of Valle – CVC) in addition to the technical, scientific and administrative ethics policies in Law 84 (Colombia National Congress, 1989).

Serology testing . Approximately 200 μL of blood sera was used to conduct a microagglut inat ion test (MAT) with 19 reference strains from the Royal Tropical Institute (Netherlands) at the Leptospirosis Diagnostic Laboratory at Universidad del Valle in Cali, Colombia. The strain pool included (L. interrogans) grippotyphosa, (L. santarosai) celledoni, (L. interrogans) pomona, (L. noguch i) austra l i s , (L. interrogans/L. k i r s hne r i ) i c t e r ohaemo r r hag i a e , ( L . a lexander i) manhao, (L. in ter rogans) bataviae, (L. borgpetersenii) sejroe, (L. noguchii) louisiana, (L. borgpetersenii)


recursos (Corporación Autónoma Regional del Valle – CVC), adicionalmente a las políticas éticas técnicas, científicas y administrativas de la Ley 84 (Congreso Nacional de Colombia, 1989). Prueba de Serología. Se ut i l i zaron aproximadamente 200 μL de suero sanguíneo para realizar una prueba de microaglutinación (MAT) con 19 cepas de referencia del Royal Tropical Institute (Holanda) y el Laboratorio Diagnóstico de Leptospirosis de la Universidad del Valle en Cali, Colombia. El pool de cepas incluyó (L. interrogans) grippotyphosa, (L. santarosai) celledoni, (L. interrogans) pomona, (L. noguchi) australis, (L. interrogans/L. kirshneri) icterohaemorrhagiae, (L. alexanderi) manhao, (L. interrogans) bataviae, (L. borgpetersenii) sejroe, (L. noguchii) louisiana, (L.

Figure 1. Cotton-top tamarin (Saguinus oedipus, a) and some individuals of the white-footed tamarin group (Saguinus leucopus, b and c) during their transient stay at Cali Zoo, Cali, Colombia. These small Neotropical primate species endemic to Colombia have lost the majority of their original distribution due to intensive colonization and previous unregulated extraction for biomedical research (S. oedipus). Current threats include ongoing forest cover loss, and proposed dam constructions (5). Disease is not currently considered a threat for these species. Photo: Susan Posada© 2013-2014.


javanica, (L. santarosai) shermani, (L. in terrogans) d jasmin, (L. santarosa i) min i , (L. in terrogans) pyrogenes, (L. fainei) hurtsbridge, (L. borgpettersenii) ballum, (L. weillii) ranarum, (L. interrogans) canicola, and (L. biflexa) seramanga. Strains are subcultured weekly in Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris medium at 30°C. Strains are typically diluted 1:2 with buffer until a density of 6-8 x 108 spirochetes/mL is evidenced. Each of the samples were stored at -20°C and thawed via refrigeration. Aliquots of 50 μL in buffer (1X PBS, pH 7.2) were placed in the first row of a microplaque as control antigen. Each blood sera sample was placed along the remaining rows and mixed with the reference strain (antigen) arranged in columns. Microplaques were covered and incubated at 30°C for 2 hours. To ev idence microagg lut inat ion, each aliquot was transferred to a glass slide and scanned by dark-field microscopy. Samples displaying a d i lut ion ≥1:100 in which 75% of the spirochetes were agglutinated was considered positive; starting and end dilutions were 1:50 and 1:3200, respectively.

RESULTS

MAT results for all S. leucopus were negative or <1:50. In contrast, samples from the only S. oedipus yielded a titer of ≥1:3200 against L. alexanderi serovar manhao. In the same ind iv idual , further b lood examination revealed an erythrocytosis and hyperproteinemia.

DISCUSSION

Ev idence o f hemoconcen t ra t i on w i th hyperproteinemia is considered dehydration; an inspecific clinical sign of leptospiral infection. Ketamine HCl and midazolam have been safely used in wild S. leucopus in the past, even at higher doses (7); although how these drugs affect blood cell parameters is not well understood in this species. Thus, it is important to consider that all anesthetic agents have the potential of altering blood parameters, as well as the stress induced by the captivity and handling of a wild animal. Generally, during certain types of anesthesia, erythrocytes and leukocytes decrease due to depression of the cardiovascular system (8). Other exogenous stimuli such as stress may have an opposite effect, in which corticosteroid-induced responses from their endogenous release influence leukocyte counts more commonly than other cell lines; typically represented by lymphopenia and neutrophilia (9). In other primates, reports of anesthesia

borgpetersenii) javanica, (L. santarosai) shermani, (L. interrogans) djasmin, (L. santarosai) mini, (L. interrogans) pyrogenes, (L. fainei) hurtsbridge, (L. borgpettersenii) ballum, (L. weillii) ranarum, (L. interrogans) canicola, y (L. biflexa) seramanga. Las cepas fueron subcultivadas semanalmente en un medio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris a 30°C. Las cepas fueron diluidas 1:2 con buffer hasta evidenciar una densidad de 6-8 x 108 espiroquetas/ml. Cada una de las muestras fue almacenada a -20°C y descongelada a través de refrigeración. Se colocaron alícuotas de 50 μL en buffer (1xPBS pH 7.2) en la primera línea de una microplaca como antígeno de control. Cada muestra de suero sanguíneo fue colocada en las filas restantes y mezclada con la cepa de referencia (antígeno) organizada en columnas. Las microplacas fueron cubiertas e incubadas a 30°C por 2 horas. Para evidenciar migroaglutinación, cada alícuota fue transferida a una lámina de vidrio y escaneada en un microscopio de campo oscuro. Las muestras que mostraron una dilución ≥1:100 en la cual el 75% de las espiroquetas se aglutinó se consideraron positivas; las diluciones de inicio y final fueron de 1:50 y 1:3200, respectivamente.

RESULTADOS

Los resultados de la MAT para S. leucopus fueron negativos o <1:50. En contraste, las muestras de la única S. oedipus arrojaron una concentración de ≥1:3200 contra L. alexanderi serovar manhao. En el mismo individuo, examenes sanguíneos adicionales revelaron eritrocitosis e hiperproteinemia.

DISCUSIÓN

La evidencia de hemoconcentración acompañada por hiperproteinemia se considera deshidratación; un signo clínico inespecíficos de infección por leptospiras. El HCl Ketamina y midazolam han sido usados de manera segura en S. leucopus en el pasado, aún en dosis mayores (7); aunque faltan más estudios que determinen cómo estas drogas afectan los parámetros sanguíneos en estas especies. Por esto, es importante considerar que todos los agentes anestésicos tienen el potencial de alterar los parámetros sanguíneos, así como el estrés inducido por la cautividad y el manejo de un animal silvestre. Generalmente, durante ciertos tipos de anestesia, los eritrocitos y leucocitos disminuyen debido a la depresión del sistema cardiovascular (8). Otros estímulos exógenos tales como el estrés pueden tener el efecto opuesto, en el cual las respuestas inducidas por la liberación endógena de corticoesteroides pueden influenciar los conteos de leucocitos de manera más común que otras líneas de células; se representan típicamente por linfopenia y neutrofilia (9). En otros primates, reportes de anestesia con

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with ketamine document erythrocytosis and leukocytosis due to hemoconcentration (8), which may also explain the hyperproteinemia evidenced in our case report of anesthesia with ketamine. It is also possible that the hemoconcentrat ion observed is due to pressor effects of ketamine, as it has been evidenced in other primates when low doses of dissociative agents are administered (8). The effects of benzodiazepine anesthesia in the blood cells of rats are primarily splenic lymphocytic depletion and low hematocrit due to increased erythrocyte destruction (10), which does not coincide with our blood and serum screening results. Despite the lack of supporting evidence of midazolam altering blood parameters in this report, it is important to consider these in future studies and perhaps compare CBC, biochemistry and serology results from paired blood and sera samples using the same anesthetic agents.

In the past, transmission experiments with Leptospira have elicited fatal disease in S. oedipus and S. geoffroyi (11), and more recently in S. labiatus (12), and in other captive callitrichids such as Callithrix kuhlii (13). Minette (3) found a serorreactive S. oedipus to serovar ballum (known to circulate in the domestic mouse, Mus spp.) among a group of eight individuals in the U.S. Reports in other marmoset species (Callithrix spp.) have found titers of up to 1:200 in asymptomatic animals (14). In 2009, Gonzalez-Astudillo et al (15) tested in Cali Zoo two Leontocebus fuscicoll is that were negative or <1:50 with the MAT. However, one Cebus albi frons did test positive and underwent an asymptomatic infection elicit ing low titers (1:160) to serovar australis. Another study conducted in captive primates in Colombia found titers of up to 1:1600 in an asymptomatic monkey (16). However, in the same study, six S. oedipus were negative.

It has been established already that non-human primates are more likely to acquire leptospiral infection in captivity; nevertheless, it is not known for how long titers remain detectable following a natural infection (3), and this is likely influenced by intraspecific factors or aspects inherent to the pathogen. Leptospira-infected primates can also turn into carriers (16), however this was not demonstrated in this study. Without further testing, these animals should be confined until their renal carrier state has been cleared. It is important that in future studies, when possible, asymptomatic primates with


ketamina documentan eritocitrosis y leucocitosis debido a hemoconcentración (8), que también puede explicar la hiperproteinemia evidenciada en nuestro reporte de caso. También es posible que la hemoconcentración observada se deba a efectos presores de la ketamina, como se ha evidenciado en otros primates cuando se administran dosis bajas de agentes disociativos (8). Los efectos de la anestesia con benzodiacepinas en células sanguíneas en ratas son principalmente depleción esplénica linfocítica y disminución de hematocrito debido a un incremento en la destrucción de eritrocitos (10), que no coincide con nuestros resultados en sangre y suero. A pesar de la falta de evidencia que apoye la alteración de parámetros sanguíneos tras la administración de midazolam en este reporte, es importante considerarlos en estudios futuros comparando los resultados de muestras pareadas de cuadros hematicos, bioquímica y serología utilizando los mismos agentes anestésicos.

En el pasado, la transmisión experimental de leptospiras ha desencadenado infecciones fatales en S. oedipus y S. geoffroyi (11), y más recientemente en S. labiatus (12). En cautiverio, se han presentado cuadros fatales en otros calitrícidos en cautiverio como Callithrix kuhlii (13). Minette (3) encontró serorreactividad en S. oedipus al serovar ballum (conocido por ser portado por el ratón doméstico, Mus spp.) pertenecientes a un grupo de ocho individuos en EE.UU. Reportes en otras especies de tití (Callithrix spp.) han encontrado títulos de hasta 1:200 en animales asintomáticos (14). En 2009, Gonzalez-Astudillo et al (15) encontró en el Zoológico de Cali dos Leontocebus fuscicollis que fueron negativos o <1:50 con la MAT. Sin embargo, un Cebus albifrons tuvo una infección asintomática con títulos bajos (1:160) al serovar australis. Otro estudio llevado a cabo en primates en cautiverio en Colombia encontró títulos de hasta 1:1600 en individuos asintomáticos (16). Sin embargo, en el mismo estudio, los seis S.oedipus muestreados resultaron negativos.

Ya ha sido establecido que los primates no humanos tienen mayor posibilidad de adquirir infección leptospiral en cautiverio; sin embargo, no se conoce por cuánto tiempo los títulos permanecen detectables después de una infección natural (3), y esto puede estar influenciado por factores o aspectos intraespecíficos inherentes al patógeno. Los primates infectados con Leptospira también se pueden tornar portadores (16), sin embargo esto no se ha demostrado en este estudio. Sin pruebas adicionales, estos animales deben ser confinados hasta que su estado de portador renal haya sido esclarecido. Es bien sabido que varios centros de recepción de fauna silvestre decomisada por la Policía Ambiental en Colombia liberan los animales tras su recepción. Sin pruebas


high titers are confined until their renal carrier status has been determined. Since some of the institutions receiving confiscated wildlife from the Environmental Police in Colombia are known to release animals back into their habitat, the potential to disseminate pathogens, including Leptospira spp. is a high risk for primate conservation and public health in Colombia, even if there is currently no documentation of a primate-to-human transmission or viceversa of the bacterium.

In Colombia, the infrastructure for long-term, large scale monitoring of health in wild animals is virtually inexistent and acquisition of wild animals or samples is usually opportunistic; thus, morbidity and mortality events caused by leptospirosis or any other disease can easily be overlooked. Wild animals are received in Colombia at rehabilitation centers adjunct to regional environmental entities, which determine the fate of the individual (e.g. release, euthanasia, or captivity). Due to financial and log ist ica l constra ints , test ing for several pathogens is not always feasible in releasable animals. Ideally, establishing collaborations with governmental diagnostic centers in orden to conduct rout inely testing with available assays. In regards to leptospirosis, incorporate MAT pools with larger numbers of serovars and serogroups in paired sampling, or other diagnostic tests (e.g. molecular techniques) to detect renal carriers as mandatory procedures in pre-release protocols as they can provide a better understanding of the infectious status of individuals. This can build baseline information that can guide future guidelines to the management of animals destined for reintroduction.

Saguinus sp. are one of the most trafficked genera in Colombia, because of their size and perceived ease of becoming tame. Despite this reality, little attention has been given to the diseases they can acquire in captivity, especially those considered threats for public health and primate conservation. This marmoset was not tested at arrival for anti-leptospiral antibodies; thus, we cannot discern when the infection occurred. However, it is possible that the marmoset got infected during its transportation to a major metropolitan center for sale, and it could have been reinfected again at Cali Zoo, eliciting this strong reaction to a serovar recognized by his immune system, and undergoing an asymptomatic infection for unknown reasons.

adicionales, estos individuos tienen el potencial de diseminar patógenos en su hábitat, incluyendo Leptospira spp., lo cual podría ser un alto riesgo para la conservación de primates y la salud pública en Colombia, aun si no hay documentación actual de transmisión de primate a humano o viceversa de la bacteria.

En Colombia, la infraestructura para monitoreo de saludo a largo plazo y de amplia escala en animales silvestres es virtualmente inexistente, ya que la adquisición de muestras provenientes de animales silvestres es usualmente oportunista; por esto, los eventos de morbilidad y mortalidad causados por leptospirosis o cualquier otra enfermedad pueden ser fácilmente pasados por alto. Los animales salvajes son recibidos en Colombia en centros de rehabilitación adjuntos a corporaciones autónomas regionales, que determinan el destino del individuo (ej. liberación, eutanasia o cautiverio). Debido a restricciones financieras y logísticas, hacer las pruebas necesarias para detectar patógenos no es siempre posible en estos animales. Sería ideal establecer convenios con centros de diagnóstico gubernamentales para realizar rutinariamente pruebas que estén disponibles, y con relación a leptospirosis, incorporar al pool de la MAT con mayor número de serovares y serogrupos en muestreos pareados, a la par con otras pruebas diagnósticas (ej. técnicas moleculares) para detectar portadores renales como procedimientos obligatorios en protocolos de pre-liberación ya que pueden ofrecer un mejor entendimiento del estado infeccioso de los individuos. Esto puede construir la información de base para guiar futuros lineamientos sobre el manejo de animales destinados a reintroducción.

Saguinus spp., es uno de los géneros taxonómicos más traficados en Colombia debido a su tamaño y aparente docilidad. A pesar de esta realidad, se ha prestado poca atención a las enfermedades que pueden adquirir en cautiverio, especialmente aquellas consideradas como amenazas a la salud pública y la conservación de primates. Debido a que no se realizaron pruebas al tití a su recepción para encontrar anticuerpos anti-leptospirales, no podemos discernir cuándo ocurrió la infección. Sin embargo, es posible que el tití se infectara durante el transporte desde su habitat hacia el lugar donde fue vendido, pudiéndose infectar de nuevo en el Zoológico de Cali, suscitando una fuerte reacción al serovar que fue reconocido por su sistema inmune pero que indujo una una infección asintomática, por razones desconocidas.

Ocasionalmente, infecciones simultáneas con otros serogrupos, también conocidas como “reacciones paradójicas” pueden interferir al determinar el serovar infectante (3). Adicionalmente, puede existir cierta variabilidad relacionada con la especie en la

4797Gonzalez-Astudillo - Anti-Leptospira agglutinins in Saguinus

respuesta humoral de la infección por leptospiras (ej. duración de la concentración) (3). Aunque la hemoconcentración de una muestra puede inducir erróneamente una hiperinmunoglobulinemia, una concentración de ≥1:3200 con la MAT en combinación con ausencia de signos clínicos podría sugerir una infección en curso. Otra posible explicación es que la exposición repetida a la infección por Leptospira puede resultar en un incremento dependiente de la edad que se refleja en aumento de la serorreactividad reflejada en títulos (16). Las infecciones anteriores en primates no humanos se asocian comúnmente con títulos bajos por periodos prolongados en individuos asintomáticos (17). Aunque el MAT excluye establecer el tiempo de infección y no se considera una prueba serovar-especifica debido a un reacción cruzada conocida con serogrupos (18), casos en los que una sola muestra tiene concentraciones elevadas se consideran diagnósticos (1), y pueden indicar un serovar infectante presuntivo (18). Aunque existen algunos reportes en la literatura sobre leptospirosis en titís Saguinus, a nuestro conocimiento, esta es el primer reporte con relación a títulos altos en individuos asintomáticos. Es posible que la transmisión de Leptospira en animales silvestres sea más común de lo que se conoce en Colombia, como se ha demostrado en varios estudios de seroprevalencia en mamíferos silvestres (19) y en colecciones de zoológicos (15,16). En contraste, son pocos los documentos citables son sobre la prevalencia de Leptospira en vida silvestre o mamíferos de zoológico. Todos los titís se mantuvieron bajo observación para la posible aparición de síntomas y su estatus clínico dictará su destino. El personal clínico y los cuidadores ejercen medidas de bioseguridad para prevenir transmisión de patógenos a ellos mismos u otra fauna cautiva.

Los signos clínicos asociados con leptospirosis en primates no humanos son usualmente no patognomónicos (1), con reportes que incluyen la pérdida de peso, diarrea, deshidratación, anorexia, ictericia y anemia (13). La infección en la hembra de S. oedipus en este reporte solo suscitó deshidratación, posiblemente debido a exposición previa a la bacteria, o baja virulencia del serovar infeccioso. El MAT detecta inmunoglobulina M (IgM), usualmente producida en la fase aguda de la infección; la aparición de signos clínicos usualmente coincide con la disminución de IgM en plasma.

El Zoológico de Cali es una de las pocas instituciones en Colombia que investiga activamente (14) y diagnostica infección por leptospiras, entre

Occasionally, simultaneous infections with other serogroups or paradoxical reactions may interfere with determining the infecting serovar (3). In addition, there may be a species-related variability in humoral response to leptospiral infection (e.g. titer duration) (3). Although hemoconcentration of a sample may overestimate hyperimmunoglobulinemia, a titer ≥1:3200 with the MAT in combination with no visible clinical signs could suggest an undergoing infection. Another possible explanation is that continuous exposure to infection throughout life can result in an age-dependent increment in seropositivity to Leptospira (16). Past infections in non-human primates are typically associated with low titers for prolonged periods in asymptomatic individuals (17). Although the MAT precludes the establishment of the time of the infection and it is not considered a serovar-specific test because of its known cross-reactivity within serogroups (18), cases in which a single sample has elevated titers is considered diagnostic (1), and can indicate the presumptive infecting serovar (18). Although some reports exist in the literature about leptospirosis in Saguinus marmosets, to our knowledge, this is the first documentation regarding such high titers in an asymptomatic individual. It is likely that Leptospira transmission is more common that it is currently known in Colombia, as it has been demonstrated in a few seroprevalence studies in wild mammals (19) and zoological collections (15,16). In contrast, there are few citable documents about Leptospira prevalence in wildlife or zoo mammals. All marmosets were kept under observation for possible onset of symptoms and their clinical status will dictate their fate. Clinical staff and caretakers exercise biosafety measures to avoid pathogen transmission to themselves and other captive fauna.

Clinical signs associated with leptospirosis in mammals are usually non-pathognomonic (1), with reports in non-human primates documen t i ng we i gh t l o s s , d i a r r hea , dehydration, anorexia, jaundice, and anemia (13). The S. oedipus female in this report only elicited dehydration, perhaps due to previous exposure to the bacterium, or low virulence of the infecting serovar. The MAT detects immunoglobulin M (IgM), usually produced in the acute phase of the infection; the onset of clinical signs usually coincides with its decrease in plasma.

Cal i Zoo is one of the few zoo log ica l institutions in Colombia actively investigating


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REFERENCES

otras etiologías que causan enfermedades, en su colección. Es importante animar a otras instituciones zoológicas y centros de rehabilitación de vida silvestre a incorporar la detección de Leptospira spp. como parte de su grupo de pruebas para animales entrantes. Esto mejoraría el conocimiento de la dinámica de Leptospira en especies animales no domésticas y podría crear la base para mejorar las prácticas actuales de manejo de vida silvestre decomisada.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado financieramente por la Fundación Zoológica de Cali y el Laboratorio Diagnóstico de Leptospirosis de la Universidad del Valle, ambos en Cali, Colombia. Los autores quisieran agradecer a los cuidadores del zoológico y el personal veterinario en el Zoológico de Cali, y a la Sra. Leonor Oviedo por su ayuda con el procesamiento del suero de la sangre.

(14) and diagnosing leptospiral infection, amongst other disease-causing etiologies, within their collection. It is important to encourage other zoological institutions and wildlife rehabilitation centers to incorporate screening for Leptospira spp. as part of their test pool for incoming animals. This would improve the understanding of the dynamics of Leptosp i ra in non-domest ic an imal species, and could lay the foundation for the improvement of the current management practices for confiscated wildlife.

Acknowledgements

This study was financially supported by the Zoological Foundation of Cali and the Leptospirosis Diagnost ic Laboratory at Universidad del Valle, both in Cali, Colombia. The authors would like to thank the zoo keepers and veterinary staff at Cali Zoo, and to Mrs. Leonor Oviedo for her help with blood sera processing.

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4800

Molecular detection of Eastern Equine Encephalitis virus in mosquitoes from La Pintada (Antioquia)

Detección molecular del virus de Encefalitis Equina del Este en mosquitos de La Pintada (Antioquia)

Richard Hoyos L,1,2 M.Sc, Juan Suaza V,2 M.Sc, Antonio Tenorio,3 Ph.D, Sandra Uribe,2 Ph.D, Juan Gallego-Gómez,1* Ph.D.

1Universidad de Antioquia, Facultad de Medicina, Grupo de investigación en Medicina Molecular y de Traslación. Carrera 51D Nro. 62-29, Medellín, Colombia. 2Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín, Escuela de Biociencias, Grupo de investigación en Sistemática Molecular. Calle 59A Nro. 63-20, Medellín, Colombia. 3Instituto de Salud - Carlos III. Ctra de Majadahonda-Pozuelo Km 2.2, Madrid, España. *Correspondencia: [email protected]


ABSTRACT

Objective. The detection of emerging and re-emerging arboviruses in mosquitoes from urban and rural areas, is fundamental for predict possible epidemic outbreaks in human populations. The Municipality of La Pintada (Antioquia), is characterized by the presence of dry tropical forest relicts, fishing, tourism, farms and mining. An entomological research was performed for explore the possible circulation of arboviruses of public health importance. Materials and methods. Mosquitoes were captured in urban and rural sites in February-April of 2012. The specimens were stored in liquid nitrogens tanks and were grouped using taxonomic keys for genera. RNA extraction from pools and generic/nested RT-PCR was performed for Flavivirus, Alphavirus, Orthobunyavirus (Group Bunyamwera) and Phlebovirus. Results. 1274 mosquitoes were collected, mainly belonging to Culex and Aedes genera. RNA extracts of 64 pools were tested by RT-PCR and one pool was positive for Alphavirus. Sequencing of the RT-PCR product and the analysis with sequences storage in GenBank designate the presence of Eastern equine encephalitis virus (EEEV). Conclusions. This is the first record of natural infection from EEEV in mosquitoes from La Pintada (Antioquia), an area with ecological elements that favor the emergence of emerging and re-emerging arboviruses of medical and veterinarian importance.

Key words: Arboviruses, Culicidae, Eastern Equine Encephalitis virus, Neighbor-joining, RT-PCR (Source: MESH, CAB).

RESUMEN

Objetivo. La detección de arbovirus emergentes y re-emergentes a partir de mosquitos provenientes de áreas semi-urbanas y rurales es fundamental para predecir posibles eventos epidémicos en poblaciones humanas. En el municipio de La Pintada (Departamento de Antioquia), caracterizado por la presencia de remanentes de bosque seco tropical, actividades de pesca, turismo, explotación agropecuaria y minera, se realizó un estudio entomológico para explorar la posible presencia y circulación de arbovirus de importancia en salud pública. Materiales y métodos. Los mosquitos adultos fueron recolectados en sitios urbanos y rurales en febrero-abril del año 2012. Los especímenes colectados fueron almacenados en tanques de nitrógeno líquido, y luego separados en grupos utilizando claves taxonómicas para género. Para la detección de los virus se realizó extracción de RNA y RT-PCR genérica/anidada para los géneros Flavivirus, Alphavirus, Orthobunyavirus (Grupo Bunyamwera) y Phlebovirus.

SHORT COMMUNICATION


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Resultados. 1274 mosquitos adultos e inmaduros fueron colectados, pertenecientes en su mayoría a los géneros Culex y Aedes. Los extractos de RNA de 64 pools fueron evaluados por RT-PCR. Se encontró un pool positivo para Alphavirus. La secuenciación de los productos de RT-PCR y el análisis con secuencias depositadas en GenBank indica la presencia del virus de Encefalitis Equina del Este (EEEV). Conclusiones. Este es el primer registro de infección natural del virus de encefalitis equina del este (EEEV) en mosquitos de La Pintada (Antioquia, Colombia), un área con factores ecológicos aptos para la emergencia y re-emergencia de arbovirus de importancia veterinaria y médica.

Palabras clave: Arbovirus, Culicidae, EEEV, Neighbor-joining, RT-PCR (Fuentes: MESH, CAB).

INTRODUCCIÓN

Entre 1940 y 2004, cerca de 300 eventos de enfermedades emergentes fueron identificados en humanos alrededor del mundo y solamente en los últimos 30 años han sido reconocidos 100 nuevos virus implicados en nuevas enfermedades virales (1). La mayoría son considerados patógenos introducidos en nuevas poblaciones de hospederos (emergencia), o aquellos que rápidamente expanden su rango de distribución geográfica, con un correspondiente incremento de casos y brotes epidémicos (1,2). En términos de salud pública, los virus emergentes más importantes son arbovirus (arthropod-borne viruses) transmitidos por mosquitos, debido a que causan viremia en humanos, encefalitis y fiebres hemorrágicas, perteneciendo a tres familias principalmente: Togaviridae, Flaviviridae y Bunyaviridae (1,2).

En Colombia, la presencia de arbovirus en mosquitos, hospederos vertebrados y humanos infectados, o con evidencia serológica de contacto, ha sido registrada para Alphavirus (Encefalitis Equina Venezolana, Encefalitis Equina del Este, Mayaro), Flavivirus (Dengue, Fiebre amarilla, Virus del Oeste del Nilo, encefalitis de Saint Louis) y Orthobunyavirus (Guaroa, Wyeomyia) (3-7).

La alta diversidad de mosquitos de los géneros Haemagogus, Aedes y Culex (subgéneros Melanoconion y Culex) (3,4,6), la fragmentación de los ecosistemas naturales y la presencia de hospederos vertebrados en diferentes áreas de la geografía colombiana (4), han favorecido el contacto humano-vector-arbovirus; aumentando la probabilidad de brotes epidémicos de enfermedades emergentes y re-emergentes (3,4,6). En este contexto, el rastreo virológico en mosquitos vectores potenciales, constituye un importante paso en la prevención y futuro control de enfermedades virales. El objetivo de este estudio fue rastrear la infección natural por arbovirus de los géneros Alphavirus, Flavivirus, Phlebovirus y grupo Bunyamwera (Orthobunyavirus) en mosquitos del municipio de La Pintada mediante una RT-PCR para cada género viral y RT-PCR anidada para secuenciación e identificación de virus presente.

INTRODUCTION

Between 1940 and 2004 close to 300 events of emerging diseases were identified in humans around the globe and only in the last 30 years 100 new viruses implicated in new viral diseases have been recognized (1). Most of these considered pathogens introduced in new host populations (emerging), or those that expand quickly in their geographic distribution range, with a corresponding increase of cases and epidemic outbreaks (1,2). In terms of public health, the most important emerging viruses are the arbovirus (arhtropod-borne viruses) transmitted by mosquitoes because they cause viremia in humans, encephalitis and hemorrhagic fevers. These viruses belong to three main families: Togaviridae, Flaviviridae and Bunyaviridae (1,2).

In Colombia, the presence of arbovirus in mosquitoes, vertebrate hosts and infected humans, or with serological contact evidence, has been recorded for Alphavirus (Encephalitis Venezuelan Equine, Encephalitis Equine East, Mayaro), Flavivirus (Dengue, Yellow fever, Virus of the West of the Nile, encephalitis of Saint Louis) and Orthobunyavirus (Guaroa, Wyeomyia) (3-7).

The high diversity of mosquitos of the Haemagogus, Aedes and Culex genera (subgenera Melanoconion and Culex) (3,4,6), the fragmentation of the natural ecosystems and the presence of vertebrae hosts in different areas of the Colombian geography (4) have favored the human-vector-arbovirus contact; increasing the probability of epidemic outbreaks of emerging and re-emerging diseases (3,4,6). In this context, the tracking of viruses in potential mosquito vectors is an important step in the prevention and future control of viral diseases. The objective of this study was to track the natural infection by arbovirus of the Alphavirus, Flavivirus, Phlebovirus and Bunyamwera group genera (Orthobunyavirus) in mosquitos of the municipality of La Pintada by a RT-PCR for each viral genera and a nested RT-PCR for sequencing and identification of the present virus.

Hoyos - EEEV en La Pintada - Antioquia



Recolecta de mosquitos. Las recolecciones entomológicas fueron realizadas en febrero y abril del 2012 en el municipio de La Pintada (Antioquia, Colombia), (coordenadas geográficas: 5°44´25.63”N, 75°36´20.18”O). Los mosquitos adultos fueron colectados usando trampas de luz CDC con cebo de dióxido de carbono (CO2) por 13 horas (5:00PM-6:00AM) por día. Así como búsqueda activa, utilizando aspiradores bucales en fragmentos de bosque del área rural, y en el peridomicilio del área urbana. Para el caso de los estados inmaduros (larvas y pupas), se recolectaron usando pipetas para removerlos junto con el agua de los criaderos identificados. Los mosquitos colectados fueron transportados en tanque de nitrógeno líquido hasta el laboratorio de Biología y Sistemática de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Los mosquitos se agruparon en pools de 2-20 individuos considerando las características morfológicas externas para separar géneros, el lugar y fecha de recolecta.

Detección molecular. Cada pool fue macerado mecánicamente con un mortero plástico, en un tubo Eppendorf con buffer RLT, y el RNA total fue extraído usando el kit comercial RNeasy (Qiagen, Valencia). La reacción en cadena de la polimerasa previa transcripción inversa para géneros virales (RT-PCR genérica), fue realizada con el kit One-Step RT-PCR (Qiagen, Valencia), usando los extractos de RNA pertenecientes a los pools de mosquito, y la RT-PCR anidada se realizó a partir del cDNA positivo para la RT-PCR genérica, usando los protocolos previamente descritos para Alphavirus (8), Flavivirus (9), Phlebovirus (10) y Orthobunyavirus (11).

Análisis de secuencias. Los productos de PCR positivos tanto de la RT-PCR genérica y anidada fueron secuenciados siguiendo el método de Sanger en Macrogen (Corea). Las secuencias obtenidas fueron editadas en BioEditv7.0.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) y alineadas en CLUSTALW, con secuencias de del grupo viral detectado disponibles en la base de datos Genbank, previa identificación por similaridad nucleotídica usando el algoritmo BLASTN disponible en NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). El alineamiento fue usado para la reconstrucción, de un árbol filogenético por Máxima Verosimilitud (ML) con el software PHYMLv6.0, para identificar la identidad de las secuencias virales detectadas.

RESULTADOS

Un total de 64 pools conformados a partir de 1274 mosquitos adultos fueron evaluados. El 84% correspondió a individuos del género Culex y Aedes,


Capture of mosquitoes. The entomological collections were conducted in February and April 2012 in the municipality of La Pintada (Antioquia, Colombia), (geographic coordinates: 5°44´25.63” N, 75°36´20.18” O). The adult mosquitoes were captured using CDC light traps with carbon dioxide baits (CO2) for 13 hours (5: 00PM-6: 00AM) per day, as well as active search using vacuums in rural area forest fragments and in the peridomicile of the urban area. For the case of the immature states (larvae and pupas), the mosquitoes were captured using pipettes together with the water from the breeding grounds that were identified. The captured mosquitoes were transported in liquid nitrogen tanks to the Biology and Systemic lab of the National University of Colombia, Medellin campus. The mosquitoes were grouped in pools of 2-20 individuals according to their external morphologic characteristics to separate genera, place and date of capture.

Molecular detection. Each pool was mechanically marked with a plastic mortar in an Eppendorf tube with RLT buffer and the total RNA was extracted using a commercial kit RNeasy (Qiagen, Valencia). The chain reaction of the polymerase prior to inverse transcription for viral genera (generic RT-PCR), was performed with the One-Step RT-PCR (Qiagen, Valencia) kit, using the RNA extracts that belong to the mosquito pools; and the nested RT-PCR was performed from the positive cDNA for the generic RT-PCR, using the protocols previously described for Alphavirus (8), Flavivirus (9), Phlebovirus (10) and Orthobunyavirus (11).

Sequence analysis. The positive PCR products both for the generic and the nested RT-PCR were sequenced following the Sanger en Macrogen (Korea) method. The sequences obtained were edited in BioEditv7.0.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) and aligned in CLUSTALW with sequences of the viral group detected available in the Genbank database, prior to their identification by nucleotide similarity using the BLASTN algorithm available in NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Maximum Likelihood (ML) was used for the alignment for the reconstruction of a phylogenetic tree with the PHYMLv6.0 software to identify the identity of the viral sequences detected.

RESULTS

A total of 64 pools formed from 1274 adult mosquitoes were evaluated. 84% corresponded to individuals of the Culex and Aedes genera and in less quantity, the Coquilletidia, Mansonia, Psorophora and Anopheles genera were found. A pool corresponding to the mosquitoes of the Culex

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y en menor abundancia se encontraron los géneros Coquilletidia, Mansonia, Psorophora y Anopheles. Un pool correspondiente a mosquitos del género Culex colectados en el área urbana fue positivo para la RT-PCR genérica y la RT-PCR anidada para la detección de Alphavirus e identificación especifica viral (8). La secuencia resultante de 147 nt proveniente de la RT-PCR anidada, permitió identificarla como virus de Encefalitis Equina del Este (EEEV), con base en la similaridad obtenida en el algoritmo BLASTN (99% de similaridad). El virus detectado aparece incluido en un complejo conformado por dos especies: Encefalitis Equina del Este sensu stricto y Madariaga virus (MADV), este último con tres linajes que agrupan cepas aisladas en Suramérica.

Para determinar específicamente la identidad del virus, se utilizó la secuencia obtenida de la RT-PCR genérica para Alphavirus por presentar mayor longitud y variabilidad (número de acceso a Genbank: KC802112), y las secuencias disponibles en GenBank para los Alphavirus EEEV y MADV. El alineamiento a partir del fragmento de 311 nt del gen NSP4 (Non-structural Protein 4 – subunidad RNA-dependiente de la RNA polimerasa viral) y posterior reconstrucción filogenética por Máxima Verosimilitud identifica al virus detectado como EEEV – linaje I (Figura 1), diferenciándolo del MADV con altos valores de bootstrapp (>90).

genera that was captured in the urban area was positive for the generic RT-PCR and for the nested RT-PCR for the detection of the Alphavirus and the specific viral identification (8). The resulting sequence of 147 nt that originated from the nested RT-PCR allowed for its identification as an Eastern Equine Encephalitis Virus (EEEV), based on the similarity obtained with the BLASTN algorithm (99% of similarity). The virus detected appears included as a complex formed by two species: Eastern Equine Encephalitis sensu stricto and Madariaga virus (MADV). The latter with three lineages that group isolated strains in South America.

To determine specifically the identity of the virus, a sequence obtained from the generic RT-PCR for the Alphavirus was used because it presents greater length and variability (Genbank access number: KC802112), and the sequences available in GenBank for Alphavirus EEEV and MADV. The alignment from the 311 nt fragment of the NSP4 gene (Non-structural Protein 4 - subunit RNA-dependent of polymerase viral RNA) and subsequent phylogenetic reconstruction for Maximum Likelihood identifies the detected virus as EEEV - lineage I (Figure 1), differentiating it from the MADV with high bootstrapp values (>90).

Pools of mosquitoes evaluated were 64, including 1274 individuals (adults and immature), from which a minimum infection rate of 0,784 could be

Figure 1. Tree with Maximum Likelihood (ML) estimated with partial sequences of nsP4 (311 nt) belonging to the Eastern Equine Encephalitis complex (EEEV sensu-stricto and Madariaga virus-MADV) and the positive pool detected in La Pintada. For the reconstruction by ML the GTR+I+G inferred in JMODELTESTV2.1.4 (- Ln=1047.84, Akaike=2207.68 Criterion) model was used and 1000 copies of bootstrap (values in branches). In front of each sequence used the GenBank access number is observed.



Los pools de mosquitos evaluados fueron 64, incluyendo 1274 individuos (adultos e inmaduros), con base en lo cual podría hablarse de una tasa de infección mínima de 0,784 (12). La ocurrencia de falsos positivos en la detección molecular, fue excluida por evaluación de secuencias genómicas de todas las potenciales fuentes de Alphavirus en nuestro laboratorio, y el control positivo usado para este género fue Encefalitis Equina Venezolana (Río Negro virus).

DISCUSIÓN

La detección molecular del Virus de Encefalitis Equina del Este (EEEV), en este estudio de arbovirus emergentes, es el primer reporte para Antioquia de infección natural en mosquitos. La epidemiología de EEEV es poco estudiada, y en general se registran anualmente sólo los casos equinos, dado que los casos humanos son escasos (4,13), con excepción de la epidemia registrada en la provincia del Darién – Panamá (14).

La infección natural de mosquitos con EEEV en Suramérica, se ha asociado generalmente con especies del subgénero Culex (Melanoconion) – Sección Spissipes como Culex taeniopus, Culex ocossa y Culex pedroi (15), sugiriéndose como el agente principal de la transmisión en pequeños mamíferos y aves en focos enzoóticos, participando secundariamente Mansonia spp., y Aedes fulvus (3-4,6); no obstante, la determinación taxonómica de la especies pertenecientes al subgénero Melanoconion es poco precisa y compleja por la similitud morfológica de las especies que lo conforman (6,15).

La circulación de EEEV en Colombia fue reportada por primera vez con evidencia serológica en dos monos (“mono araña” – Ateles sp, “mono capuchino” – Cebus sp) en San Vicente del Chucurí (Santander). Sin embargo existen algunos registros previos de actividad en zonas selváticas del Magdalena medio (comunicación personal de Downs 1961 citado por Groot 1964) (3). Posteriormente actividad viral ha sido encontrada en otras áreas de Colombia como Casanare, Boyacá, costa Caribe, aislándose de caballos y hámster (4). En el departamento de Antioquia, existen registros de una epidemia de EEEV en 1992 que originó 13 casos fatales en equinos (4), considerándose una zona de riesgo por la presencia del virus, especies de mosquitos competentes, factores ambientales y la presencia de áreas dedicadas al ganado bovino/equino.

La presencia del linaje I de EEEV sensu stricto en La Pintada - Antioquia, suma evidencia en relación con la diversidad de cepas circulando, en diferentes áreas geográficas de Colombia; además, sugiere intercambio viral entre Norte y Suramérica.

inferred (12). The occurrence of false positives in the molecular detection was excluded by genomic sequence evaluation of all the potential sources of Alphavirus in our lab and the positive control used for these genera was Venezuelan Equine Encephalitis (Rio Negro virus).

DISCUSSION

The molecular detection of the Eastern Equine Encephalitis Virus (EEEV) in this study of emerging arbovirus is the first report for Antioquia of the natural infection in mosquitoes. The epidemiology of EEEV has not been studied in depth and in general, only equine cases are recorded annual since human cases are rare (4,13) with the exception of the plague recorded in the province of the Darien - Panama (14).

The natural infection of mosquitoes with EEEV in South America has been associated with species of the Culex (Melanoconion) - Spissipes Section subgenera like Culex taeniopus, Culex ocossa and Culex pedroi (15), suggesting that it is the main agent for transmission to small mammals and birds in enzootic foci, and in second place the Mansonia spp., and Aedes fulvus (3-4,6); however, the taxonomic determination of the species belonging to the Melanoconionsubgenera is not very precise and complex because of its morphological similarity with the species that belong to the group (6,15).

The circulation of EEEV in Colombia was reported for the first time as serologic evidence in two monkeys (“spider monkeys” - Ateles sp, “capuchin monkey” - Cebus sp) in San Vicente del Chucurí (Santander). However, there are prior records of activity in jungle areas of the Magalena Medio region (personal communication from Downs 1961 cited by Groot 1964). Subsequent viral activity has been found in other areas of Colombia like Casanare, Boyaca, Caribbean coast, isolating them from horses and hamsters (4). There are records of an EEEV plague in 1992 that originated 13 fatal cases in equines in Antioquia (4), considering this region a high risk area because of the presence of the virus, competent mosquito species, environmental factors and the presence of areas dedicated to bovine/equine breeding.

The presence of EEEV lineage I sensu stricto in La Pintada - Antioquia, adds to the evidence of the diversity of circulating strains in different geographic areas of Colombia; it also suggests the viral exchange between North and South America. Similar evidence is the isolation of two South American strains of EEEV from migratory birds in Mississippi (USA) (13). However, it is

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Evidencia similar la constituye el aislamiento de dos cepas suramericanas de EEEV, a partir de aves migratorias en Mississippi (EEUU) (13). Sin embargo, es deseable caracterizar secuencias adicionales del virus, para precisar posibles eventos de sustitución o adaptación, que posiblemente confieran mayor eficacia biológica en nuevos hospederos y en consecuencia afectar la virulencia, impactando la ecología de hospederos y vectores que permitan la emergencia viral en poblaciones humanas (14), y en consecuencia originar cuadros clínico-patogénicos en humanos; además, se es necesario determinar la presencia de otros linajes de EEEV en La Pintada. Lo anterior dado que recientemente se ha revisado taxonómicamente el complejo EEEV, mediante análisis filogenómico y se ha separado en dos especies: EEEV sensu stricto (linaje I) y Madariaga virus (MADV). En este último se encuentra las cepas suramericanas, que pertenecen a los linajes II-III-IV del complejo (15).

Posteriores trabajos entomológicos de los autores usando taxonomía clásica y molecular: código de barras genético (citocromo oxidasa I), han permitido identificar en la misma zona de este estudio, especies de mosquitos con registros previos de infección natural con EEEV y el virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEEV), entre otros arbovirus de interés médico. Estas especies son Culex nigripalpus, Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti, Psorophora ferox, Ochlerotattus spp. (Datos sin publicar).

La detección de bajas tasas de infección natural con EEEV, en mosquitos junto con la presencia de ganado bovino/equino, especies de vectores potenciales y el posible rol de los equinos en la amplificación el virus detectado, permiten postular esta zona como de riesgo para la emergencia de este arbovirus. Es importante considerar la alta cercanía evolutiva del virus detectado, con cepas norteamericanas virulentas pertenecientes al linaje I o EEEV sensu stricto. Adicionalmente es pertinente realizar un inventario detallado de los posibles reservorios vertebrados (aves y pequeños mamíferos), así como una encuesta serológica/clínica para identificar circulación del virus en humanos, y precisar los posibles casos en equinos y humanos, los cuales pueden ser inaparentes en sus manifestaciones clínicas o confundidos con otros arbovirus que circulan en la zona, como el virus Dengue y el virus de Encefalitis Equina Venezolana.

Agradecimientos

Colciencias, por la beca de doctorado nacional otorgada a Richard Hoyos López (Convocatoria-528) y la financiación de este trabajo bajo el proyecto 111549326198. La Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia, por conceder la Dedicación Exclusiva a Juan Carlos Gallego-Gómez. Diego Puerta por asistencia en las colectas y laboratorio.

desirable to characterize additional sequences of the virus to precise possible substitution and adaptation events that would possibly generate more biological efficiency in new hosts and as a consequence, affect the virulence, which would impact the ecology of the hosts and vectors that allow for the viral emergence in human populations (14) and therefore, originate clinical-pathogenic symptoms in humans; also, it is necessary to determine the presence of other EEEV linages in La Pintada. Recently, the taxonomy of the EEEV complex has been reviewed through phylogenomic analysis and it has been separated in two species: EEEV sensu stricto (lineage I) and Madariaga virus (MADV). The South American strains are found in the latter, which belong to the II-III-IV linages of the complex (15).

Subsequent entomological works of authors using classic and molecular taxonomy: genetic bar code (cytochrome c oxidase I), have allowed for the identification of mosquito species in the same area of this study, with prior records of natural infection with EEEV and the Venezuelan Equine Encephalitis virus (VEEV), among other arbovirus of medical interest. These species are Culex nigripalpus, Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti, Psorophora ferox, Ochlerotattus spp. (Unpublished data).

The detection of low rates of natural infection with EEEV in mosquitos together with the presence of bovine/equine cattle, potential vector species and the possible role of equines in the amplification of the detected virus, allow proposing this area as a risk area for the emergence of this arbovirus. It is important to consider the high evolutionary proximity of the detected virus with North American strains of the virus belonging to lineage I or EEEV sensu stricto. Additionally, it is relevant to perform a detailed inventory of the possible vertebrae reservoirs (birds and small mammals), as well as a serologic/clinical survey to identify the circulation of the virus in humans and to identify the possible cases in equines and humans, which can be non-apparent in their clinical symptoms or confused with other arbovirus that circulate in the area, such as the Dengue virus or the Venezuelan Equine Encefalitis virus.

Acknowledgments

Colciencias, for the scholarship granted to Richard Hoyos Lopez (Grant-528) and the financing of this work under project 111549326198. The School of Medicine of the University of Antioquia, for granting Exclusive Dedication to Juan Carlos Gallego-Gomez. Diego Puerta for support in the captures and the lab.



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SHORT COMMUNICATION


Curve control, development and phenotypic bad formations in poodle the city of Medellin

Curva de control, desarrollo y mal formaciones fenotípicas en Poodle en la ciudad de Medellín

José Ortiz Á, Esp.

Corporación Universitaria Lasallista, Centro Veterinario Génesis. Carrera 51 Nº118Sur - 57. Caldas - Antioquía *Correspondencia: [email protected]

Received: October 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT

Objective. Quantifying phenotypic malformations and make a curve control and development of the breed Poodle puppies in the city of Medellin. Materials and methods. We analyzed 60 individuals, 30 females and 30 males were measured and weighed from 2 to 12 months of age with these data, build a table and a control growth curve and after about 12 months of age there were the Phenotypic malformations, which are considered by the American Kennel Club (AKC) and Cynological International (FCI). Results. Of the specimens analyzed, 10% had bone spurs, cryptorchidism 20%, 5% had polidoncia a year old, with teeth retained teeth more often. Conclusions. In an effort to find examples of smaller faults have been committed at the time of mating, resulting in increased phenotypic malformations found in the study, this work also provide veterinarians, another tool for assessing pediatric puppies Poodle race in the city of Medellin.

Key words: Canines, height, malformations phenotype, weight (Source:CAB).

RESUMEN

Objetivo. Cuantificar las malformaciones fenotípicas y realizar una curva de control y desarrollo, de cachorros de la raza Poodle en la ciudad de Medellín. Materiales y métodos. Se analizaron 60 individuos; 30 hembras y 30 machos, se midieron y se pesaron desde los 2 hasta los 12 meses de edad; con estos datos se construyó una tabla y una curva de control del crecimiento; a los 12 meses de edad se contabilizaron las malformaciones fenotípicas, las cuales son consideradas por la American Kennel Club (AKC) y la Federación Cinologica Internacional (F.C.I). Resultados. De los ejemplares analizados, un 10% tenían espolones, 20% criptorquidismo y 5% presentaban polidoncia al año de edad, siendo los colmillos los dientes retenidos con más frecuencia. Conclusiones. Por el afán de encontrar ejemplares de menor tamaño se han cometidos fallas al momento de realizar los apareamientos, dando como resultado el aumento de las malformaciones fenotípicas encontradas en el estudio, con este trabajo también se ofrecer a los veterinarios, otra herramienta más para la evaluación pediátrica de los cachorros de la raza Poodle en la ciudad de Medellín.

Palabras clave: Caninos, fenotipo, malformaciones, peso, talla (Fuente: CAB).



INTRODUCCIÓN

Todos los seres vivos cumplen una serie de etapas como son nacer, crecer, reproducirse y morir; el crecimiento y desarrollo es una etapa fundamental que permite formar unas características que ayudan a superar las otras etapas (1,2).

En medicina humana, el termino crecimiento y desarrollo es un área interdisciplinaria que involucra todas las actividades concernientes a que un niño tenga un desarrollo físico e intelectual similar en comparación con sus congéneres de su misma edad, esto se logra con la implementación de tablas de medidas y curvas de crecimiento (1).

En medicina veterinaria este tema no tiene amplia difusión, solo existen algunas tablas de crecimiento para la crianza de ganado vacuno, equino y canino para procurar un buen desarrollo fenotípico y de producción (3,4).

La American Kennel Club (AKC) categoriza al caniche ó poodle dentro del grupo 5 ó perros de juguete ó compañía, la Federación Cinologica Internacional (F.C.I) lo categoriza en el grupo IX sección 2 caniches (5,6).

Los lineamientos que dan estas asociaciones se dirigen a conservar unos estándares para las razas de perros, sean estos de exposición ó como perros de compañía (6,7).

Estas asociaciones tienen en cuenta varios factores como el peso, la talla, el color del manto y las características del cuerpo para conformar el estándar de cada raza, también dictaminan las faltas ó penalizaciones que merezca un ejemplar (6,8).

En la ciudad de Medellín una de las razas caninas más popular es el caniche o poodle, fruto de esto y con el afán de los criadores de conseguir un ejemplar de tamaño pequeño (mal llamada tacita de te) se ha producido una degeneración en las características de esta raza.

Viendo el problema y por la falta de herramientas para medirse adecuadamente el desarrollo de los cachorros de esta raza, se realizó un trabajo en el cual a 60 cachorros poodle, se les analizó diferentes variables como el peso, la talla, el color del manto y se compararon con el estándar internacional, además se realizó una tabla y una curva de control del crecimiento y desarrollo, para poder evaluar el progreso de los cachorros y que esta se ha otra herramienta de análisis utilizada por los clínicos de pequeños animales para una mejor evaluación pediátrica de estos ejemplares.

INTRODUCTION

All live beings fulfill a series of stages such as to be born, to grow, to reproduce and to die; growth and development are fundamental stages that form some characteristics that helps to move on to other stages (1,2).

In human medicine, the terms growth and development are an interdisciplinary area that involves all activities for a child to have a physical and intellectual development similar in comparison with their peers. This is accomplished with the implementation of measurement tables and growth curves (1).

In veterinary medicine, this subject is not widely studied. Some growth tables exist for bovine, equine and canine animal breeding to ensure a good phenotypic and production development (3,4).

The American Kennel Club (AKC) categorizes the poodle within group 5 or companion or toy dogs; the World Canine Organization (F.C.I.) categorizes the poodle ingroup IX section 2 poodles (5,6).

The guidelines given by these associations are directed to the conservation of some standards for some dog breeds, whether these are for exhibition or companion dogs (6,7).

These associations consider several factors such as weight, size, coat color and body characteristics to form a standard for each breed. They also dictate failures or penalties that a particular specimen deserves (6,8).

In the city of Medellin, one of the most popular canine breeds is the poodle. Because of this and because of the breeder’s eagerness to achieve a small size specimen (the so called tea cup), a degeneration of the characteristics of this breed has occurred.

With the problem in mind and because of the lack of tools to adequately measure the development of the puppies from this breed, a work was conducted in which 60 poodle puppies were subjected to analysis of different variables such as weight, size, coat color and they were compared to the international standard; also, a table and growth and development control cure was developed in order to assess the progress of these puppies. This analysis could be another tool for analysis by small animal clinics for a better pediatric assessment of this specimen.

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Sitio de estudio. Los datos utilizados fueron obtenidos del Centro Veterinario Génesis, ubicado en la ciudad de Medellín (Colombia).

Sección de los ejemplares. El único factor que fue tenido en cuenta para escoger los ejemplares fue que estos fueran hijos de perros poodle reconocidos fenotípicamente o que provinieran de algún criadero.

Tipo de estudio. Se realizó un estudio descriptivo, donde se efectuó el seguimiento a 60 cachorros de la raza poodle (30 machos y 30 hembras) desde los 2 hasta los 12 meses de edad.

P e s a j e , m e d i c i ó n y r e g i s t r o d e malformaciones fenotípicas. Se midió cada ejemplar desde el piso hasta la altura de la cruz (Figura 1), se pesaron en una bascula y en la última visita se midió el largo desde el occipucio hasta la base de la cola, la condición corporal, el color del manto y se registraron las malformaciones fenotípicas encontradas en este momento.

Análisis estadístico. Los datos se describen mediante la obtención del porcentaje para las mal formaciones fenotípicas y el promedio, percentiles 25,50 y 75 del peso y de la talla, para construir las curvas y la condición corporal medida en una escala de 1-5 (9); se utilizó el programa Microsoft Office Excel® 2007 para la determinación de los valores anteriores.

RESULTADOS

En cuanto al color del manto se encontró que 43 ejemplares eran blancos lo que equivalía a un 71.6% del total, 6 eran negros (10%) y 11 (18.5%) eran de otro color en los que se encuentra grises, albaricoque y combinaciones de colores.

En cuanto a otros hallazgos se encontró que 6 ejemplares que corresponden a un 10%, presentaban espolones, 6 machos que correspondían a un 20% eran criptorquidos, 3 individuos que equivalían a un 5% presentaban polidoncia al año de edad siendo los colmillos los dientes retenidos más frecuentes, 1 hembra (1.6%) presento al año de edad prognatismo inferior, también se pudo observa al año de edad que solo 3 hembras que equivalía a un 10% habían sido esterilizadas y ningún macho había sido esterilizado y por último a 3 ejemplares que equivalen a un 3.3% por decisión de sus dueños


Study location. The data used was obtained from the Genetic Veterinary Center in the city of Medellin (Colombia).

Selection of specimens. The only factor that was considered to select the specimens was that these were sons of phenotypically recognized poodle dogs or that they would come from a kennel.

Type of study. A descriptive study was conducted in which 60 puppies of the poodle breed (30 male and 30 female) from 2 to 12 months old were monitored.

Weight, measurement and record of phenotypical malformations. Each specimen was measured from the floor to the cross (Figure 1). They were measured in a scale and at the last visit, the length was measured from the occiput to the tail, the body condition, the color coat and also the phenotypical malformations found were recorded.

Figure 1. Measurement method used, line A from the base of the tail to the occiput, line B from the cross to the floor (own design image).

Statistical analysis. The data is described with a percentile for phenotypical malformations and the average; percentiles 25, 50 and 75 of weight and size to build the curves and the body condition was measured in a scale of 1 to 5 (9); Excel Microsoft Office® 2007 was used to determine the previous values.

RESULTS

With respect to the color of the coat it was found that 43 specimen were white, which is equivalent to 71.6% of the total; 6 were black (10%) and

Ortiz - Curve control, development and phenotypic bad


al considerar una práctica aberrante no se les había realizado caudectomia

En cuanto al tamaño se encontró que 38 ejemplares que equivalen a un 63.3% se categorizaron como miniatura y 22 ejemplares (36.6%) se categorizaron como minitoy.

En cuanto a la condición corporal medida de 1-5, se encontró lo siguiente al año de edad, del total, 22 ejemplares presentaron condición corporal menor a 3, de estos 9 eran machos que correspondían a un 40.9% y 13 eran hembras (59%); 29 tenían condición corporal de 3; de estos 8 (27.5%) eran machos y 21 (72.4%) eran hembras; con condición corporal mayor a 3 se encontró 9 animales, 6 (66.6%) eran machos y 3 (33.3%) eran hembras.

Con las tallas y pesos recolectados se conformaron las siguientes tablas para machos y para hembras las cuales contienen los percentiles 25, 50 y 75, además con estos valores se construyo una curva de crecimiento para cada género (Tablas 1, 2 y Figuras 2-5).

DISCUSIÓN

Desde el momento mismo de la concepción, todo ser vivo adquiere una determinación genética que repercutirá durante toda su vida, pero inmediatamente empieza a ser influenciada por el medio ambiente en su proceso de crecimiento y desarrollo (1,10).

A lo anterior hay que sumarle la nutrición, todas las razas de perros tienen unos requerimientos nutricionales, los cuales van a depender del tamaño

11 (18.5%) were of another color, among which are grays, apricot and a combination of colors.

With respect to other findings, it was found that 6 specimens that correspond to 10% presented bone spurs; 6 male, which correspond to 20%, had cryptorchidism; 3 individuals, which correspond to 5%, presented polydontia at age one, being the tusk of the retained tooth the most frequent; 1 female (1.6%) presented lower prognathism by age one; also, by age one, it was observed that only 3 females, equivalent to 10%, had been sterilized and no male had been sterilized; lastly, 3 specimens equivalent to 3.3%, had not been subjected to caudectomy because their owners consider this practice to be aberrant.

With respect to the size, it was found that 38 specimen, equivalent to 63.3%, were categorized as miniature and 22 specimen (36.6%) were categorized as minitoy.

With respect to the body condition measured between 1-5, it was found that at age one, from the total, 22 specimen showed a body condition of less than 3; of these, 9 were male, corresponding to 40.9% and 13 were female (59%); 29 had a body condition of 3; from these, 8 (27.5%) were male and 21 (72.4%) were female; 9 animals had a body condition greater than 3, 6 (66.6%) were male and 3 (33.3%) were female.

With the sizes and weights recollected, the following tables were elaborated for male and for female, which have the 25, 50 and 75 percentiles; also, with these values, a growth curve was build for each gender (Tables 1, 2 and Figures 2-5).

Table 1. Size and weight of females of the Poodle breed 2 to 12 months old size percentiles (cm), weight percentiles (kg).

Weight (kg) Age (months)

Percentiles 2 4 6 8 10 12

25 1.0 1.5 2.0 2.6 2.7 3.0

50 1.0 2.1 3.0 3.4 3.4 4.0

75 2.0 2.5 3.2. 4.0 4.3. 4.8

Size (cm)

25 14 16 18.6 22 23 24

50 15 17.5 21 24.5 26.5 27

75 16 19 24.8 27.8 29.6 30

Table 2. Size and weight of males of the Poodle breed 2 to 12 months old.

Weight (kg) Age (months)

Percentiles 2 4 6 8 10 12

25 1.0 2.0 2.7 3.0 3.2. 3

50 1.7 2.5 3.0 4.0 4.3. 4.0

75 2.0 3.0 3.5 4.4 5.3. 5.0

Size (cm)

25 15 17.3. 20 22 24 25

50 15 19 22 24 26.5 27

75 17 22 24 26 29.6 30

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del ejemplar, el sexo y la actividad (11). Al observar los resultados obtenidos en este estudio encontramos que el color blanco del manto prima sobre los otros colores, entre los propietarios de los perros poodle en nuestro medio se tiene el concepto que el ejemplar de color blanco es más puro que el ejemplar de otro color, esto por falta de información sobre los estándares de la raza (6,7).

En el estudio se encontraron varias malformaciones fenotípicas algunas de ellas penalizadas por las diferentes asociaciones y clubes caninos, uno de estos problemas, el criptorquidismo tiene un componente genético hereditario (4,10); como norma preventiva estos ejemplares deberían ser esterilizados o no se les debería dejar reproducir.

También se observó la polidoncia en algunos ejemplares, cabe recordar que este problema va a

DISCUSSION

From the moment of conception, all live beings acquire a genetic determination that will have an impact during their entire life, but that immediately starts to become influenced by the environment in its growth and development process (1,10).

Nutrition must also be added to this; all dog breeds have nutritional requirements that will depend on the size of the specimen, the sex and the activity (11). When observing the results obtained in this study, we found that the white coat color prevails over the other colors. Among the owners of poodle dogs in our environment, there is a belief that white color specimens are more pure than other color specimens. This is due to lack of information on breed standards (6,7)

Figure 5. Curve of percentiles 25, 50, 75 of the size in centimeters of males from the Poodle breed 2 to 12 months old.

Figure 2. Curve of percentiles 25, 50, 75 of the weight in kilograms of females from the poodle breed 2 to 12 months old.

Figure 3. Curve of percentiles 25, 50, 75 of the size in centimeters of females from the Poodle breed 2 to 12 months old.

Figure 4. Curve of percentiles 25, 50, 75 of the weight in kilograms of males from the Poodle breed 2 to 12 months old.



ocasionar que los animales adultos presenten mala conformación de la cavidad oral por el apiñamiento que se presentara en las piezas dentales y la mala ubicación de algunas de ellas que pueden ocasionar heridas y dolor a la masticación (3, 12), todo esto redundara en la presentación de halitosis, enfermedad periodontal y las correcciones quirúrgicas que se deban realizar para retirar las piezas dentales supernumerarias (12,13)

Es obligación del veterinario recomendar la esterilización temprana de la hembras y los machos, pues como se observó en el estudio esta práctica es poco utilizada; se debe hacer énfasis en todos los beneficios que se obtienen al realizar el procedimiento a temprana edad como son la presentación de patologías reproductivas, la preñez no deseada, la supresión del ciclo estral y la baja probabilidad de la presentación de tumores mamarios (3,4).

Otro hallazgo significativo del estudio es en cuanto a la condición corporal con que llegaron al año de edad esto individuos, aunque el mayor porcentaje llegaron a la edad adulta con una condición corporal ideal de 3 estos no llegan hacer ni el 50% del total del estudio, con esto se puede ver que hay serios problemas en la alimentación de los cachorros de esta raza; pues hay un alto porcentaje de individuos que llegaron con un condición corporal menor a 3 (bajo peso), esto se observó especialmente en la hembras; en cambio hay más porcentaje de machos que llegaron con sobre peso; se ha encontrado que un cachorro que llegue con una pobre calificación de condición corporal (menor de 3) al final de su crecimiento, redundara en un perro adulto que no se desempeñara bien en su trabajo, será susceptible a las infecciones bacterianas, parasitarias (9,14).

En cuanto al peso se observó que los individuos alcanzaron un peso promedio de entre 3 y 5 kg a los 12 meses, algo parecido a lo encontrado por Posada et al (2014) aunque para ellos fue el peso promedio de las razas pequeñas (15).

Al indagar a los dueños de estos animales sobre la forma de alimentación la gran mayoría respondió que la alimentación era a voluntad, los propietarios no conocen o no utilizan las tablas de cantidad de alimento que traen impresos los empaques de los alimentos, también algunos respondieron que administraban trozos de su propia comida como golosinas a sus perros, pues piensan que sus perros se cansan de comer siempre los mismo.

También se encontró que lentamente procedimientos como la caudectomia empiezan a dejar de realizarse; en muchos eventos y exposiciones caninas ya no se penaliza los ejemplares con cola que anteriormente era

In the study, phenotypical malformations were found, some of them penalized by different associations and canine clubs. One of these problems, cryptorchidism, has a hereditary genetic component (4,10); as a preventive rule, these specimens should be sterilized or should not be able to reproduce.

Polydontia was also observed in some specimen. It is worth noting that this problem will cause adult animals to present bad formation of the oral cavity due to the overcrowding of teeth and the wrong location of some of the teeth that can cause bruising and pain when chewing (3, 12). All of this will result in halitosis, a periodontal disease, and the surgical corrections that should be performed to remove the supernumerary teeth (12, 13).

It is the duty of the veterinary to recommend early sterilization of females and males, because, as it was observed in the study, this practice is not widely used; emphasis should be made in all the benefits that are obtained when performing the procedure at an early age, such as the appearance of reproductive pathologies, unwanted pregnancy, suppression of the estrous cycle and low probability of appearance of breast tumors (3,4).

Another significant finding of the study is with respect to the body condition reached at age one. Although a large percentage of these individuals reached adulthood with an ideal body condition of 3, these are not even 50% of the study’s total. Therefore, it can be seen that there are serious problems in the nutrition of the puppies from this breed; since there is a high percentage of individuals that reached a body condition of less than 3 (low weight). This was observed primarily in females; however, there is a higher percentage of males that reached the body condition with over weight; it has been found that a puppy that arrives with a poor body condition score (less than 3) at the end of their growth cycle, it will result in an adult dog that will not perform well, will be susceptible to bacteria infection and parasites (9,14).

Regarding weight, it was observed that the individuals reached an average weight between 3 and 5 kg at 12 months, something similar to Posada et al (2014) findings, although for them, it was the average size of smaller breeds (15).

When asking the owners about the nutrition of these animals, most responded that the nutrition was voluntary; owners do not know or do not use the food quantity tables from the labels found on animal food products. Some also responded that they gave pieces of their own food as treats for their dogs, because they believe that their dogs get tired of eating always the same thing.

4813

obligatorio amputársela para no ser descalificados de las competencias (6,7).

En cuanto a la construcción de las curvas de crecimiento hay que tener presente que toda curva de crecimiento o de seguimiento del peso consta de tres partes; la primera es una fase de crecimiento acelerado, la segunda es una etapa de crecimiento lento y la tercera parte es de estabilización (1).

En las curvas obtenidas con los datos recopilados, se observaron estas tres etapas; en las hembras se puede observar en cuanto al peso que la primera fase de la curva termina aproximadamente entre los 5-6 meses de edad, la segunda fase termina de 9-10 meses de edad y en adelante se presenta la fase de estabilización; para la talla, la primera fase termina de 3-4 meses de edad, la segunda de 8-9 meses y a partir de este tiempo comienza la tercera y última fase; en los machos en cuanto al peso la primera fase termina de 4-5 meses de edad, la segunda de 9-10 meses y en adelante la última fase, para la talla la primera fase termina de 2-3 meses de edad, la segunda de 7-8 meses después de este tiempo comienza la fase de estabilización.

La utilización de varios percentiles para formar las curvas en vez de una sola tiene como finalidad realizar un seguimiento más detallado de cada individuo y nos ayuda a ubicar y a comparar el crecimiento o el peso con el resto de la población en un momento dado (1).

En conclusión el veterinario debe hacer mucho énfasis con la recomendaciones para la alimentación de los cachorros durante todos el periodo de desarrollo (9, 15) y estar evaluando constantemente el cumplimiento de las mismas para poder en un momento dado realizar las correcciones necesarias, al mismo tiempo debe desalentar las practicas reproductivas que pueden generar mal formaciones fenotípicas en una raza especifica.

La importancia de tener tablas y curvas de crecimiento como las que se obtuvieron en este trabajo es puedan ser utilizadas como herramientas fundamentales para la evaluación y seguimiento de un correcto crecimiento y desarrollo de los cachorros, como también puede ser el punto de partida para realizar las correcciones nutricionales oportunas como se realiza en medicina humana.

It was also found that procedures such as caudectomy, have slowly stopped being performed; in many canine events and exhibitions, specimen with tail are no longer penalized; previously it was mandatory to amputate the tail so that the specimen would not be disqualified from the competitions (6,7).

With respect to the elaboration of the growth curves, one must keep in mind that all growth curves or monitoring of weight have three parts; the first is an accelerated growth phase; the second is a slow growth stage and the third is the stabilization part (1).

These three stages were observed in the curves obtained with the data collected; in females it can be observed with respect to weight that the first phase of the curve ends approximately at 5-6 months, the second phase ends at 9-10 months and after, comes the stabilization phase; for size, the first phase ends at 3-4 months, the second phase at 8-9 months and after that, the third and last phase begin; in males, with respect to weight, the first phase ends at 4-5 months, the second at 9-10 months and after, the last phase; for size, the first phase ends at 2-3 months, the second at 7-8 months and after this, the stabilization phase begins.

The use of several percentiles to form the curves instead of only using one percentile has the purpose of monitoring in more detail each individual and it helps us locate and compare their growth or their weight with respect to the rest of the population in a given moment (1).

In conclusion, the veterinary must emphasize the recommendations for the puppies’ nutrition during all phases of development (9, 15) and constantly monitor their fulfillment in order to perform the necessary corrections at a given moment, and must also discourage the reproductive practices that could cause phenotypical malformations in a specific breed.

The importance of having growth tables and curves like the ones obtained in this work is so they can be used as main tools for the evaluation and monitoring of the correct growth and development of puppies, as well as a point of reference to make the timely necessary nutritional corrections as in human medicine.



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Closed reduction of humeral condylar fracture and elbow luxation in a dog

Reducción cerrada de fractura condilar de húmero y luxación de codo en un canino

Sebastián Cardona R,1 MVZ, Luis-Carlos Muñoz R,1 MVZ, Raúl-Fernando Silva M,1* Ph.D.

Universidad de Caldas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Grupo de investigación Terapia Regenerativa, A.A Nro. 275, Manizales, Colombia. *Correspondencia: [email protected]

Received: August 2014; Accepted: February 2015.

ABSTRACT

Fractures of the distal humerus that involving the condyles often requires extensive surgical approach for treatment, leading to a prolonged recovery time. In a West Highland White Terrier dog two years old, with a fracture of the lateral humeral condyle portion and elbow luxation, was performed a closed technique for luxation reduction, fracture reduction was performed by digital pressure and percutaneous osteosynthesis by introduction of a Kirschner wire of 2 mm diameter, accompanied by Robert-Jones bandage modified for 6 weeks. Limb function was recovered in the immediate postoperative, the wire was removed six weeks after, non-was observed postoperative complications, and full functional recovery of the limb was clinically evident. This suggests that this technique could be an option in cases of condylar fractures in small-sized dogs.

Key words: Dog, fixation, orthopedics (Source: CAB).

RESUMEN

Las fracturas de la porción distal del húmero que involucran los cóndilos, frecuentemente exigen para su reparación un amplio abordaje quirúrgico, que conlleva un tiempo de recuperación prolongado. En un canino West Highland White Terrier de dos años de edad, con una fractura de la porción lateral del cóndilo humeral y luxación de codo, se realizó una técnica cerrada de reducción de la luxación, reducción de la fractura mediante presión digital, y osteosíntesis percutánea mediante la introducción de un clavo de kirschner de 2 mm de diámetro, acompañado de vendaje de Robert-Jones modificado durante 6 semanas. El paciente recuperó la función del miembro en el posquirúrgico inmediato, no se evidenciaron complicaciones posquirúrgicas, seis semanas después se retiro el clavo y se evidenció clínicamente recuperación total de la funcionalidad del miembro. Lo anterior sugiere que esta técnica podría ser una opción en casos de fracturas condilares en perros de pequeño porte.

Palabras clave: Fijación, ortopedia, perro (Fuente: CAB).


CLINICAL CASE



INTRODUCCIÓN

Las fracturas humerales corresponden a cerca del 10% de todas las fracturas apendiculares (1). Casi la mitad de las fracturas de húmero (46.6%), ocurren en el aspecto distal (2). De estas, las fracturas de los cóndilos humerales son relativamente frecuentes (2).

La reducción de las fracturas condilares usualmente se realiza con abordajes quirúrgicos amplios, que permitan visualizar todas las estructuras. Dentro de las cuales se incluyen abordaje de la porción humero-ulnar de la articulación del codo por osteotomía del olecranon o por tenotomía del tendón del tríceps entre otras (3). Debido a lo anterior, la reducción de fracturas condilares presenta una alta incidencia de complicaciones posquirúrgicas, dentro de las cuales se presenta disminución del rango de movimiento articular y osteoartritis del codo entre otras (4).

Debido a lo anterior, la aplicación de los conceptos de osteosíntesis biológica (5), mediante el uso de clavos de kirschner de una manera mínimamente invasiva puede ofrecer grandes ventajas con respecto a las técnicas tradicionales, como menor dolor posoperatorio, cicatrización rápida y menor trauma iatrogénico a estructuras importantes como las fisis y la cápsula articular.

A continuación se describe la reducción cerrada de una luxación traumática lateral de la articulación humero-radio-ulnar, reducción mediante presión digital de una fractura de la porción lateral del cóndilo humeral y fijación mediante aplicación percutánea de un clavo de kirschner, en un paciente canino.

CASO CLÍNICO

El paciente era un canino de raza West Highland White Terrier, macho entero, de dos años de edad y 7.4 kilogramos de masa corporal, que se presentó a consulta después de 96 horas de sufrir una caída desde una altura aproximada de 3 metros, con claudicación severa del miembro torácico derecho caracterizada por no apoyo y ausencia total de movilidad articular.

Se realizaron radiografías en las proyecciones medio-lateral y cráneo-caudal evidenciando luxación lateral de la articulación humero-radio-ulnar y fractura condilar del aspecto lateral del cóndilo humeral (Figura 1).

INTRODUCTION

The humerus fractures make up almost 10% of all appendicular fractures (1). Almost half of the humerus fractures (46.6%), occur in the distal aspect (2). Of these fractures, the humeral condyle is relatively frequent (2).

The reduction of condylar fractures is usually made with wide surgical approaches that allow for the visualization of all structures. These approaches include a portion of the ulnar-humerus of the el joint elbow by osteotomy of the olecranon or by tenotomy of the triceps tendon, among others (3). As a result, the reduction of condyle fractures shows a high incidence in post surgical complications, among which are the reduction of the range of the articular movement and osteoarthritis of the elbow, among others (4).

As a result, the application of biological osteosynthesis concepts (5), through the use of Kirschner wires in a minimally invasive way, can offer great advantages with respect to traditional techniques, such as less postoperative pain, fast healing and less iatrogenic trauma to important structures such as the physes and the articular capsule.

The closed reduction of a lateral traumatic luxation of the humerus-radius-ulnar is described below. The reduction is performed by digital pressure of a fracture of the lateral portion of the condylar humeral and the fixation through the precutaneous application of a Kirschner wire to a canine patient.

CLINICAL CASE

The patient was a West Highland White Terrier dog, adult, two years old and 7.4 kilograms of body mass, that went to consultation after 96 hours of suffering a fall from a height of 3 meters, with severe claudication of the right thoracic limb characterized by lack of support and total absence of articular mobility.

X-rays were made in the medium-lateral and the crown-rump length projections evidencing lateral luxation of the humerus-radius-ulnar articulation and the condylar fracture of the lateral aspect of the humeral condyle (Figure 1).

Because the owner did not have the financial resources to pay for the cost of the treatment through open reduction and internal fixation, and since the owner had to travel quickly to a remote location with no veterinary service available, it was decided to perform an ambulatory treatment. Through traction and counter-traction maneuvers

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Debido a que el propietario no contaba con los recursos financieros para costear el tratamiento mediante reducción abierta y fijación interna, y a que se tenía que desplazar rápidamente a una población lejana donde no contaba con servicio veterinario. Se decidió instaurar tratamiento ambulatorio. Mediante maniobras de tracción y contra-tracción se realizó reducción cerrada de la luxación y mediante el método de evaluación de Campbell se determinó que los ligamentos colaterales estaban intactos (6).

El tratamiento quirúrgico consistió en reducción cerrada de la fractura del aspecto lateral del cóndilo humeral mediante presión digital. Se introdujo vía percutánea a través del aspecto lateral fracturado un clavo de kischner de 2 mm, intercondilar hasta el aspecto medial del cóndilo humeral, como único método de fijación (Figura 2). Posteriormente, se inmovilizó mediante vendaje de Robert-Jones modificado durante cuatro semanas.

RESULTADOS

El paciente recuperó la función del miembro en el posquirúrgico inmediato, tan pronto como recuperó la conciencia, comenzó a deambular con claudicación moderada del miembro tratado. No se evidenciaron complicaciones posquirúrgicas durante las seis semanas de acompañamiento clínico. Cuatro semanas después se retiro el clavo, se evidenció clínicamente recuperación satisfactoria de la funcionalidad. El vendaje de Robert Jones modificado fue retirado definitivamente a las seis semanas. Los ángulos de extensión y flexión de la articulación afectada fueron 150 y 40 grados, y los de la articulación contralateral fueron de 154 y 30 grados, respectivamente, radiográficamente no se encontraron signos compatibles con osteoartritis de la articulación (Figura 3).

DISCUSIÓN

Si bien, el objetivo fundamental en el tratamiento de fracturas de los cóndilos humerales es restablecimiento de la superficie articular y fijación y estabilización del cóndilo a la diáfisis humeral (7). En casos donde no se puede realizar reducción abierta y fijación interna (RAFI) para permitir una rápida movilización de la articulación, el tratamiento quirúrgico es contraproducente (8). En el presente relato de caso ante la imposibilidad de realizar RAFI se realizó reducción cerrada

a closed reduction of the luxation was performed and, through the Campbell evaluation method, it was determined that the collateral ligaments were intact (6).

The surgical treatment consisted in a closed reduction of the fracture of the lateral aspect of the humeral condyle by digital pressure. A Kischner wire of 2 mm was introduced by percutaneous access through the lateral fractured aspect, intercondylar until the medial aspect of the humeral condyle, as the only method of fixation (Figure 2). Later, the dog was immobilized with Robert-Jones bandage that was modified during four months.

RESULTS

Limb function was recovered in the immediate postoperative. When the patient recovered his conscience, he started to wander with moderate

Figure 1. CRL x-ray shows lateral luxation of the elbow and condyle fracture of the lateral aspect of the humeral condyle in a dog patient of West Highland White Terrier breed, two years old and 7,4 kilograms of body mass, after 96 hours of suffering a fall from a height.

Cardona - Closed reduction humeral condylar fracture in a dog


e inmovilización externa como alternativa de tratamiento.

En la actualidad una de las técnicas mas utilizadas es aplicar un tornillo para lograr compresión interfragmentaria y conseguir cicatrización primaria de la fractura (7). Si bien, la aplicación de un clavo no produce compresión interfragmentaria, lo cual podría derivar en que no ase consiga total congruencia articular y complicaciones como mala unión o no unión, en el presente caso este tipo de complicaciones no se evidenciaron, y clínicamente durante la evaluación subjetiva de la marcha se observo evolución de claudicación severa (perdida de función) a no presencia de claudicación, lo que permite especular con que el tratamiento instaurado no las produjo.

claudication of the treated limb. No postsurgical complications appeared during the six weeks of clinical support. Four weeks after the removal of the wire, a satisfactory clinical recovery of the functionality of the limb was evidenced. The Robert Jones modified bandage was removed definitively at six weeks. The extension and bending angles of the affected joint were 150 and 40 degrees, and the angles of the contralateral joint were 154 and 30 degrees, respectively; in the x-rays, no compatible signs with osteoarthritis of the joint were found (Figure 3).

DISCUSSION

Although the main objective of the treatment of fractures in the humeral condyles is to restore the join surface and fixation and the stabilization of the condyle to the humeral dyaphisis (7), in cases

Figure 2. CRL x-ray that shows a closed reduction of the luxation and the lateral aspect fracture of the humeral condyle by a 2 mm Kischner wire, intercondylar until the medial aspect of the humeral condyle.

Figure 3. CRL x-ray that shows the elbow joint 4 weeks after the surgical treatment at the moment in which the Kischner wire was removed, even with the modified Robert Jones bandage still on for two more weeks.

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Aunque la RAFI se realiza para asegurar el alineamiento anatómico de la superficie articular, se ha reportado alta incidencia de complicaciones, que incluyen claudicación, osteoartritis, no unión, osteomielitis y pérdida del rango de movimiento, entre otros (9). Se reporta que entre el 28-57% de perros que fueron sometidos a reducción de fractura del cóndilo humeral tuvieron claudicación a largo plazo y pérdida de la función del miembro afectado (2).

El método tradicional de reducción de fracturas conocido como reconstrucción anatómica (10), ofrece desventajas con respecto a la osteosíntesis biológica, como tiempo de cirugía prolongado, requiere retracción excesiva y alteración del tejido blando circundante (11), lo cual no sólo limita el suministro sanguíneo extra óseo necesario para la formación del callo (10,12), sino que disminuye la transferencia de células mononucleares; lo que no sólo podría afectar el tiempo de cicatrización sino comprometer la resistencia a la infección y aumentar las posibilidades de contaminación bacteriana (10,12). A diferencia de los conceptos de osteosíntesis biológica (5), que incluyen fijación de fracturas sin alterar los tejidos blandos circundantes y el periostio (12), que entre otras ofrece ventajas como la preservación del potencial osteogénico del hematoma de la fractura (10,13), lo cual promueve la regeneración ósea y disminuye el tiempo de cicatrización y de convalecencia (10). En este caso ante la imposibilidad de realizar RAFI se optó por aplicar los conceptos de osteosíntesis biológica como alternativa de tratamiento.

Al no disponer de métodos cinéticos y/o cinemáticos, para medir objetivamente el grado de claudicación, se opto por realizar como indicador indirecto del grado de funcionalidad articular la goniometría, que ha sido utilizada ampliamente por ortopedistas y fisioterapeutas humanos para cuantificar los límites de los movimientos de las articulaciones, determinar el grado de pérdida de función, como ayuda diagnóstico, toma de decisiones terapéuticas y control pos tratamiento. En ortopedia canina, se ha utilizado la goniometría para evaluar la eficacia del tratamiento, en alteraciones que involucran enfermedades articulares y ha mostrado una gran confiabilidad (14). En este sentido, existen reportes de disminución de los ángulos de flexión y extensión de la articulación del codo en caninos sometidos a cirugía (7). Si bien, los valores reportados para los ángulos de flexión y extensión del codo oscilan alrededor de 20° y 170° respectivamente (15),

were an open reduction and internal fixation (RAFI) cannot be performed to allow a fast mobilization of the joint, the surgical treatment is counterproductive (8). In this case, since the RAFI treatment could not be preformed, a closed reduction and external immobilization was performed as an alternative treatment.

Currently, one of the most used techniques is to apply a screw to obtain interfragmentary compression and primary healing of the fracture (7). Although in this case the application of a wire does not produce interfragmentary compression, which could cause the nonoccurrence of joint congruence and even complications such as bad union or non union, in this case, no complications were evidenced during the evaluation period and clinically, during the subjective evaluation, there was an evolution from severe claudication (loss of function) to no claudication. This allows speculating that the performed treatment did not cause it.

Although RAFI is performed to ensure anatomic alignment of the joint surface, a high incidence of complications has been reported, including claudication, osteoarthritis, non-union, osteomyelitis and loss of movement range, among others (9). It is reported that between 28-57% of the dogs that were subjected to a reduction of the fracture of the humeral condyle, had long-term claudication and loss of the function of the affected limb (2).

The traditional method of reduction of fractures known as anatomic reconstruction (10), offers disadvantages with respect to biological osteosynthesis, such as prolonged surgery time, excessive retraction and alteration of the soft surrounding tissue (11). This not only limits the extra osseous blood supply necessary for the formation of the callus (10, 12), but it also reduces the transfer of mononuclear cells; which could not only affect the healing time but could also compromise the resistance to infection and increase the probabilities of bacteria contamination. Unlike the biological osteosynthesis concepts (5), which include the fixation of fractures without altering surrounding soft tissues and the periosteum (12), which among others, the treatment offers advantages such as the preservation of the potential osteogenic of the bruising of the fracture (10, 13), which promotes the osseous regeneration and reduces healing and recovery time (10). In this case, given the impossibility to perform RAFI, the biological osteosynthesis concepts were applied as alternative treatment.

Since no kinetic and/or kinematic methods were available to measure the objective degree of claudication, goniometry was used as an indirect indicator of the degree of joint functionality. This method has been widely used by orthopedics and physiotherapies on humans to quantify the limits



los valores encontrados en este caso para la articulación del codo afectada fueron de 40° y 150° en flexión y extensión, pero los valores de la articulación contralateral normal fueron de 38° y 154°, respectivamente. Lo cual indica que el paciente recuperó un rango de movilidad cercano a la normalidad, durante el tiempo de evaluación.

Si bien, el presente relato de caso presenta limitaciones respecto a ayudas diagnosticas, evaluación clínica objetiva y el tratamiento discierne de lo considerado como ideal, en un país con condiciones socioeconómicas como el nuestro donde no siempre se cuentan con las condiciones económicas, técnicas y logísticas ideales para el diagnóstico y tratamiento de ciertas afecciones, es importante ofrecer alternativas terapéuticas diferentes al curso natural impredecible de la enfermedad y mejorar el resultado final de la evolución de esta, posiblemente basadas en la masa corporal y actitud zootécnica del paciente, y limitantes técnicas y económicas.

Los resultados obtenidos en este caso, sugieren que la reducción cerrada de este tipo de fracturas y los procedimientos descritos en este caso clínico, podrían considerarse una alternativa para el tratamiento de este tipo de fracturas en perros de pequeño porte.

of joint movements, determine the degree of loss of function, as a diagnosis aid, to make therapeutic decisions and post treatment control. In canine orthopedist, goniometry has been used to evaluate the efficiency of the treatment in alterations involving joint diseases and it has shown great reliability (14). In this sense, there are reports about the reduction of flexibility and extension degrees of elbow joints in canines subjected to surgery (7). Even though the reported values for flexibility and extension degrees of the elbow range between 20° and 170° respectively (15), the estimated values for this case for elbow joint in flexibility and extension were 40° and 150° in flexibility and extension, but the normal contralateral joint values were of 38° and 154°, respectively. This indicates that the patient recovered a range of mobility close to normal during the evaluation period.

Even though this case presents limitations with respect to diagnostic aids, objective clinical evaluation and the treatment differs from the ideal treatment, in a country with socioeconomic conditions like ours were the ideal economic, technical and logistic conditions for the diagnosis and treatment of certain conditions are not always available, its important to offer therapeutic alternatives different from the natural course of the disease and improve the final result of this evolution, possibly based in body mass and zoo technical attitude of the patient and technical and economical limitations.

The results obtained in this case suggest that the closed reduction of this type of fractures in the procedures described in this clinical case could be considered as an alternative for the treatment of this type of fractures in small dogs.

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15. Millis D & Levine D. Appendix 2. Joint motion and ranges. 2nd edition. En: Canine rehabilitation and physical therapy. Philadelphia, PA: Elsevier. 2014


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Canine Leishmaniosis: tools for diagnosis in veterinary practice in Colombia

Leishmaniosis canina: herramientas para el diagnóstico en la consulta veterinaria en Colombia

Víctor Acero P,1* DMV, Perla Ángel B,2 DMV, Esther Fonseca B,3 DMV, Lluís Ferrer,4 Ph.D, Xavier Roura,5 Ph.D.

1Asociación Nacional de Médicos Veterinarios de Colombia (AMEVEC), Bogotá, Colombia. 2Clínica Protectora de Animales, Bogotá, Colombia. 3Clínica Veterinaria Animaux S.A.S., Bogotá, Colombia. 4Tufts Cummings School of Veterinary Medicine, Department of Clinical Sciences, 200 Westboro Road, North Grafton, Massachusetts, USA 01536. 5Universitat Autònoma de Barcelona, Hospital Clínic Veterinari, Bellaterra 08193, Barcelona, Spain. *Correspondencia: [email protected].

Received: March 2015; Accepted: June 2015.

ABSTRACT

The objective of this article is to perform a critical analysis and guide veterinarians in the management of canine Leishmaniosis. A systematic literature review was performed between 2005 and 2014 including scientific papers which take into account experiences and reports of: pathogenesis, diagnosis, clinical presentation, treatment, vaccination, prevention and control strategies. We discuss the different aspects of VL management and aspects that should be taken into account depending on the country, after a patient is suspected or confirmed as positive, including the possibility of euthanasia. We describe the different clinical manifestations of the disease, diagnosis, signs and treatment of canine leishmaniosis. Canine leishmaniosis is present in different parts of the country, therefore it must be considered as a possible differential diagnosis in the veterinary clinic, in patients with dermatological and systemic signs that are compatible with various diseases. In Colombia, the patients diagnosed with cutaneous leishmaniasis could be treated and have a favorable prognosis, whereas in canines with diagnosis of visceral leishmaniasis euthanasia should be considered because of the public health implications.

Key words: Diagnosis differential, leishmania, reservoirs, zoonoses (Source: DeSC).

RESUMEN

Se realiza un análisis crítico con el fin de orientar a los médicos veterinarios en el tema de Leishmaniosis canina. Se realizó una revisión de literatura a partir del año 2005 de manera sistemática considerando artículos científicos donde se tuvieran en cuenta experiencias y reportes de la patogenia, diagnóstico, presentación clínica de la enfermedad, tratamiento, la vacunación, el abordaje de los casos, estrategias de prevención y control y las consideraciones que se deben tener, según el país, ante la sospecha o confirmación de un paciente positivo, entre estos aspectos, la eutanasia. Se presentan las diferentes manifestaciones clínicas de la enfermedad, el diagnóstico, los signos y tratamiento de un paciente sospechoso para leishmaniosis canina, a manera de orientación para el profesional de la clínica veterinaria. La leishmaniosis canina se encuentra presente en diferentes partes del país, por lo que debe considerarse como posible diagnóstico diferencial en la clínica veterinaria, en pacientes con signos dermatológicos y sistémicos que son compatibles con diversas enfermedades. En Colombia, los pacientes diagnosticados con leishmaniosis cutánea podrían ser tratados y tener un pronóstico favorable, mientras que en los caninos con diagnóstico de leishmaniosis visceral debe considerarse la eutanasia por las implicaciones en salud pública.

Palabras clave: Diagnóstico diferencial, leishmania, reservorios, zoonosis (Fuentes: DeSc).

REVISIÓN DE LITERATURA



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INTRODUCCIÓN

La Leishmaniosis es una enfermedad transmitida por vectores a los seres humanos y animales. Es causada por parásitos protozoarios del género Leishmania. Los caninos son susceptibles de adquirir la forma visceral y la forma cutánea (L. braziliensis, L. panamensis) y son los principales reservorios de Leishmania infantum, el agente causal de la forma visceral en humanos. La leishmaniosis visceral canina es una infección crónica que puede llevar a los animales a la muerte. Es endémica en varios países de Latinoamérica, el Mediterráneo y África. Se constituye como un grave problema tanto de salud pública como para el médico veterinario. El pronóstico en los animales es peor que en los humanos, debido a las dificultades y a la ineficacia en el tratamiento, lo que deriva en la decisión de sacrificar los animales positivos, sobre todo en lugares donde es endémica, hay un alto número de casos humanos y poca disponibilidad de terapias alternativas (1).

Esta enfermedad es una de las principales zoonosis reconocidas a nivel mundial, con potencial fatal para seres humanos y animales y los caninos son el principal reservorio o fuente de infección para los humanos. En la clínica se manifiesta con un sin número de síntomas y grados de severidad. Actualmente no existe un consenso unificado acerca del manejo de la enfermedad (2).

La enfermedad se transmite a los mamíferos a través de la picadura de flebótomos hembra infectados de forma natural. La distribución geográfica de la leishmaniosis está limitada a la distribución de los vectores del género Lutzomyia, los cuales son responsables de la transmisión de la enfermedad en América y los del género Phlebotomus en el viejo mundo (Europa, Asia y África) (3). Existen tres formas principales de presentación: Cutánea (más común), Mucocutánea y Visceral (considerada la más grave y también conocida como kala-azar) (4). En Colombia, según el Instituto Nacional de Salud (INS), se ha venido observando un incremento en el número de casos de Leishmaniosis cutánea, enfermedad que es considerada endémica en casi todo el territorio nacional, exceptuando San Andrés Islas, Bogotá y Atlántico, y se cree que hay más de 10 millones de personas en riesgo de contraerla, considerándose como focos que coinciden con la distribución del vector los departamentos de Tolima, Huila, Cundinamarca, Bolívar, Córdoba, Sucre, Santander y Norte de Santander, entre otros (5).

Los protagonistas de la violencia armada en el país se encuentran ampliamente expuestos a la picadura de Lutzomyia, así como los militares que van a combatir en zonas rojas o territorios poco habitables. De igual manera, la presentación de la

INTRODUCTION

Leishmaniasis is a disease that is transmitted to human beings and animals by vectors. It is caused by protozoan parasites of the genus Leishmania. Canines are susceptible to acquire a visceral form and cutaneous form (L. braziliensis, L. panamensis) and are the main reservoir for Leishmania infantum, the causative agent of the visceral form in humans. The visceral canine leishmaniosis is a chronic infection that can cause death to animals. It is endemic in several countries in Latin America, the Mediterranean and Africa. It is considered as a severe problem both for public health as well as for the veterinary doctor. The prognosis in animals is worse than in humans due to the difficulties and to the inefficiency of the treatment, which leads to the decision to sacrifice positive animals. In endemic places there is a particularly high number of human cases and little availability of alternative therapies (1).

This disease is one of the main zoonotic diseases recognized at a global level, with a fatal prospective for human beings and animals. Canines are the main reservoir or source of infection for humans. At the hospital there are a number of symptoms and degrees of severity that appear. Currently there is a unified consensus about the management of the disease (2).

The disease is transmitted to mammals through female sand-fly bites naturally infected. The geographic distribution of leishmaniasis is limited to the distribution of the genus Lutzomyia vectors, which are responsible for the transmission of the disease in America and those of the genus Phlebotomus, which are responsible for the transmission of the disease in the old world (Europe, Asia and Africa) (3). There are three main types: Cutaneous (most common), Mucocutaneous and Visceral (considered the most severe, also known as kala-azar) (4). In Colombia, according to the National Health Institute (INS), there has been an increase in the number of cases of cutaneous Leishmaniasis, a disease that is considered endemic in almost all of the national territory, except San Andres Islands, Bogota and Atlantico. It is believed that there are more than 10 million people at risk of transmission, considering as sources those which coincide with the distribution of the vector in the departments of Tolima, Huila, Cundinamarca, Bolivar, Cordoba, Sucre, Santander and Norte of Santander and Norte de Santander, among others (5).

Players of the armed conflict in the country are widely exposed to the bite of Lutzomyia. Members of the armed forces that are deployed to red combat

Acero - Canine leishmaniosis: tools for diagnosis in Colombia


zones or uninhabited territories are also at high risk of exposure. Likewise, the type of disease depends on two key factors: the presence of the vector and the infected reservoirs (6). According to this statement, the members of the armed forces have all the risks factors, which are: movement through areas where the vectors are present and contact with main reservoirs, among them the most important, the dogs. Within the different reservoirs to the dog we can find: wild rodents, sloths, armadillos, forest mammals and some arboreal mammals, such as the opossum (Didelphis marsupialis). The most important are man, the dog and the opossum (7), although this depends on the parasite species involved and the natural source of the infection. In summary, in Colombia there are 3 epidemiological transmission cycles: jungle cycle, where men enter into jungle areas and are bitten by the vector (in the case of soldiers, armed conflict players, local pheasants, illegal crop sowers, deforesters, kidnapped, oil workers, etc.), a rural domestic cycle and an urban cycle. In these two cycles, the vector enters homes and can affect the entire family, especially children when the byte habitat starts in the late afternoon or night hours, like in the case of Lu. gomezi.

The parasite and the life cycle of the disease

There are two types of stages of causative parasites of Leishmaniasis: promastigotes, which present a flagellum that allows them to move inside the vector of the alimentary tract and the amastigote, which are intracellular and they multiply in the macrophages. The parasite completes the cycle in two hosts, the vector and the reservoir. Promastigotes mature in the alimentary tract of the vector and are then transmitted in their infective form to the reservoirs. These promastigotes are engulfed by macrophages and are transformed into amastigotes, later multiplying into other macrophages and migrating to various organs. This is how the disease can be transmitted in various ways (the canines being reservoirs): blood transfusions, vertical transmission and venereal transmission (2). It follows that those canines with high genetic value or high value for their training and performance in different activities (explosive-sniffing, drug-sniffing, breeders, other) and that are suspects or are positive, its reproduction must be stopped or avoided, and should not be used as blood donors because they may transmit the disease.

Nowadays, bytes of infected canines and the transmission through ticks and fleas are not considered as transmission mechanisms (2).

In a domestic environment, not only can canines be infected by parasites; there are other types of

enfermedad depende básicamente de dos factores claves: la presencia del vector y los reservorios infectados (6). Según este postulado, los miembros de las fuerzas armadas tienen todos los factores de riesgo presentes, los cuales son: circulación por zonas donde se encuentran los vectores y el contacto con los principales reservorios, entre ellos el más importante, el perro. Dentro de los reservorios diferentes al perro podemos encontrar: roedores silvestres, perezosos, armadillos, mamíferos de bosque y algunos arbóreos, como la zarigüeya (Didelphis marsupialis). Los más importantes son el hombre, el perro y la zarigüeya (7), aunque esto depende de la especie involucrada del parásito y del foco natural de infección. En resumen, en Colombia, se presentan 3 ciclos epidemiológicos de transmisión: el selvático, en el cual el hombre ingresa a zonas selváticas donde es picado por el vector (el caso de soldados, alzados en armas, campesinos, sembradores de cultivos ilícitos, deforestadores, secuestrados, trabajadores de oleoductos, etc), un ciclo domestico rural y un ciclo urbano. En estos dos ciclos el vector ingresa a las casas y puede afectar a toda la familia, especialmente a los niños cuando el hábito de picadura comienza en horas de la tarde-noche, como el caso de Lu. gomezi.

El parásito y el ciclo de vida de la enfermedad

Los parásitos causantes de la Leishmaniosis tienen dos tipos de estadios: los promastigotes, quienes presentan un flagelo que les permite movilizarse en el intestino del vector, y los amastigotes, los cuales son intracelulares y se multiplican en los macrófagos. El parásito completa el ciclo en dos huéspedes, el vector y los reservorios. Los promastigotes maduran en el intestino del vector y luego son transmitidos en su forma infectiva a los reservorios, estos promastigotes son fagocitados por macrófagos y se transforman en amastigotes, multiplicándose luego en otros macrófagos y migrando hacia diversos órganos. Es así como la enfermedad se puede transmitir de diversas maneras (siendo reservorios los caninos): transfusiones sanguíneas, transmisión vertical y transmisión venérea (2). De lo anterior se deriva que aquellos caninos de alto valor genético o de alto valor por su entrenamiento y rendimiento en diversas labores (antiexplosivos, antinarcóticos, jefe de raza, otros) y que sean sospechosos o sean positivos, debe evitarse su reproducción o evitar utilizarlos como donadores de sangre, ya que pueden transmitir la enfermedad.

Hoy en día, no son considerados mecanismos de transmisión las mordeduras de caninos infectados y la transmisión a través de garrapatas o pulgas (2).

En el ámbito doméstico, no solo los caninos pueden

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species that serve as food source for the vector, such as felines and equines as well as bovines and domestic birds. Other types of unconventional pets like rabbits, gerbils, hamsters, mice and lab rats are also susceptible of acquiring the disease (8). Leishmaniasis is not a significant disease in bovines. Some cases have been reported in equines as well as in sheep, goats and cattle in Africa, and one case in pork was reported in South America. Likewise, some antibodies have been reported in donkeys, cows, goats and pigs. Infected pigs and sheep have not developed the disease in experiments. 10 This does not mean that all types of species develop the disease or have some epidemiological importance in the transmission cycle. It means that they can be a food source for the vector. Epidemiologically and clinically, the importance lies in the canine as main reservoir.

Pathogenesis of the disease in the dog and the cat

After the byte of the phlebotominae, a complex immune reaction is triggered in the host. In order to repair the injured tissue, the proinflammatory cells such as nutrophile, macrophages and “killer cells” (NK) initially migrate. These cells are in charge of gobbling the majority of promastigotes in order to destroy them (9). Within the macrophages, which also gobble neutrophiles, a series of enzymatic reactions are triggered to destroy the parasite. Nevertheless, this is not always accomplished and, on the contrary, the amastigotes begin to multiply and break the membrane of the macrophage, scattering themselves through the blood and lymphatic vessels to the main organs and tissues. From that moment, a severe inflammatory chain is initiated because in the closest regional lymphatic gland, dentridic cells present parasite antigens to the Lymphocytes T “helpers (Th)” and to the cytotoxic Lymphocytes T (LTc), who will proliferate themselves and will differentiate in LTh1 producers of the Interferon (IFN-g) gamma or the LTh2 producers of cytokines (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13). These Th2 Lymphocytes promote the infection of more macrophages through the interaction of immunoglobulins and block the activation mechanisms of the macrophages. This makes the intracellular parasite to multiply. Th1 lymphocytes predominate in the initial stages when the immune response is cellular, when there are low antibody titers and it seems that the infection is controlled (self-limiting). In this stage, the dog is apparently healthy. Th2, predominate in the severe stage of the disease. There are high antibodies; the cellular immunity drops and there is a high population of parasites in the entire organism. Also, there is non-specific activation of all the humoral system, specially the Immunoglobulin G (IgG). In this reaction the aqueous humor may even be

verse infectados por el parásito, existen otras especies tales como felinos y equinos, y como fuente de alimentación para el vector pueden encontrarse bovinos y aves domésticas. Otro tipo de mascotas no convencionales como conejos, gerbos, hámsters, ratas y ratones de laboratorio, son susceptibles de adquirir la enfermedad (8). La leishmaniosis no es una enfermedad significativa en los bovinos, en los equinos se han reportado casos, igual en ovinos, cabras y ganado en África además de un caso de un porcino en Sudamérica. De igual manera se han reportado anticuerpos en burros, vacas y cabras y cerdos. Cerdos y ovejas infectados de forma experimental no han desarrollado la enfermedad. (10). Lo anterior no significa que todas estas especies desarrollen la enfermedad o tengan alguna importancia epidemiológica en el ciclo de transmisión, solo que pueden ser fuente de alimentación para el vector. Epidemiológicamente y clínicamente la importancia radica en el canino como principal reservorio.

Patogenia de la enfermedad en el perro y el gato

Posterior a la picadura del flebótomo, se desencadena una respuesta inmunológica compleja en el hospedero. Con el fin de reparar el tejido lesionado, inicialmente migran células proinflamatorias como neutrófilos, macrófagos y “células asesinas” (NK), quienes se encargan de fagocitar la mayoría de promastigotes para destruirlos (9). Dentro de los macrófagos, que también fagocitan neutrófilos, se generan una serie de reacciones enzimáticas con el fin de destruir el parásito, sin embargo, esto no siempre se logra y por el contrario, los amastigotes comienzan a multiplicarse y rompen la membrana del macrófago diseminándose por vía sanguínea y linfática a los principales órganos y tejidos . A partir de ese momento, inicia una cadena inflamatoria severa, ya que en el ganglio linfático regional más cercano, las células dendríticas presentan los antígenos del parásito a los Linfocitos T “ayudadores (Th)” y a los Linfocitos T citotóxicos (LTc), quienes van a proliferar y a diferenciarse en LTh1 productores de Interferón gamma (IFN-g) o a LTh2 productores de citoquinas (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13). Estos Linfocitos Th2 promueven la infección de más macrófagos a través de la interacción de inmunoglobulinas y bloquean los mecanismos de activación de los macrófagos, lo cual hace que el parásito intracelular se multiplique. Los linfocitos Th1, predominan en los estadios iniciales, cuando la respuesta inmune es celular, hay títulos bajos de anticuerpos y al parecer la infección está controlada (autolimitante). En este estadio el perro se encuentra aparentemente sano. Los Th2, predominan en el estadio severo de la enfermedad, hay anticuerpos elevados, decae la inmunidad celular y hay una alta población de



found in dogs with a specific anti-Leishmania IgG, confirmed through ELISA. This triggers a migration of complex Antigen-Antibodies that in some cases can cause uveitis.

Cats are more resistant than dogs probably because they have more cellular immunity, which acts at first contact with promastigotes. This is proven by most of the reported cases where more than 70% of the positive felines had their immune system compromised with pathologies such as: malignancy, retrovirus, etc. As with canines, cutaneous signs dominate. Even though there are no more than 40 to 50 cases reported in felines, and felines are considered an accidental host, it is important to consider at the clinic this species as a possible frequent host of the parasite, mainly when they come from endemic zones (11).

In the dog two patterns of immune presentation are described: patients were the cellular immune response dominates and there is a low production of antibodies (these patients are associated with the resolution of symptoms but they continue to be positive); and those patients where there is a high production of antibodies (IgG and IgE). These patients develop the disease progressively and show a variety of clinical symptomatology (12). A relevant aspect of the immune response in the disease is the formation of immune complexes in different organs of the animal, which is reflected in different clinical complications (interstitial pneumonia, uveitis, interstitial nephritis), which makes the treatment at the clinic more difficult.

Clinical presentation of the canine Leishmaniosis

The clinical signs as well as the symptomatology are very variable and they depend on the strain that infects the dog; if cutaneous (L. panamensis, L. braziliensis) or if visceral (L. infantum); the prognosis and the clinical presentation also depends on this. This disease affects animals of all breeds, ages and sex. Some dogs or some breeds seem to be more resistant to the development of the disease and only show a localized nodular reaction at the site of the byte. In other countries, only a percentage (10%) develops a clinical form. When developed, animals may present symptoms such as: local or generalized lymphadenopathy, diverse cutaneous injuries such as ulcers (in some cases similar to bedsores) (Figure 1), alopecia in some areas, splenomegaly (Figure 2), epistaxis, progressive wasting (even when the patient has not lost appetite or the food is of good quality), eye injury which result in most cases from reactions to hypersensitivity type IV (uveitis, conjunctivitis, keratoconjunctivitis, blepharitis) (Figure 3), renal insufficiency, diarrhea, hematuria, limps and

parásitos en todo el organismo. Asimismo, hay una activación inespecífica de todo el sistema humoral, especialmente de Inmunoglobulina G (IgG), reacción en la cual se puede inclusive encontrar en el humor acuoso de los perros una IgG específica anti-Leishmania, confirmada a través de ELISA, lo que desencadena una migración de complejos Antígeno-Anticuerpo, que en algunos casos puede producir uveítis.

Los gatos son más resistentes que los perros probablemente a que tienen una mejor inmunidad celular, la que actúa en el primer contacto con los promastigotes. Esto lo demuestran la mayoría de casos reportados, donde más del 70% de los felinos positivos tenían el sistema inmune comprometido, con patologías tales como: neoplasias, retrovirus, etc. Al igual que en los caninos predominan los signos cutáneos. Aunque existen no más de 40 a 50 casos reportados en felinos, y éste se consideraba un hospedador accidental, es importante considerar en la clínica a esta especie como un posible huésped frecuente del parásito sobre todo cuando provienen de zonas endémicas (11).

En el perro están descritos dos patrones de presentación inmune: pacientes en donde predomina la respuesta inmune celular y hay baja producción de anticuerpos (estos pacientes se asocian con resolución de síntomas pero siguen siendo positivos) y aquellos pacientes donde hay una alta producción de anticuerpos (IgG e IgE), estos pacientes desarrollan la enfermedad de manera progresiva y muestran una variada sintomatología clínica (12). Un aspecto relevante de la respuesta inmune en la enfermedad es la formación de complejos inmunes en diferentes órganos del animal, lo cual se ve reflejado en diferentes complicaciones clínicas (neumonía intersticial, uveítis, nefritis intersticial), lo cual hace más difícil aún el tratamiento en la clínica.

Presentación clínica de la Leishmaniosis canina

Los signos clínicos son muy variables, al igual que la sintomatología, y depende de la cepa con la que el perro se infecte; si es cutánea (L. panamensis, L. braziliensis) o visceral (L. infantum); de esto también depende el pronóstico y la presentación clínica. Esta enfermedad afecta a animales de todas las razas, edades y sexos. Algunos perros o algunas razas parecen ser resistentes al desarrollo de la enfermedad y sólo muestran una reacción nodular localizada en el lugar de la picadura del flebótomo. En otros países, solo un porcentaje (10%) desarrollan la forma clínica. Cuando ésta se desarrolla los animales pueden presentar síntomas tales como: linfadenopatía local o generalizada, diversas lesiones cutáneas como

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Figure 1. Ulcer in hind limb of patient with suspicion of visceral leishmaniasis.

Figure 2. Splenomegaly of canine with visceral leishmaniasis.

Figure 3. Ocular manifestations in canine with suspicion of visceral leishmaniasis.

úlceras (en algunos casos parecidas a úlceras por decúbito) (Figura 1), alopecia en algunas zonas, esplenomegalia (Figura 2) , epistaxis, emaciación progresiva (aun cuando el paciente no ha perdido el apetito o el alimento es de buena calidad), lesiones oculares resultado en la mayoría de las veces por reacciones de hipersensibilidad tipo IV (uveítis, conjuntivitis, queraconjuntivitis, blefaritis) (Figura 3), insuficiencia renal, diarrea, hematuria, cojeras y onicogrifosis (crecimiento exagerado y anormal de las uñas), temperatura normal en unos casos y fiebre en otros, atrofia muscular, diferentes tipos de dermatitis (exfoliativa, nodular, pustular). De igual manera se pueden presentar lesiones articulares como poliartritis. (13, 14). En algunos caninos machos, se pueden observar úlceras a nivel escrotal (Figura 4).

Las afecciones renales ocurren en casi todos los caninos infectados con el parásito. La enfermedad renal se puede presentar como glomerulonefritis (asociada a depósito de complejos inmunes), nefritis intersticial, síndrome nefrótico y progresar a insuficiencia renal crónica. En el hemograma pueden aparecer anormalidades en las plaquetas y anemia. En algunos casos la causa de la muerte puede ser la pérdida de sangre incontrolable, además de la posible eritrolísis inmunomediada (14). Es posible que algunos pacientes desarrollen otras complicaciones tales como la coagulación intravascular diseminada, asociado probablemente a las hemorragias, al consumo de plaquetas y factores de coagulación. Esta complicación no ocurre de manera primaria, suele venir precedida de otros trastornos o condiciones clínicas como sepsis y hemólisis, las cuales coinciden con pacientes infectados por el parásito (15).

La glomeruonefritis se desarrolla debido al depósito de inmunocomplejos en las paredes de los capilares glomerulares. Estos complejos inmunes causan proliferación de células glomerulares y engrosamiento de las paredes capilares, lo que morfológicamente se denomina hialinización y esclerosis glomerular. Estas lesiones irreversibles dañan la nefrona y a medida que avanza la enfermedad, se disminuye la filtración glomerular, lo que resulta en insuficiencia renal y azotemia. De todos los mecanismos que cursan con glomerulopatías progresivas, las inmunomediadas son las más importantes, aunque en los casos de leishmaniasis aún no está totalmente definida su fisiopatología (16). Los animales infectados por el parásito muestran una serie de manifestaciones clínicas compatibles con diversas enfermedades lo cual hace aún más difícil que el Médico Veterinario sospeche en un primer momento de una infección por Leishmania. Es por esto que los profesionales de



onychogryphosis (excessive and abnormal nail growth), normal temperature in some cases and fever in others, muscular atrophy, different types of dermatitis (exfoliative, nodular, pustular). Joint injuries such as polyarthritis can also be present. (13, 14). In some male canines, ulcers at the scrotal level can be observed (Figure 4).

Kidney failures occur in almost all canines infected with the parasite. Kidney failure can manifest itself as glomerulonephritis (associated with the deposit of immune complexes), interstitial nephritis, nephritic syndrome and can progress to chronic kidney failure. Abnormalities in the plaques and anemia can appear in the blood count. In some cases, the cause of death can be uncontrollable loss of blood as well as possible immune-mediated erythrolysis (14). Its possible that some patients develop other complications such as disseminated intravascular coagulation probably associated to the hemorrhages, platelet consumption and coagulation factors. This complication is not primary. The complication is usually preceded by other disorders or clinical conditions such as sepsis and hemolysis, which coincides in patients infected by the parasite (15).

Glomerulonephritis is developed due to the deposit of immune complexes in the glomerular capillary walls. These immune complexes cause the proliferation of glomerular cells and enlargement of the capillary walls, which is morphologically called hyalinization and glomerular sclerosis. These irreversible injuries cause damage to the nephrone and as the disease progresses, the glomerular filtration decreases, resulting in kidney failure and azotemia. Of all the mechanisms that cause progressive glomerulopathies, the immune-mediated are the most important; although in some cases of leishmaniasis, the pathophysiology has not been completely defined (16). Animals infected with the parasite show a series of clinical manifestations compatible with various diseases that make it more difficult for the Veterinary Doctor to suspect infection from Leishmania in a first instance. This is why the professionals at the veterinary clinic must consider the disease within the possible differential diagnoses when a patient from endemic areas of less than 2,000 meters above sea level arrives with the injuries described above.

The d iagnos is o f can ine v iscera l Leishmaniasis

When there is a suspicion that a canine has leishmaniasis, the basic tests are blood count, a biochemical hepatic or renal profile as well as

la clínica veterinaria deben tener en cuenta esta enfermedad dentro de los posibles diagnósticos diferenciales cuando les llegue un paciente proveniente de zonas endémicas, de menos de 2.200 metros sobre el nivel del mar, con lesiones como las descritas anteriormente.

El diagnóstico de la Leishmaniosis visceral canina

Cuando se sospecha de un canino con leishmaniosis, los exámenes básicos como un hemograma, un perfil bioquímico hepático o renal así como un urianálisis son de gran importancia para evaluar la condición del paciente y si ya existe algún grado de insuficiencia renal (17, 18).En el hemograma de un paciente con Leishmania se puede observar anemia normocít ica normocrómica no regenerativa y leucopenia en las formas graves; en los perfiles bioquímicos se puede evidenciar aumento de ALT y AST, en algunos casos, y con mayor frecuencia incremento de urea y creatinina. En el urianálisis se puede hallar proteinuria con presencia de cilindros en el sedimento, indicativo de glomerulonefritis (17,18).

Con el fin de conseguir muestras para observar el protozoo, pueden obtenerse punciones o impresiones de médula ósea (fundamentalmente en la costilla, el fémur y la cresta ilíaca, unión costo-condral o esternón), de ganglio linfático poplíteo (o cualquier otro ganglio que presente linfadenomegalia) o de la porción subcutánea de las lesiones o úlceras si corresponde a un caso sospechosos de presentar la forma cutánea. Se puede realizar una tinción de Giemsa. La presencia de un sólo amastigote en el interior de los macrófagos se considera diagnóstica de infección, por lo que esta prueba es muy rápida para conocer si el paciente es positivo. También se puede realizar la detección

Figure 4. Ulcer at the scrotal level of patient with suspicion of cutaneous leishmaniasis.

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a urinalysis, which are of great importance to evaluate the condition of the patient if there is already some degree of kidney failure (17, 18).In the blood count of a patient with Leishmania, normocytic normochromic non regenerative anemia and leukopenia in severe forms can be observed; in the biochemical profiles an increase in ALT and AST can be observed, and in some cases, and with more frequency, an increase in the urea and creatinine levels. In the urinalysis, proteinuria with presence of casts in the sediment can be found, which is indicative of glomerulonephritis (17,18).

In order to obtain samples to observe the protozoa, punctures or impressions of the bone marrow (mainly the rib, the femur and the iliac crest, the costochondral joint or the sternum), poplyteal lymph nodes (or any other node that presents lymphadenomegaly) or of a subcutaneous portion of the injuries or the ulcers if they correspond to a suspicious case of cutaneous form, can be collected. A Giemsa stain can be performed. The presence of only one amastigote inside the macrophages is considered a diagnosis of infection. Therefore, the test is very fast to know if the patient is positive. The detection of circulating anti-Leishmania antibodies can be performed (mainly IgG and specially IgG1 and IgG2) by means of serology. In dogs with leishmaniasis, the humoral response is very high, which causes a large production of IgGs. There are other methods for diagnosis that vary in sensibility and specificity such as immunohistochemistry, histopathology of affected tissue, PCR and ELISA. In general, PCR and other tests are used for the diagnosis and in order to identify the Leishmania strain that affects the dog, for the prognosis and to obtain epidemiological data from the zone where the patient comes from (19).

Also, there are culture media (NNN, amended Schneider´s, Senekjie’s two-phase media, media enriched with fetal serum or cell cultures of insects). These culture media, although specific, cannot be used for fast diagnosis and are used only for research to extend and determine the leishmania stain that was found. The sensitivity of culture media is approximately 68%, although it depends on if the stain is the cause of the visceral or cutaneous form (19, 20).

Cytology (lymph nodes, bone marrow) and staining are also fast and effective tools to identify positive dogs in cases where the patient shows evident clinical signs and signs compatible with the disease. Nevertheless, this tools is not efficient in dogs that live in endemic areas because many times the signs are diffuse and

de anticuerpos anti-Leishmania circulantes (principalmente IgG y especialmente IgG1 e IgG2) por medio de serología. En perros con leishmaniosis, la respuesta humoral es muy alta, lo que genera una gran producción de IgGs. Existen otros métodos diagnósticos que varían en sensibilidad y especificidad, la inmunohistoquímica, histopatología de tejidos afectados, PCR y ELISA. En general la PCR y otras pruebas se determinan para el diagnóstico y con el fin de identificar la cepa de Leishmania que afecta al perro, para el caso del pronóstico y de querer obtener datos epidemiológicos de la zona de donde proviene el paciente (19).

De igual manera existen medios de cultivo (NNN, Schneider´s modificado, Senekjie’s medio bifásico, medios enriquecidos con suero fetal o cultivos celulares de insectos). Estos medios de cultivo, aunque son específicos, no sirven para un diagnóstico rápido y se utilizan solamente para investigación, ampliar y determinar la cepa de leishmania encontrada. La sensibilidad de los medios de cultivo está alrededor del 68%, aunque depende si la cepa es causante de la forma visceral o cutánea (19, 20).

La citología (ganglios linfáticos, médula ósea) y tinción también es una herramienta rápida y eficaz para identificar los perros positivos, en aquellos casos en los cuales el paciente muestra signos clínicos evidentes y compatibles con la enfermedad. Sin embargo, esta herramienta no es eficaz en perros que viven en áreas endémicas ya que muchas veces los signos son difusos y no específicos. Es muy importante la interpretación de los signos para acercarse al estado real del paciente. Se proponen cuatro posibles interpretaciones de los resultados de las pruebas diagnósticas así:

Se define a un paciente con leishmaniosis activa cuando tiene tejidos dañados y la citología es positiva.

Si la citología es negativa, la serología es la herramienta a elegir para confirmar los títulos de anticuerpos.

En el caso de presentar lesiones cutáneas se debe realizar una biopsia cutánea. Aunque existan signos y la citología salga negativa, se recomienda inmunohistoquímica y PCR de tejido cutáneo.

Sin lesiones cutáneas pero con síntomas sistémicos compatibles con leishmaniosis, se recomienda realizar PCR para detectar el ADN del parásito, los tejidos podrían ser médula ósea o ganglios linfáticos.



are not specific. The interpretation of the signs is very important to get closer to the real state of the patient. Four possible interpretations of the results of the diagnostic tests are proposed as follows:

A patient with active leishmaniasis is defined when both damaged tissues and the cytology are positive.

If the cytology is negative, the serology is the tool to choose to confirm the antibody titers.

In the event that the patient has cutaneous injuries, a cutaneous biopsy must be preformed. Even if there are signs and the cytology is negative, immunohistochemistry and PCR of the cutaneous tissue are recommended.

Without cutaneous injuries but with compatible systemic symptoms with leishmaniasis, a PCR to detect the DNA of the parasite is recommended. The tissues could be bone marrow or lymph nodes.

Nevertheless, those suspicious patients that present low titers, must be monitored because the infection can be reactivated. Titers of low antibodies indicate prior contact with the parasite (21).

Treatment for canine Leishmaniasis

To initiate the treatment against Leishmaniasis, there must be in first place a confirmed diagnosis, since some of the drugs used for this therapy are highly nephrotoxic. The objectives of the treatment must be focused on the reduction of the parasite load, in the restoration of the efficiency of the immunologic system, in treating the damaged tissue, providing a clinical improvement and thus, improving the quality of life of the patient, and reducing the probability of transmission of the parasite (22).

The most common drugs used for the treatment of canine Leishmaniasis are meglumine antimoniate (Gucantime®), Allopurinol, Amphotericin B, Miltefosine or the combination of meglumine antinomate and allopurinol. Although today other drugs have also been used such as Enrofloxacin, Domperidone, Pentamidine and the combination of Spiramicyn-Metronidazole, until now and by unanimity of several groups of experts in canine leishmaniasis, the combination of meglumine antinomate (Glucantime®, dosage of 75-100 mg/kg/day via SC) + Allopurinol (10-20 mg/kg/day by mouth-during 6 months to 1 year) has been established as the most used and efficient protocol and is the treatment of choice for this disease (22,23).

Sin embargo, aquellos pacientes sospechosos, que presentan títulos bajos, deben ser monitoreados ya que la infección se puede reactivar. Títulos de anticuerpos bajos indican un contacto previo con el parásito (21).

Tratamiento de la Leishmaniosis canina

Para instaurar el tratamiento contra Leishmaniosis, en primer lugar se debe tener un diagnóstico confirmado, ya que algunos de los fármacos utilizados para esta terapéutica son altamente nefrotóxicos. Los objetivos del tratamiento deben ir enfocados a la reducción de la carga parasitaria, restaurar la eficiencia del sistema inmunológico, tratar el daño tisular, proveer mejoría clínica y por ende una mejor calidad de vida al paciente, disminuyendo la probabilidad de transmisión del parásito (22).

Los fármacos más utilizados para el tratamiento de Leishmaniosis canina son el Antimoniato de meglumina (Glucantime®), Alopurinol, Anfotericina B, Miltefosina, o la combinación de Antimoniato de meglumina y Alopurinol. Aunque hoy por hoy también se ha implementado el uso de otros fármacos como Enrofloxacina, Domperidona, Pentamidina y la combinación Espiramicina-Metronidazol, hasta ahora y por unanimidad de varios grupos de expertos en leishmaniosis canina, la combinación Antimoniato de meglumina (Glucantime®, a dosis de 75-100 mg/kg/día vía SC) + Alopurinol (10-20 mg/kg/día vía oral-por 6 meses a 1 año) se establece como el protocolo más empleado, eficaz y de elección en el tratamiento de esta enfermedad (22,23).

Es importante resaltar que en América, no se recomienda el tratamiento de caninos sospechosos o confirmados de leishmaniosis visceral debido a que: no se curan así clínicamente se vea mejoría de los signos clínicos, las recaídas son constantes, la cepa de Leishmania puede generar resistencia y el tratamiento no está disponible comercialmente. De igual manera es importante saber que existen evidencias que demuestran que pueden existir perros infectados y asintomáticos que pueden actuar como reservorios, con capacidad de infectar a los vectores, de ahí que la recomendación sea el sacrificio. Sin embargo, se exponen aquí los tratamientos disponibles según diversas referencias, lo cual no indica que esto sea lo indicado, por eso es importante el criterio del médico veterinario y el impacto en salud pública que pueda tener el canino sospechoso.

Los antimoniales pentavalentes menos tóxicos, operan como pro fármacos que, normalmente son reducidos hasta la forma más tóxica y eficaz (la

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Its important to highlight that in America, treatment of suspicious or confirmed canines with visceral leishmaniasis is not recommended because: they will not be cured even though they clinically show an improvement in the clinical signs, relapses are constant, the stain of Leishmania may become resistant and the treatment is not commercially available. Also, its important to know that there is evidence that shows that infected and asymptomatic dogs can exist that can act as reservoirs, with the capacity to infect the vectors. For such reason, slaughtering a dog is recommended. Nevertheless, the available treatments are described herein according to various references, but this does not mean that this is the right approach. This is why the criteria of the veterinary doctor and the impact to public health that the suspicious canine could have is important.

The least toxic pentavalent antimonias operate as prodrugs that normally are reduced to its most toxic and efficient form (the trivalent form), because they destroy the amastigotes in the phagolysosome of the macrophages. Recently, an enzyme capable of reducing the antimonials from pentavalent to trivalent reductase AsV was discovered. The presence of this enzyme in promastigotes, increases its sensitivity towards drugs. The trivalent form demonstrated a greater speed of distribution than the pentavalente form. This is due to its greater electrochemical reaction capacity. Trivalent antimonial has expressed affinity with the erythrocytes in which it is deposited for 24 to 48 hours and in macrophages it can be accumulated for at least three days, reducing the freely available antimony for excretion. Reports have been known that pentavalent antimonial has a fast distribution and slow elimination, while in trivalent antimonia, these characteristics increased and decreased very slowly (24).

Currently, promastigotes (depending on the stain of Leishmania) can offer resistance to the antimonial pentavalentes, which generates low reliability in the treatment. In some countries, this resistance can exceed 40% of the cases. One of the alternatives in the treatment is miltefosine, which has a prolonged average life expectancy, which at medium or long term could generate resistance. Perhaps the best option is a combination treatment (similar to the management of patients with malaria, tuberculosis or leprosy), in order to strengthen the effects of the medications, to include two or three action mechanisms, reduce the dosage to those which are more toxic, limit resistance and probably reduce costs. Miltefosine increases the activity of amphotericin B and meglumine antimoniate (25). First-line drugs are: meglumine antimoniate, allopurinol, a combination of these two and finally the anphotericin B. Second-line

forma trivalente), ya que destruyen los amastigotes en los fagolisosomas de los macrófagos. Hace poco, se descubrió una enzima capaz de reducir los antimoniales de pentavalente a trivalente, la reductasa de AsV. La presencia de esta enzima en los promastigotes, aumenta su sensibilidad hacia los fármacos. La forma trivalente demostró una mayor velocidad de distribución que la forma pentavalente, esto es por su mayor capacidad de reacción electroquímica. El antimonial trivalente ha expresado afinidad por los eritrocitos, en los cuales se deposita por 24 a 48 horas, y en los macrófagos se pueden acumular por al menos tres días, acortando el antimonio libre disponible para la excreción. Se ha reportado que el antimonial pentavalente tiene una rápida distribución y una lenta eliminación, mientras que con el antimonio trivalente estas características subieron y bajaron muy lentamente (24).

Actualmente los promastigotes (dependiendo de la cepa de Leishmania) pueden presentar resistencia a los antimoniales pentavalentes, lo que genera una baja confiabilidad en el tratamiento. En algunos países esta resistencia puede superar el 40% de los casos. Una de las alternativas en el tratamiento es la miltefosina, la cual tiene una vida media prolongada, lo cual también a mediano o largo plazo podría generar resistencia. Tal vez la mejor opción es un tratamiento combinado (similar al manejo de pacientes con malaria, tuberculosis o lepra), con el propósito de potenciar los efectos de los medicamentos, abarcar dos o tres mecanismos de acción, reducir la dosis de los que son más tóxicos, limitar la resistencia, y probablemente reducir costos. La miltefosina aumenta la actividad de anfotericina B y el antimoniato de meglumina (25). Los medicamentos de primera línea son: el antimoniato de meglumina, alopurinol, la combinación de los dos anteriores y por último la anfotericina B. Los de segunda línea son la aminosidina, pentamidina, metronidazol y enrofloxacina, metronidazol y espiramicina, miltefosina y ketoconazol (19).

El tratamiento de las úlceras de la piel con inyecciones locales de antimonio pentavalente podría convertirse en un enfoque razonable para disminuir el riesgo de infección humana en el entorno peri-domésticos, sin necesidad de sacrificar los perros infectados (en aquellos países donde está disponible el tratamiento). Estas lesiones sanan en un período de 2 a 6 semanas (26). Sin embargo, deben realizarse estudios que evidencien que este tratamiento disminuye realmente el riesgo de transmisión post-tratamiento.

Otro de los posibles tratamientos es la Miltefosina. El mecanismo de acción de la miltefosina como fármaco frente a la leishmaniosis se basa en su



drugs are aminosidine, pentamidine, metronidazole and enrofloxalin, metronidazole and spiramycin, miltefosine and ketoconazole (19).

Treatment of skin ulcers with local pentavalent antimony injections could become a reasonable approach to reduce the risk of human infection in the peridomestic environment, without the need of slaughtering the infected dogs (in those countries where the treatment is available). These injuries heal within a period of 2 to 6 weeks (26). Nevertheless, studies must be conducted to prove that this treatment really reduces the post-treatment risk of transmission.

Another possible treatment is Miltefosine. The mechanism of action of miltefosine as a drug to treat leishmaniasis is based on its action on phospholipids metabolic pathways of the parasite; miltefosine is a lipophilic and hydrophobic molecule and therefore is able to penetrate cell membranes and cause a fast metabolism of other phospholipids (18).

Miltefosine interrupts cell signaling pathways and the synthesis of cell membranes of the protozoa through different points of action: It inhibits the biosynthesis of GFI fixers (Glycosylphosphatidylinositol), mainly for the intracellular survival of amastigotes.

It alters the transduction of the signaling at the phospholipase C and protein kinase C specific levels of Leishmania, regulating and controlling its growth and cell differentiation.

It inhibits the biosynthesis of hosphatidylcholine, a molecule of the lipid bilayer of the cell membrane of the protozoa (18).

Due to various organs and tissues to where the Leishmania protozoa can travel to, it is recommended that the treatment last approximately 28 days to ensure the efficiency of the treatment and not cause resistance (18).

In current clinical veterinary practice, due to the restriction of these drugs, the implementation of the treatments is more difficult; therefore, alternatives should be explored. In Europe miltefosine exists for veterinary use (Milteforan®); nevertheless, this drug is not available in Colombia maybe because of the repercussions it could have due to the armed conflict and the indiscriminate use by third parties. The dosage is 2 mg/kg/day by mouth during 28 days combined with allopurinol to 10 mg/kg/day by mouth for 6 to 12 months.

One of the alternatives that could be used are medicinal plants since they respect the liver and kidney health and they have healing properties and

acción sobre las vías metabólicas fosfolipídicas del parásito; es una molécula lipofílica e hidrofóbica, y por ello es capaz de penetrar membranas celulares y causar el rápido metabolismo de éter-fosfolípidos (18).

La Miltefosina interrumpe las vías de señalización celular y la síntesis de la membrana celular del protozoo a través de distintos puntos de acción: Inhibe la biosíntesis de fijadores GFI (glicosil-fosfatidil-inositol), fundamental para la supervivencia intracelular de los amastigotes.

Altera la transducción de la señal a nivel de fosfolipasa C y proteinkinasa C específicas de la Leishmania, haciendo una regulación y control de su crecimiento y diferenciación celular.

Inhibe la biosíntesis de fosfatidilcolina, molécula de la bicapa lipídica de la membrana celular del protozoo (18).

Debido a los diversos órganos y tejidos a donde pueden llegar los protozoos de Leishmania, el tratamiento, se recomienda, que dure aproximadamente 28 días, para asegurar su eficacia y no generar resistencia (18).

En la práctica clínica veterinaria, por la restricción del uso de estos medicamentos, la implementación de los tratamientos se hace difícil, por lo que se deben buscar alternativas. En Europa la miltefosina existe en presentación de uso veterinario (Milteforan®), sin embargo ese medicamento no está disponible en Colombia tal vez por las repercusiones que pueda tener debido al conflicto armado y el uso indiscriminado por parte de terceras personas. La dosis es de 2 mg/kg/día por vía oral durante 28 días combinado con alopurinol a 10 mg/kg/día por vía oral durante 6 a 12 meses.

Una de las alternativas que se podrían utilizar son las plantas medicinales, ya que respetan la salud hepática y renal y a las cuales se les atribuye propiedades curativas y tienen fácil acceso, aunque no hay estudios en animales podrían ser una alternativa (27).

Otra alternativa en el tratamiento es la domperidona, la cual funciona como inmunomodulador en forma oral. Actualmente está disponible para el tratamiento y prevención de la Leishmaniasis en Europa y otros países (Leisguard®). La domperidona actúa como un antagonista de la dopamina, la cual promueve la liberación de serotonina, que estimula la producción de prolactina. Esta última promueve la respuesta inmune celular Th1, con las respectivas IL-2, IL-12, INF-γ y TNF, lo que lleva a la activación de los macrófagos y la muerte celular respectiva. Es un medicamento que tiene la ventaja de ser

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are easily available; although, there are no studies in animals, they could be an alternative (27).

Domperidone is another alternative in the treatment that works as an immunomodulatory in oral form. Currently, domperidone (Leisguard®) is available for the treatment and prevention of Leishmaniasis in Europe and other countries. Domperidone acts as an antagonist of dopamine, which promotes the release of serotonin that stimulates the production of prolactin. The later promotes a Th1 cell immune response with the respective IL-2, IL-12, INF-γ and TNF, which causes the activation of macrophages and the corresponding cell death. Domperidone is a drug that has the advantage that it is taken by mouth; it’s inexpensive and can be used in patients with kidney failure, which is one of the most common complications in the treatment of canines with leishmaniasis. In animals that have not been infected, the treatment can work as a preventive measure since it increases the phagocytic capacity of neutrophils and monocytes, thus increasing the resistance to the infection. The dosage is 0,5 mg/kg every 24 hours for 30 consecutive days during times when the activity of the vectors increases (in countries where the vectorial activity is seasonal) (28, 29); perhaps in tropical countries where there is abundance of vectorial activity during the whole year, a preventive treatment would need to be evaluated or other tools would need to be used.

The study demonstrated that domperidone makes the dog 7 times less susceptible to infection than in those canines that did not receive the treatment, while the vaccine makes them 4 times less susceptible. Likewise, domperidone proved to be efficient in the reduction of anti-leishmania antibodies during the first stages of the infection, thus possibly reducing the risk of deposit of immune complexes and controlling the subclinical infections (30).

In summary, it is important to consider the clinical classification according to the diagnosis in order to implement the treatment the correct way as follows:

Dogs that have been exposed or with subclinical infection: do not necessarily need therapy; they must be monitored and subject to serological testing.

Dogs with evident infection: therapy is carried out if there is an increase in antibody titers.

Sick dogs: need anti-leishmania therapy and support therapy if necessary

Dogs with serious disease: need anti-leishmania therapy and support therapy in case of kidney or liver failure

administrado vía oral, no es costoso y puede ser utilizado en pacientes con insuficiencia renal, que es una de las complicaciones más frecuentes en el tratamiento de caninos con leishmaniosis. En los animales no infectados puede funcionar como método preventivo ya que aumenta la capacidad fagocítica de los neutrófilos y los monocitos, aumentando así la resistencia a la infección. La dosis es de 0.5 mg/kg cada 24 horas por 30 días consecutivos, en las épocas donde se aumenta la actividad de los vectores (en países donde esta actividad vectorial es estacional) (28, 29), tal vez en países tropicales donde la abundancia vectorial es durante todo el año habría que evaluar la administración preventiva o hacer uso de otras herramientas.

En un estudio se demostró que el uso de domperidona hace al perro 7 veces menos susceptible a la infección que en aquellos caninos que no recibieron el tratamiento, mientras que la vacuna los hace 4 veces menos susceptibles. De igual manera la domperidona demostró ser eficaz en la reducción de anticuerpos antileishmania en los primeros estadios de la infección, reduciendo posiblemente el riesgo de depósito de complejos inmunes y controlando así infecciones subclínicas (30).

En síntesis, es importante considerar la clasificación clínica según el diagnóstico para poder implementar el tratamiento de la manera correcta así:

Perros expuestos o con infección subclínica: no necesariamente necesitan terapia, hay que monitorearlos y hacer evaluación serológica.

Perros con infección evidente: se realiza terapia si hay aumento en los títulos de anticuerpos.

Perros enfermos: necesitan terapia antileishmania y terapia de soporte si es necesario

Perros con enfermedad grave: necesitan terapia antileishmania y terapia de soporte en caso de insuficiencia renal o hepática

Perros que no responden al tratamiento o tuvieron una recaída: reevaluar la terapia, verificar si existe otra enfermedad concomitante, evaluar exámenes de laboratorio, considerar una cepa resistente a los antimoniales.

Un esquema terapéutico podría ser antimoniato de meglumina a dosis de 100mg/kg cada 24 horas SC por 4 semanas y el alopurinol a dosis de 10 mg/kg cada 12 horas por vía oral durante mínimo 6 meses a 1 año. Este protocolo puede mostrar una cura clínica hasta por un año, así mismo disminuye la cantidad de parásitos por varios meses, lo cual reduce el riesgo de transmisión del parásito a los vectores (21).



Dogs that do not respond to the treatment or had a relapse: reevaluate the therapy, verify if there is another parallel disease, evaluate lab tests, consider a stain resistant to antinomies

A therapeutic scheme could be a dosage of 100mg/kg every 24 hours SC for 4 weeks of meglumine antimoniate and a dosage of 10 mg/kg every 12 hours by mouth of allopurinol during at least 6 months to 1 year. This protocol can show a clinical cure of up to one year; also, the amount of parasites will be reduced for several months, which reduces the risk of transmission of the parasite to the vectors (21).

The vaccination in cases of Leishmania

In European countries, vaccination can be considered as an alternative method for prevention; nevertheless, in Colombia, there are no studies on the subject; additionally, the possibility of elaborating a vaccine from native stains of the tropics should be considered. The vaccines currently available are: Leishmune® (Fort Dodge), which was approved in 2003, contains an immunogen Fucose Mannose Ligand (FML), Leishmania donovani glycoprotein, associated with a coadjutant saponine based; Complexion® Leish, approved in 2007 and composed of the A2 Antigen (a specific recombinant protein of amastigote state from different types of Leishmania, also as a coadjutant spanning based; these vaccines are not effective in the protection of the disease and although both vaccines comply with the technical requirements for their registration and to be on the market, the need to differentiate between the natural infection due to L. infantum and the vaccine immune response through serological tests and to evaluate if the vaccines reduce the incidence of the infection and the disease in canines is necessary. Likewise, to obtain absolute results that the biologics are capable of blocking the cycle of the disease in the parasite’s transmission phase (31).

In 2014, a review of the efficiency of the prophylactic measures for canine leishmaniasis was conducted. 937 publications were included where all the prevention and control strategies against canine leishmaniasis were gathered, including vaccination, topical insecticides and preventive treatments. 12 of these documents were considered relevant to the vaccination subject. The main result to evaluate was the proportion of dogs infected with L. infantum, whether based on the serology or the detection of parasites, after the vaccination period; nevertheless, only 6 studies showed a significant protective effect based on the parameters mentioned above. In spite of these reports that

La vacunación en casos de Leishmania

La vacunación puede considerarse como una alternativa como método de prevención en países europeos, más sin embargo en Colombia no hay estudios respecto al tema; adicionalmente se debe considerar la posibilidad de elaborar una vacuna a partir de cepas nativas del trópico. Las vacunas actualmente disponibles como: Leishmune® (Fort Dodge), la cual fue aprobada en el año 2003, contiene un inmunógeno Ligando de Fucosa-Manosa (FML), glicoproteína de Leishmania donovani, asociado con un coadyuvante a base de saponina; Tec® Leish, aprobada en 2007 y compuesta por el Antígeno A2 (una proteína específica recombinante del estado amastigote de diferentes especies de Leishmania, también con un coadyuvante a base de saponina; no son eficaces en la protección de la enfermedad y aunque ambas vacunas cumplieron con los requisitos técnicos para su registro y para ser lanzadas al mercado, es necesario distinguir entre la infección natural por L. infantum y la respuesta inmune vacunal a través de pruebas serológicas, así como evaluar si las vacunas reducen la incidencia de la infección y de la enfermedad en los caninos. De la misma forma obtener resultados absolutos de que los biológicos son capaces de bloquear el ciclo de la enfermedad en la etapa de transmisión del parásito (31).

En el 2014 se realizó una revisión acerca de la eficacia de las medidas profilácticas para la leishmaniosis canina. Se incluyeron 937 publicaciones donde se reunieron todas las estrategias de prevención y control contra la leishmaniosis canina, incluyendo la vacunación, insecticidas tópicos y tratamientos preventivos, 12 de estos documentos se consideraron relevantes acerca del tema de la vacunación. El principal resultado a evaluar fue la proporción de perros infectados con L. infantum, ya sea basado en la serología o la detección de parásitos, luego de un período de vacunación, sin embargo, sólo 6 estudios mostraron un efecto protector significativo basado en los parámetros anteriores. A pesar de estos reportes disponibles, varios tienen deficiencias en su diseño metodológico, estadístico, diagnóstico y evaluación de la respuesta inmune. Por ejemplo, algunas de las vacunas disponibles provocan una respuesta humoral que, aún con los métodos actuales disponibles, no diferencia claramente entre infección activa y la vacunación. Algunos estudios apoyan el uso de la vacunación para prevenir la infección por L. infantum (Leishmune®, CaniLeish®), sin embargo, las deficiencias metodológicas de estos reportes sobre estas intervenciones deben tenerse en cuenta.

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are available, several have deficiencies in their methodological, statistical, diagnostics and evaluation design to the immune response. For example, some of the available vaccines provoke a humoral response that, even with the current available methods, does not clearly differentiate between the active infection and the vaccination. Some studies support the use of vaccination to prevent infection from L. infantum (Leishmune®, CaniLeish®); nevertheless, the methodological deficiencies of these reports about these interventions must be considered. Additionally, although these vaccines could have prevented the infection, they do not prove that they can prevent the later transmission of the infection or cure the infected patient (32).

Considerations about euthanasia

In Latin America, especially in Brazil and Argentina, euthanasia is currently considered as an alternative, even if there is a medical treatment available. Also, by informing the population about the disease and its variables, prevention and control strategies can be implemented in addition to informing the health authorities (33).

Nevertheless, the disease is not handled the same way in all countries. Some countries consider euthanasia as the best option in canines to avoid the installation and propagation of the disease in an area, especially in urban areas. Nevertheless, this type of strategy sometimes is enough as a method of prevention and control of canine Leishmaniasis (33, 34).

Failures in handling euthanasia as an eradication method are the non-acceptance of the method by the citizens, low sensibility to the diagnostic tests, late detection of the disease and replacement of the sacrificed canine by a susceptible one, that could even be a puppy. In this field, public, private, corporate and community interests of the State also have an influence. Labs and animal protection groups (protectionist) also have an influence one-way or the other in the decision making process with respect to the disease. The role of the veterinary doctor in this situation is very complex, because he also must participate in the decision making process of carrying out or not the euthanasia or the adequate treatment for the canine, if such treatment is available (34).

The migration of the population to urban centers bringing with them their belongings and their pets, makes the disease propagate even faster than expected. This will be reflected in an increase of the public health problem every day, in the sense that pets that are not infected are at high risk of

Adicionalmente, aunque estas vacunas pudieran prevenir la infección, no demuestran que puedan prevenir la transmisión posterior a la infección o curar al paciente infectado (32).

Consideraciones acerca de la eutanasia

En América Latina, y en especial en Brasil y Argentina, actualmente se considera la eutanasia como una alternativa, aunque pueda estar disponible el tratamiento médico. Además, informando a la población sobre la enfermedad y sus variables se pueden implementar estrategias de prevención y control, además de informar a la autoridad sanitaria (33).

No obstante, no en todos los países se maneja de la misma manera, en algunos consideran la eutanasia como la mejor opción en caninos para evitar la instalación y propagación de la enfermedad en una zona, principalmente urbana. Sin embargo, este tipo de estrategia muchas veces es insuficiente como método de prevención y control de la Leishmaniosis canina (33, 34).

Las fallas de manejar la eutanasia como un método de erradicación son la no aceptación por parte de la ciudadanía, baja sensibilidad de las pruebas diagnósticas, detección tardía de la enfermedad y el reemplazo del canino sacrificado por uno susceptible, que inclusive puede ser un cachorro. En este campo también influyen los intereses públicos, privados corporativos y comunitarios del Estado, laboratorios y animalistas (proteccionistas) influyen de una u otra manera en la toma de decisiones respecto a la enfermedad. El rol del médico veterinario en esta situación es bastante complejo ya que él también debe participar en la toma de decisiones frente a la realización o no de la eutanasia o del adecuado tratamiento para el canino si es que éste se encuentra disponible (34).

La migración de la población a cascos urbanos, trayendo con ellos sus enseres y sus mascotas hace que la enfermedad se propague aún más rápido de lo esperado, lo que se ve reflejado en que este problema de salud pública empeore cada día más, llevando a que mascotas que no se encuentran infectadas estén en un alto riesgo de contraer la enfermedad, para el caso de zonas urbanas donde se encuentre el vector (35).

Desafortunadamente en países en vía de desarrollo se enfocan en el sacrificio de los caninos independientemente de si tiene el efecto esperado o no, además que los entes territoriales no destinan dinero para el tratamiento en los perros. Es necesario tener en cuenta que también



getting the disease, for the case of urban centers where the vector can be found (35).

Unfortunately in developing countries the focus is in the slaughtering the canines regardless of the expected effect, in addition to the fact that territorial entities do not provide funding for the treatment in dogs. It is necessary to also consider that in some countries the state has prohibited the treatment of canines with drugs for human use, making its management more complex and therefore, forcing veterinary doctors and the health authorities to recommend and conduct euthanasia in infected patients. Epidemiology and social classes play a very important role in the decision making process with respect to the sick pet, since they consider the pet as another member of the family and therefore, will do everything possible to get the treatment and avoid losing it at all cost. This way, they exert pressure on the industry to keep looking for the most efficient treatment against Leismania, and also that the treatment be available to any person. Among these social classes it’s also important to remember that street dogs are a means for dissemination of the disease. But many of these street dogs are “adopted” by some persons or some neighborhoods that will prevent its slaughter, without any treatment being carried out (35).

A strategy to avoid euthanasia is to alert the population about the responsible care of pets, because when pets are not kept at all times at home and are left wandering in the rural or urban environment, there is a greater risk of transmission and proliferation of the disease in endemic zones. Another way is to use repellents, adequate nutrition and all the necessary measures that can maintain the a competent immune system of the dog, which, although it works in other countries, given the number of dogs infected with the visceral form somewhat dismiss these premises. (35).

Given the possibility of considering this option, there are several aspects to consider:

The animal: Considering that animals, as with humans, have the right not to suffer and that humans have a moral obligation of not inflicting unnecessary suffering, it will be necessary to evaluate the benefits of this treatment versus the benefits of euthanasia and the benefits of the absence of the transmission of the disease in the population.

Owners: must be conscious of hygiene rules and precautions that must be taken, the cost of the treatment if available, the probability of success

en algunos países el estado ha prohibido el tratamiento en caninos con medicamentos de uso humano, haciendo mucho más complejo su manejo y por ende obligando a los médicos veterinarios y a las autoridades sanitarias recomendar y realizar la eutanasia en pacientes infectados. La epidemiología y las clases sociales juegan un papel muy importante en cuanto a la toma de decisiones en torno a la mascota enferma, ya que la consideran como un miembro más de la familia y por ende harán lo posible por realizar un tratamiento y evitar a toda costa perderlo, de este modo presionan de algún modo a la industria para seguir buscando el tratamiento más eficaz contra la Leishmania, además de que sea un tratamiento que esté al alcance de cualquier persona. Dentro de estas clases sociales también es importante recordar que los perros callejeros son un medio de diseminación de la enfermedad, pero que muchos de estos son “adoptados” por algunas personas o algunos vecindarios impidiendo su sacrificio, sin que se les realice algún tipo de tratamiento (35).

Una estrategia para evitar la eutanasia es haciendo un llamado a la población sobre la tenencia responsable de mascotas, ya que al no tenerlas en casa todo el tiempo y dejándolas en el ambiente rural o urbano tienen un mayor riesgo de contagio y proliferación de la enfermedad en zonas endémicas, otra manera es la utilización de repelentes, una adecuada nutrición, y todas aquellas medidas que puedan mantener el sistema inmune del perro competente, lo cual, aunque funciona en otros países, también el número de casos de perros infectados con la forma visceral, desestima un poco estas premisas (35).

Ante la posibilidad de considerar esta opción, hay varios aspectos que se deben tener en cuenta:El animal: Teniendo en cuenta que los animales, como los humanos, tienen derecho a no sufrir y que los humanos tienen una obligación moral de no infligir un sufrimiento innecesario, será necesario evaluar los beneficios del tratamiento versus los beneficios de la eutanasia y los beneficios de la ausencia de la transmisión de la enfermedad en la población.

Los propietarios: deben ser conscientes de las normas de higiene y las precauciones que deben tomar, el costo del tratamiento si está disponible, la probabilidad del éxito del mismo, el uso o destino del animal si es posible la curación. El Médico Veterinario: deberá tener en cuenta la salud del animal, la relación con el propietario y la responsabilidad en la protección de la salud pública.

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of the treatment, the use or destination of the animal if a cure is possible. The Veterinary Doctor: must consider the health of the animal, the relationship with the owner and the responsibility in the protection of public health

Animal population: the potential of an epizootic outbreak in the population at risk must be considered.

Public Health: the risks for the human population (36).

In Colombia, the regulation regarding zoonotic diseases (Decree 2257 of 1986), in addition to being a mandatory the notification of a zoonotic disease, article 49 establishes the elimination by the health authorities of those animals that present a zoonotic disease, with or without owner, as the case may be. Also, chapter V of Law 84 of 1989 considers the slaughtering of animals in similar cases or situations such as those produced by leishmaniasis, like: incurable diseases, self-defense o defense of a third person (transmission of a disease to other persons) and in case of a threat to public health. Nevertheless, these criteria are to be considered and decided by the veterinary doctor responsible for the case.

What to do when faced with suspicious case?

If there is a suspicious patient with this disease at the veterinary clinic, some considerations must be noted: The possibility of an adequate diagnosis, the availability of the treatment, the zone where the canine comes from and the place where the canine lives or is destined to live, make the owners aware of the disease, the risks to the community and other animals. In Colombia, some simple techniques that have been described above can be conducted for the diagnosis or resort to research Centers or reference Centers that can carry out a proper diagnosis (INS, CIDEIM, PECET, for example). With respect to the treatment, its necessary to be conscious that the availability of treatment is little or none; therefore, some alternatives can be sought such as improve the patient’s immune system, nutrition and, definitely, inform the health authorities about the case if positive and avoid returning patient to endemic zones in light of the risk of being a source of parasites to the vectors. In figure 5 a scheme of the steps that could be followed if faced with a suspicious case can be observed.

La población animal: se debe considerar el potencial de presentarse una epizootia en la población a riesgo.

La Salud Pública: los riesgos para la población humana (36).

En Colombia, la normatividad en cuanto a zoonosis se refiere (Decreto 2257 de 1986), además de ser una zoonosis de notificación obligatoria, en el artículo 49 se plantea la eliminación por parte de las autoridades sanitarias de aquellos animales que presenten zoonosis, con o sin dueño, según sea el caso. De igual manera la Ley 84 de 1989, en su capítulo V considera el sacrificio de animales para casos o situaciones similares a las producidas por la leishmaniosis, tales como: enfermedades incurables, defensa propia o de un tercero (transmisión de la enfermedad a otras personas) y en caso de amenaza a la salud pública. Sin embargo, estos criterios quedan a disposición y decisión del médico veterinario responsable del caso.

¿Qué hacer ante un caso sospechoso?

Cuando en la clínica veterinaria se nos presenta un paciente sospechoso de esta enfermedad debemos tener algunas consideraciones. La posibilidad de un diagnóstico adecuado, la disponibilidad del tratamiento, la zona de donde proviene el canino y el lugar donde vive o va a ser destinado, sensibilizar a los propietarios acerca de la enfermedad, los riesgos a la comunidad y a los otros animales. En Colombia, para el diagnóstico se pueden realizar algunas técnicas sencillas descritas anteriormente o recurrir a Centros de investigación o Centros de referencia que puedan realizar el diagnóstico adecuadamente (INS, CIDEIM, PECET, por ejemplo). Con respecto al tratamiento hay que ser conscientes de que la disponibilidad es poca o nula, por lo que se podrían buscar algunas alternativas, mejorar la inmunidad del paciente, nutrición; y definitivamente, informar a la autoridad sanitaria acerca del caso si es positivo y evitar que el paciente regrese a zonas endémicas ante el riesgo de ser fuente de parásitos a los vectores. En la figura 5 se puede observar un esquema de los pasos que se podrían seguir ante un caso sospechoso.

Prevención y control

Debido a que en Colombia aún no se dispone de vacuna para prevenir la enfermedad y la posibilidad de realizar el tratamiento es muy baja, se pueden aplicar diversos métodos que actúan como barrera



Prevention and control

Considering that in Colombia a vaccine to prevent the disease is not yet available and the possibility of treatment is very low, several methods that act as a barrier between the vector and the host can be applied, such as: external use repellents (Advantix®), other repellents (chemical and natural), pyrethroids topical treatments, use of insecticides in kennels or canines, appropriate size barriers or nets treated with residual pyrethroids, mosquito nets, permethrin and deltramethrin based ectoparasiticides collars, such as the protective collar Scalibor®. Scalibor® protects animals for up to six months, is resistant to water and has a repellent action against sand-fly, ticks and fleas. Likewise, healthy and immunocompetent dogs with updated sanitary schemes and right nutrition are less susceptible.

In 2014, Willy et al (37), made a review about the efficiency of preventive measures such as the topical application of insecticides (colors, spot-on) and prophylactic drugs (domperidone, allopurinol). Generally, collars are made from deltametrine and spot-on formulas are made from permethrin or permethrin together with imidaclopride. One of the ways to measure the results was the difference in the proportion of dogs infected with L. infantum, whether based on the serology or the detection of parasites. It was shown that deltametrine collars have a protective effect, the same as spot-on formulations. Only

Figure 5. Proposed scheme for steps to follow when faced with a suspicious case of canine leishmaniasis.

entre el vector y el hospedero, tales como: pipetas repelentes de uso externo (Advantix®), otros repelentes (químicos o naturales), formulaciones tópicas a base de piretroides, uso de insecticidas en las perreras o caniles, barreras o redes del tamaño adecuado tratadas con piretroides residuales, toldillos, collares ectoparasiticidas a base de permetrina y deltrametrina, como por ejemplo el collar protector Scalibor®, el cual protege a los animales hasta por seis meses, es resistente al agua y posee acción repelente contra flebótomos, garrapatas y pulgas. De igual manera perros sanos, inmunocompetentes, con esquemas sanitarios al día y adecuada nutrición, son menos susceptibles.

Wylie et al (37) en 2014 realizaron una revisión acerca de la eficacia de las medidas preventivas tales como la aplicación tópica de insecticidas (collares, spot-on) y medicamentos profilácticos (domperidona, allopurinol). En general los collares están hechos a base de deltametrina y las formulaciones spot-on a base de permetrinas o permetrinas junto con imidacloprid. Una de las formas de medir los resultados fue la diferencia en la proporción de perros infectados con L. infantum, ya sea basado en la serología o en la detección de parásitos. Se evidenció que los collares a base de deltametrina tienen un efecto protector, al igual que las formulaciones en spot-on. Sólo uno de los tres estudios revisados sobre el uso de medicación profiláctica mostró un efecto estadísticamente significativo, con un efecto protector evidente con base en la domperidona. De igual manera, los

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one of three studies reviewed about the use of prophylactic medication showed a significant statistical effect, with an evident protective effect based on domperidone. Also, dogs that live in endemic zones are commonly treated with collars and spot-on formulations as complimentary measures. There are studies that support the use of control measures to prevent infection from L. infantum both in endemic zones as well as in non-endemic zones, mainly, collars based on deltametrine, permetrine 65%, 10% imidaclopride with 50% spot-on permetrine and domeperidone as a preventive drug.

Conclusions

Since Leishmaniasis is considered as a anthropozoonosis disease, it is very important to consider its effects to human health and animals in the geographic zone where it is present.

Diverse clinical forms of leishmaniasis present a serious problem to public health around the world. The World Health Organization (WHO), in its Tropical Disease Research, has classified leishmaniasis in category I as an emerging disease without control (7).

In Colombia, an increase of notified cases in the last five years reflects a considerable increase, which can be attributed to several factors, such as, the increase of human activities in wild areas where enzootic transmission exists, the adaptation of the vectors to new places and the urbanization of parasites in the cutaneous form (7).

In Colombia, decree 2257 of 1986 regulates diseases of the zoonotic type. Article 49 of such decree states that in areas with zoonosis problems transmitted by dogs, health authorities may restrict the animal population by individual or collective capture and sanitary elimination of such animals that do not have an owner. This is where the responsibility of veterinary doctors in the education of responsible pet ownership derives from. According to the above, this disease is of mandatory notification.

In Colombia, the veterinary clinic must differentiate cases of canines infected with visceral leishmaniasis (L. infantum) from cases of canines infected with cutaneous stains (L. panamensis, L. braziliensis). As recommended by the World Health Organization, treatment for cases compatible with visceral leishmaniasis is euthanasia since NO other treatment is available and the role that the canine has as a source of parasites to the vector, which is considered as a dangerous epidemiological situation (38). For cases of canines compatible with cutaneous stains

perros que viven en zonas endémicas se tratan comúnmente con collares y formulaciones spot-on como medidas complementarias. Hay estudios que apoyan el uso de medidas de control para prevenir la infección por L. infantum tanto en zonas endémicas como no endémicas, en particular, collares a base de deltametrina, permetrina 65%, 10% imidacloprid con un 50% permetrina en spot-on y la domperidona como medicamento de uso preventivo.

Conclusiones

Al considerarse una enfermedad antropozoonótica, es de gran relevancia tener en cuenta los efectos para la salud humana y animal en la zona geográfica donde se presenta.

Las diferentes formas clínicas de la leishmaniosis presentan un serio problema de salud pública en el mundo. La Organización Mundial de la Salud (OMS), en el Tropical Disease Research, han clasificado la leishmaniosis en la categoría I como una enfermedad emergente y sin control (7).

En Colombia el aumento de los casos notificados en los últimos cinco años refleja un aumento considerable, que se puede atribuir a diversos factores, entre ellos, al aumento de las actividades humanas en zonas silvestres en donde existe la transmisión enzoótica, la adaptación de los vectores en nuevos lugares, y la urbanización de la parasitosis en la forma cutánea (7).

En Colombia, existe el decreto 2257 de 1986, el cual regula las enfermedades de tipo zoonótico, en el cual se estipula en el artículo 49 que en áreas con problemas de zoonosis transmitidas por perros, las autoridades sanitarias podrán restringir la población animal, por medio de capturas individuales o colectivas y eliminación sanitaria de aquellos que se consideren que no tienen dueño, lo que deriva en la responsabilidad que tienen los médicos veterinarios en educar en tenencia responsable de mascotas. Según la norma anterior, esta enfermedad es de notificación obligatoria.

En Colombia, en la clínica veterinaria se deben diferenciar los casos de caninos infectados con leishmaniosis visceral (L. infantum) de los casos de caninos infectados con cepas cutáneas (L. panamensis, L. braziliensis), el tratamiento de los casos compatibles con leishmaniosis visceral es la eutanasia, debido a la NO disponibilidad del tratamiento y al papel que desempeña el canino como fuente de parásitos al vector, lo cual se considera una situación epidemiológica peligrosa, tal como lo recomienda la Organización Mundial de la Salud (38). Para el caso de caninos compatibles con cepas cutáneas el tratamiento es sintomático,



the treatment is symptomatic, thermotherapy in injuries (heat, nitrogen), increase of immunity, etc. Currently, the purpose of the research is the search for effective treatments for veterinary use that do not generate resistance and that replace the slaughtering of animals.

Acknowledgments

To the Center for Canine Training and Retraining (CERCA) of the School of Military Engineers (ESING), for figures 1, 3 and 4. To Dr. Bruno Travi, Depts. of Internal Medicine (Infectious Diseases), & Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch (UTMB); for his comments and for figure 2. To Dr, Martha Stella Ayala Sotelo, of the Parasitology Group of the National Institute of Health (INS) of Colombia, for her comments and recommendations. To Dr. Iván Darío Vélez, Study and Control of Tropical Diseases Program (PECET) of the University of Antioquia, for his comments and recommendations on the article.

termoterapia en las lesiones (calor, nitrógeno), aumentar la inmunidad, etc. Actualmente, es objeto de investigación, la búsqueda de tratamientos de uso veterinario, eficaces, que no provoquen resistencia y que reemplacen el sacrificio de los animales.

Agradecimientos

Al Centro de Entrenamiento y Reentrenamiento Canino (CERCA) de la Escuela de Ingenieros Militares (ESING), por las figuras 1, 3 y 4. Al Dr. Bruno Travi, Depts. of Internal Medicine (Infectious Diseases), & Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch (UTMB); por sus comentarios y la figura 2. A la Dra. Martha Stella Ayala Sotelo, del Grupo de Parasitología del Instituto Nacional de Salud (INS) de Colombia, por sus comentarios y recomendaciones. Al Dr. Iván Darío Vélez, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET) de la Universidad de Antioquia, por sus comentarios y recomendaciones al manuscrito.

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