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Research Collection

Doctoral Thesis

Genetische und physiologische Untersuchungen an femD-Mutanten in Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus

Author(s): Glanzmann, Philipp Johann

Publication Date: 1999

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-003825062

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Diss.ETHNr. 13252

Genetische und physiologische

Untersuchungen an/emD-Mutanten

in Methicillin-resistenten

Staphylococcus aureus

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN

der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

vorgelegt von

PHILIPP JOHANN GLANZMANN

Dipl. Natw. ETH

geboren am 6. Mai 1969

von Luzern

Angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. M. Teuber, Referent

Prof. Dr. B. Berger-Bäehi, Korreferentin

1999

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen iv

Zusammenfassung vi

Abstract viii

1. Einleitung 1

1.1. Staphylococcus aureus l

1.2. Ursprung und Entwicklung der Antibiotikaresistenz 2

1.3. Resistenzmechanismen 3

1.4. Entwicklung der Antibiotikaresistenz bei Staphylokokken 4

1.5. Aufbau der Zellwand und ihre Biosynthese 5

1.6. Die Methicillin-Resistenz: Penicillin-Bindeproteine und Wirkung der ß-Laktame 8

1.7. Die mec Determinante 10

1.8. Die,fem Faktoren (/actors essential for wethicillin resistance) 11

8.1. Das/emAß-System 12

8.2. Das/emC~System 13

8.3. DasfemD-System 14

8.4. DasfemE-System 14

8.5. Das/emF-System 14

1.9. Zusätzliche Methicillin-Resistenz beeinflussende Faktoren 15

1.10. Globale Regulatoren 15

1.11. Zielsetzung der Arbeit 18

2. Material & Methoden 19

2.1. Bakterien und Plasmide 19

2.2. Medien 19

2.3. Chemikalien und molekularbiologische Produkte 25

2.3.1. Synthetische Oligonukleotide 25

2.3.2. Restriktionsendonukleasen und DNA/RNA modifizierende Enzyme 25

2.3.3. Molekulare Grössen und Gewichtsmarker 25

2.4. Allgemeine molekularbiologische Methoden 26

2.5. DNA Isolierungsmethoden 26

2.5.1. Isolierung chromosomaler DNA aus S. aureus 26

2.5.2. Isolierung von Plasmid DNA 27

2.5.3. Isolierung von X Phagen DNA 27

2.5.4. Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarose Gel 27

2.6. RNA Isolierungsmethoden 2 8

2.7. Northern-und Southern-Analyse 28

Inhaltsverzeichnis il

2.7.1. Herstellung von DNA Sonden 28

2.7.2. Northern Blot 29

2.7.3. Southern Blot 29

2.7.4. Northern Hybridisierung 30

2.7.5. Southern Hybridisierung 30

2.8. Klonieren von glmM 31

2.9. Sequenzierungen 31

2.9.1. Nicht radioaktive Sequenzierung 31

2.9.2. Radioaktive Sequenzierung 31

2.10. PCR (Polymerase Chain Reaction) 32

2.11. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 32

2.12. Primer Extension 32

2.13. Herstellung eines transduzierenden Phagenlysats 34

2.14. Transduktion von S. aureus 34

2.15. Kompetente Zellen 35

2.15.1. Herstellung DMSO-kompetenter E. coli Zellen 35

2.15.2. Herstellung elektrokompetenter DH10B E. coli Zellen 35

2.15.3. Herstellung elektrokompetenter S. aureus RN4220 Zellen 35

2.16. Transformation 36

2.16.1. Transformation von DMSO-kompetenten E. coli Zellen 36

2.16.2. Transformation elektrokompetenter E. coli Zellen 36

2.16.3. Transformation elektrokompetenter S. aureus RN4220 36

2.17. Nachweis der Penicillin-Bindeproteine (PBP) 37

2.18. Western-Blot Analyse 37

2.19. Resistenzbestimmungen 3 8

2.20. Populationsanalysen 38

2.21. Autolyse 38

2.22. Wachstumskurven 39

3. Resultate 40

3.1. Das £/mM-System 40

3.1.1. Phänotypische Charakterisierung der Insertion Q12F glmM::Tn551 40

3.1.2. Das glmM Operon 48

3.1.3. Transkription der glmM Region 60

3.1.4. Komplementation der glmM Mutation 67

3.1.5. Wachstumsverhalten 72

3.1.6. Proteinanalysen 72

Inhaltsverzeichnis m

3.2. DasfmtB-System 78

3.2.1. Phänotypische Charakterisierung der Tn55i Insertion in fintB 80

3.2.2. Komplementation derfintB Mutation 8 3

3.2.3. Wachstumsverhalten 84

3.2.4. Transkription derfmtB Region 84

3.2.5. Proteinanalysen 89

3.3. Das femX-System (fmhB-System) 89

3.3.1. Identifizierung des fem Faktors femX (finhB) 89

3.3.2. Northern Blot 98

4. Diskussion 100

4.1. Die Phosphoglukosamin-Mutase GlmM 100

4.1.1. Sequenz des Phosphoglukosamin-Mutase Operons 101

4.1.2. Suppressor Mutante PG100 102

4.1.3. Transduktion von glmM::Tx\551 J 05

4.1.4. Komplementation der glmM Mutation 105

4.1.5. Proteine 107

4.2. Das/m^-System 107

4.2.1. Transduktion und Wirkung 107

4.2.2. FmtB Protein 109

4.2.3. Offene Fragen über den Effekt derfintB Inaktivation 109

4.3. Das/emX-System (/mfti?-System) 112

5. Literaturverzeichnis 113

6. Anhang 130

Lebenslauf 130

Publikationen 13 ]

Danksagung 132

Abkürzungen IV

Abkürzungen

A Adenin

Amp Ampicillin

dATP Deoxyadenosintriphosphat

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

C Cytosin

°c Grad Celsius

Cm Chloramphenicol

cm Zentimeter

cps counts per second

dCTP Deoxycytosmtriphosphat

DEPC Diethyl Pyrocarbonat

DNA Desoxyribonukleinsäure

Em Erythromycin

EtOH Ethanol

G Guanin

GlcNAc-1-P N-Acetylglukosamin-1 -Phosphat

h Stunde

kb Kilobasen

kcal Kilokalorien

LB Luria-Bertani

kDa kilo-Dalton

M Molar

Mcr Methicillin-resistent

Mcs Methicillin-empfindlich

min Minuten

mJ Millijoule

raM Millimolar

NAG N-Acetylglukosamin

Abkürzungen

NAM

NaOAc

nm

OD

Ox

ORFs

PCR

RNA

RT

RT-PCR

T

Tet

UDP

UV

UN

w/v

N-Acetylmuraminsäure

Natriumacetat

Nanometer

optische Dichte

Oxacillin

Open Reading Frames

Polymerasen-Kettenreaktion

Ribonukleinsäure

Raum Temperatur

Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion

Thymin

Tetracyclin

U

Ultraviolettes Licht

über Nacht

Gewicht pro Volumen

Zusammenfassung vi

Zusammenfassung

Die Methicillin-Resistenz in Staphylococcus aureus wird durch ein

zusätzliches Penicillin-bindendes Protein, das PBP2' (PBP2a), vermittelt.

Dieses PBP2' übernimmt die Transpeptidase-Funktion der anderen vier PBP,

wenn diese durch hohe ß-Laktam Konzentrationen inaktiviert werden. Dieses

zusätzlich PBP2' wird nur in Methicillin-resistenten S. aureus Stämmen

(MRSA) gefunden und wird durch das Strukturgen mecA kodiert, das sich auf

der mec Determinante befindet. Eine charakteristische Eigenschaft der mec-

bedingten Resistenz ist deren heterogene Expression, d.h. die meisten Zellen

einer MRSA Population exprimieren eine niedrige Basisresistenz, während

einige wenige Zellen hochresistent sind.

Neben PBP2' gibt es eine grosse Zahl chromosomaler Faktoren, die die

Methicillin-Resistenz beeinflussen. Diese Faktoren wurden mittels Transposon-

Insertionsinaktivierung mit Tn55I identifiziert und werden fem Faktoren

(factors essential for methicillin resistance) genannt. Im Gegensatz zur mec

Determinante kommen die fem Faktoren auch in Methicillin-empfindlichen S.

aureus Stämmen (MSSA) vor. Diese Faktoren sind direkt oder indirekt in den

Peptidoglykan-Metabolismus involviert und ihre Inaktivierung reduziert die

Methicillin-Resistenz. Einer dieser Faktoren ist das glmM, welches für eine

Phosphoglukosamin Mutase GlmM kodiert und ursprünglich als femD

bezeichnet wurde. Seine Inaktivierung führt zu einer generell erhöhten

Empfindlichkeit gegenüber ß-Laktamen, unabhängig davon ob es sich um einen

MRSA oder einen MSSA handelt. Weiter resultierte die glmM Inaktivierung in

einer Teicoplanin-Hyperempfindlichkeit. Trotz dieser erhöhten

Empfindlichkeit gegen ß-Laktame und Teicoplanin wurde die PBP2'

Produktion nicht beeinflusst. glmM ist Teil eines dreizistronischen Operons

orfJ-orß~glmM. Distal von orfl, als auch vor glmM konnte ein

Transkriptionsstart identifiziert werden, was zu einem dreizistronischen und

einem monozistronischen Transkript führte.

Zusammenfassung vu

Komplementation der g/mM-Mutation mit dem ganzen g/mM-Operon

stellte sowohl die Methicillin-Resistenz als auch die ursprüngliche Teicoplanin-

Empfindlichkeit wieder her. Wurde hingegen nur mit glmM komplementiert,

so konnte zwar die Methicillin-Resistenz wieder hergestellt werden, die

Teicoplanin-Hyperempfindlichkeit blieb jedoch bestehen.

Aus g/mM-Mutanten konnten hoch Methicillin-resistente Suppressor»

Mutanten durch Wachstum auf Methicillin selektioniert werden. Eine dieser

Suppressor Mutanten wurde genauer charakterisiert. Sie produzierte wie die

MethiciUin-empfindlich gewordenen g/mM-Mutanten keine

Phosphoglukosamin-Mutase mehr und war ebenfalls Teicoplanin

hyperempfindlich. Die Suppressor-Mutation war nicht mit der g/mM-Mutation

transduzierbar, korrelierte mit einer erniedrigten spontanen Autolyse und

zeigte eine erhöhte Produktion eines 49 kDa grossen Proteins. Daraus wurde

geschlossen, dass es in S. aureus einen alternativen Weg für die Glukosamin-1-

Phosphat Synthese geben muss.

Abstract vin

Abstract

Methicillin resistance in Staphylococcus aureus is due to the additional

penicillin-binding protein, PBP2' (PBP2a), which has a lower affinity for

methicillin than the endogenous four PBPs. PBP2' is encoded by the structural

gene mecA, has in vitro transpeptidase activity and is thought to substitute for

the functions of the PBPs when they are inactivated by high concentrations of

ß-lactams. Methicillin resistance levels are strain-specific and may vary from

very low to high values. Characteristic for methicillin-resistant S. aureus is the

heterogeneous expression of the resistance with the production of a

subpopulation of cells highly resistant to methicillin.

Besides mecA, there is a large number of chromosomal genes, initially

called fern factors, which are known to influence methicillin resistance levels.

These genes are involved, directly or indirectly, in peptidoglycan metabolism.

Any mutations that alter peptidoglycan precursor composition and/or -

formation reduce methicillin resistance. The phosphoglucosamine mutase

GlmM, initially identified as femD mutation catalyses the conversion of

glucosamine-6-phosphate to glucosamine-1-phosphate, which is an early

cytoplasmatic step in peptidoglycan biosynthesis.

glmM was shown to be the last gene of a three-cistronic Operon orfl-

orß-glmM, One transcriptional start was identified upstream of orf], and a

second transcriptional start producing a mono-cistronic transcript, upstream of

glmM. Disruption of glmM abolished GlmM production, decreased methicillin

resistance, and resulted in teicoplanin hypersusceptibility, without affecting the

production of the endogenous penicillin-binding proteins and PBP2'.

Complementation of the glmM mutation by the complete glmM Operon

restored both methicillin resistance and normal teicoplanin susceptibility. In

contrast, complementation with glmM only restored the methicillin resistance,

but the teicoplanin susceptibility remained low.

A highly methicillin-resistant suppressor mutant obtained by selection for

growth in presence of methicillin remained GlmM deficient and teicoplanin

Abstract ix

hypersusceptible. The inactivation of glmM can be overcome by a suppressor

mutation leading to high level methicillin resistance. The suppressor mutation

was not linked to the glmM Operon and correlated with decreased autolysis and

increased production of a 49 kDa protein suggesting that there is an alternative

pathway for glucosamine-1-phosphate synthesis in S. aureus.

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1. Staphylococcus aureus

Die Gattung der Staphylokokken wird in 30 Spezies und Subspezies

unterteilt. Staphylokokken sind grampositiv, unbeweglich, katalasepositiv,

fakultativ anaerob und können in einem bis zu 10% Kochsalz enthaltenden

Medium bei Temperaturen von 18 bis 42 °C wachsen. Sie sind kugelförmig mit

einem Durchmesser von 1 (im und ordnen sich in Haufen bzw. Trauben

(griechisch: staphylé) an, was auf die in verschiedenen Ebenen stattfindende

Zellteilung zurückzuführen ist. Die Pigmentierung ist variabel, sie reicht von

weiss bis goldgelb. Bei diesen Pigmenten handelt es sich um Karotinoide,

welche die Staphylokokken vor Licht und UV-Strahlen schützen (118).

Die grösste pathogène und klinisch bakteriologische Bedeutung kommt

der koagulasepositiven Spezies Staphylococcus aureus zu. Für den gesunden

Menschen stellt S. aureus, der bei ungefähr 30% der Bevölkerung

regelmässiger Bestandteil der Normalflora von Haut und Schleimhäuten ist,

keine Gefahr dar. Bei hospitalisierten und immunsupprimierten Patienten kann

S. aureus jedoch schwere Infektionen hervorrufen. Er gehört zusammen mit

Escherichia coli zu den häufigsten Erregern bakterieller Infekte beim

Menschen. Seine Pathogenität beruht auf einer Vielzahl von Virulenzfaktoren.

Dazu gehören Faktoren wie zum Beispiel die Fibrinogen-bindenden Proteine A

und B, welche es dem Bakterium ermöglichen an extrazelluläre Matrix zu

binden, oder die V8 Protease, die IgG schneidet und inaktiviert oder das

Protein A, welches die Opsonisierung durch Phagozyten behindert, oder die

verschiedenen Hämolysine, die die Invasion von Zellen erleichtern (91).

Die Krankheitsbilder reichen von kutanen Infektionen (Impetigo,

Furunkel), postoperativen und posttraumatischen Wundinfektionen bis hin zu

lebensgefährlichen, systemischen Krankheiten wie Sepsis, Endokarditis,

Pneumonie, toxisches Schocksyndrom oder Lebensmittelvergiftung (16).

Einleitung 2

1.2. Ursprung und Entwicklung der Antibiotikaresistenz

Substanzen, die für eine Behandlung von Infektionen zum Einsatz

kommen, fasst man unter dem Begriff Antiinfektiva zusammen. Neben den

synthetischen Chemotherapeutika gehören Antibiotika zu den wichtigsten und

am meisten verwendeten Antiinfektiva. Bei den Antibiotika handelt es sich um

Naturstoffe, die von Bakterien oder Pilzen produziert werden, die diese zur

Verteidigung ihres natürlichen Lebensraumes gegen andere Mikroorganismen,

die im gleichen Biotop leben, brauchen. Semisynthetische Antibiotika mit

einem erweiterten oder verändertem Wirkungsspektrum werden durch

chemische Modifikationen der Antibiotika erhalten.

Zahlreiche Antibiotika-Resistenzgene waren schon vor dem Einsatz von

Antibiotika in der Medizin als Teile des Antibiotika-Syntheseweges in

Antibiotikaproduzenten vorhanden oder sind in Bakterien entstanden, die mit

Antibiotikaproduzenten eng zusammenleben. Das bedeutet, dass viele

Resistenzdeterminanten bereits vor Millionen von Jahren in Mikroorganismen

entstanden sind.

Neben den in den Antibiotikaproduzenten vorkommenden natürlichen

Resistenzdeterminanten können auch Gene von empfindlichen

Mikroorganismen durch Mutation und Rekombination zu Resistenz führen.

Die horizontale Ausbreitung von Resistenzdeterminanten zwischen

Mikroorganismen erfolgt durch interzellulären Gentransfer mittels

Transformation, Transduktion oder Konjugation (52).

Unter Antibiotikadruck weisen resistente Varianten gegenüber

empfindlichen einen Vorteil auf, werden selektioniert und nehmen schliesslich

deren Platz ein. Der Einsatz von Antibiotika führt also einerseits zu einer

Selektion und Verbreitung von Resistenzgenen, die bereits existierten, und

andererseits zur Evolution neuer Resistenzen (16).

Einleitung 3

1.3. Resistenzmechanismen

Um sich der Wirkung der Antibiotika zu entziehen haben Bakterien

faszinierende Strategien erworben. Damit ein Antibiotikum überhaupt seine

Wirkung entfalten kann, muss es an den Wirkungsort gelangen. Um ins

Zellinnere zu gelangen kann das Antibiotikum die vom Bakterium zur

Verfügung gestellten Transportsysteme benutzen. Resistenz kann sowohl durch

eine veränderte Permeabilität der Zellmembran erworben werden, die das

Antibiotikum nur bedingt oder überhaupt nicht ins Zellinnere gelangen lässt,

als auch durch eine Erhöhung des Exports des Antibiotikums. Dabei werden

Antibiotika mittels einer in der Zytoplasmamembran liegender Effluxpumpe

aktiv von innen nach aussen gepumpt, wie zum Beispiel durch NorA, eine

Effluxpumpe für Norfloxacin und andere Chinolone in S. aureus (80).

Andere Resistenzmechanismen basieren auf inaktivierenden Enzymen,

die das Antibiotikum entweder abbauen oder modifizeren. Zu den abbauenden

Enzymen gehören unter anderem die ß-Laktamasen, welche den ß-Laktamring

der Penicilline hydrolysieren. Zu den modifizierenden Enzymen gehören

sowohl Chloramphenicol-Acetyltransferasen, die die freien Hydroxylgruppen

von Chloramphenicol acetylieren, als auch Aminoglykosid-modifizierende

Enzyme, welche Aminoglykoside entweder durch Phosphorylierung, oder

NukleotidyHerung freier Hydroxylgruppen oder durch Acetylierung freier

Aminogruppen wirkungslos machen (52).

Eine weitere Strategie, derer sich die Bakterien bedienen ist die

Veränderung des Zielmoleküls. Durch Mutation in einzelnen Genen werden

Proteine mit einer erniedrigten Affinität zu Antibiotika gebildet, wie zum

Beispiel Mutationen in der Topoisomerase und Gyrase, die zu Chinolon-

Resistenz oder Mutationen in der DNA-Polymerase, die zu Rifampicin-

Resistenz führen. Oder die Bakterien erwerben ein neues Gen, das für ein

Protein mit erniedrigter Affinität kodiert, wie zum Beispiel das mecA-Gen, das

für ein Penicillin-Bindeprotein (PBP) mit geringerer Affinität zu ß-Laktamen

als die zelleigenen PBPs kodiert. Zur gleichen Strategie kann auch die

Einleitung 4

Vancomycin-Resistenz (2) gezählt werden, die für Enzyme kodiert, die sowohl

den Abbau des empfindlichen Zielmoleküls, wie auch die Synthese eines neuen

resistenten Moleküls katalysieren.

1.4. Entwicklung der Antibiotikaresistenz bei Staphylokokken

Die antibakterielle Wirkung des Penicillins wurde vom englischen

Mikrobiologen Alexander Fleming im Jahre 1928 entdeckt (31). In den frühen

40er Jahren wurde Penicillin in den klinischen Gebrauch eingeführt. Damit

verbesserten sich zwar die Überlebenschancen eines mit Staphylokokken

infizierten Patienten, aber kurz nach Einführen des Therapeutikums konnten

schon die ersten Penicillin-resistenten klinischen S. aureus Isolate identifiziert

werden (4, 83). Ihre Resistenz beruhte auf der Produktion einer

plasmidkodierten ß-Laktamase, die sich horizontal mittels Bakteriophagen

rasch verbreitete. Heute sind weltweit 50-80% der klinischen S. aureus Isolate

gegen Penicillin resistent (69).

Parallel zur Weiterentwicklung der Antibiotika nahmen auch die

Resistenzen kontinuierlich zu. Kaum war Methicillin, das erste

semisynthetische ß-Laktamase-feste Penicillin, im Jahre 1959 in den klinischen

Gebrauch eingeführt worden, konnten kurze Zeit später auch schon die ersten

Methicillin-resistenten S. aureus Stämme (MRSA) identifiziert werden (5, 47).

Ursprünglich war ein einzelner Klon für die ersten weltweiten Epidemien von

MRSA verantwortlich (64). Inzwischen scheint sich die Methicillin-Resistenz in

verschiedenen weiteren klonalen Linien von S. aureus integriert zu haben (1,

77). Mittlerweile wurden in S. aureus an die 40 weitere Resistenzmechanismen

gegen praktisch alle klinisch relevanten Antibiotika identifiziert (102).

Die MRSA Stämme haben ein DNA-Element von 30-50 kb erworben,

das in eine spezifische Stelle ins Chromosom integriert und die Methicillin-

Resistenz-Determinante mec trägt. Diese vermittelt eine inhärente Resistenz

gegen alle ß-Laktame (11), einschliesslich gegen Cephalosporine und

Einleitung 5

Carbapeneme. Zudem begünstigt das DNA-Element die Integration von

weiteren, nicht verwandten Resistenzplasmiden und Transposons in das DNA-

Element, was zu Multiresistenz führt.

Multiresistente S. aureus Stämme haben in den letzten Jahren weltweit

stark zugenommen (19) und Vancomycin ist häufig das einzige, therapeutisch

noch wirksame Antibiotikum. Kürzlich wurden aber bereits die ersten

klinischen Isolate mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin

gefunden (42). Experimentell konnten ebenfalls durch schrittweise Erhöhung

der Vancomycin-Konzentration resistente Mutanten ausgehend von

empfindlichen Stämmen selektioniert werden (100). Es konnte sogar gezeigt

werden, dass unter Laborbedingungen Vancomycin-Resistenz (vanA) von

Enterokokken auf Staphylokokken übertragbar ist (82). Es scheint also nur

eine Frage der Zeit, bis auch Vancomycin bei einer S. aureus Infektion

wirkungslos sein wird. Daher ist es sehr wichtig, nach neuen Wegen und

Mitteln zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten zu suchen, wenn verhindert

werden soll, dass die moderne Medizin in die präantibiotische Zeit zurückfällt.

1.5. Aufbau der Zellwand und ihre Biosynthese

Die Zellwand von S. aureus ist ein halb-rigides, dynamisches

Makromolekül, das sich aus Peptidoglykan, auch Murein genannt, und kovalent

gebundenen Teichonsäuren und Proteinen zusammensetzt. Die Mureinschicht

kann bis zu 40 Peptidoglykanstränge dick sein und 50% des Zellwandgewichtes

betragen (35). Das Peptidoglykan besteht aus unverzweigten Glykansträngen,

die über kurze Peptide miteinander vernetzt sind (96). Aufgebaut sind diese

Glykanstränge aus alternierend ß-1,4 glykosidisch verbundenen Aminozuckern

dem N-Acetylglukosamin (NAG) und der N-Acetylmuraminsäure (NAM).

Glykanstränge erreichen im Durchschnitt eine Länge von 10

Disaccharideinheiten (99). Die Peptide, die die Glykanstränge untereinander

vernetzen, bestehen aus dem von der NAM ausgehenden Stammpeptid L~Ala-

Einleitung 6

iD-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala und der für S. aureus charakteristischen

Pentaglycinkette, die das Peptidoglykan zwischen der e-Aminogruppe des L-

Lys einer Mureineinheit und dem D-Ala der anderen unter Abspaltung des

letzten D-Ala Restes verbindet. Der Quervernetzungsgrad im Peptidteil des

Mureins erreicht bei S. aureus bis zu 90% (62).

Weiter kann das Kohlestoffatom C-6 der NAM mit Teichonsäuren

substituiert sein, die 20-50% der Zellwandmasse ausmachen können, oder mit

O-Acetylgruppen verbunden sein (96).

Die Biosynthese und der Einbau der Bausteine des Peptidoglykans in das

Zellwandgerüst lassen sich in drei lokale Abschnitte unterteilen und zwar in die

Biosyntheseschritte die im Zytoplasma, an der Zytoplasmamembran und in der

Zellwand stattfinden. Ausgehend von Glukosamin-6-Phosphat wird in

aufeinanderfolgenden enzymatischen Schritten UDP-N-Acetyl-Muraminsäure

(UDP-NAM) gebildet, an die schrittweise die fünf Aminosäuren des

Stammpeptids, L-Ala-iD-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala, synthetisiert werden (Fig.

1). Durch den Austausch von UDP gegen den C55-Lipidcarrier

Undekaprenylphosphat wird der Komplex, das Lipid 1, an die

Zytoplasmamembran gebunden. Dort wird zusammen mit UDP-NAG ein

Disaccharidpentapeptid, das Lipid II, gebildet. In den nächsten Schritten wird

die Pentaglycinseitenkette an das L-Lys des Stammpeptids synthetisiert. Im

dritten Biosyntheseabschnitt wird die membranständige Vorstufe, unter

Freisetzung des Membranankers Undekaprenyldiphosphat, durch die

Zytoplasmamembran nach aussen in den Bereich der Zellwand geschleust. Hier

erfolgt die Verknüpfung der Disaccharide mit dem Peptidoglykangerüst durch

Transglykosylierung und einer anschliessenden Quervernetzung des

Peptidanteils mittels Transpeptidasen. Dabei muss das endständige D-Ala

abgespalten werden, damit die freie Carboxylgruppe des anderen D-Ala mit

der Aminogruppe des endständigen Glycins der Pentaglycinkette verknüpft

werden kann (93).

Einleitung 7

Fruktose-6-P

NagB lÀGImSH<

Glukosamin-6-P

1 GlmM

Glukosamin-l-P

acetyl-CoA . GimU

.glul.

:etyl

I4Ac-

'-Mi

N-Acetylglukosamin-1 -P

UTP 1 GimU

UDP-N-Acetylglukosamin

MurZ

UÜP-GIcNAc-Enolpyruvat

MurB

UDP-MurNAc

MurC, D. E. F

Pentapeptid

UDP-MurNAc

C„-P •=> è MraY

Pentapeptid

C„-PP-MurNAc

UDP-GlcNAc => IMurG

Lipidl

IPentapeptid

C„-PP-MurNAe Lipidil

GlcNAc

I(Gh ),=t> w FmhBi FemAj FemB

Pentapeptid~~(Gly)s

C,,-PP-MurNAc

GlcNAc

C S-PP ^""X Transpeptidase. Fransglykosylase

Peptidoglykan

Figur 1: Zellwandhiosynthese in S. aureus, modifiziert naeh Höltje (44). NagB: Deaminase; GlmS:

Amidotraiisleiase; GlmM: Phosphoglukosamin-Mutase; GimU. bifunktionelles Enzym, Acetyltransferase

und UDP-Pyrophosphorylase; MmZ: Enolpyru\\l Transferase; MurB: Reduktase; MurCDEF:

Synthetasen, die die einzelnen AS übertragen ; MraY: Transferase; MurG: Transferase; FmhB, FemAB:

Bildung der Pentaglycinseitenkette.

Einleitung 8

1.6. Die Methicillin-Resistenz:

Penicillin-Bindeproteine und Wirkung der ß-Laktame

ß-Laktame und ihre Derivate bilden eine grosse Gruppe von sicheren

und effizienten Antibiotika. Sie sind gegen die letzten Schritte der

Zellwandbiosynthese gerichtet. Zu den ß-Laktamen gehört auch das

semisynthetische Methicillin (Fig. 2).

Der primäre Wirkungsort der ß-Laktame sind die sogenannten

Penicillin-Bindeproteine (PBP), die die letzten Schritte der Mureinbiosynthese,

die Transpeptidase Reaktion, katalysieren. PBP werden in allen Bakterien

nachgewiesen, die einen Mureinsacculus synthetisieren.

Alle Methicillin-empfindlichen S. aureus Stämme (MSSA) verfügen über

drei hochmolekulare PBP (PBP1-3) und ein niedermolekulares PBP (PBP4).

Im Gegensatz zu den bifunktionellen PBP von E. coli, die sowohl

Transpeptidase- als auch Transglykosylase-Aktivität besitzen, katalysieren die

PBP von S. aureus nur Transpeptidasereaktionen, während die

Transglykosylase-Aktivität auf einem separaten, nicht Penicillin-sensitiven

Enzym vorhanden ist (86). Die genaue physiologische Funktion der

Staphylokokken-PBP ist bis heute nicht geklärt, jedoch zeigt sich eine

unterschiedliche Bedeutung für die Zelle. Durch selektive Inaktivierung

einzelner PBP konnte nachgewiesen werden, dass PBP1 die Schlüsselrolle

zufällt. Hemmung von PBP1 führt zu einem Verlust des „Splitting Systems",

das an der Trennung der Tochterzellen beteiligt ist (8). Zudem ist PBP1

essentiell für das Zellwachstum (112). PBP2 wirkt als Transpeptidase und

katalysiert die Quervernetzimg von neu synthetisiertem Peptidoglykan mit der

bereits existierenden Zellwand, während PBP3 in die Septum-Bildung

involviert zu sein scheint (92). PBP4 schliesslich katalysiert eine sekundäre

Transpeptidase-Reaktion, die in die Quervernetzung des Peptidoglykans

involviert ist.

Die Wirkung der ß-Laktame ist stark konzentrationsabhängig und daher

ziemlich komplex. Niedere Konzentrationen hemmen das Zellwachstum,

Einleitung9

OCH3

CONH

COOH

Figur 2: Strukturformel des semisynthetischen ß-Laktamase-festenPenicillins Methicillin.

Einleitung 10

während höhere Konzentrationen, die der Minimalen Wachstums-Hemm-

Konzentration (MHK) entsprechen, zu einer Abnahme der Quervernetzung der

Zellwand und zu einer Hemmung der Bildung eines neuen Septums führen.

Zelltod wird bei solchen Konzentrationen durch Murosomen-induzierte

Perforation der Zellwand verursacht (63). Diese lokalisierte Perforation der

Zellwand wird am Ort des neuen Septums durch eine N-Acetylmuramyl-L-

Alanin-Amidase und eine endo-ß-N-Acetylglukosaminidase bewerkstelligt, die

durch das atl-Gen kodiert werden (107). Bei sehr hohen ß-Laktam-

Konzentrationen erleiden die Bakterien einen Tod, der nicht von schneller

Lyse begleitet wird (113).

1.7. Die mec Determinante

Methicillin war das erste semisynthetische ß-Laktamase-feste Penicillin,

das im lahre 1959 in den klinischen Gebrauch eingeführt wurde. Kurze Zeit

später konnten jedoch bereits die ersten Methicillin-resistenten S. aureus

Stämme (MRSA) identifiziert werden (5, 47).

Die intrinsische Methicillin-Resistenz bei MRSA-Stämmen ist durch die

Anwesenheit einer chromosomal lokalisierten mec Determinante bedingt. Sie

liegt auf einem zusätzlichen, mindestens 30 kb grossen Stück DNA (7), das in

Methicillin-empfindlichen S. aureus (MSSA) Stämmen nicht vorhanden ist

(104). Diese Determinante enthält neben den regulatorischen Elementen med

und mecRI das Strukturgen mecA, das für ein zusätzliches, hochmolekulares

PBP, genannt PBP2' oder PBP2a, kodiert (40). Dieses zusätzliche PBP wird in

allen MRSA-Stämmen gefunden und besitzt eine stark reduzierte Affinität zu

ß-Laktamen (18). In Anwesenheit hoher ß-Laktam-Konzentrationen

übernimmt PBP2' offenbar die Aufgabe der anderen PBP (62) und

funktioniert möglicherweise als Transpeptidase (34). Die Transkription von

mecA steht sowohl unter der Kontrolle seines eigenen Regulationssystems

mecRI-mecI als auch unter der des ß-Laktamase-Regulationssystems blaRI-blal

Einleitung 11

(94). med kodiert für den Repressor (97), während mecRI für den

transmembranen ß-Laktam Sensor-Transduktor kodiert, der aus einer ß~

Laktam erkennenden Domäne ausserhalb der bakteriellen Membran und einem

ins Zytoplasma hereinragenden Zink-Peptidase Motiv besteht (50). Vermutlich

aufgrund der Selektion durch ß-Laktame besitzen viele klinische MRSA Isolate

Punktmutationen oder Deletionen im med-Gen oder im mecA Operator, so

dass der Repressor nicht mehr an seine Zielsequenz binden kann. Als Folge

wird PBP2' konstitutiv synthetisiert (53, 108). Die Inaktivierung des

Repressors führt zwar in gewissen Stämmen aufgrund der Zunahme sowohl

der mecA Transkription als auch der PBP2' Produktion zu einem Anstieg der

Methicillin-Resistenz, doch scheint ein vollständiges mecI-mecRI und eine

intakte Operatorsequenz in anderen, genetisch unterschiedlichen Stämmen nur

einen geringen Effekt auf die mecA Transkription und die PBP2' Produktion

zu haben (81). Offenbar gibt es stammspezifische Unterschiede und es scheinen

einzelne Schritte im Regulationsnetzwerk der PBP2' Induktion noch nicht

bekannt zu sein.

Eine charakteristische Eigenschaft der raec-bedingten Resistenz der

MRSA-Stämme ist deren heterogene Expression (29). Die meisten Zellen einer

MRSA Population exprimieren eine niedrige Basisresistenz gegen Methicillin,

während einige wenige Zellen (eine in 104 bis 107) hochresistent sind. Die Höhe

der Resistenz und die Grösse der hochresistenten Subpopulation ist eine

stammspezifische, konstante Eigenschaft (51). Neben dem genetischen

Hintergrund eines jeden Stammes beeinflussen auch äussere Faktoren wie

Temperatur, pH, Osmolarität, Medium, Anaerobiose und Licht die Höhe der

Resistenz (73).

1.8. Ditfem Faktoren (/actors essential for methicillin resistance)

Aufgrund verschiedener Beobachtungen, dass die in der Zelle

vorhandene Menge PBP2' nicht direkt mit der Höhe der Methicillin-Resistenz

Einleitung 12

korreliert (20, 40, 76), wurden zusätzliche Faktoren für die Expression der

Methicillin-Resistenz verantwortlich gemacht (13). Diese Faktoren, die mittels

Transposon-Insertionsinaktivierung mit Tn55i identifiziert wurden, liegen auf

dem Chromosom, sind aber nicht mit der mec Determinante assoziiert (14, 24,

111). Sie werden fem (factors essential for methicillin resistance) (12) oder

aux (auxiliäre) Faktoren (109) genannt und kommen sowohl in MRSA- als

auch in MSSA-Stämmen vor. Die meisten dieser fem Faktoren beeinflussen

direkt oder indirekt den Zellwandmetabolismus (15).

1.8.1. Das femAB-System

Von allen bekannten fem Faktoren hat das femAB Operon den grössten

Einfluss auf die Methicillin-Resistenz. Seine Inaktivierung führt zu einer

Hyperempfindlichkeit gegenüber allen ß-Laktamen. Das femAB Operon liegt

auf dem Smoi Fragment A und entstand vermutlich aufgrund einer

Sequenzduplikation. Es kodiert für zwei in ihrer Aminosäurensequenz sehr

ähnliche Proteine von ungefähr 50 kDa, die 39% Identität und 70%

Ähnlichkeit aufweisen (12). Die Proteine FemA und FemB sind an der Bildung

der charakteristischen Pentaglycinseitenkette des Mureins beteiligt, wobei

FemA für das Anhängen der Glycine Gly2 - Gly3 (70) und FemB für die

Glycine Gly4 - Gly5 (41) verantwortlich ist. Trotz ihrer Sequenzähnlichkeiten

können sich FemA und FemB nicht gegenseitig komplementieren (27).

femA und femB Mutanten produzieren nur noch Mono- respektive

Triglycinseitenketten, wobei die femA Mutation zu einer Resistenz gegenüber

der Glycyl-Glycin Endopeptidase Lysostaphin führt. Dieser reduzierte

Glycingehalt hat einerseits eine erniedrigte Quervernetzung des Mureins und

andererseits verminderte Autolysinaktivität zur Folge (70). Weiter zeigen diese

Stämme eine gestörte Septumanordnung, eine verlangsamte Zelltrennung und

ein pseudomultizelluläres Erscheinungsbild (41). Der wichtigste Effekt der

Inaktivierung ist jedoch die Reduktion der Resistenz gegen Methicillin und

allen anderen ß-Laktamen bei MRSA-Stämmen, obwohl diese Stämme

Einleitung 13

weiterhin PBP2' exprimieren (10). Zudem zeigen femAB Mutanten auch

grössere Empfindlichkeit gegen ein ganzes Set anderer Antibiotika (67).

Von den Resultaten der kompletten Inaktivierung des femAB Operons,

die nur noch zu Monoglycinseitenketten führt, lässt sich neben FemA und

FemB ein zusätzlicher Faktor postulieren (105). Dieser dritte Faktor, vorläufig

FemX genannt, soll für den Einbau des Gly, verantwortlich sein (57). Da aber

eine femAB Mutation das Wachstum einer Zelle bereits sehr stark reduziert,

kann davon ausgegangen werden, dass eine Inaktivierung des postulierten

Faktors FemX wahrscheinlich letal ist.

Der charakteristische Aufbau der Pentaglycinseitenkette mit Hilfe der

Fem Faktoren spricht für eine räumlich kontrollierte Anordnung der

Reihenfolge dieser Faktoren FemX-FemA-FemB, ähnlich einem streng

geordneten Multienzymkomplex. Interessanterweise sind in S. aureus vier

verschiedene Glycyl-t-RNA gefunden worden. Eine dient der

Proteinbiosynthese, die drei weiteren der Mureinbiosynthese (37), die

zahlenmässig den drei Fem Faktoren X, A und B entsprechen.

1.8.2. Das femC-System

femC befindet sich ebenfalls auf dem chromosomalen Smal Fragment A,

ist jedoch nicht mit dem femAB Operon assoziiert (14), sondern ist mit thrB

kotransduzierbar (38). Durch eine Tn55i Insertion bedingte Inaktivierung von

glnR im Glutaminsynthetase (glnRA) Operon wird in femC Mutanten die

Transkription vom distalen glnA Gen, das für die Glutaminsynthetase kodiert,

herabgesetzt, was zu einem Mangel an Glutamin führt (38). Im weiteren zeigt

sich in der Mutante eine deutliche Reduktion des Amidierungsgrades der iso-D-

Glutaminsäure (iD-Glu) im Stammpeptid und eine geringere Quervernetzung

des Mureins (84, 93). Die Inaktivierung hat aber nur einen schwachen Effekt

auf die Ausprägung der Methicillin-Resistenz. Dabei ist nur die Grundresistenz

dieser Mutanten reduziert, die Resistenzhöhe der hochresistenten Subpopulation

bleibt annähernd erhalten (14). Die Methicillin-Resistenz (38) und die

Einleitung 14

Amidierung von iD-Glu (93) kann durch externe Zugabe von Glutamin ins

Medium wiederhergestellt werden.

1.8.3. Das femD-System

femD wurde mittels Tn55i Insertion identifiziert und liegt auf dem

chromosomalen Smal Fragment I (14). Die Inaktivierung von femD hat einen

ähnlich schwachen Effekt auf die Ausprägung der Methicillin-Resistenz wie die

Inaktivierung von femC, d.h. es wird ebenfalls nur die Grundresistenz

reduziert, während die Resistenzhöhe der hochresistenten Subpopulation

annähernd erhalten bleibt (14, 36). Neben einem verringerten Anteil von

Alanin anstelle von Glycin in der ersten Position der Seitenkette kann keine

weitere, signifikante Zellwandveränderung festgestellt werden (93).

Interessanterweise liegt femD, gleichbedeutend wie glmM (116), genau

auf dem chromosomalen Smal Fragment auf welchem Mutationen, die zu einer

erhöhten Resistenz gegen Teicoplanin führen (98), lokalisiert wurden.

1.8.4. Das femE-System

Bis heute ist sehr wenig über femE bekannt. Es befindet sich wie das

femAB Operon und femC auf dem chromosomalen Smal Fragment A. Die

Methicillin-Resistenz ist nur geringfügig herabgesetzt. Es kann auch keine

signifikante Zellwandveränderung in entsprechenden Mutanten festgestellt

werden (24).

1.8.5. Das femF-System

femF Mutanten haben eine beeinträchtigte Zellwandbiosynthese und zwar

kann in diesen Mutanten kein L-Lysin mehr an das Stammpeptid des Mureins

gehängt werden. Die Folge ist eine Akkumulation von Dipeptid-Peptidoglykan-

Einleitung 15

Vorstufen in der Zellwand (85). Das Gen ist auf dem Smal Fragment B

lokalisiert und wurde noch nicht eingehender untersucht.

1.9. Zusätzliche Methicillin-Resistenz beeinflussende Faktoren

Neben den erwähnten fem Faktoren gibt es noch weitere chromosomale

Faktoren, die die Methicillin-Resistenz beeinflussen.

Das Gen fmt kodiert für ein PBP-ähnliches Protein (54), das

möglicherweise in die Zellwandbiosynthese involviert ist oder als

Signaltransduktor fungiert.

Ein weiters Gen, das mittels Insertion inaktiviert wurde und dabei die

Methicillin-Resistenz reduziert, ist das //m-Gen, das für ein 38 kDa schweres

membrangebundenes Protein kodiert (71).

lytH war das erste Gen, bei dem gezeigt werden konnte, dass zwischen

der lytischen Aktivität und der Methicillin-Resistenz ein Zusammenhang

besteht (32). Inaktivierung von lytH führt zu einer hohen homogenen

Methicillin-Resistenz.

1.10. Globale Regulatoren

In S. aureus gibt es verschiedene chromosomal kodierte globale

Regulatoren, die die Ausprägung der Methicillin-Resistenz beeinflussen können

(Tab. 1). Dazu gehören unter anderem die Operons agr und sar, die beide

einen geringen Einfluss auf die Methicillin-Resistenz haben, wobei allerdings

noch unklar ist auf welche Art und Weise sie die Methicillin-Resistenz

beeinflussen (26). Bei agr handelt es sich um einen globalen Regulator, der die

Regulation der wachstumsabhängigen Exoprotein- und Zellwand-assoziierten

Proteinbiosynthese kontrolliert (88). Der agr-Lokus baut sich aus zwei

divergenten, von zwei verschiedenen Promotoren kontrollierten Operons auf.

Tabelle

1:Be

einf

luss

ungderMethicillinresistenzdurchchromosomaleFaktoren

Gen

Funktion

Referenz

Membran-

oderZellwand-assoziiertechromosomaleGene

fmt

PBP-ähnlichesProtein

Funktionunbekannt

(54)

php2

PBP2,Tr

ansp

eptida

se,Peptidoglykanbiosynthese

(89)

Um

lipophiles,membrangebundenes

Protein

Beei

nflu

ssun

gderau

toly

tisc

henAktivität

(71)

lytH

autolytische

Aktivität

(32)

GlobaleRegulatoren

sar,agr

sigB

Regu

lati

onderwachstumsabhängigenExoprotein-undzellwand-assoziierten

Proteinbiosynthe

se

Expression

vonGenen

inderstationärenWachstumsphaseundunterbestimmten

Stre

ssbe

ding

ungen

(26)

(117)

Tabelle

1:Fo

rtse

tzun

g.

InPe

ptid

oglykanvorläufersynthese

involviertechromosomaleGene

femX

postulierteGlycin

1Se

iten

kett

enbi

ldun

g(5

7)

femA

Glyc

in2-

Glyc

in3Se

iten

kett

enbi

ldun

g(1

2)

femB

Glycin4-Glycin5Se

iten

kett

enbi

ldun

g(4

1)

femC

(glnR)

Glut

amin

synt

hetase

Repressor

AmdierungdesiD-GlutamatdesStammpeptids

(38)

femD(glmM)

Phosphoglukosaminmutase,BildungdesPeptidoglykanvorlä

ufersGlukosamin-

1-Phosphat

(48)

femF

Lysinaddierender

SchrittbeiderStammpeptid-Bildung

(84)

Einleitung 18

Bei sar handelt es sich ebenfalls um einen globalen Regulator, der die

Expression von agr zu beeinflussen scheint (21).

Der Transkriptionsfaktor sigB reagiert auf Stresseinwirkung und die

Stationärphase (60). Es wurde gezeigt, dass eine Tn55i Insertion in sigB in

einem homogen resistenten MRSA die Methicillin-Resistenz herabsetzt (117).

Die Rolle der globalen Regulatoren sowie SigB bezüglich der Methicillin-

Resistenz wird noch genauer untersucht werden müssen.

Da äussere Faktoren wie Temperatur, Osmolarität, Nährmedien und pH

die Methicillin-Resistenz verändern können, muss die Expression der

Methicillin-Resistenz auch von Umweltsensoren abhängen (73).

1.11. Zielsetzung dieser Arbeit

Die Inaktivierung von glmM (-femD) mittels Tn551 erhöht die

Empfindlichkeit von allen S. aureus Stämmen gegenüber ß-Laktamen ob es

sich nun um einen mec Determinante tragenden MRSA, eine in vitro durch

Mutation und Selektion für Wachstum auf Methicillin erhaltene Methicillin-

resistente Mutante, oder einen MSSA handelt (14, 36). Herabgesetzt wird

gleichzeitig auch die Resistenz gegenüber den Glycopeptiden Vancomycin und

Teicoplanin, wobei vor allem die Empfindlichkeit gegenüber Teicoplanin

zunimmt (36).

Ausgehend von diesen Resultaten wurde das femD Gen kloniert,

sequenziert und charakterisiert.

Material & Methoden 19

2. Material & Methoden

2.1. Bakterien und Plasmide

Die Staphylococcus aureus- und E. co/i-Stämme sowie die Vektoren und

die rekombinanten Plasmide können den Tabellen 2, 3 und 4 entnommen

werden.

2.2. Medien

LB-Bouillon für Flüssigkulturen

LB-Agar für Platten

LB Softagar für Transduktionen

SOC-Medium

Müller-Hinton-Agar-Platten

20 g/1 LB Broth (Difco, Detroit, USA)

20 g/1 LB Broth

1.5% w/v Agar (Difco, Detroit, USA)

20 g/1 LB Broth

0.6% w/v Agar

20 g/1 Trypton (Difco, Detroit, USA)

5 g/1 Yeast Extract (Difco, Detroit, USA)

2.5 mM KCl

lOmMNaCl

lOmMMgCl,

10mMMgSO4

20 mM Glucose

21 g/1 Müller-Hinton Broth

(Difco, Detroit, USA)

Tabelle

2:Staphylococcus

aureusStämme

S.aureus

relevanterGenotyp

relevanterPh

änot

ypHerkunft,

Stämme

Bemerkungen

BB255

8325

ue

(13)

BB270

8325mec

Mcr

(13)

BB270AsigB

8325mec,AsigBOp

eron

Mcr,Tef

(61)

PG27

8325,

ClUFglmM::Tn55I

Mcs,Emr,kleine

Kolonien

dieseArbe

it;TransduktionvonQ12FglmM::Tn551von

BB591

inBB270

PG108

PG100

8325mec,

012FglmM::Tn551

8325mec,

Mcs,Em1

Mcr,Emr

dieseArbeit;TransduktionvonQ12FglmM::Tn551von

BB591

inBB270

dieseArbe

it;McrSu

ppre

ssor

MutantevonPG108

PG105

PG106

PG79

012FglmM::Tn551hmrDl

8325mec,

012Fg/mM::Tn55i

8325mec,

D.X2VglmM::ln551

8325mec,

Mcs,Emr

Mcs,Emr

Mcr,Emr,Tef

dieseArbeit;TransduktionvonQ12Fgl

mM::

Tri5

51von

PG100inBB270

dieseArbeit;TransduktionvonQ12Fgl

mM::

Tii5

51von

PG108

inCOL

dieseArbe

it;TransduktionvonPG108

PG231

Q12Fg/mM::TnJ5i;

8325mec,

pPG76

Mcr,Emf,Cm1

dieseArbeit;TransduktionvonPG108

PG232

Q12Fg/mM::Tn55i;

8325mec,

pHK4176

Mcr,Emr,Cm'

dieseArbeitTransduktionvonPG100

PG217

012Fg/mM::Tn557;

pHK4176

8325mec,

Q12Fg/mM::Tn55i;

hmrDl

pAW8

Mcs,Enf,Tef

dieseArbeit;TransduktionvonPG108

TO a.

EL

9p Ci Ero & a too

RN4220

PG77

PG78

BB1000

BBlOOOAs/gß

BB1163

BB1164

BB1165

BB1166

COL

COL-TS111

COL-TS111

pHK4357

COL-TS111

pHK4069

RN450

RN450-TS111

KSA8

Ha56

Ha57

8325-r"

8325-f

;pAW8

8325-r

;pPG76

Newman

Newman,AsigBOperon

$325Aa

grv.

tet

8325

Aagr

v.te

t,sar::7n917LTVl

8325mec,Aa

grv.

tet

8325mec,Aagrv.te

t,sar::Tn917LTVl

COL

COLfmtB::Tn551

Restriktion,

transformierbardurch

Elek

trop

orat

ion

Rest

rikt

ion"

;Tef

Rest

rikt

ion"

;Tef

Enf

Mc\Tef

Mcs,Tef,Emr

Mcr,Tef

Mcr,Tef,Em1

Mcr,Oxr

Me',Emr

COLfmtB::Tn551

;pHK4357

Ox\Emr,Cmr

COL

fintB:

:Tn55i

;pHK4069

Oxr,

Emr,Cm'

8325-4

8325-4frntBv.7n551

mec,fintBpartiel]

8325mec,

fmtB::Tn551

8325mec,

fmtB::7n551

Mcs

Mcs,Em'

Oxr,

Mcr

Mcs,Emr

McT,Emr

(59)

dieseArbeit;ElektroporationvonRN4220

dieseArbeit;ElektroporationvonRN4220

erhaltenvon

P.Vaudaux,Genf

(61)

(26)

(26)

(26)

(26)

(58)

COL

muta

genisiertmitTnJJ/

infintB;

erhaltenvon

Komatsuzawa

erhaltenvonKomatsuzawa




KlinischesIsolâtvonKomatsuzawa

dieseArbeit;TransduktionvonfintB::7n551

COL-TSlllinBB270

dieseAr

beit;TransduktionvonfmtB::Tn5'51

COL-TSlllinBB270

BB1395

8325mec,

Mc',Em'

dieseArbeit

;TransduktionvonfintB::7n551

fmtBv.7n551

COL-TSlllinBB270

BB1399

8325mec,

Mcs,Em'

dieseArbeit;TransduktionvonfintB::7n551

fmtBv.7n551

COL-TSlllinBB270

s. Rp

Cm',Chlo

ramphenicol-resistent;

Em',Er

ythromycin-resistent;Mc',Methiciliin-resistent;

Mcs,Methicillin-empfmdlich;Tef,Tetracyclin¬

resistent;

Ox',

Oxacillin-resistent.

o S

Tabelle

3:E.

coliStämmeundVektoren

E.coli

relevanterGenotyp

Herkunft

Stämme

Bemerkungen

DH5oc

supE44,AlacU169,FSOdlacZ,AMI5,hsdR17,

recAl,endAl,gyrA99,

thi-

1,relAl

Gibco,Basel,Schweiz

DH10B

F",mcrA,galKF,

rpsL,

(68),

A(mrr-hsdRMS-mcrBC)FSOdlacZ,AM15,

Stammzum

KlonierengrosserFragmente

AlacX74,deoR,recA,endAl,araD139,

A(ar

a,le

u)76

9,galU,nupG

CD

o 3

Vektor

Grösse

Phänotyp

Herkunft

Bemerkungen

pAW8

5.1kb

Tef

Wada,

unpublizie

rt,E.coli-S.aureus

shuttleVektor

pTZ18R

2.9kb

Ampr

USB

Corp

.,Cleveland,Ohio,USA

pUC18

2.69kb

Ampr

Boeh

ring

erMannheim,Schweiz

pLI50

5.266kb

Ampr,Cmr

(66);E.coli-S.aureus

shuttleVektor

pGC2

5.78kb

Ampr,Cmr

E.coli-S.aureus

shuttleVektor,

erhaltenvon

P.Matthews

Ampr,

Ampicillin-resistent;Cmr,Chloramphenicol-resistent;

Tef,

Tetracyclin-

resi

sten

t.

Tabelle4:

RekombinantePlasmide

rekombinante

Vektor,

Schnittstelle

Insertgrösse,Stamm,

Herkunft

Plasmide

Schn

itts

tell

e,Gene

Bemerkungen

pPG76

pAW8,

Pstl

5kb(BB270)

Pstl

,ar

gl-o

rfl-

orfl-glmM

dieseArbeit

pBBB106

pTZ18R,Xbal

10.5kb(BB591)XM,

JR(ai2Fg/mM;:Tn55/)

Gustafson,un

publ

izie

rt

pPGl.l

pUC18,Smal

4.1kb(BB270)£coRV

femX-orfl

dieseArbeit

pHK4176

pLI50

1.8kbPCR-FragmentmitglmM


pHK4069

pGC2,Xhal

8.9kb(KSA8)XbalFragment

mitfmtB


pHK4357

pGC2

7.8kbPCR-Fragment

ausCOL


Cmr,Chloramphenicol-resistent;

Emr,Er

ythr

omyc

in-r

esis

tent

;Mcr,

Methicil

iin-

resi

sten

t;Mcs,

Methicillin-

empfindlich;

Tef,

Tetr

acyc

lin-resistent;

Oxr,

Oxacillin-resistent;


2.3. Chemikalien und molekularbiologische Produkte

Die Chemikalien und Lösungsmittel wurden, wenn nicht speziell

angegeben, über die Firmen Fluka (Buchs, Schweiz), Sigma (Buchs, Schweiz)

oder BioRad (Glattbrugg, Schweiz) bestellt. Radiochemikalien wie a35S-dATP,

Y^P-dATP und a32P-dCTP wurden bei Amersham Life Science (Zürich,

Schweiz) bezogen.

2.3.1. Synthetische Oligonucleotide

Synthetische Oligonukleotide wurden durch Microsynth (Balgach,

Schweiz) hergestellt.

2.3.2. Restriktionsendonukleasen und DNA/RNA modifizierende

Enzyme

Restriktionsendonukleasen und DNA/RNA modifizierende Enzyme

wurden (wenn nicht speziell angegeben) bei den Firmen Boehringer Mannheim

(Rotkreuz, Schweiz), MBI Fermentas (Gebrüder Mächler AG, Basel, Schweiz)

oder Gibco Life Technologies (Basel, Schweiz) bezogen. Die AmplitaqGold

DNA Polymerase und die pfu Polymerase wurden bei Perkin Eimer (Rotkreuz,

Schweiz) bestellt. Die Sequenzierungskits wurden von Amersham Life Science

(Zürich, Schweiz) erhalten.

2.3.3. Molekulare Grössen und Gewichtsmarker

Der molekulare Grössenmarker für DNA (1 kb Plus DNA ladder) wurde

bei Gibco (Basel, Schweiz) bezogen. Der molekulare Grössenmarker für RNA

(RNA Molecular Weight Marker I, 0.3-7.4 kb) wurde von Boehringer

Mannheim (Rotkreuz, Schweiz) erhalten. Der vorgefärbte molekulare Protein-

Gewichtsmarker (Prestained SDS/PAGE Standards, low range) und der


molekulare Protein-Gewichtsmarker (SDS/PAGE Standards, broad range)

wurden bei Bio Rad (Glattbrugg, Schweiz) bestellt.

2.4. Allgemeine molekularbiologische Methoden

Alle grundlegenden molekularbiologischen Methoden wurden den

Protokollen von Ausubel et al. (3) und Maniatis et al. (72) entnommen.

2.5. DNA-Isolierungsmethoden

2.5.1. Isolierung chromosomaler DNA aus S. aureus

Das Pellet einer 30 ml ÜN-Kultur wurde in 3 ml Lysis-Mix (0.1 M Tris-

HCl, pH 7.5; 0.1 M EDTA; 0.15 M NaCl) mit 1 Ltg/ml Lysozym und 0.2 u.g/ml

Lysostaphin suspendiert und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Um vollständige

Lyse zu erreichen wurden anschliessend 0.3 ml 5% SDS in 50% EtOH

zugegeben, kurz gevortext und 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und 10 min Zentrifugation bei

40000g wurde die chromosomale DNA mit zwei Volumen EtOH versetzt, auf

einen Glasstab aufgespult, 2 x in 100% Ethanol gewaschen und in 1 ml TE

Puffer (0.01 M Tris-HCl, pH 8; 1 mM EDTA) über Nacht bei RT gelöst. Um

die RNA abzubauen wurden 0.5 q,g DNase-freie RNase dazugegeben.

Die DNA-Konzentration wurde mit einem Photospektrometer

(Amersham Pharmacia Biotech, Dübendorf, Schweiz) bei 260 nm bestimmt.


2.5.2. Isolierung von Plasmid DNA

Die Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli ÜN-Kulturen (25» 100ml)

erfolgte unter Verwendung des QIAGEN Midiprep/Maxiprep Systems

(QIAGEN, Basel, Schweiz) nach Anleitung des Herstellers.

2.5.3. Isolierung von X Phagen DNA

X Phagen DNA wurde wie durch Patterson und Dean (87) beschrieben

isoliert.

2.5.4. Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarose Gel

Mit einem Restriktionsenzym verdaute chromosomale DNA wurde über

ein 0.8% präparatives Agarose Gel (Low Melt Agarose, Sigma, Buchs,

Schweiz) bei (2.6 V/cm) nach Bandengrösse aufgetrennt. Der entsprechende

Bandenbereich wurde mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten und die DNA

enthaltende Agarose in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben. Dieses Eppendorf-

Röhrchen wurde anschliessend für 2 min in Trockeneis/EtOH

schocktiefgefroren und dann für 10 min bei 16000g abzentrifugiert. Der

erhaltene Überstand wurde in ein separates Eppendorf überführt und die

verbleibende Agarose erneut schocktiefgefroren und zentrifugiert. Der

Überstand wurde gesammelt und zur restlichen Agarose 100 Lil TE-Puffer

hinzugefügt. Die Agarose wurde an der Eppendorfwand zerquetscht und von

neuem schocktiefgefroren und zentrifugiert.

Die gesamten gesammelten Überstände wurde dann erst mit einem

Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und anschliessend mit einem

Volumen Chloroform extrahiert. Zum resultierenden Überstand wurden 1/10

Volumen 3 M Natrium-Acetat pH 4.8 und zwei Volumen Ethanol zugegeben,

gut gemischt, für 10 min auf Eis gefällt und abzentrifugiert. Nach Waschen mit

80% Ethanol und Trocknen wurde die DNA in 0.1 x TE aufgenommen.


2.6. RNA-Isolierungsmethoden

50-100 ml LB-Medium mit oder ohne Antibiotikum wurden mit 1/100

Volumen einer S. aureus ÜN-Kultur angeimpft. Bei 37 °C wurde diese

Hauptkultur bis zur gewünschten OD600 wachsen gelassen. Wenn die Zellen mit

EtOH gestresst werden sollten, wurde nach Erreichen einer OD600 von 0.3 6%

v/v 100% EtOH zugegeben und die Zellen daraufhin bis zu einer OD600 von 0.6

wachsen gelassen. 35 ml wurden für 5 min bei 11000g zentrifugiert, das Pellet

in 500 Ltl kaltem TKM-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 10 mM KCl; 5 mM

MgCl2) resuspendiert und nach Zugabe von 10 ul Lysozym (10 mg/ml) und 10

}il Lysostaphin (10 mg/ml) bis zur sichtbaren Lyse bei 37 °C unter Schütteln

inkubiert. Unmittelbar nach der Lyse wurde die Suspension in

Trockeneis/EtOH schocktiefgefroren und bis zur Weiterverarbeitung bei -80

°C aufbewahrt.

Das Lysat wurde bei 65 °C für 1 min aufgetaut, bevor es mit je 40 pl

20% SDS und 3 M NaOAc (pH 5.2) und mit 600 jLtl saurem auf 65 °C

erwärmten Phenol vermischt und kräftig gevortext wurde. Nach 4 min

Inkubation bei 65 °C wurde erneut gevortext und anschliessend abzentrifugiert.

Nach Wiederholung der Extraktion mit saurem Phenol folgte eine

herkömmliche Phenol/Chloroform Extraktion, gefolgt von einer Chloroform

Extraktion. Die Fällung erfolgte mit 2 Volumen 100% EtOH während 30 min

bei -20 °C. Schliesslich wurde die RNA einmal mit 80% EtOH gewaschen, in

50-100 ml DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert und die Konzentration im

Photospektrometer gemessen.

2.7. Northern- und Southern-Analyse

2.7.1. Herstellung von DNA Sonden

Die Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden erfolgte unter

Verwendung des Random Primed DNA Labeling Kits (Boehringer Mannheim).


9 pT DNA (30-100 ng) wurde für 5 min bei 95 °C denaturiert und sofort

eisgekühlt. In einem 20 p.1 Ansatz wurde die DNA mit 2 \il Reaktionsmix, 3 pl

Nukleotidmix (0.5 M dATP; 0.5 M dGTP; 0.5 M dTTP), 0.5 units Klenow-

Fragment und 5 p.1 a32P-dCTP (50 pCi) für 30 min bei 37 °C inkubiert und

von nicht eingebauten Nukleotiden über eine G-50-Sepharose-Säule

(Boehringer Mannheim) abgetrennt. Vor Zugabe zum Hybridisierungs-Mix

wurde zur markierten DNA 100 Lil Heringssperma-DNA (10 mg/ml;

Boehringer Mannheim) zugegeben und die Mischung anschliessend während 5

min bei 95 °C denaturiert.

Nicht-radioaktive Sonden wurden mittels PCR unter Verwendung des

markierten Nukleotids DIG-11-dUTP (Digoxigenin-ll-2'-deoxy-uridine-5'-

triphosphate, Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Schweiz) hergestellt.

2.7.2. Northern Blot

10 pig Gesamt-RNA wurde über ein 1.2% Formaldehyd-Agarose-Gel

(21.4 ml 37% Formaldehyd, 23.6 ml 5x MOPS Puffer pH 7, 0.96 g Agarose in

75 ml DEPC behandeltem Wasser) bei 6.2 V/cm elektrophoretisch aufgetrennt

und mittels der von Münch (75) beschriebenen "downward-alkaline-transfer"

Methode auf eine Nylonmembran (FALL, Biodyne® Nylon Membranes, East

Hills, NY, USA) übertragen. Nach dem Transfer wurde die Membran kurz in

2 x SSC gewaschen und im Anschluss daran wurde die transferierte RNA im

UV-Stratalinker® 1800 (Stratagene, Zürich, Schweiz) durch UV-Licht (254

nm, 120 mJ) auf der noch feuchten Membran fixiert.

2.7.3. Southern Blot

Chromosomale DNA aus 5. aureus (je 1 jig) wurde mit verschiedenen

Restriktionsenzymen verdaut und über ein 0.8% Agarose-Gel elektrophoretisch

aufgetrennt. Die erhaltenen Gele wurden jeweils 10 min in 0.25 M HCl

depuriniert, für 20 min in 0.4 M NaOH denaturiert und anschliessend auf eine


mit 0.4 M NaOH vorbehandelte Nylonmembran transferiert. Nach dem

Transfer wurde die Membran für fünf Minuten in 2 x SSC gewaschen und im

Anschluss daran wurde die DNA im UV-Stratalinker® 1800 (Stratagene) durch

UV-Licht (254 nm, 120 ml) auf der noch feuchten Membran fixiert.

2.7.4. Northern Hybridisierung

Die 30 minütige Prähybridisierung und die Hybridisierung über Nacht

erfolgte in Hybridisierungspuffer (0.5 M NaHP04-Puffer, pH 7.2; 1%

lyophilisiertes Rinderserumalbumin; 1 mM EDTA; 7% SDS) bei 65 °C. Als

Sonden wurden mittels Random primed labeling kit (Boehringer Mannheim)

markierte PCR Fragmente verwendet. Nach über Nacht erfolgter

Hybridisierung wurde die Membran für 5 min mit Wash 1 (40 mM NaHP04-

Puffer, pH 7.2; 0.5% lyophilisiertes Rinderserumalbumin; 1 mM EDTA; 5%

SDS) gewaschen, danach so lange für je 3 min mit Wash 2 (40 mM NaHP04-

Puffer, pH 7.2; 1 mM EDTA; 1% SDS), bis die Waschlösung nicht mehr

radioaktiv war. Nach dem Entfernen von SDS mit Wash 3 (100 mM NaHP04-

Puffer, pH 7.2) wurden die Filter bei -70 °C auf Röntgenfilmen (Fuji X-Ray,

Fuijfilm, Dielsdorf, Schweiz) exponiert.

2.7.5. Southern Hybridisierung

Die Hybridisierungsschritte waren, sofern radioaktiv gearbeitet wurde,

die gleichen wie bei der Northern Analyse.

Wenn mit DIG-Sonden hybridisiert wurde, wurde nach der im „The DIG

System User's Guide for Filter Hybridization" vom DIG-Kit Lieferanten

Boehringer Mannheim vorgeschlagenen Methode vorgegangen (The DIG

System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim).


2.8. Klonieren von glmM

Ein 10.5 kb chromosomales Xbal Fragment aus dem Stamm PG108, das

die rechte Seite (Junction right, JR) des Transposons Tn55i enthielt, wurde mit

Tn55/ als Sonde identifiziert und in den Vektor pTZ18R (Genescribe-Z,

USB Corp., Cleveland, Ohio, USA) kloniert. Dieses Fragment wurde

verwendet um in einem chromosomalen Pstl Verdau des Stammes BB270 ein 5

kb grosses Fragment zu identifizieren, welches das gesamte glmM Operon

enthielt. Dieses Fragment wurde in den Vektor pAW8 subkloniert, woraus

schliesslich der Vektor pPG76 resultierte.

2.9. Sequenzierungen

2.9.1. Nicht-radioaktive Sequenzierung

Das 5 kb grosse klonierte Insert von pPG76 wurde mit verschiedenen

Restriktionsenzymen verdaut und in den E.coli Vektor pTZ18R (Genescribe-

Z, USB Corp.) subkloniert. Anschliessend wurden die verschiedenen

Subklone mit dem halbautomatischen ALF-Sequenator (Pharmacia, Uppsala,

Schweden) unter Verwendung des Thermo Sequenase fluorescent-labeled

primer cycle sequencing kit (Amersham Life Science) sequenziert.

2.9.2. Radioaktive Sequenzierung

Für die radioaktive Sequenzierung mit a35S-dATP wurde der T7

Sequenase Kit vs. 2.0 (Amersham Life Science) verwendet und nach den

Angaben des Herstellers vorgegangen.


2.10. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Kettenreaktion (PCR, (95)) wurden nach den Vorschriften

der Hersteller der verwendeten Polymerasen in einem Techne Progene

(Techne, Cambridge, Grossbritannien) oder DNA Thermal Cycler (Perkin

Eimer Cetus, Rotkreuz, Schweiz) durchgeführt. Als Polymerasen wurde die

AmphtaqGold DNA Polymerase (Perkin Eimer) oder die pfu Polymerase

(Perkin Eimer) verwendet.

2.11. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)

Für die Reverse Transkriptions Polymerase Ketten Reaktion (RT-PCR)

wurden 3 p,g Gesamt-RNA während 5 min bei 65 °C inkubiert um

Sekundärstrukturen zu zerstören. Die entsprechenden Primer wurden während

10 min bei RT anhybridisiert. Die reverse Transkription erfolgte während

einer Stunde bei 42 °C unter Verwendung der Reversen Transkriptase

SuperScript II (Gibco, Life Technologies AG). Anschliessend wurde der ganze

Ansatz für 5 min bei 95 °C inkubiert um die Reverse Transkriptase zu

inaktivieren und schliesslich für 5 min auf Eis gekühlt.

Die erhaltene cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung

entsprechender Primer amplifiziert. Um eine Verunreinigung der Gesamt-

RNA Ansätze mit chromosomaler DNA auszuschliessen wurden dieselben

Gesamt-RNA Ansätze ohne vorhergehende RT-PCR mittels PCR amplifiziert.

Die Sequenz der Primer kann der Tabelle 5 entnommen werden.

2.12. Primer-Extension

Die für die Primer Extenison verwendeten Primer wurden mit y^P-

dATP (Amersham Life Science) unter Verwendung einer T4


Tabelle 5: für PCR und RT-PCR verwendete Primer

Primersequenz (5'-»3') Position des 5' Nukleotids

im glmM-Operon

Nummer

in Fig. 8

TGATTTAGGACCAACAGC

ACCTAATGAAACCGCCTG

AGGGAACTAAAGCGATAC

GGGGCTTGAGATTTATTG

CAACTGGATTATGAGAGG

TTACTTTGAAGGGGC

TTTATCTGTTACGCG

CAGACAATGGCAAATAAC

107 1

968 2

1307 3

2025 4

3286 5

3426 6

4116 7

1786 8

Primersequenz (5'—>3') Position des 5' Nukleotids

in fmhB

Nummer

in Fig. 26

TCAGAAACAAAGAAATTAACTG

TAAATCGTTAAAGCCGTACTTC

1

2

Tabelle 6: für Primer Extension verwendete Oligonukleotide

Oligonukleotidsequenz (5'—>3') Position des 5' Nukleotids im

g/mM-Operon; Fig. 9

GAAAAATCCATAACATCTCCTC

AAAGACCGTGATGAGAAG

TAGTTCCCTTAAAGACCGTGATGAG

ATAAAAAGAAAAACAATGCCAAAAG

GTTTGCGACACCTCTTACTCC

CTAGAACATAGCCACCGTATCTTCC

TTTCACCTTTATTATGTGCTAGAAC

1209

1305

1315

2072

3012

3070

3088


Polynukleotidkinase endmarkiert und über Sephadex®G-25 Säulen (Pharmacia

Biotech, Uppsala, Schweden) gereinigt. Die RNA (40 pig) und der Primer (500

cps) wurden zuerst für 5 min auf 85°C erhitzt und während 15 min bei 55°C

wurde der Primer anhybridisiert, kurz auf Eis abgekühlt und dann nach

Zugabe von Reverser Transkriptase (SuperScript II RT, Gibco, Life

Technologies AG, Basel, Schweiz) 1 h bei 42 °C inkubiert. Anschliessend

wurde die cDNA gefällt, in 9 jllI Stop Solution (Sequenase Stop Solution,

Amersham Life Science) aufgenommen, denaturiert und auf einem 6%

Sequenziergel zusammen mit der radioaktiven Sequenzierreaktion des gleichen

Primers aufgetrennt.

Die Sequenz der Primer kann der Tabelle 6 entnommen werden.

2.13. Herstellung eines transduzierenden Phagenlysats

0.3 ml einer ÜN-Kultur des Donorstammes wurde mit 5 mM CaCl2

versetzt und mit 0.1 ml verschiedener Verdünnungen des Phagen 80a infiziert.

Damit der Phage an die Bakterienzellen adsorbieren konnte, wurde der Ansatz

während 15 min bei RT inkubiert. Anschliessend wurde der Ansatz mit 4 ml

Softagar und 5 mM CaCl2 vermischt, auf Schafblut-Agarplatten ausplattiert

und ÜN bei 30 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Platte mit

konfluenter Lyse mit 1 ml LB versetzt mit 5 mM CaCl2 überschichtet, die

Softagarschicht zusammen mit dem 1 ml LB abgekratzt, kurz gevortext und

für 10 min bei 10000g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen 0.45

p.m Filter (Millipore S.A., Molsheim, Frankreich) gefiltert und bei 4 °C

gelagert.

2.14. Transduktion von S. aureus

Für Transduktionen wurden 0.3 ml einer ÜN-Kultur des

Akzeptorstammes mit 5 mM CaCl2 versetzt und mit 0.1 ml der verschiedenen


Verdünnungen des transduzierenden Phagen 80a infiziert. Nach 15 min

Inkubation bei RT wurde die Transduktionsmischung mit 4 ml Softagar, der 20

mM Natriumeitrat enthielt, gemischt und sofort auf LB-Agar-Platten mit 20

p.g/ml Erythromycin ausplattiert.

Nach 48 h Inkubation bei 37 °C konnten Transduktanten gepickt werden.

2.15. Kompetente Zellen

2.15.1. Herstellung DMSO-kompetenter E. coli Zellen

Die Gewinnung DMSO-kompetenter E. coli Zellen wurde nach der

Methode von Inoue et al. (45) vorgenommen. Im allgemeinen wurde der E.

coli Stamm DH5a (Gibco Life Technologies AG) verwendet.

2.15.2. Herstellung elektrokompetenter DH10B E. coli Zellen

Von einer ÜN-Kultur wurden 100 ml LB 1:100 angeimpft und bis zu

einer OD600 von 0.5-0.6 wachsen gelassen. Die für 10 min bei 2000g

abzentrifugierten Zellen wurden in gleichem Volumen eiskaltem Wasser

resuspendiert und nochmals 10 min bei 2000g zentrifugiert. Darauf wurde das

Pellet in 0.5 Volumen eiskaltem Wasser resuspendiert und wieder

zentrifugiert. Nach Aufnahme in 1-1.5 ml eiskaltem Wasser wurde die

Zellsuspension nochmals kurz abzentrifugiert und das Zellpellet in 500 pl

Wasser eiskaltem Wasser aufgenommen und bis zur Transformation auf Eis

stehen gelassen oder bei -70 °C aufbewahrt.

2.15.3. Herstellung elektrokompetenter S. aureus RN4220

500 ml LB wurden mit einer ÜN-Vorkultur auf eine OD600 von 0.05

angeimpft und bei 37 °C unter starkem Schütteln inkubiert, bis eine OD600 von


0.5-0.6 erreicht wurde. Bei 2000xg wurden die Zellen bei 4 °C pelletiert.

Anschliessend wurden die Zellen viermal mit eiskalter 0.5 M Saccharoselösung

gewaschen und zwar mit jeweils 0.5, 0.25, 0.125 und 0.0625 des

Kulturvolumens. Nach dem zweiten Waschgang wurden die resuspendierten

Zellen für 2-4 h auf Eis stehengelassen. Zuletzt wurden die Zellen in 2.5 ml

eiskaltem, filtersterilisiertem 10% Glycerin resuspendiert, in 50 pf Aliquots im

Trockeneis/EtOH-Bad schocktiefgefroren und bei -70 °C aufbewahrt.

2.16. Transformationen

2.16.1. Transformation von DMSO-kompetenten E. coli Zellen

Die Transformation DMSO-kompetenter E. coli Zellen mit

zirkularisierter Plasmid-DNA erfolgte wie bei Inoue et al. (45) beschrieben.

2.16.2. Transformation elektrokompetenter E. coli Zellen

Zu 40-80 pJ elektrokompetenten Zellen wurden 1-2 u.1 des

Ligationsansatzes in vorgekühlten 0.2 cm Elektroporationsküvetten (BioRad,

Glattbrugg, Schweiz) zugegeben und für 1 min auf Eis belassen. Nach

erfolgtem Puls (Gene, BioRad, Glattbrugg, Schweiz: 2.5 kV, 200 O, 25 uF)

wurde sofort 1 ml SOC-Medium zugegeben und der Ansatz für 1 h bei 37 °C

leicht geschüttelt. Anschliessend wurden 100-150 pl des Ansatzes auf

entsprechende Selektivplatten ausgestrichen und ÜN bei 37 °C inkubiert. Der

Rest des Ansatzes wurde bei 4 °C aufgehoben.

2.16.3. Transformation elektrokompetenter S. aureus RN4220

50 pl kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut, mit einer

entsprechenden Menge Plasmid-DNA gemischt (300-1000 ng) und für 30 min


auf Eis inkubiert. Das Zellen-DNA-Gemisch wurde in eine vorgekühlte 0.1 cm

Elektroporationsküvette (BioRad) transferiert und anschliessend wurden die

Zellen mit einem Pulser (Gene Pulser, BioRad; 1.5 kV, 100 D, 25 jiF)

elektroporiert. Sofort wurde 0.9 ml eiskaltes SOC-Medium zugegeben und der

Ansatz für 1 h bei 37 °C inkubiert, bevor 100-150 jil auf entsprechende

Selektivplatten ausgestrichen wurde. Der Rest wurde bei 4 °C aufbewahrt.

2.17. Nachweis der Penicillin-Bindeproteine (PBP)

Zellmembran-Proteine wurden nach Curtis et al. (23) mittels

verschiedener Zentrifugationsschritten aus mit Lysostaphin (Sigma, Buchs,

Schweiz) lysierten ÜN-Kulturen gewonnen. Die mit 10 mg/ml (Phenyl-4(n)~

3H)Benzylpenicillin (Endkonzentration; 11.9 Ci/mmol, Amersham Life

Science) für 10 min bei 30 °C markierten PBP wurden über ein 12% SDS-Gel

aufgetrennt. Nach der Auftrennung wurde das Gel mit Coomassie Blau gefärbt

und photographiert. Anschliessend wurde das Gel für 20 min in Enhancer

(EN3-Hance, New England Nuclear, Boston, USA) inkubiert. Der Nachweis

der PBP erfolgte mittels Fluorographie. Das Gel wurde während vier Wochen

bei -70 °C auf einem Röntgenfilmen (Fuji X-Ray, Fuijfilm, Dielsdorf,

Schweiz) exponiert.

2.18. Western Blot Analyse

Für die Western Blot Analyse wurden zytoplasmatische Proteine und

Membranproteine aus mittels Lysostaphin lysierten Kulturen gewonnen und

nach Standardprotokollen mittels SDS-Gel Elektrophorese aufgetrennt und

geblottet.

Anti GlmM Antikörper wurden von H. Komatsuzawa, University School

of Dentristy, Hiroshima, Japan, erhalten.


2.19. Resistenzbestimmungen

Minimale Hemmkonzentrationen (MHK) von den entsprechenden

Antibiotika wurden mittels E-Test (AB BIODISK, Solna, Schweden) auf

Müller-Hinton-Agar-Platten oder mittels der Mikrodilution-Methode nach

NCCLS (79) in LB-Medium durchgeführt. Die Zellzahl wurde auf den 0.5

McFarland Trübungsstandard eingestellt, was 0.5 x 108 Bakterienzellen/ml

entspricht.

2.20. Populationsanalysen

Populationsanalysen von entsprechenden Bakterienstämmen wurden von

ÜN-Kulturen gemacht indem Aliquote von 0.1 ml aus einer Verdünnungsreihe

von 10"1 bis 10"9 auf frisch gegossene LB-Agar-Platten mit steigender

Antibiotika-Konzentration ausgestrichen wurde. Nach 48 h Inkubationszeit bei

35 °C wurden die gewachsenen Kolonien gezählt und graphisch dargestellt.

2.21. Autolyse

Um die spontane Autolyse zu bestimmen wurden exponentiel! wachsende

Zellen (OD600 = 0.6) geerntet, zweimal mit physiologischem Phosphatpuffer pH

7.0 gewaschen und in 0.05 M Tris-HCl pH 7.5 auf eine OD600 von 0.5

resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden bei 37 °C inkubiert und die

mit der Zeit wegen der Zunahme lysierter Zellen abnehmende Trübung

gemessen und entsprechend graphisch dargestellt.


2.22. Wachstumskurven

Von einer S. aureus ÜN-Kultur wurde eine Probe entnommen,

entsprechend verdünnt und die OD600 photospektrometrisch gemessen. Anhand

des erhaltenen Wertes wurde in einem Gesamtvolumen von 100 ml LB eine

OD600 zwischen 0.02 und 0.05 eingestellt. Die Kulturen wurden anschliessend

bei 37 °C geschüttelt, von Zeit zu Zeit Proben entnommen und ihre OD600

gemessen.

Resultate 40

3. Resultate

3.1. Das glmM-System

glmM ist ein fem Faktor und wurde mittels Transposon-

Insertionsinaktivierung mit Tn55i auf dem Smal Fragment I lokalisiert. Seine

Inaktivativierung erhöhte die Empfindlichkeit gegenüber ß-Laktamen, wobei

es aber immer noch zur Ausbildung hochresistenter Subpopulationen kam.

Weiter führte die Inaktivierung zu einer Telcoplanin-Hyperempfindlichkeit.

3.1.1. Phänotypische Charakterisierung der Insertion Q12F

glmM::Tn551

Populationsanalyse, Minimale Hemm-Konzentrationen (MHK)

Charakteristisch für MRSA ist die heterogene Expression der

Methicillin-Resistenz. Alle Zellen des MRSA-Stammes BB270 besitzen eine

bestimmte Grundresistenz von etwa 4-8 pg/ml Methicillin. Eine kleine

Subpopulation ist aber fähig, bei Konzentrationen von über 100 pg/ml

Methicillin zu wachsen. Bei einigen hochresistenten MRSA-Stämmen wie COL

zeigen alle Zellen eine hohe Grundresistenz; solche Stämme werden auch

homogen hochresistente MRSA genannt. Die Höhe der Resistenz ist durch

chromosomale Faktoren bedingt und nicht abhängig von der Menge an PBP2'

(94). Über 40 solcher auf dem Chromosom verteilter Gene sind bereits mittels

Tn551 Insertionsinaktivierung identifiziert worden (13, 25, 111). Ursprünglich

sind diese Gene fem oder aux Faktoren genannt worden, werden aber, sobald

sie charakterisiert sind, nach ihrer eigentlichen Funktion umbenannt.

Die Inaktivierung des Phosphoglukosamin-Mutase Gens glmM,

ursprünglich femD, mittels Tn557 Insertion, verleiht eine erhöhte

Empfindlichkeit gegenüber Methicillin. Dabei wird sowohl die Grundresistenz,

Resultate 41

als auch die Anzahl von Subklonen, die in Anwesenheit von mehr als 10 pg/ml

Methicillin wachsen können, reduziert. Die Insertion D12F glmM::Tn551

reduzierte die MHK von 6 u.g/ml im Methicillin-resistenten Ausgangsstamm

BB270 auf 0.38 pg/ml Methicillin in der Mutante PG108 (Tab. 7). Die MHK

beim Stamm PG108 lag damit sogar unter derjenigen des isogenen MSSA

Stammes BB255. Dennoch bildete PG108 eine kleine Subpopulation (10"2-10"7),

die bei höheren Methicillinkonzentrationen von bis 128 u.g/ml Methicillin

wachsen konnte (Fig. 3). Diese hochresistenten Subklone waren immer noch

Erythromycin-resistent, was schliessen Hess, dass sie die Tn55i Insertion noch

trugen. Einer dieser hochresistenten Subklone, Stamm PG100, wurde

eingehender untersucht. Der Stamm PG100 zeigte im Vergleich zum

Ausgangsstamm BB270 eine erhöhte Resistenz gegenüber allen ß-Laktamen

und brachte auch eine grössere hochresistente Subpopulation hervor (Fig. 3).

Dieses charakteristische Resistenzprofil von Stamm PG100 blieb auch nach

Subkultivieren in LB ohne Antibiotikazugabe, sowie nach Lagerung bei -70 °C

erhalten, so dass angenommen werden konnte, dass es sich dabei um eine

Mutante handelte.

Um herauszufinden, ob die hohe Methicillin-Resistenz in PG100 mit der

Erythromycin-Resistenz kotransduzierbar ist, wurde die Erythromycin-

Resistenz von PG100 in BB270 zurücktransduziert. Die Transduktanten,

repräsentiert durch den Stamm PG105 wurden aber Methicillin-empfindlich

wie PG108 (Tab. 7; Fig. 3). Hybridisierungen von i7mdIII geschnittener

chromosomaler DNA der Stämme PG108, PG100 und PG105 mit Tn55i-DNA

als Probe ergaben die gleichen Bandenmuster. Damit wurde gezeigt, dass

glmM in allen drei Stämmen, auch in PG100, immer noch durch Tn55i

unterbrochen war (Fig. 4B; Fig. 5). Daher wurde folgendes postuliert: eine

suppressorische oder kompensatorische Mutation, hmrDl genannt für ,,/ngh-

level methicillin-resistant suppressor mutant of femD", scheint für die hohe

Resistenz in PG100 verantwortlich und ist, da nicht kotransduzierbar, nicht mit

glmM verknüpft.

Resultate 42

Tabelle 7: Minimale Hemmkonzentrationen verschiedener Zellwand¬

gerichteter Antibiotika gegen verschiedene glmM Mutanten und ihre

parentalen Stämme.

Stämme MHK(ug/ml)

VA TP OX ME IP

BB255 1.5 1.0 0.19 0.75 0.032

PG27 1.5 0.25 0.064 0.25 0.012

BB270 1.5 1.0 12 6 0.25

PG108 0.75 0.064 0.094 0.38 0.032

PG100 1.0 0.064 >256 >256 f^" ^J a£j

PG105 0.75 0.064 0.19 0.75 0.047

COL 1.5 2 >256 >256 >32

PG106 1.0 0.25 0.19 0.75 0.047

PG79 1.5 1.0 16 12 0.125

PG231 1.5 0.125 16 6 0.125

PG232 1.5 0.38 >256 >256 >32

PG217 0.75 0.19 0.38 0.38 0.047

VA, Vancomycin; TP, Teicoplanin; OX, Oxacillin; ME, Methicillin; IP, Imipenem.

O

"sa

1 10 100 1000 10000

Methicillin pg/ml

Figur 3: Populationsanalyse von Uebernachtkulturen. Kolonie¬

formende Einheiten nach 48 h Inkubation auf LB-Agar Platten mit

zunehmender Methicillin-Konzentration. #, BB255; , BB270;

, PG108; A, PG100; A, PG105; O, PG79

Resultate 44

abcdefghi abcdefghi

<!=3

A B

Figur 4: Southern Blot von Hindlll verdauter chromosomaler DNA

verschiedener Wildtypen und ihren g//;/A/-Mutanten hybridisiert mit (A)einem g/mM-Fragment und (B) mit Tn55 7. a, COL; b, BB255; c,

BB270; d, PG106; e, PG27; f, PG108; g, Marker; h, PG100; i, PG105.

Pfeil zeigt auf das ungefähr 1 kb grosse Tn557 interne Hindlll

Fragment (Fig. 5).

Resultate 45

Tn551

CAH

ermB

KA SB HAC H X B AC

lkb

Figur 5: Restriktionskarte von Tn55i. A, Aval; B, Bglll; C,

CM; H, HindlU; H, Hpal; S, Sali; X, Xbal.

Resultate 46

Der MSSA Stamm BB255 erwies sich im Vergleich zu den mec

tragenden MRSA Stämmen in Transduktionen als schlechterer Rezipient. Es

wurden häufig Erythromycin-resistente Kolonien erhalten, die sich bei

genauerer Untersuchung als abortive Transduktanten erwiesen. Erst nach

mehreren Versuchen und längerer Inkubation der Transduktanten konnten

stabile BB255 glmM Mutanten erhalten werden, die sich aber phänotypisch

auffällig verhielten. Die Kolonien zeigten entweder eine gelb-orange

Verfärbung oder sie waren sehr klein. Die repräsentative BB255 glmM

Mutante PG27 zeigte bei der Hybridisierung mit Tn55i das gleiche

Bandenmuster wie alle anderen glmM Mutanten (Fig. 4B). Die Tn55i Insertion

hatte aber erwartungsgemäss weniger Einfluss auf die Empfindlichkeit gegen

Methicillin als bei einem MRSA Stamm (Tab. 7).

Die Transduktion von glmM::Tn551 in den homogen hochresistenten

Stamm COL ergab den Stamm PG106 und führte ebenfalls zu einer erhöhten

Methicillin-Empfindlichkeit (Tab. 7).

Neben den verschiedenen getesteten ß-Laktam Antibiotika Methicillin,

Oxacillin und Imipenem wurde der Einfluss der glmM Inaktivierung auf das

Verhalten gegen zwei weitere gegen die Zellwand gerichtete Antibiotika

untersucht. Die Insertion D12F (glmM::Tn551) hatte auf die Empfindlichkeit

gegen Vancomycin keine Wirkung (Tab. 7); die Empfindlichkeit gegen ein

weiteres Glykopeptid, Teicoplanin, nahm jedoch in allen MRSA glmM

Mutanten, auch im hochresistenten Suppressor Stamm PG100, zu (Tab. 7). Die

postulierte hmrDl Mutation beeinflusst demnach nur die Methicillin-Resistenz,

wohingegen die erhöhte Teicoplanin-Empfindlichkeit mit dem immer noch

inaktivierten glmM in Zusammenhang stehen muss.

Autolyse

Die spontane Autolyse zeigte nur einen geringen Unterschied zwischen

dem Wildtyp BB270 und seiner glmM Mutante PG108 (Fig. 6). Die Tn557

Insertion in glmM scheint auf die Autolyse keinen grossen Einfluss zu haben.

Resultate 47

o

o

O

o

0.45-

0.35

0.25 t r

0 40 80 120 160 200

min

Figur 6: Autolyse. Spontane Autolyse der Stämme, BB270; ,

PG108undA,PG100.

Resultate 48

Die Suppressor Mutante PG100 hingegen autolysierte im Vergleich dazu

deutlich langsamer, was mit der postulierten Mutation, die zu der erhöhten

Methicillin-Resistenz geführt hatte, zusammenhängen könnte.

3.1.2. Das glmM Operon

Klonieren und Sequenzieren

Um das Wildtyp Allel von glmM zu klonieren wurde Pstl-verdaute

chromosomale Wildtyp BB270 DNA mit dem 2.2 kb grossen CM Fragment

aus dem Plasmid pBBB106, das sowohl die Jr von Tn557 als auch 10 kb der

distalen Region von glmM enthielt, hybridisiert (Fig. 7). Die resultierende

Bande war um die 5 kb gross. Entsprechend wurde der 5 kb Bereich Pstl-

verdauter chromosomaler Wildtyp BB270 DNA in den Pstl geschnittenen

Shuttle Vektor pAW8 kloniert. Daraus resultierte das Plasmid pPG76, das

später auch zur Komplementation verwendet wurde.

Der gesamte Insert wurde mittels primer walking Methode sequenziert

und analysiert. Er beinhaltete vier offene Leseraster (ORF), die alle die gleiche

Orientierung aufwiesen (Fig. 8).

Analysieren der verschiedenen offenen Leserastern

Der erste ORF beginnt bei Nukleotid 107 und endet bei Nukleotid 1013

(Fig. 9). Er kodiert für ein 302 Aminosäuren (AS) grosses Protein mit einem

errechneten Molekulargewicht von 33 kDa. Datenbankvergleiche mit diesem

302 AS grossen Protein zeigten in einem 300 AS überlappenden Bereich eine

Identität von 53% und eine Ähnlichkeit von 73% mit der AS-Sequenz der

Arginase von Bacillus caldovelox (Swissprot accession no. p53608) und eine

Identität von 52% und eine Ähnlichkeit von 70% mit der von Bacillus subtilis

(Swissprot accession no. p39138). Das Enzym Arginase katalysiert den Abbau

von Arginin zu Ornithin und Harnstoff. Ein Vergleich der im aktiven Zentrum

2.2kbClalFragment

JrTn551

YA

XB

AvCH

PH

CP

PP

AX

kb

Figur

7:Ausschnitt

ausdem

10.5kbXbal

Insert

inPlasmidpBBBlOö.

Das

alsProbe

verwendete

2.2kb

grosseC/al-Fragment

istangegeben.A,AccI;Av,Aval;B,Bg

lll;

C,

Clal

;

H,Hindll;P,

Pstl:X,Xbal.

tTn55i

j

14

argl

orfJ

orß

glmM

AH

HC

HHN

HN

kb

Figur

8:RestriktionskartederRegiondesglmMOperons.

P,Ps

tl;A,Asp718;H,Hindll;C,

Clal

;

N,

Nsil.DieoffenenLeserastersindmitPfeilenangegeben,sowiediePositionundOr

ient

ieru

ngdesTn557.Diekleinennummerierten

Pfeilezeigen

diePositionundOr

ient

ieru

ngderfürdieRT-

PCR

verwendeten

Primer.

Die

daraus

resultierenden

Produkte

sind

oberhalb

als

Linien

angegeben.

Die

fürdieNorthem

Blotsverwendetenundge

zeigte

nProben

sind

alsDoppellinien

angegeben.

TTTTTTTATGAAGTAATAAGATAAACAGATTATATGTGTAGCTATTGCTT GATAATGGTA

1 * * * * * * 60

AGCC-CATACATTATTCTTTAATTACATAGAGCAAAGGGGGACGCTTATGACÄAAGACAAA

61 * * * SD* * * 120

1 M T K T K 5

AGCAATTGATATTATAGGTGCACCATCAACATTTGGACAAAGAAAATTAGGTGTTGATTT

121 ****** ]_go

6AIDIIGAPSTFGQRKLGVDL 25

AGGACCAACAGCAATTAGATATGCTGGATTAATTTCAAGATTAAAGCAATTAGACCTTGA

181 ****** 240

26GPTAIRYAGLISRLKQLDLD 45

TGTATATGACAAGGGGGATATTAAGGTACCTGCTGTGAACATTGAAAAATTTCATAGTGA

241 ****** 3oo

46VYDKGDIKVPAVNIEKFHSE 65

ACAAAAAGGATTAAGAAATTATGATGAAATTATAGATGTTAATCAAAAATTAAATAAAGA

301 * * * * * * 360

66QKGLRNYDEIIDVNQKLNKE 85

GGTTTCAGCATCAATTGAAAATAACAGATTTCCTCTAGTTCTTGGTGGAGATCATTCTAT

361 ****** 420

86VSASIENNRFPLVLGGDHSI 105

TGCGGTAGGTTCAGTATCAGCAATAAGTAAACATTATAATAATTTAGGTGTTATTTGGTA

421 ****** 4gQ

106 AVGSVSAISKHYNNLGVTWY 125

TGATGCACATGGTGATTTAAATATACCTGAAGAGTCACCAAGTGGAAATATTCATGGTAT

481 * * * * * * 540

126 DAHGDLNIPEESPSGNIHGM 145

GCCTCTAAGGATTTTGACAGGCGAAGGTCCCAAAGAACTTTTAGAATTAAATAGTAATGT

541 ****** 600

146 PLRILTGEGPKELLELNSNV 165

AATCAAGCCAGAAAACATCGTACTAATTGGTATGAGAGATTTAGATAAAGGTGAAAGACA

601 ****** 660

166 IKPENIVLIGMRDLDKGERQ 185

ATTTATCAAAGATCATAATATTAAAACATTTACTATGTCAGATATTGATAAATTGGGGAT

661 ****** 720

186 FIKDHNIKTFTMSDIDKLGI 205

AAAGGAAGTAATTGAAAATACAATAGAATATTTGAAGTCACGCAATGTTGATGGCGTTCA

721 ****** 73o

206KEVÏENTIEYLKSRNVDGVH 225

Resultate

TTTATCTTTAGATGTTGATGCTTTAGATCCGCTTGAAACGCCAGGCACTGGTACTAGAGT

781 ****** 340

226 LSLDVDALDPLETPGTGTRV 245

TTTGGGTGGTCTTAGTTATAGAGAAAGCCATTTTGCATTGGAATTACTGCATCAATCACA

841 * * * * * * 900

246 LGGLSYRESHFALELLHQSH 265

TTTAATTTCCTCAATGGATTTAGTTGAAGTAAATCCATTGGTTGACAGTAATAATCATTC

gOl * * * * * * 960

266 LISSMDLVEVNPLVDSNNHS 285

TGCTGAACAGGCGGTTTCATTAGGTGGAACATTTTTTGGTGAACCTTTATTATAAATAAA

961 ******1020

286AEQAVSLGGTFFGEPLL* 302

TGATTTGTAGTGAAAAAGTATÄTTTTGCTTTTGCACTACTTTTTTTAATCACTAAAATGA

1021 ******1080

TTAAGGGTAGTTATATC TTTAAAATAATTTTTTTCTATTAAAATATATGTCGT ATGA CAG

1081 ***** 1140

TGATGTAAATGATTGGTATAATGGGTATTATCGAAAAATATTCCCGGAGGAGATGTTATG

1141 * * * * SD* * 120Q

M 1

GATTTTTCCAACTTTTTTCAAAACCTCAGTACGTTAAAAATTGTAACGAGTATCCTTGAT

1201 ******1260

2DFSNFFQNLSTLKIVTSILD 21

TTACTGATAGTTTGGTATGTACTTTATCTTCTCATCACGGTCTTTAAGGGAACTAAAGCG

1261 ******1320

22LLIVWYVLYLLITVFKGTKA 41

ATACAATTACTTAAAGGGATATTAGTAATTGTTATTGGTCAGCAGATAAGTATGATATTG

1321 ******13S0

42IQLLKGILVIVIGQQISMIL 61

AACTTGACTGCAACATCTAAATTATTCGATATCGTTATTCAATGGGGGGTATTAGCTTTA

1381 ******1440

62NLTATSKLFDIVIQWGVLAL 81

ATAGTAATATTCCAACCAGAAATTAGACGTGCGTTAGAACAACTTGGTAGAGGTAGCTTT

1441 ******1500

82IVIFQPEIRRALEQLGRGSF 101

TTAAAACGCTATACTTCTAATACGTATAGTAAAGATGAAGAGAAATTGATTCAATCGGTT

1501 ******156û

102 L ?" R Y T S N T Y S K D E E K L I Q S V 121

Resultate 53

TCAAAGGCTGTGCAATATATGGCTAAAAGACGTATAGGTGCATTAATTGTCTTTGAAAAA

1561 ******1620

122 SKAVQYMAKRRIGALIVFEK 141

GAAACAGGTCTTCAAGATTATATTGAAACAGGTATTGCAATGGATTCAAATATTTCGCAA

1621 ******16gQ

142 ETGLQDYIETGIAMDSNISQ 161

GAACTTTTAATTAATGTCTTTATACCTAACACACCTTTACATGATGGTGCAATGATTATT1681 ******1740

162 ELLINVFTPNTPLHDGAMII 181

CAAGGCACGAAGATTGCAGCAGCAGCAAGTTATTTGCCATTGTCTGATAGTCCTAAGATS1741 ******1800

182 QGTKIAAAASYLPLSDSPKI 201

TCTAAAAGTTTGGGTACAAGACATAGAGCTGCGGTTGGTATTTCAGAAGTATCTGAGGCC

1801 ******186o

202 SKSLGTRHRAAVGISEVSEA 221

TTTACCGTTATTGTATCTGAAGAAACTGGTGATATTTCGGTAACATTTGATGGAAAATTS1861 ******1920

222 FTVIVSEETGDISVTFDGKL 241

CGACGAGACATTTCAAACGAAATTTTTGAAGAGTTGCTTGCTGAACATTGGTTTGGCACA1921 ******1930

242 RRDISNEIFEELLAEHWF_GT 261

CGCTTTCAAAAGAAAGGTGTGAAATAATATGCTAGAAAGTAAATGGGGCTTGAGATTTAT1981 ******2040

262/1R FQKKGVK* MLESKWGLRFI 269/11

TGCCTTTCTTTTGGCATTGTTTTTCTTTTTATCTGTTAACAATGTTTTTGGAAATATCTT2041 ******2100

12AFLLALFFFL SVNNVFGNI F 31

TAACACTGGTAATCTTGGTCAAAAGTCTAGTAAAACGATTCAAGATGTACCCGTTGAAAT2101 ******2160

32NTGNLGQKSSKTIQDVPVEI51

TCTTTATAACACTAAAGATTTGCATTTAACAAAAGCGCCTGAAACAGTTAATGTGACTAT2161 ******2220

52LYNTKDLHLTKAPETVNVTI71

TTCAGGACCACAATCAAAGATAATAAAAATTGAAAATCCAGAAGATTTAAGAGTAGTGAT2221 ******2280

72SGPQSKIIKIENPEDLRVVI91

Resultate 54

TGATTTATCAAATGCTAAAGCTGGAAAATATCAAGAGAAGTATCAAGTTAAAGGGTTAGC

2281 ******2340

92DLSNAKAGKYQEKYQVKGLA 111

TGATGACATTCATTATTCTGTAAAACCTAAATTAGCAAATATTACGCTTGAAAACAAAGT

2341 ******2400

112 DDIHYSVKPKLANITLENKV 131

AACTAAAAAGATGACAGTTCAACCTGATGTAAGTCAGAGTGATATTGATCCACTTTATAA

2401 ******2460

132 TKKMTVQPDVSQSDIDPLYK 151

AATTACAAAGCAAGAAGTTTCACCACAAACAGTTAAAGTAACAGGTGGAGAAGAACAATT

2461 ******2520

152 ITKQEVSPQTVKVTGGEEQL 171

GAATGATATCGCTTATTTAAAAGCCACTTTTAAAACTAATAAAAAGATTAATGGTGACAC

2521 ******2580

172 NDIAYLKATFKTNKKINGDT 191

AAAAGATGTCGCAGAAGTAACGGCTTTTGATAAAAAACTGAATAAATTAAATGTATCGAT

2581 ******2640

192 KDVAEVTAFDKKLNKLNVSI 211

TCAACCTAATGAAGTGAATTTACAAGTTAAAGTAGAGCCTTTTAGCAAAAAGGTTAAAGT

2641 ******2700

212 QPNEVNLQVKVEPFSKKVKV 231

AAATGTTAAACAGAAAGGTAGTTTAGCAGATGATAAAGAGTTAAGTTCGATTGATTTAGA

2701 ******2760

232 NVKQKGSLADDKELSSIDLE 251

AGATAAAGAAATTGAAATCTTCGGTAGTCGAGATGACTTACAAAATATAAGCGAAGTTGA

2761 ******2820

252 DKEIEIFGSRDDLQNISEVD 271

TGCAGAAGTAGATTTAGATGGTATTTCAGAATCAACTGAAAAGACTGTAAAAATCAATTT

2821 ******2880

272 AEVDLDGISESTEKTVKINL 291

ACCAGAACATGTCACTAAAGCACAACCAAGTGAAACGAAGGCTTATATAAATGTAAAATA

2881 ******2940

292PEHVTKAQPSETKAYINVK 310

AATAGCTAAATTAAAGGAGAGTAAACAATGGGAAAATATTTTGGTACAGACGGAGTAAGA

2941 * SD * * * * 3ooo

1 * M G K Y F G T D G V R 11

Resultate 55

GGTGTCGCAAACCAAGAACTAACACCTGAATTGGCATTTAAATTAGGAAGATACGGTGGC

3001 ******3060

12GVANQELTPELAFKLGRYGG 31

TATGTTCTAGCACATAATAAAGGTGAAAAACACCCACGTGTACTTGTAGGTCGCGATACT

3061 ******3120

32YVLAHNKGEKHPRVLVGRDT 51

AGAGTTTCAGGTGAAATGTTAGAATCAGCATTAATAGCTGGTTTGATTTCAATTGGTGCA

3121 ****** 3180

52RVSGEMLESALIAGLISIGA 71

GAAGTGATGCGATTAGGTATTATTTCAACACCAGGTGTTGCATATTTAACACGCGATATG

3181 ******3240

72EVMRLGIISTPGVAYLTRDM 91

GGTGCAGAGTTAGGTGTAATGATTTCAGCCTCTCATAATCCAGTTGCAGATAATGGTATT

3241 ****** 3300

92 G A E LGVMI SASHNPVADNGÏ 111

AAATTCTTTGGATCAGATGGTTTTAAACTATCAGATGAACAAGAAAATGAAATTGAAGCA

3301 ****** 3360

112 KFFGSDGFKLSDEQENEIEA 131

TTATTGGATCAAGAAAACCCAGAATTACCAAGACCAGTTGGCAATGATATTGTACATTAT

3361 ******3420

132 LLDQENPELPRPVGNDIVHY 151

TCAGATTACTTTGAAGGGGCACAAAAATATTTGAGCTATTTAAAATCAACAGTAGATGTT

3421 ******3480

152 SDYFEGAQKYLSYLKSTVDV 171

AACTTTGAAGGTTTGAAAATTGCTTTAGATGGCGCAAATGGTTCAACATCATCACTAGCG

3481 ******3540

172 NFEGLKIALDGANGSTSSLA 191

CCATTCTTATTTGGTGACTTAGAAGCAGATACTGAAACAATTGGATGTAGTCCTGATGGA

3541 ****** 3g00

192 PFLFGDLEADTETIGCSPDG 211

TATAATATCAATGAGAAATGTGGCTCTACACATCCTGAAAAATTAGCTGAAAAAGTAGTT

3601 ******3660

212 YNINEKCGSTHPEKLAEKVV 231

GAAACTGAAAGTGATTTTGGGTTAGCATTTGACGGCGATGGAGACAGAATCATAGCAGTA

3661 ******3720

232 ETESDFGLAFDGDGDRIIAV 251

Resultate 56

GATGAGAATGGTCAAATCGTTGACGGTGACCAAATTATGTTTATTATTGGTCAAGAAATG

3721 ****** 3780

252 DENGQIVDGDQIMFIIGQEM 271

CATAAAAATCAAGAATTGAATAATGACATGATTGTTTCTACTGTTATGAGTAATTTAGGT

3781 ******3840

272 HKNQELNNDMIVSTVMSNLG 291

TTTTACAAAGCGCTTGAACAAGAAGGAATTAAATCTAATAAAACTAAAGTTGGCGACAGA

3841 ******39oo

292 FYKALEQEGIKSNKTKVGDR 311

TATGTAGTAGAAGAAATGCGTCGCGGTAATTATAACTTAGGTGGAGAACAATCTGGACAT

3901 ******396o

312 YVVEEMRRGNYNLGGEQSGH 331

ATCGTTATGATGGATTACAATACAACTGGTGATGGTTTATTAACTGGTATTCAATTAGCT3961 ******4020

332 IVMMDYNTTGDGLLTGIQLA 351

TCTGTAATAAAAATGACTGGTAAATCACTAAGTGAATTAGCTGGACAAATGAAAAAATAT4021 Tn551 ******408O

352 SVIKMTGKSLSELAGQMKKY 371

CCACAATCATTAATTAACGTACGCGTAACAGATAAATATCGTGTTGAAGAAAATGTTGAC4081 ******4140

372 PQSLINVRVTDKYRVEENVD 391

GTTAAAGAAGTTATGACTAAAGTAGAAGTAGAAATGAATGGAGAAGGTCGAATTTTAGTA4141 ******4200

392 VKEVMTKVEVEMNGEGRILV 411

AGACCTTCTGGAACAGAACCATTAGTTCGTGTCATGGTTGAAGCAGCAACTGATGAAGAT4201 ******4260

412 RPSGTEPLVRVMVEAATDED 431

GCTGAAAGATTTGCACAACAAATAGCTGATGTGGTTCAAGATAAAATGGGATTAGATAAA4261 ******4320

432 AERFAQQIADVVQDKMGLDK 451

TAAÄTACTGTATTACAAATGAGCCGATGCGTATGCATCGGTTTTTTGTGTTTGTAGAAAT4321 ******43g0

AATTTATAGTACAAACGTAAAATGATATAAACAAAATAAAAACAAAGTAATCAATATGTA4381 ****** 444Q

ATATAAAATACACTGGTACTCAATATATAATGATGATAAAATTAATTTTAATTAGATAGA4441 ****** 4500

Resultate 57

GTTGCTTTGTGTTTTTAACGCAGATGCTACTACTTATCTTAACAGTTGATTAAGTGAAAT

4501 ******4560

CATTTAACAGCGAGAATAATCAACCAGGAGGATGACTTAATGAATTTATTCAGACAACAA

4561 ****** 4620

AAATTTAGTATCAGAAAATTTAATGTCGGTATTTTTTCAG

4621 * * * * 4660

Figur 9: Sequenz der Arginase argl und dem glmM Operon mit den ORF

orfl, orfl und glmM. Die möglichen Promotorsequenzen sind

fettgedruckt und unterstrichen, die Transkriptionsstartpunkte fettgedruckt

und kursiv geschrieben, Shine-Dalgarno Sequenzen sind kursiv

geschrieben, die Startkodons ATG sind fettgedruckt und die Inverted

Repeats sind unterstrichen. Die „active site" von GlmM ist fettgedruckt.

Tn557 Insertionsstelle Nukleotidposition 4022/4023.

Resultate 58

liegenden AS ergab eine Identität von über 70%. Daher wurde dieser ORF argl

genannt. Distal zu argl folgte ein Abschnitt von sieben Thymidin-Resten mit

vorgestelltem Inverted Repeat von 14 Nukleotiden, der für einen Faktor¬

unabhängigen RNA-Polymerase Terminator charakteristisch ist (Fig. 9) (17).

AG für diesen Terminator beträgt -3.3 kcal/mol.

Der zweite ORF, orfl genannt, startet bei Nukleotid 1198 und endet bei

Nukleotid 2005 (Fig. 9). Er kodiert für ein 269 AS grosses Protein mit einem

errechneten Molekulargewicht von 29.6 kDa. Dieses Protein hatte eine Identität

von 56% und eine Ähnlichkeit von 76% mit der AS-Sequenz von YbbP, einem

hypothetischen, von B. subtilis kodierten Protein. Zwei hydrophobe Regionen

im N-terminalen Bereich lassen vermuten, dass dieses Protein, dessen Aufgabe

noch nicht klar ist, membranassoziiert sein könnte (Fig. 10).

Der dritte ORF, orfl, von orfl nur durch vier Nukleotide getrennt,

beginnt bei Nukleotid 2009 und endet bei Nukleotid 2939 (Fig. 9). Er kodiert

für ein 310 AS grosses Protein mit einem errechneten Molekulargewicht von

34 kDa. Seine AS-Sequenz wies eine Identität von 28% und eine Ähnlichkeit

von 53% mit der AS-Sequenz von YbbR, einem wie YbbP hypothetischen, von

B. subtilis kodierten Protein auf. Bei orf2 konnte im Gegensatz zu allen

anderen ORF weder eine mögliche Promotor- noch eine wahrscheinliche

Shine-Dalgarno Sequenz ausfindig gemacht werden (Fig. 9).

Der vierte und letzte ORF, glmM, war 29 Nukleotide von orfl entfernt

und kodiert für ein 451 AS grosses Protein mit einem errechneten

Molekulargewicht von 49.6 kDa. Die glmM DNA Sequenz ist identisch mit der

des Phosphoglukosamin-Mutase Gens glmM von COL (117) (48) ausser einem

Nukleotidaustausch T zu C an der Position 3179, was zu einem

Aminosäurenaustausch von Valin zu einem Alanin an der Position 251 führte.

Die Tn55i Insertion unterbricht glmM im Stamm PG108 im C-terminalen

Bereich an Position 4022/4023 und verkürzt GlmM um 99 Aminosäure-Reste.

Trotz der Tn557 bedingten Unterbrechung von glmM, beinhaltet GlmM immer

noch das aktive Zentrum, das eine Phosphogluko- und Phosphomanno-Mutase

Phosphoserin Signatur enthält. Diese charakteristische Aminosäuren liegen

hydrophilic

I120 160 200

amino acid position

Figur 10: Hydrophobizitätsdiagramm von Orfl. Stark hydrophober N-

terminaler Bereich.

Resultate 60

zwischen den Aminosäuren 91 und 95, 95 und 110 und 111 und 115. Ein

Abschnitt von Thymidin-Resten mit vorgestelltem palindromischem

Sequenzabschnitt charakteristisch für einen Faktor-unabhängigen RNA-

Polymerase Terminator (Fig. 9) (17) folgte distal von glmM. AG für diesen

Terminator beträgt -10.3 kcal/mol.

3.1.3. Transkription der glmM Region

Die Analyse der vier verschiedenen ORF liess vermuten, dass argl

unabhängig von den ORF orfl, orfl und glmM transkribiert würde. Unklar

war allerdings, ob argl Teil eines grösseren, proximal gelegenen Operons ist

und ob orfl, orfl und glmM nur als dreizistronisches Transkript vorliegen

würde. Mittels Northern Blot Hybridisierungen und Primer-Extension

Analysen wurde die Transkription dieser Region untersucht.

Northern Blot

RNA von exponentiellen, spät-exponentiellen und stationären

Wachstumsstadien wurden vom MRSA BB270, MSSA BB255, von der glmM

Mutante PG108 und der hmrDl glmM Suppressor Mutante PG100 extrahiert

und mittels Northern Blot mit verschiedenen Proben (Fig. 8) analysiert.

Hybridisierung mit einer 0.69 kb langen g/mM-internen Probe, die die

Tn55i Insertionsstelle bedeckte, ergab bei allen Wachstumsstadien das gleiche

Bandenmuster. Bei den parentalen Stämmen BB255 und BB270 erhielt man

jeweils Transkripte von 3.2, 2.2 und 1.3 kb Grösse mit zunehmender

Bandenintensität (Fig. IIA). Abgeleitet von ihrer Grösse wurde davon

ausgegangen, dass das 3.2 kb Transkript die drei ORF orfl-orfl-glmM

repräsentierte. Das 1.3 kb Transkript schien vom glmM zu stammen, da es in

den Tn557-inaktivierten glmM Mutanten fehlte. Dafür war bei den Insertions-

Mutanten eine Bande von 4.7 kb Grösse vorhanden, bei der es sich

wahrscheinlich um ein „Readthrough" Produkt in das Tn55i handelte. Die 2.2

A

kb a b c

4.7 -

3.2 - »^

1.3-

B

a b c d

Figur 11 : Northern Blot der glmM Region. (A) Hybridisierung mit

einer glmM internen Probe (Fig. 8) und (B) Hybridisierung mit dem

argl (Fig. 8). a, BB255; b, BB270; c. PG108; d, PG100. Die

Grössen der einzelnen Banden sind angegeben.

Resultate 62

kb grosse Bande schien der Länge nach einem zweizistronischen Transkript

ausgehend vom orfl zu entsprechen. Dem widerspricht die Tatsache, dass eine

Bande in genau derselben Grösse bei den glmM Mutanten vorkommt, was

aufgrund der Tn55i Insertion nicht der Fall sein dürfte.

Aufgrund der Sequenzanalyse wurde postuliert, dass argl unabhängig

von den ORF orfl, orfl und glmM transkribiert werde. Daher wurde auch mit

einer argl internen Probe (Fig. 8) hybridisiert um dieses Postulat zu

überprüfen. Die erhaltene Bande hatte eine Grösse von 1.25 kb und war somit

um die 300 Nukleotide grösser als argl (Fig. IIB). Ihre Grösse und das

Vorhandensein sowohl in den Wildtypen und Mutanten haben gezeigt, dass argl

offenbar nicht zum glmM Operon gehört. Weshalb die Bandenintensität vom

argl Transkript in den Mutanten stärker war als im Wildtyp konnte nicht

geklärt werden.

Reverse Transkription

Einen weiteren Hinweis darauf, dass argl unabhängig vom postulierten

glmM Operon transkribiert wird, hat die Analyse der mRNA mittels reverser

Transkription und anschliessender PCR-Amplifikation geliefert. Sowohl eine

Amplifikation mit den Primern 1 und 5, als auch eine mit den Primern 1 und 8

lieferte kein RT-PCR Produkt, woraus geschlossen werden konnte, dass

anscheinend keine mRNA existierte, die sowohl argl als auch das glmM

Operon beinhaltete (Fig. 12). Die RT-PCR Analyse des glmM Operons im

Wildtyp BB270 und der entsprechenden glmM Mutante PG108 mit den

Primern 3 und 5 ergab sowohl im Wildtyp als auch in der Mutante ein 1969 bp

langes Produkt, das den grössten Teil von orfl, orfl und den Anfang von

glmM beinhaltete (Fig. 8). Mit den Primern 4 und 7 resultierte nur im Wildtyp

ein 2091 bp grosses, orfl-glmM abdeckendes Fragment, während in der glmM

Mutante, die das 5.2 kb grosse Tn55i Insert trug, kein Transkript zu sehen war

(Fig. 8). Da aber sowohl mit den Primern 3 und 5 und den Primern 4 und 5

bei der Mutante und beim Wildtyp ein Transkript zu sehen war und somit die

kb abcdefghi

Figur 12: RT-PCR mit verschiednen Primern von mRNA von

PG108 (Spuren a-d) und BB270 (Spuren f-i).

a, Primerpaar 5/3; b. Kontrolle von Primerpaar 5/3; c, Primerpaar

5/4; d, Kontrolle von Primerpaar 5/4; e. Marker; f, Kontrolle von

Primerpaar 5/3; g. Primerpaar 5/3; h, Kontrolle von Primerpaar II

4; i, Primerpaar 7/4.

Resultate 64

transkriptionelle Verbindung zwischen den drei ORF gezeigt war, konnte orfl-

orfl-glmM als dreizistronisches Operon bestätigt werden (Fig. 8; Fig. 12).

Transkriptionsstart-Bestimmung mittels Primer-Extension

Bei der Hybridisierung der Northern Blots mit der glmM internen Probe

erhielt man beim Wildtyp BB270 drei Banden verschiedener Grössen. Das 3.2

kb grosse Transkript wurde postuliert, die drei ORFs orfl-orfl-glmM zu

beinhalten (Fig. IIA). Das 1.3 kb grosse Transkript stammte, da es in den

Mutanten fehlte, von glmM ab (Fig. IIA). Dies deutete auf mindestens zwei

verschiedene Transkriptionsstart hin: einen am Anfang des Operons vor orfl

und einen zweiten vor glmM. Diese Annahme wurde mittels Primer-Extension

überprüft. Die dazu verwendeten Primer sind in Material und Methoden

aufgelistet.

Die getroffenen Annahmen konnten experimentell bestätigt werden. So

wurden kurz vor dem orfl zwei, nur durch drei Nukleotide getrennte

transkriptioneile Starts identifiziert und zwar an Position 1167 und Position

1171 (Fig. 9; Fig. 13). Diese beiden Starts wurden mit allen drei eingesetzten

Primern bestätigt. Ebenfalls gefunden wurde der transkriptioneile Start 5' von

glmM. Dieser befand sich an Position 2954, 13 Nukleotide entfernt vom

Startkodon von glmM (Fig. 9; Fig. 13).

Hingegen konnte, auch mit verschiedenen Primern, vor orfl kein

transkriptioneller Start identifiziert werden. Zudem konnte keine mögliche

Promotor- oder Shine-Dalgarno Sequenz vor dem orfl identifiziert werden.

Der orfl scheint demnach nur im Zusammenhang mit dem ganzen Operon

transkribiert zu werden. Bei der 2.2 kb grossen Bande, die bei der

Hybridisierung der Northern Blots erhalten wurde, scheint es sich daher um

ein Abbauprodukt des grösseren Transkripts zu handeln.

Weiter wurde in der Promotor Region des orfl-orfl-glmM Operons

eine für den Stressfaktor SigB spezifische Promotorsequenz identifiziert (Fig.

14) (39). Allerdings befindet sich, wenn man von diesem SigB Promotor

Resultate65

G A T C G A T C

B

Figur 13: Transkriptionsstarts. Die Transkriptionsstarts des glmM

Operon wurde mittels Primer Extension bestimmt. Die Spuren G, A, T

und C zeigen die Sequenz der entsprechenden Region des glmM

Operons. (A) zeigt den Transkriptionsstart von orfl, (B) denjenigen

von glmM. Die Transkriptionsstarts sind jeweils mit einem Stern

gekennzeichnet.

VV

TGTCGTATGACAGTGATGTAAATGATTGGTATAATGGGTATTATGGAAAAATATTCCCGGAGGAGATGTTATGGA

35

-10

^#

TGTCGTATGACAGTGATGTAAATGATTGGTATAATGGGTATTATGGAAA

-35

-10

TGTCGTATGACAGTGATGTAAATGATTGGTATAATGGGTATTATGGAAA

B

Figur

14:PromotorRegiondesorfl-orß-glmMOperons.

(A)gesamtePromotorRegiondesglmM

Operons:

v,Transkript

ions

star

tpun

kte:

I1

,Shine-Dalgarno

Sequenz;

unte

rstr

iche

n,Startkodon

ATG.

(B)

vorgeschlagene

Promotor

Region

desglmM

Operons

mit

den

beiden

Transkriptionsstartpun

kten

undSigB-ErkennungssequenzinnerhalbderPromotorRegion.

Resultate 67

ausgeht, der erste Transkriptionsstart A mitten im -10 Bereich des Promotors

und der zweite Transkriptionsstart nur zwei Nukleotide vom letzten Nukleotid

von der -10 Region entfernt. Trotzdem wurde mRNA aus sigB Mutanten und

gestressten Wildtypen isoliert, um einen ersten Eindruck einer möglichen

Wirkung des SigB Promotors zu erhalten. Die mit 6% v/v 100% EtOH

gestressten Stämme (siehe auch Kapitel 2.6.) zeigten zwar kein anderes

Bandenmuster als deren Wildtypen, aber es waren Unterschiede in den

Intensitäten der Banden festzustellen (Fig. 15). Es hat sich gezeigt, dass bei den

sigB Mutanten und den mit EtOH gestressten Zellen die 1.3 kb glmM Bande

eine grössere Intensität aufwies. Vor allem bei den sigB Mutanten war die

glmM Bande viel intensiver als beim entsprechenden Wildtyp.

Die Zellwand von der glmM Mutante PG108 unterschied sich nicht

wesentlich von der Zellwand des Wildtyps BB270, ausser durch eine geringe

Menge an durch ein D-Ala substituierte Interpeptidkette. Wurde jedoch die

glmM Mutante in Anwesenheit von Erythromycin wachsen gelassen, erschienen

Monomer- und Dimer-Muropeptide, die auf eine erhöhte Endopeptidase-

Aktivität schliessen lassen (Roos, persönliche Mitteilung). Es schien so, als

würde Erythromycin bei PG108 in der Lage sein, regulatorisch auf eine

Endopeptidase zu wirken. Um zu testen, ob Erythromycin einen Einfluss auf

die Transkription des glmM Operons hat, wurden daher PG108 und PG100 in

Erythromycin wachsen gelassen und daraus die mRNA isoliert. Es konnten

allerdings keine Veränderungen der Bandenmuster festgestellt werden (Fig.

15), so dass angenommen wird, dass Erythromycin keinen Einfluss auf die

Transkription des glmM Operons hat.

3.1.4. Komplementation der glmM Mutation

Die Insertionsinaktivierung von glmM führte zu einer Reduktion der

Grundresistenz. Um zu überprüfen, ob die Abnahme der Grundresistenz auf

die Transposon-Insertion zurückzuführen ist, wurde die glmM Mutante PG108

mit dem Plasmid pPG76 (argl-orfl-orß-glmM) und dem Plasmid pHK4176

abcdefghij

kl

m

Figu

r15:NorthernBlotverschiedenerglmM-und

s/gZ

?-Mu

tant

enhy

brid

isie

rtmitglmM

internenFragment

(Fig

.8).

a,PG100

(Em);

b,PG100;

c,BB591

(Em);

d,BB591;

e,

PG108

(Em);

f,PGJ08;

g,COLAsigB;

h,COL

(EtOH);

i,COL;

j,BB270AsigB;

k,BB270

(EtOH);

1,BB270;m,PG79.(EtOH):ab

einerbestimmtenOD600mit6%

v/v100%EtOH

bis

zurgewünschten

OD600

gest

ress

t;(E

m):

Zellen

inLB

mit20pg/ml

Erythromycin

gewachsen.

Resultate 69

(glmM) in trans komplementiert, das heisst, es wurde untersucht, ob dank dem

transduzierten Plasmid wieder MHK-Werte des Wildtyps BB270 erreicht

werden können.

Komplementation in trans

Die Komplementation der glmM Mutation wurde sowohl mit dem

Plasmid pHK4176 (glmM), als auch mit dem Plasmid pPG76 (argl-orfl-orß-

glmM) durchgeführt.

Die Komplementation von PG108 mit pPG76 ergab den Stamm PG79,

der dieselbe Resistenz gegen ß-Laktame sowie Teicoplanin aufwies wie der

parentale Stamm BB270 (Tab. 7). Hingegen konnte in PG108 mit dem Plasmid

pHK4176 (Stamm PG231) nur die ß-Laktam Resistenz nicht aber die

Teicoplanin-Resistenz wieder hergestellt werden. Auch im Suppressor Stamm

PG100 hatte das Plasmid pHK4176 (Stamm PG232) keinen Einfluss auf die

Teicoplanin-Resistenz. Dies führte zur Vermutung, dass möglicherweise orfl

und/oder orß einen Einfluss auf die Teicoplanin Resistenz ausüben könnten.

Phänotypische Komplementation

Die Syntheseschritte, die in E. coli zu GlcNAc-1-P, einem

zytoplasmatischen Vorläufer der Peptidoglykansynthese, führen, sind vor

kurzem veröffentlicht worden (Fig. 16) (90). Aufgrund dieser Daten wurde

versucht glmM durch externe Zugabe eines Vorläufers von GlcNAc-1-P

phänotypisch zu komplementieren. Der Einfluss von Mannosamin,

Glukosamin, Glukose, Glukose-1,6-di-Phosphat oder Glukose-1-Phosphat auf

die MHK von Methicillin wurde bestimmt.

Nur Glukosamin konnte die Methicillin-Resistenz von Stamm PG108 auf

die Werte des Ausgangsstammes BB270 erhöhen (Tab. 8). Die anderen

getesteten Zucker hatten keinen Einfluss auf die Methicillin-Resistenz und die

NANA

ManNAc-

GlcNAc-

GlcN-

NanT NanA

NANA ManNAc + Pyruvat

NanK

ManNAc-6-P

NanE

GlcNAc-6-P,

NagA*

NagB

GlcN-l-P

GlmU

tGlcNAc-1-P

GlmU

Glc-6-P

aussen mnen UDP-GlcNAc

Figur 16: Synthese von GlcNAc-1-P in E. coli nach Piumbridge et al. (90),verändert. Ausgezogene Pfeile: in E. coli identifizierte Stoffwechselschritte;

gestrichelte Pfeile: postulierte Wege in S. aureus; NANA: N-

Acetylneuraminsäure; ManNAc: N-Acetylmannosamin; GlcN: Glukosamin;

GlcNAc: N-Acetylglukosamin; Fru: Fruktose; Glc: Glukose. NanT: NANA-

Transporter; NanA: NANA-Lyase; NanK: ManNAc Kinase; ManXYZ:

Phosphotransferase System (PTS); NanE: Epimerase; NagG: GlcNAc

spezifischer PTS Transporter; NagA: Deacetylase; NagB: Deaminase;

GlmS: Amidotransferase; GlmM: Phosphoglukosamin-Mutase; GlmU:

bifunktionelles Enzym, Acetyltransferase und UDP-Pyrophosphorylase.

Tabelle

8:EinflussverschiedenerGlcNAc-1-PVorläuferaufdieMHK

von

MethicillinundTeicoplanin

inverschiedenen

Stämmenim

Mikrodilutionsverfahren.

MethicillinMHK

pg/ml

TeicoplaninMHK

pg/ml

Stämme

+10mM

Glukose

+10mM

Glukosamin

+5mM

Glukose

1,6-

di-P

+10mM

Glukose-1-P

+5mM

Mannosamin

+10mM

Glukosamin

PG108

42

>256

0.5

40.5

0.032

0.032

BB270

128

128

>256

232

41

0.5

Ha56

22

80.5

20.5

0.032

0.032

BB1395

44

256

44

10.25

0.25

Ha57

32

32

256

4128

80.25

0.125

BB1399

64

64

16

0.5

128

64

0.5

0.25

COL

>256

>256

>256

32

256

64

1.5

1

COL-TSlll

0.5

132

<0.25

20.5

0.063

0.25

P:Phosphat

Resultate 72

phosphorylierten Zucker hatten sogar eine hemmende Wirkung auf das

Wachstum und die MHK-Werte.

Bei Teicoplanin war mit keiner der Vorläufersubstanzen eine

Veränderung in der Empfindlichkeit gegen dieses Glykopeptid festzustellen

(Tab. 8).

3.1.5. Wachstumsverhalten

Nachdem bekannt war, dass Glukosamin die Methicillin-Resistenz in

glmM Mutanten erhöhte, wurde dessen Einfluss auf die

Wachstumsgeschwindigkeit untersucht. Interessanterweise hatte die Zugabe von

10 mM Glukosamin in der exponentiellen Wachstumsphase bei allen getesteten

Stämmen einen hemmenden Einfluss, wie dies bei den anderen getesteten

Substanzen bereits bei der MHK Bestimmung festgestellt werden konnte. Dies

drückte sich auch in den höheren Generationszeiten aus. So betrug die

Generationszeit von PG108 71 min, währenddessen die Generationszeit

desselben Stammes bei Zugabe von Glukosamin auf 81 min anwuchs. Noch

deutlicher fiel dieser hemmende Einfluss bei PG100 aus: ohne Glukosamin

betrug die Generationszeit rund 94 min und mit Glukosamin etwa 120 min.

Auch BB270 war von einer Generationszeitzunahme unter Glukosamineinfluss

betroffen: hier stieg die Zeit von 67 auf 85 min. Dafür erreichten die mit

Glukosamin wachsenden Zellen die höhere OD600als diejenigen Zellen, die ohne

Glukosamin wuchsen (Fig. 17). Diese erhöhte OD könnte auf die erhöhte C-

Quelle durch die externe Glukosaminzugabe zurückzuführen sein, während der

hemmende Einfluss der externen Glukosaminzugabe auf das Wachstum auf die

Katabolitrepression zurückzuführen ist.

3.1.6. Proteinanalysen

MRSA Stämme besitzen das Strukturgen mecA, das für ein zusätzliches,

hochmolekulares PBP, das PBP2', kodiert, das für die Methicillin-Resistenz

min

mm

mm

B

Figur

17:Wachstumskurvenmit/ohne

10mM

Glukosaminim

LB-Medium.D,

repr

äsen

tier

tLB-

MediumohneGlukosamin;A,

repräsentiertLB-MediummitGlukosamin.A,BB270;B,PG108;

C,

PG100.

Resultate 74

verantwortlich ist. PBP-Profile der verschiedenen Stämme zeigten, dass glmM

keinen Einfluss auf die PBP2' Produktion hatte. Die typische PBP2' Bande war

sowohl beim Wildtyp BB270 als auch bei der glmM Mutante PG108 und der

Suppressor Mutante PG100 deutlich zu sehen (Fig. 18B). Im Vergleich dazu

fehlte diese Bande beim MSSA Stamm BB255 (Fig. 18B, Spur a). Liess man

den Wildtyp BB270 ÜN in Anwesenheit von Methicillin wachsen, so zeigte

sich, dass alle PBP ausser dem PBP2' und einem kleinen Anteil des PBP2 mit

Methicillin abgesättigt waren und daher nicht mit dem radioaktiven

(3H)Benzylpenicillin markiert werden konnten (Fig. 18B, Spur c). Das

Membranprotein Muster der Suppressor Mutante PG100 zeigte zudem eine 49

kDa grosse Bande (Fig. 18A, Spur d) von starker Intensität verglichen mit den

übrigen Stämmen. Diese 49 kDa Bande könnte möglicherweise mit der

postulierten Suppressor Mutation hmrDl zusammenhängen.

Anhand der aus den Northern Blots erhaltenen Resultate wurde davon

ausgegangen, dass PG108 und PG100 kein GlmM produzieren würden. Dies

konnte in Western Blots bestätigt werden (Fig. 19). Sowohl beim Stamm

PG108 als auch beim Suppressor Stamm PG100 konnte mit den GlmM-

Antikörpern keine Phosphoglukosamin-Mutase mehr nachgewiesen werden,

während bei den MSSA und MRSA Wildtypen und beim komplementierten

Stamm PG79 ein Signal detektiert werden konnte. Das Molekulargewicht der

GlmM Bande betrug etwa 57 kDa und war somit um 7.4 kDa grösser als die

errechnete. Bei den zusätzlichen Banden von geringerem Molekulargewicht

beim komplementierten Stamm handelt es sich wahrscheinlich um unspezifische

Produkte, da mit ungereinigten Antikörpern hybridisiert wurde.

Da eine mögliche SigB abhängige Promotorsequenz vor dem glmM

Operon identifiziert wurde (Fig. 14), wurde überprüft, ob das glmM Operon

durch einen der bekannten globalen Regulatoren beeinflusst wird. Es wurden

sowohl sigB-, sar- als auch agr- Mutanten auf ihre GlmM Expression

untersucht. Bei den aus ÜN-Kulturen gewonnen Proteinen zeigte sich zwischen

den Wildtypen und den entsprechenden Mutanten Unterschiede in der Intensität

der GlmM Bande (Fig. 20A und 20B). Wiederum war ein Unterschied

Resultate 75

kDa abcdeabcde

200^»*w!(**

A

^W-VYsfe

O

PBP3

PBP4

Figur 18: Membranproteine und PBP. (A) Coomassie blau

gefärbtes Membranproteingel mit den Stämmen a, BB255; b,

BB270; c, BB270; d, PG100; e, PG108.

Alle Stämme wuchsen in LB-Medium ohne Antibiotikazugabeausser BB270 in Spur c, dem 256 pg/nü Methicillin beigefügtwurden.

(B) Fluorogramm der (Tf)PeniciHin-markierten PBP vom

Coomassie blau gefärbten Membranproteingcl (A). Die Grössen

des Molekulargewichtsmarkers und die Positionen der

hochmolekularen PBP sowie die Position der 49 kDa Bande sind

gekennzeichnet.

Resultate 76

kDa a b c d e f

Figur 19: Nachweis der Phosphoglukosamin Mutase m verschiedenen

Stammen im Western-Blot. Zytoplasmatische Zeil-Extrakte von UN-

Kulturen wurden mit Anti-GlmM Antikörpern hybridisiert, a, PG79; b,

PG100; c, PG108; d. BB255; e. BB270, t, lekombinantes GlmM. Der

Pfeil zeigt auf GlmM

Resultate 77

a b c d e f g

*Pf| ^—y

l\

a b c d e f g

B

Figur 20: Nachweis der Phosphoglukosamin Mutase in

verschiedenen sigB- (A), agr- und «//--Mutanten (B) im Western-

Blot. Zytoplasmatische Zeil-Extrakte von ÜN-Kulturen wurden

mit Anti-GlmM Antikörpern hybridisiert. (A): a, BBIOOO; b,

BB WOOAsigB; c. COL ; d, COL AsigB; e, BB255; f, BB255A.s7##;g, PGI08. (B): a. BB1164; b, BB1163; c, BB1 166; d, BB1165; e,

BB270; f. Molekluargewichtsmarker; g, PGJ08. Pfeil zeigt auf

GlmM.

Resultate 78

zwischen dem Wildtyp und seiner sigB Mutante festzustellen, wie dies schon

bei den Northern Blots zu sehen war. Die sigB Mutante schien jeweils mehr

GlmM zu produzieren als der Wildtyp (Fig. 20A). Dieser Unterschied war vor

allem zwischen BB255 und seiner sigB Mutante zu erkennen. Bei der agrisar

Doppelmutante BB1164 schien weniger GlmM produziert zu werden als bei

der agr Mutante BB1163 (Fig. 20B). Wie relevant diese Resultate allerdings

sind lässt sich erst sagen, wenn die GlmM Expression in den verschiedenen

Stämmen über die gesamte Wachstumsphase überprüft würde. Einzig bei der

sigB Mutation scheint ein Zusammenhang zu bestehen zwischen der sigB

Mutation und der Menge an transkribierten glmM (Fig. 15) und der Menge an

produziertem GlmM.

GlmM ist in den Biosyntheseweg der Peptidoglykan-Vorläufer

involviert. Daher wurde angenommen, dass GlmM dementsprechend nur im

Zytoplasma gefunden würde. Wie Figur 21 zeigt, konnte GlmM zwar in der

Membranproteinfraktion nicht nachgewiesen werden, dafür wie erwartet in der

Zytoplasmafraktion.

3.2. Das fmtB-System

Die meisten Methicillin-Resistenz beeinflussenden Faktoren wurden

mittels Tn55I Insertions-Mutagenese und anschliessender Zunahme der

Methicillin-Empfindlichkeit identifiziert. Nicht-inhibitorische Konzentrationen

des nicht-ionischen Detergens TritonX-100 reduzieren die Oxacillin Resistenz

in MRSA ohne dabei das Wachstum, die Lebensfähigkeit oder die PBP2'

Produktion zu beeinflussen (55, 56). Der Einfluss von TritonX-100 auf die

Zunahme der Empfindlichkeit ist von Stamm zu Stamm unterschiedlich und

scheint vom genetischen Hintergrund des jeweiligen Stammes abzuhängen.

Wenn nebst der Zunahme der Empfindlichkeit gegenüber Oxacillin auch noch

die Zunahme der Empfindlichkeit gegenüber TritonX-100 als Kriterium zur

abed efghiWW

A

abed efgh

B

Figur 21: Nachweis der Phosphoglukosamin Mutase in

verschiedenen glmM- und ////fB-Mutanten im Western-Blot.

Entsprechende Zeil-Extrakte aus ÜN-Kulturen wurden mit

Anti-GlmM Antikörpern hybridisiert. (A) zytoplasmatischeFraktion: a, Ha56; b, Ha57; c. Marker; d, COL; e, COL-TS111 ;

f, BB270; g, PG108; h. PG100; i, PG79.

(B) Membranprotein Fraktion: a, Ha56; b, Ha57; c, COL; d,

COL-TS111; e. BB270; f, PG108; g. PG100; h, PG79.

Der Pfeil zeigt auf GlmM.

Resultate 80

Identifikation von Mutanten eingesetzt wird, können andere Arten von

Faktoren gefunden werden, die die Resistenz beeinflussen können.

Distal von glmM liegt fmtB, das von Komatsuzawa identifiziert, kloniert

und sequenziert wurde. fmtB kodiert für ein 263 kDa grosses Peptidoglykan-

assoziiertes Protein. Es hat die für ein Peptidoglykan-assoziiertes Protein

typische positive Ladung im C-Terminus, gefolgt von einer Signalsequenz, dem

Zellwand-sortierenden LPXTG-Motif, einer im zentralen Bereich von FmtB

gelegenen 17 fachen Tandem-Repeat-Region von 75 AS sowie einem 687 AS

langen N-terminalen Teil (Fig. 22). Komatsuzawa konnte proximal vom

Startkodon von fintB eine mögliche Shine-Dalgarno Sequenz identifizieren und

mittels Primer-Extension 14 bp proximal zum Startkodon den

Transkriptionsstart bestimmen.

3.2.1. Phänotypische Charakterisierung der Tn55I Insertion in

fmtB

Komatsuzawa konnte zeigen, dass eine Tn557 Insertion in fmtB im

homogen hoch Methicillin-resistenten Stamm COL eine starke Reduktion der

Oxacillin-Resistenz (Tab. 9) und eine Reduktion der Resistenz gegenüber

TritonX-100 bewirkte (Komatsuzawa et al., Manuskript eingereicht).

Rückkreuzungen in zwei genetisch unterschiedliche aber ebenfalls homogen

hoch resistente MRSA bestätigten die starke Reduktion der Oxacillin-Resistenz

durch die Insertion fmtB::Tn551. In MSSA Stämmen hatte die Tn557 Insertion

in fmtB weder einen Einfluss auf die Oxacillin- noch auf die Triton-XIOO

Empfindlichkeit. Die Transduktion von fintB::Tn3'51 in BB270 ergab zwei

Typen von Transduktanten. Transduktanten vom Typ I, repräsentiert durch die

beiden Stämme Ha57 und BB1399, waren Methiciliin-resistent und erschienen

bereits nach zwei Tagen, während Transduktanten vom Typ II, repräsentiert

durch die beiden Stämme Ha56 und BB1395, Methicillin-empfindlich waren

und erst nach vier Tagen Inkubation erschienen. Das Verhältnis Typl : TypII

betrug 1:10 nach sechs Tagen Inkubation. Transduktanten vom Typ I zeigten

Tn55i

glmM

nght R]

-R17

LPXTG

EfmtB

PB

CP

PEC

P

1kb

Figur

22:

RestriktionskartederfmtB

Region.

B,BamHl;

C,

Clal

;E,EcoRV;

P,Pstl.Die

Positionund

Orientierung

desTn551

istangegeben.R1-R17:

Inverted

Repe

ats.

LPXTG:

Zellwand-sortierendeMotifimC-terminalenBereich..Die

fürdenNorthernBlotverwendete

internefmtBProbe

istalsdo

ppel

teLinieangegeben.

Resultate 82

Tabelle 9: Minimale Hemmkonzentrationen von Oxacillin und Teicoplanin

gegen verschiedene ymtö-Mutanten.

Stämme MHK(ag/ml)OX TP

COL >256Jmi

COL-TSlll 0.13 0.19

COL-TSlll

pHK4357 (fmtBvon COL) 0.13* nb

COL-TSlll

pHK4069 (fmtBvon KSA8)COL-TSlll

pHK4176 (glmM)COL-TSlll

pHK4251(glmM+fmtB)

0.13*

128*

256*

nb

nb

nb

RN450 1 1.5

RN450-TS111 0.75 1.5

BB270 12 1

Ha56 0.38 0.38

BB1399 0.75 0.38

Ha57 12 1.5

BB1395 12 1

OX: Oxacillin; TP: Teicoplanin; *: Werte von Komatsuzawa; nb: nichtbestimmt

Resultate 83

dicke, fette Kolonien, wohingegen die Transduktanten vom Typ II schwach

wuchsen und nur kleine Kolonien bildeten. Beide Typen von Transduktanten

waren Hämolyse positiv. Obwohl sich die zwei Typen in ihrer Resistenz

gegenüber Methicillin unterschiedlich verhielten, enthielten sie die

fmtB::Tn551 Insertion wie durch Southern Blots bestätigt werden konnte

(Daten nicht gezeigt).

3.2.2. Komplementation der fmtB Mutation

Komplementation in trans

Interessanterweise konnte Komatsuzawa die fmtB Mutation weder mit

fmtB aus COL noch mit fmtB aus KSA8, einem weiteren MRSA,

komplementieren. Die Oxacillin Empfindlichkeit war dieselbe wie in der

ursprünglichen fintB Mutante COL-TSlll (Tab. 9). D'à fmtB nur wenige

hundert Nukleotide distal vom glmM Operon liegt, wurde vermutet, dass die

Tn55i Insertion möglicherweise einen polaren Effekt auf das gesamte glmM

Operon oder zumindest auf glmM ausüben könnte und die Resistenz gegen

Oxacillin aus diesem Grund herabgesetzt wurde. Die Komplementation von

fintB: :Tn551 mit glmM alleine führte zu einem 1000 fachen Anstieg der MHK

verglichen mit der Mutante (Tab. 9). Wurde fmtB::Tn551 mit glmM plus fmtB

komplementiert, wurden fast die MHK Werte des Wildtyps erreicht.

Phänotypische Komplementation

Da die Zugabe des Zellwandvorläufers Glukosamin bei PG108 die

Resistenz wiederherstellen konnte und glmM in trans die fmtB Mutation

komplementieren konnte, wurde der Einfluss von Glukosamin und N-

Acetylglukosamin auf die Methicillin-Resistenz bei fmtB Mutanten untersucht.

Die Zugabe sowohl von Glukosamin als auch von N-Acetylglukosamin

Resultate 84

erhöhten die Resistenz (Tab. 10), wobei die ursprüngliche Oxacillin-Resistenz

des Wildtyps mit beiden Zellwandvorläufern nicht ganz erreicht wurde.

3.2.3. Wachstumsverhalten

Wie bei den glmM Mutanten wurde auch bei den fmtB Mutanten der

Einfluss von Glukosamin auf das Wachstum untersucht. Während die

Generationszeit bei COL um die 66 min war, war diejenige von COL-TSlll

rund 73 Minuten. Interessanterweise hatte Glukosamin eine eher hemmende

Wirkung auf die Verdopplungszeit, auch wenn der Einfluss nicht so stark

ausfiel wie bei PG100. Unter Einfluss von Glukosamin erreichten die

Generationszeiten einen Wert von 83 min bei COL bzw. 87 min bei seiner

entsprechenden fmtB Mutante (Fig. 23). Bei den von BB270 abstammenden

fmtB Transduktanten war die Generationszeit in etwa gleich wie bei ihrem

Ausgangsstamm. Sie betrug bei der TypI/mfß Transduktante Ha57 71 min und

bei der TypII fmtB Transduktante 68 min (Fig. 24). Offenbar hatte die fmtB

Mutation in BB270 nur einen geringen Einfluss auf die Generationszeit. Aber

auch bei den beiden Typen von BB270 ^«^-Transduktanten hatte die Zugabe

von 10 mM Glukosamin in der exponentiellen Wachstumsphase einen

hemmenden Einfluss. Dafür erreichten die Ansätze mit Glukosamin ebenfalls

höhere Endkonzentrationen.

3.2.4. Transkription der fmtB Region

Die DNA-Sequenz der Region zwischen glmM und fmtB Hess vermuten,

dass die beiden ORF vermutlich unabhängig voneinander transkribiert werden.

Da glmM die fmtB Mutation in trans komplementieren konnte, wurde

untersucht ob diese Tn55i Insertion möglicherweise einen Einfluss auf die

glmM Transkription hat. Die Transkription war jedoch identisch im Wildtyp

und in der fmtB Mutante (Fig. 25). Es konnte in keinem Fall ein Transkript

Resultate85

Tabelle 10: Einfluss von N-Acetylglukosamin und Glukosamin auf die MHK

von Oxacillin (Werte erhalten von Komatsuzawa).

Oxacillin MHK

pg/ml

Stämme +10mMN-

Acetylglukosamin

+10 mM

Glukosamin

COL

COL,fmtB::Tn551

COL glmM::Tn551

512

0.25

4

512

64

64

1024

32

64

min

A

mm

B

Figur

23:Wachstumskurvenmit/ohne

10mM

Glukosaminim

LB-Medium.,

repr

äsen

tier

tLB-


repräsentiertLB-MediummitGlukosamin.A,COL;B,COL-TSl

11.

mm

B

mm

mm

Figur24:Wachstumskurvenmit/ohne

10mM

Glukosaminim

LB-Medium.,

repr

äsen

tier

tLB-


repräsentiertLB-MediummitGlukosamin.A,BB270;B,Ha57;

C,

BB1399.

Resultate 88

kb abed

Figur 25: Transkription von glmM. Northern Blot der fmtBMutanten und ihren entsprechenden Wildtypen hybridisiert mit

einem glmM internem Fragment (Fig. 8). a, COL; b, COL

fmtB::Tx\551; c, RN450; d, RN450,/mfi::Tn557. Die Grössen der

einzelnen Banden sind angegben.

Resultate 89

grösser als 3.2 kb nachgewiesen werden, was bei einer Kotranskription von

glmM undfmtB der Fall sein müsste.

Die fmtB Transkription wurde mittels Northern Blots und einer Probe

aus dem N-terminalen Bereich von fmtB (Fig. 22) analysiert. Da nur diffuse

Abbauprodukte und keine Transkripte von der zu erwartenden Grösse

nachgewiesen werden konnten, ist nicht bekannt, ob fmtB Teil eines grösseren

Operons ist oder allenfalls monozistronisch transkribiert wird (Daten nicht

gezeigt).

3.2.5. Proteinanalysen

Da die Komplementation von fintB;:Tn551 mit fmtB keine Zunahme der

Oxacillin-Resistenz zur Folge hatte, mit glmM hingegen erfolgreich war,

drängte sich die Frage auf, ob in den fintB Mutanten eventuell die GlmM

Produktion durch Tn557 Insertion beeinflusst worden ist. Western Blots mit

entsprechenden GlmM-Antikörpern zeigten, dass immer noch GlmM

produziert wurde, unabhängig davon, ob das fmtB unterbrochen war oder

nicht (Fig. 21). Die reduzierte Oxacillin-Resistenz in fmtB Mutanten schien

daher nicht direkt mit der Menge von produziertem GlmM

zusammenzuhängen.

3.3. Das femX-System (fmhB-System)

3.3.1. Identifizierung des fem Faktors femX (fmhB)

FemA und FemB sind in die Synthese der Pentaglycin Seitenkette

involviert. Sie kanalisieren oder kontrollieren den Einbau von Gly2-Gly3

(FemA) und Gly4-Gly5 (FemB). Ein dritter Faktor, FemX, der für den Einbau

des ersten Glycins verantwortlich ist wurde bereits postuliert (57). Es wurde

vermutet, dass FemX Sequenzähnlichkeit mit FemA oder FemB haben könnte

Resultate 90

und dass femX für das Überleben der Zelle essentiell ist. Eine potentielle

Sequenz fmhB, die femX entsprechen könnte, wurde durch Tschierske

beschrieben (110).

Anhand der zum Teil bekannten Sequenz von fmhB wurde eine Probe

hergestellt (Fig. 26) um das fmhB Allel und die umliegende Region aus dem

Stamm BB270 zu klonieren. Ein 4 kb grosses EcoRV Fragment wurde in einen

Smal geschnittenen pUC18 Vektor Moniert. Das daraus resultierende Plasmid

pPGl.l mit einem Insert von ungefähr 4 kb Grösse wurde vollständig

durchsequenziert.

Analysieren der Sequenz

Der ORF des fmhB beginnt bei Nukleotid 1 und endet bei Nukleotid

1263 (Fig. 27). fmhB kodiert für ein 421 AS grosses Protein mit einem

errechneten Molekulargewicht von 46.3 kDa. FmhB hat eine Identität von 27%

zu FemA und eine Identität von 26% zu FemB (110). Distal zu fmhB folgte ein

Abschnitt von sieben Thymidin-Resten mit vorgestelltem Inverted Repeat von 9

Nukleotiden, der für einen Faktor-unabhängigen RNA-Polymerase Terminator

charakteristisch ist (17). DG für diesen Terminator beträgt -10.2 kcal/mol.

In einem Abstand von 173 Nukleotiden 3' von fmhB konnte das 5' Ende

eines ORFs identifiziert werden, der über den Monierten Bereich

hinausreichte. Er startet bei Nukleotid 1437 und bricht aufgrund der Grösse

des klonierten Fragments bei Nukleotid 3858 ab. Die Grösse des partiellen

Proteins beträgt 807 AS und hat ein Molekulargewicht von 88.7 kDa.

Datenbankvergleiche des partiellen Proteins ergaben die grösste

Homologie mit YerP, einem Protein von B. subtilis, welches Ähnlichkeit zu

einem Akriflavin-Resistenz Protein hat. Zu diesem YerP wurde eine Identität

von 42% und eine Ähnlichkeit von 63% gefunden.

fmhB

t/—

EBC

BHA

CC

1kb

Figur

26:

RestriktionskartederMoniertenfmhB

Region.Die

offenen

Leseraster

sindmit

Pfeilenangegeben.DieMeinennummerierten

Pfeilegeben

Orientierung

und

Positionder

PCR

Primer,mitdenen

dieProbe

hergestelltwurde

an.DieProbe

istdurchdieDoppellinie

angegeben.A,AccI;B,BamHl;C,

Clal

;E,EcoKV;H,Hindlll.

Resultate 92

ATGGAAAAGATGCATATCACTAATCAGGAACATGACGCATTTGTTAAATCCCACCCAAAT]_ ******

gg

1MEKMHITNQEHDAFVKSHPN 20

GGAGATTTATTACAATTAACGAAATGGTCAGAAACAAAGAAATTAACTGGATGGTACGCG61 * * * * * * 120

21GDLLQLTKWSETKKLTGWYA 40

CGAAGAATCGCTGTAGGTCGTGACGGTGAAGTTCAGGGTGTTGCGCAGTTACTTTTTAAA

121 ****** !80

41RRIAVGRDGEVQGVAQLLFK 60

AAAGTACCTAAATTACCTTATACGCTATGTTATATTTCGCGTGGTTTTGTTGTTGATTAT

181 ****** 240

61KVPKLPYTLCYISRGFVVDY 80

AGTAATAAAGAAGCGTTAAATGCATTGTTAGACAGTGCAAAAGAAATTGCTAAAGCTGAG

241 ****** 300

81SNKEALNALLDSAKEIAKAE 100

AAAGCGTATGCAATTAAAATCGATCCTGATGTTGAAGTTGATAAAGGTACAGATGCTTTG

301 ****** 350

101 KAYAIKIDPDVEVDKGTDAL 120

CAAAATTTGAAAGCGCTTGGTTTTAAACATAAAGGATTTAAAGAAGGTTTATCAAAAGAC361 * * * * * * 420

121 QNLKALGFKHKGFKEGLSKD 140

TACATCCAACCACGTATGACTATGATTACACCAATTGATAAAAATGATGATGAGTTATTA421 ****** 480

141 YIQPRMTMITPIDKNDDELL 160

AATAGTTTTGAACGCCGAAATCGTTCAAAAGTGCGCTTGGCTTTAAAGCGAGGTACGACA481 * * * * * * 540

161 NSFERRNRSKVRLALKRGTT 180

GTAGAACGATCTGATAGAGAAGGTTTAAAAACATTTGCTGAGTTAATGAAAATCACTGGG541 ****** 600

181 VERSDREGLKTFAELMKITG 200

GAACGCGATGGCTTCTTAACGCGTGATATTAGTTACTTTGAAAATATTTATGATGCGTTG601 ****** 660

201 ERDGFLTRDI SYFENIYDAL 220

Resultate 93

CATGAAGATGGAGATGCTGAACTATTTTTAGTAAAGTTGGATCCAAAAGAAAATATAGCG661 ****** 720

221 HEDGDAELFLVKLDPKENIA 240

AAAGTAAATCAAGAATTGAATGAACTTCATGCCGAAATTGCTAAATGGCAGCAGAAGATG721 ****** 780

241 KVNQELNELHAEIAKWQQKM 260

AAAACATCTGAAAAGCAAGCTAAAAAAGCGCAAAATATGATTAATGATGCGCAAAATAAA

781 ****** 840

261 KTSEKQAKKAQNMINDAQNK 280

ATTGCTAAAAATGAAGATTTAAAACGAGACCTAGAAGCTTTAGAAAAGGAACATCCTGAA

841 ****** goo

281 IAKNEDLKRDLEALEKEHPE 300

GGTATTTATCTTTCTGGTGCACTATTAATGTTTGCTGGCTCAAAATCATATTACTTATAT

901 ****** 960

301 GIYLSGALLMFAGSKSYYLY 320

GGTGCGTCTTCTAATGAATTTAGAGATTTTTTACCAAATCATCATATGCAGTATACGATG961 ******102Q

321 GASSNEFRDFLPNHHMQYTM 340

ATGAAGTATGCACGTGAACATGGTGCAACAACTTACGATTTCGGTGGTACAGATAATGAT1021 ******1080

341 MKYAREHGATTYDFGGTDND 360

CCAGATAAAGACTCAGAACATTATGGATTATGGGCATTTAAAAAAGTGTGGGGAACATAC

1081 ***** li40

361PDKDSEHYGLWAFKKVWGTY 380

TTAAGTGAAAAGATTGGTGAATTTGATTATGTATTGAATCAGCCATTGTACCAATTAATT1141 ******1200

381 LSEKIGEFDYVLNQPLYQLI 400

GAGCAAGTTAAACCGCGTTTAACAAAAGCTAAAATTAAAATATCTCGTAAATTAAAACGA1201 ******1260

401 EQVKPRLTKAKIKISRKLKR 420

AAATAGATTAACGACTGAAATCTGAACGCTCATAAGACTGTCATTTGCGTTCAGATTTTT1261 ******j_320

421 K *

Resultate 94

TTACACAATATAGAATGGTTGAGTAAAATATTTTTGAATATAGTGAAAGAGGGGGAAGTA

1321 ******1380

CTGTGATAAAAAAGCTATTACAATTTTCTTTAGGGAATAAGTTTGCTATCTTTTTAATGG

1381 * * * SD * * * 1440

MV 2

TTGTTTTAGTTGTCTTGGGCGGTGTATATGCGAGTGCTAAATTGAAATTAGAATTACTAC

1441 ****** 1500

3 VLVVLGGVYASAKLKLELLP 22

CAAATGTACAAAATCCAGTTATTTCAGTTACAACAACAATGCCGGGTGCAACGCCACAAA

1501 ******1560

23 NVQNPVISVTTTMPGATPQS 42

GTACCCAAGATGAAATAAGTAGTAAAATTGACAATCAAGTAAGATCATTGGCATATGTGA

1561 ******1620

43 TQDEISSKIDNQVRSLAYVK 62

AAAATGTTAAAACGCAATCCATACAAAATGCTTCAATTGTAACAGTTGAATATGAAAATA

1621 ******16go

63 NVKTQSIQNASIVTVEYENN 82

ATACAGATATGGATAAAGCAGAAGAACAGCTTAAAAAAGAAATCGATAAAATTAAATTTA

1681 ******1740

83 TDMDKAEEQLKKEIDKIKFK 102

AAGATGAAGTTGGTCAACCAGAATTAAGACGTAATTCGATGGATGCTTTTCCGGTTTTAG

1741 ******180o

103 DEVGQPELRRNSMDAFPVLA 122

CATATTCATTTTCAAATAAAGAGAATGACTTGAAAAAAGTAACGAAAGTACTGAATGAAC

1801 ******1860

123 YSFSNKËNDLKKVTKVLNEQ142

AATTAATACCAAAATTGCAAACGGTAGATGGTGTGCAAAATGCGCAATTAAATGGGCAGA

1861 ******192o

143 LIPKLQTVDGVQNAQLNGQT162

CGAACCGTGAAATCACCCTTAAATTTAAGCAAAATGAACTTGAAAAATATGGGTTGACTG

1921 ******193o

163 NREITLKFKQNELEKYGLTA182

CTGATGATGTAGAAAACTATCTAAAAACGGCAACAAGAACAACGCCACTTGGATTGTTCC

1981 ******2040

183 DDVENYLKTATRTTPLGLFQ 202

Resultate

AATTTGGTGATAAAGATAAATCAATTGTTGTTGATGGTCAATATCAATCTGTTGATGCTT

2041 ******2100

203 FGDKDKSIVVDGQYQSVDAF222

TTAAAAACATAAATATTCCATTAACGTTGGCAGGAGGACAAGGGCAATCTCAATCCCAAA

2101 ******2160

223 KNINIPLTLAGGQGQSQSQS 242

GTGACAATAAACAAAATTCAGCCATGTCAGACGTTAATCAGGCATCACCACAGCAAAATT

2161 ******2220

243 DNKQNSAMSDVNQASPQQNS 262

CAAAAGCGTCAGCACCAAATAATATAAGTGGTATGCCGACAGCGAAACTAGGAGATTTAG

2221 ******2280

263 KASAPNNISGMPTAKLGDLA282

CTGATATTACAGTTGGTGATGTGCGTACTTCTATTTCTAAAACGAATGGAAAGGATGCGG

2281 ******2340

283 DITVGDVRTSISKTNGKDAV302

TTAATCTACAAATAACTAAAGCTCAAGATGCCAATACAGTTCAAGTAGCCAAAGATGTAC

2341 ******2400

303 NLQ ITKAQDANTVQVAKDVQ 322

AACGTAAAATTGATACATTCGTTGATGAAAATAAAGATTTTAATGTCACAAAAACAATGG

2401 ******2460

323 RKIDTFVDENKDFNVTKTMD 342

ATACTGCAAAGCCTGTTGAGAAATCACTTTATACGATGGTTGAAAAAGCATCATTAGGTA

2461 ******2520

343 TAKPVEKSLYTMVEKASLGT 362

CAATCGTGGCAATTATAGTTATTTTGCTGTTTTTAAGAAACATTCGTACGACGGCAATTT

2521 ******2580

3 63 IVAIIVILLFLRNIRTTAIS382

CTATTATATCGATTCCGTTATCACTTCTTATGGCGCTTATTGCTCTGAAATTGAGTGATG

2581 ******2640

383 IISIPLSLLMALIALKLSDV 402

TTTCATTGAATATACTAACGTTAGGTGCATTAACAGTAGCGATTGGACGTGTGATAGACG

2641 ******2700

403 SLNILTLGALTVAIGRVIDD 442

Resultate 96

ATTCGATTGTAGTTGTTGAAAATATTTATCGACGCTTAACAGATTCAGAAGAACAACTAA

2701 ******2760

443 SIVVVENIYRRLTDSEEQLK462

AAGGTGAAAATTTAATTATCAGTGCGACAACTGAAGTATTTAAACCAATAATGTCATCGA

2761 ******2820

463 GENLIISATTEVFKPIMSST 482

CACTAGTTACTATTATCGTCTTCTTACCACTTGTGTTTGTATCAGGTTCAGTAGGCGAAA

2821 ******2880

483 LVTI IVFLPLVFVSGSVGEM 502

TGTTTAGACCTTTTGCATTGGCTATTGCATTTAGTTTATTAGCATCGTTATTAGTGTCAA

2881 ******2940

503 FRPFALAIAFSLLASLLVSI522

TTACACTCGTTCCAGCGTTGGCAGCTACACTATTTAAAAAAGGCGTTAAACGTCGTAATA

2941 ******3000

523 TLVPALAATLPKKGVKRRNK542

AACAACATCAAGAAGGATTAGGTGTTGTTAGTACAACTTATAAAAAAGTATTACATTGGT

3001 ******3060

543 QHQEGLGVVSTTYKKVLHWS 562

CATTAAATCATAAGTGGATTGTAATTATATTAAGTACATTAATTTTGGTTGCAACTATTG

3061 ******3120

563 LNHKWIVI ILSTLILVATIV 582

TATTTGGAGGACCGAGACTAGGCACTAGCTTTATTTCAGCAGGTGACGATAAATTTTTAG

3121 ******3180

583 FGGPRLGTSFISAGDDKFLA 602

CTATTACTTATACACCGAAGCCTGGTGAAACGGAGCAAGCAGTGTTGAATCATGCGAAAG3181 ******3240

603 ITYTPKPGETEQAVLNHAKD 622

ATGTTGAAAAATATTTAAAACAGAAAAAGCATGTAAAAACAATTCAATACTCAGTTGGCG3241 ******33oo

623 VEKYLKQKKHVKTIQYSVGG 642

GTAGTAGTCCAGTAGATCCAACGGGTAGTACAAATAGTATGGCAATCATGGTTGAATATG

3301 ******3360

643 SSPVDPTGSTNSMAIMVEYD662

Resultate 97

ATAATGACACGCCTAATTTTGATGTAGAAGCGGATAAGGTTATTAAACATGCAGATGGCT

3361 ******3420

663 NDTPNFDVEADKVIKHADGF682

TTAAACATCCTGGAGAGTGGAAAAATCAAGATTTAGGAACAGGTGCAGGTAATAAATCTG

3421 ******3480

683 KHPGEWKNQDLGTGAGNKSV702

TAGAGGTTACTGTAAAAGGTCCATCAATGGATGCCATAAAATCAACTGTAAAAGATATTG

3481 ******3540

703 EVTVKGPSMDAIKSTVKDIE 722

AACAGAAAATGAAACAGGTTAAAGGACTAGCCAATGTCAAATCTGATTTATCGCAAACAT

3541 ******36oo

723 QKMKQVKGLANVKSDLSQTY 742

ATGATCAGTATGAAATTAAAGTCGATCAAAATAAAGCGGCAGAAAATGGTATTTCTGCAA

3601 ******3660

743 DQYEIKVDQNKAAENGISAS 762

GTCAACTTGCAATGCACTTGAATGAAAACTTACCAGAAAAAACAGTTACGACTGTTAAAG

3661 ******372Q

763 QLAMHLNENLPEKTVTTVKE 782

AAAATGGTAAAACTGTTGATGTTAAAGTCAAACAAAATAAGCAAACAGACTGGTCAGAAG

3721 ******3780

783 NGKTVDVKVKQNKQTDWSED 802

ATAAGTTGAATAATATAACTTTGAAAAAGCCGACTGGTGGTACGATTAAATTGGGAGATG

3781 ******3840

803 KLNNITLKKPTGGTIKLGDG 822

GGTACCGAGCTCGAATTC

3841 *

3858

823 Y R A R I 827

Figur 27: Sequenz von fmhB und dem sequenzierten Teil des proximalen orf

Die möglichen Promotorsequenzen sind fettgedruckt und unterstrichen, Shine-

Dalgarno Sequenzen sind kursiv geschrieben, die Startkodons ATG sind

fettgedruckt und die Inverted Repeats sind unterstrichen.

Resultate 98

3.3.2. Northern Blot

Untersuchung der fmhB Transkription in Northern Blots mit der fmhB

internen Probe (Fig. 26) ergab drei Transkripte von 4.1, 2.9 und 1.7 kb (Fig.

28) mit zunehmender Intensität. Die kleinste Bande ist um etwa 400 Nukleotide

länger als fmhB. Interessanterweise war die Intensität der Banden bei den

entsprechenden sigB Mutanten und den durch Ethanol gestressten Stämmen

stärker als bei den Wildtypen. Dieses Phänomen konnte auch bei glmM in

Northern Blots beobachtet werden (Fig. 15).

Ob fmhB als Teil eines noch unbekannten Operons oder als

monozistronische mRNA abgelesen muss noch mit Primer-Extension überprüft

werden.

Resultate

kb a b c d e f

Figur 28: Transkription von fmhB. Northern Blot hybridisiert mit

einer fmhB internen Probe (Fig. 26). a, BB270; b, BB270AsigB;c, BB270 (EtOH); d, COL; e, COLAsigB; f. COL (EtOH).

Diskussion 100

4. Diskussion

4.1. Die Phosphoglukosamin-Mutase GlmM

GlmM katalysiert die Umlagerung des C6-Phosphats von Glukosamin-6-

Phosphat an das Cl zu Glukosamin-1-Phosphat (48, 116). Diese Umlagerung

wird als einer der ersten Schritte betrachtet, die schliesslich zur Bildung des

Nukleotidzuckers UDP-N-Acetylglukosamin führen, der in die Biosynthese des

Peptidoglykans involviert ist (Fig. 1). Die endgültige Zusammensetzung und

Struktur des Peptidoglykans in S. aureus glmM Mutanten wird dadurch kaum

beeinflusst. glmM Mutanten haben eine 5% niedrigere Quervernetzung des

Peptidoglykans verglichen mit der des Wildtyps (93). Neben den

Pentaglycinseitenketten kommen auch Seitenketten vor, die an Stelle von Glyl

ein Ala! enthalten. Die Alanin enthaltenden Seitenketten sind in glmM Mutanten

nicht mehr nachweisbar (93). Der Einfluss einer solch geringen Änderung auf

die Methicillin-Empfindlichkeit lässt sich möglicherweise dadurch erklären,

dass die Produktionsrate von Peptodiglykan-Vorläufern aufgrund der

glmM::Tn551 Insertion herabgesetzt wurde und dass die noch produzierte

Menge nicht ausreicht, um den von PBP2' ausgehenden Schutz gegen

Methicillin voll ausnützen zu können. Es war bereits bekannt, dass in E. coli

das Gen glmM für das Überleben des Bakteriums entscheidend ist (74). Da

aber das Peptidoglykan in S. aureus trotz der glmM::Tn551 Insertion kaum

beeinflusst und im Gegensatz zu E. coli eine Inaktivierung des glmM toleriert

wird, nimmt man an, dass in S. aureus für die Glukosamin-1-Phophat Synthese

möglicherweise ein alternativer Weg vorhanden ist, der bis jetzt noch nicht

identifiziert wurde. Diese Hypothese wird insofern von den Resultaten

unterstützt, als dass die phänotypischen Komplementierungsexperminte mit

Glukosamin, das dem Wachstumsmedium zugegeben wurde, ganz klar zeigen

konnten, dass die Methicillin-Empfindlichkeit in den glmM Mutanten deutlich

abnahm und beinahe das Resistenz-Niveau des Wildtyps erreichte. Das

Diskussion 101

zugegebene Glukosamin muss, um als Substrat für die Bildung von UDP-N-

Acetylglukosamin zur Verfügung zu stehen, zuerst am C6 phosphoryliert

werden und anschliessend muss die Phosphatgruppe an das Cl umgelagert

werden. Alternativ könnte Glukosamin direkt am Cl phosphoryliert werden.

Beim ersten Weg wäre eine Phosphoglukosamin-Mutase notwendig um eine

entsprechende Umlagerung ablaufen zu lassen. Da aber in den glmM Mutanten

GlmM nicht exprimiert wird, muss diese Aufgabe von einem anderen, noch

unbekannten Enzym oder mehreren Enzymen übernommen werden, die Teil

des postulierten alternativen Weges zur Bildung von UDP-N-Acetylglukosamin

wären (Fig. 16).

Da GlmM in die ersten Schritte der Zellwandbiosynthese involviert ist,

schien es zumindest denkbar, dass die glmM::Tn551 Insertion einen Einfluss

auf die Teichonsäuren Substitution des Peptidoglykans haben könnte (30). Es

zeigte sich jedoch, dass sowohl die Menge an Teichonsäuren, ihre

Zusammensetzung und N-Acetylglukosaminyl Substitution in Stationärphasen

Kulturen von PG108 und BB270 (46) als auch die „plating efficiencies" der

Phagen, die von N-Acetylglukosaminyl Modifikationen der Wandteichonsäure

abhängt (22), genau gleich waren (46).

4.1.1. Sequenz des Phosphoglukosamin-Mutase Operons

glmM wurde auf dem Smal I Fragment des NCTC8325 Chromosoms

lokalisiert. Es liegt am Ende eines dreizistronischen Operons das sich aus den

ORFs orfl-orß-glmM zusammensetzt. Dieses Operon resultiert in zwei

Transkripten, einem dreizistronischen bestehend aus allen drei ORFs und

einem monozistronischen glmM Transkript. Letzteres Transkript war in den

glmM Mutanten nicht mehr vorhanden; dafür erschien ein längeres aber

schwächeres Transkript von etwa 4.7 kb. Im Gegensatz zu den femAB oder

femC Mutanten, in welchen die Tn55i unterbrochenen Transkripte

entsprechend der Grösse vom Tn557 um 5.2 kb zunahmen, nahmen die

Transkripte in den glmM Mutanten weniger an Grösse zu. Der Unterschied

Diskussion 102

rührt wahrscheinlich von einr im Gegensatz zu den femAB undfemC Mutanten

unterschiedlichen Prozessierung der mRNA her.

Aus der Sequenzanalyse des glmM Operons ging hervor, dass das Tn557

im C-terminalen Bereich von glmM integriert hatte. Das aktive Zentrum

wurde dadurch nicht unterbrochen, da es sich im N-terminalen Bereich

befindet. Das möglicherweise daraus resultierende Transkript könnte vielleicht

für ein partielles GlmM kodieren, was allerdings durch die Western Blots

widerlegt werden konnte, da weder in PG108 noch in PG100 GlmM-Produkte

nachgewiesen werden konnte. In B. subtilis konnte eine dem glmM Operon

orfl-orß-glmM ähnliche Genorganisation ybbP-ybbR-ybbT gefunden werden

(Fig. 29). Entsprechend hoch waren die Identitäten der von den beiden

Operons kodierten Genen untereinander. YbbP, YbbR und YbbT zeigten zu

Orfl, Orf2 und GlmM eine Identität von 56, 28 und 67%. Da aber auch in B.

subtilis die Aufgabe der beiden Proteine YbbP und YbbR noch nicht klar ist,

konnten noch keine Rückschlüsse auf 5. aureus gezogen werden.

4.1.2. Suppressor Mutante PG100

Eine charakteristische Eigenschaft der mec-bedingten Resistenz der

MRSA Stämme ist deren heterogene Expression (29). Diese heterogene

Expression der Resistenz blieb auch nach der glmM;:Tn551 Insertion erhalten,

auch wenn die Grund-Resistenz abnahm. So konnte der Stamm PG100 isoliert

werden, der trotz der glmM Mutation sogar eine höhere MHK aufwies als

BB270. Die postulierte Suppressor Mutation hmrDl führte zur

Wiederherstellung oder sogar Erhöhung der Resistenz gegenüber den ß-

Laktamen Methicillin, Oxacillin und Imipenem. Um die Möglichkeit einer

möglichen Kotransduktion von hmrDl zusammen mit glmM::Tn551 zu

überprüfen, wurde mittels Phagen, gewachsen auf PG100, erneut BB270

transduziert. Der resultierende Stamm zeigte aber das gleiche Resistenz-Profil

wie PG108, was schliessen liess, dass die Mutation hmrDl, die die hohe

?

ybbP

ybbR

ybbT

glmS

?.9

orfl

orß

glmM

Ikb

Figur29:Vergle

ichderglmMRegionvon

S.aureusmitderRegion

inB.

subtilis,derenGene

fürProteinekodieren,

diehoheHomologie

zudenenvon

S.aureus

zeig

ten:

OrflzuYbbP

56%

Identitätund76%

Ähnl

ichk

eit;

Orf2zuYbbR28%

Identitätund53%

Ähnl

ichk

eit;

GlmM

zuYbbT65%

Identitätund80%

Ähnl

ichk

eit.9,

Terminator.

Diskussion 104

Resistenz gegenüber Methicillin verursacht mehr als 40 kb von glmM entfernt

sein muss.

Die offenbar durch die Tn551 Insertion in glmM verursachte Zunahme

der Empfindlichkeit gegenüber dem Glykopeptid Teicoplanin blieb in der

Suppressor Mutante unverändert. Das Glykopeptid Teicoplanin inhibiert

sowohl die Transglykosylase- als auch die Transpeptidase-Reaktion indem es

sich an das terminale D-Ala-D-Ala des Peptidoglykanvorläufers bindet. Diese

Eigenschaft des Teicoplanins wird zusätzlich durch seinen Membrananker

verstärkt (6). Daher wird vermutet, dass neben der fehlenden GlmM Aktivität

zusätzlich eine Membran Komponente in den glmM Mutanten betroffen sein

könnte. Das Hydropathie Profil von Orfl weist auf ein möglicherweise

Membran-assoziiertes Protein hin. Es ist also denkbar, dass die glmM;:Tn551

Insertion nicht nur die GlmM Aktivität beeinflusst.

Zudem zeigte PG100 im Vergleich zu PG108 und BB270 eine

schwächere spontane Autolyse. Es ist bereits bekannt, dass die Inaktivierung

von lytH, das für ein Autolysin kodiert, heterogene Methicillin-Resistenz in

hohe homogene Methicillin-Resistenz umwandelt (32). Bei PG100 führt die

postulierte hmrDl Mutation zu einer hohen aber nicht zu einer hohen

homogenen Methicillin-Resistenz. Trotzdem könnte bei der postulierten

Mutation hmrDl ein oder mehrere Gene betroffen sein, die die spontane

Autolyse beeinflussen.

Die Produktion eines 49 kDa grossen Membran Proteins scheint in

PG100 hochreguliert zu sein. Kompensatorische Mutationen, die zu hoher

Methicillin-Resistenz führen, wurden auch in femC Mutanten beschrieben,

wobei der Ursprung dieser Art von Mutation noch nicht bekannt ist (106). Wie

bei der postulierten hmrDl Mutation ist die kompensatorische Mutation, die in

femC Mutanten zu einer hohen homogenen Resistenz führt nicht mit der

/emC::Tn55/ Insertion kotransduzierbar (106). Es unterstützt damit die

Hinweise, wonach offenbar verschiedene Mechanismen zu dieser hohen

Methicillin-Resistenz beitragen können (106).

Diskussion 105

4.1.3. Transduktion von glmM::Tw551

Die Transduktionseffizienz ist in mec Determinante tragenden Stämmen erhöht

(9, 36). So erwies sich der MSSA BB255 als schlechterer Rezipient für

glmM::Tn551 als MRSA BB270. Da die seltenen stabilen BB255 glmM

Mutanten zudem einen zusätzlichen auffälligen Phänotyp aufwiesen, wurde

angenommen, dass eine zusätzliche Mutation notwendig ist, damit die

Inaktivierung von glmM durch Tn55/ in einem MSSA möglich ist. Ein

weiteres Indiz, dass die Transduktion von glmM::Tn551 in MSSA Stämme

durch zusätzliche chromosomale Mutationen beeinflussbar zu sein scheint, ist

die Transduktion von glmM::Tn551 eines in einen in vitro auf Methicillin-

Resistenz selektionierten BB255. Obwohl die Transduktionsfrequenz immer

noch niedriger war als die eines MRSA Stammes, hatten die Transduktanten

keine auffällige Veränderungen phänotypischer Merkmale (36).

Möglicherweise kompensierte in diesem Fall eine zusätzliche Mutation den

schädlichen Einfluss der glmM Mutation und ermöglichte so die Integration,

während in MRSA die mec Determinante diesen schützenden Effekt übernahm.

4.1.4. Komplementation der glmM Mutation

Die Komplementationen von glmM::Tn551 einerseits mit dem gesamten

glmM Operon, andererseits mit glmM allein haben gezeigt, dass offenbar

glmM ausreicht um die ß-Laktam-Resistenz und die MHK für Vancomycin

wiederherzustellen, nicht aber die MHK für Teicoplanin. Die MHK für

Teicoplanin blieb sowohl beim komplementierten PG108 als auch beim

komplementierten PG100 unverändert tief. Betrachtet man das Hydropathie

Profil von Orfl, so kann vermutet werden, dass es sich dabei um ein

Membran-assoziiertes Protein handeln könnte, da im N-terminalen Bereich ein

stark hydrophober Bereich ausgemacht werden konnte. Da Teicoplanin sich an

das terminale D-Ala-D-Ala des Peptidoglykanvorläufers bindet und auch mit

Diskussion 106

der Membran interagiert, könnte Orfl in die Teicoplanin-Resistenz involviert

sein.

Da GlmM von S. aureus eine E. coli glmM Mutante komplementieren

konnte und für GlmM Phosphoglukosamin-Mutase Aktivität nachgewiesen

werden konnte (48), stellte sich die Frage, ob durch Zugabe bestimmter

Zucker die glmM Mutation phänotypisch umgangen werden könnte. Es zeigte

sich, dass durch Zugabe von N-Acetylglukosamin oder Glukosamin ins

Medium die MHK für Methicillin wieder auf das Niveau von BB270 erhöht

wurde. Interessanterweise sind aber beide Substanzen nur Vorläufer und

müssen erst durch enzymatische Schritte in Glukosamin-1-Phosphat

umgewandelt werden. Da aber das für diesen Schritt notwendige Enzym GlmM

in den entsprechenden glmM Mutanten nicht nachgewiesen werden konnte,

wurde ein sekundärer Weg postuliert, der die Aufgabe von GlmM übernimmt

und kompensiert.

Die glmM::Tn551 Insertion reduziert nur die basale Resistenz von BB270, bei

E. coli hingegen ist eine Insertion in glmM letal. Bei S. aureus muss daher ein

sekundärer Weg existieren, der es dem Organismus ermöglicht trotz fehlender

Phosphoglukosamin-Mutase zu überleben. Dabei nimmt zwar die Resistenz ab,

aber es bleibt die Möglichkeit zur Ausbildung von hochresistenten

Subpopulationen bestehen. Die empfindlich gewordenen glmM Mutanten wie

PG108 verfügen offenbar über einen sekundären Weg um weiterhin

Zellwandvorläufer zu produzieren. Dieser sekundäre Weg scheint aber

weniger effizient zu sein, da die Resistenz in glmM Mutanten herabgesetzt ist.

Gibt man von aussen Glukosamin oder N-Acetylglukosamin zu, so nimmt die

Resistenz wieder zu und erreicht gleiche MHK-Werte wie in BB270. Offenbar

scheinen diese Substrate einen Einfluss auf den postulierten sekundären Weg zu

haben. Entweder bewirkt die grössere Menge an Substraten eine zusätzliche

Aktivierung der in den sekundären Weg involvierten Proteine oder aber deren

möglicherweise niedrigere Spezifität für diese Substrate wird durch die

erhöhte Menge überdeckt.

Diskussion 107

4.1.5. Proteine

Wie sich gezeigt hat, hatte die glmM::Tn551 Insertion keinen Einfluss

auf die PBP2' Expression da in den Mutanten gleich viel PBP2' exprimiert

wurde wie im Wildtyp. Auch bei der heterogen hochresistenten Suppressor

Mutante PG100 konnte keine Zunahme der PBP2' Produktion festgestellt

werden. Dass die postulierte hmrDl Mutation, die dem PG100 ein hohe

Methicillin-Resistenz verleiht, keinen Einfluss auf die PBP2' Produktion zu

haben scheint, korreliert mit der Beobachtung, dass zwischen der Menge an

produziertem PBP2' und der Höhe der Methicillin-Resistenz kein direkter

Zusammenhang besteht, und mit der Hypothese, dass noch andere Genprodukte

mit dem PBP2' kooperieren müssen. Das in PG100 in der Membranfraktion

stärker exprimierte Protein von 49 kDa Grösse könnte mit der erhöhten

Resistenz in Zusammenhang stehen, da gleichzeitig die spontane Autolyse in

PG100 reduziert war. Diese mögliche Korrelation muss aber weiter

experimentell bestätigt werden.

Die glmM::Tn551 Insertion hatte zur Folge, dass kein GlmM mehr

exprimiert wurde wie in den Western Blots gezeigt wurde. Im Wildtyp konnte

das GlmM nur in der zytoplasmatischen Fraktion nachgewiesen werden. In der

Membranprotein Fraktion konnte GlmM nicht nachgewiesen werden. GlmM

scheint also nur im Zytoplasma vorzukommen, was aufgrund seiner Aufgabe

innerhalb der Synthese der Zellwandvorläufer naheliegend ist.

4.2. Das fmtB-System

4.2.1. Transduktion und Wirkung

Die fmtB::Tn551 Insertion führte zu einer starken Abnahme der

Oxacillin-Resistenz und machte MRSA Stämme empfindlich gegen alle ß-

Laktame. Im homogen hochresistenten Stamm COL bewirkte eine fmtB

Diskussion 108

Mutation, dass die Mutante ein heterogenes Resistenz-Profil zeigte. Die

Transduktion von fmtB::Tn551 in den heterogen Methicillin-resistenten Stamm

BB270 führte einerseits zu TypI-Transduktanten, die Methiciliin-resistent

blieben, und andererseits zu TypII-Transduktanten, die wie COL-TS111

Methicillin-empfindlich wurden. Interessanterweise erschienen Transduktanten

vom Typl bereits nach zwei Tagen, die Transduktanten vom TypII hingegen

erst nach vier Tagen. Möglicherweise trugen die Transduktanten vom Typl

bereits vor der Transduktion eine chromosomale Mutation, die es erlaubte, die

fmtB::Tn551 Insertion zu kompensieren, so dass bereits nach zwei Tagen

Transduktanten wachsen konnten. Die empfindlich gewordenen Transduktanten

vom TypII brauchten im Gegensatz zu Typl länger um den Metabolismus auf

die Insertion in fintB einzustellen. Trotz dieser Diskrepanz zeigten beide Typen

mit Tn551 als Probe das gleiche Hybridisierungsmuster wie COL-TSlll, was

daraufhinweist, dass die fmtB: :Tn551 Insertion in beiden Typen stattgefunden

hatte. Die Transduktion von fmtB::Tn551 in empfindliche Stämme

funktionierte nicht ausser in RN450. Aus bisher noch unbekannten Gründen

hatte aber die Inaktivierung von fmtB in RN450 keinen Effekt auf dessen

Resistenz-Profil. Vermutlich zerstörte die fmtB::Tn551 Insertion die

Lebensfähigkeit der Zellen oder aber die wenigen Mutanten, die gefunden

werden konnten besassen ähnlich den resistenten fintB Mutanten vom Typl eine

sekundäre chromosomale Mutation, die der fmtB Mutation entgegenwirkt.

Da die Insertion von fmtB::Tn551, wie mittels Southern Blots gezeigt

werden konnte, in beiden Typen stattgefunden hatte, wurde folgende Hypothese

aufgestellt: Transduktanten vom Typl besassen eine /m?J5-kompensierende

chromosomale Mutation, während TypII Transduktanten, da sie erst nach vier

Tagen erschienen und Methicillin-empfindlich waren, diese postulierte

Mutation nicht enthielten, aber trotzdem einen Stoffwechsel induzieren müssen,

um mit der fintB Mutation überleben zu können

Diskussion 109

4.2.2. FmtB-Protein

fmtB kodiert für ein Protein noch unbekannter Funktion, das offenbar

Zellwand-assoziiert ist. Dies zeigt sich einerseits in seiner AS-Sequenz, die das

charakteristische Zellwand-sortierende Motif LPXTG beinhaltete, andererseits

in der Detektion von FmtB mittels Western Blot in der Membran-Protein-

Fraktion und dessen Fehlen sowohl im Kulturüberstand als auch in der

zytoplasmatischen Fraktion. Das Protein selbst besitzt vermutlich wichtige

Eigenschaften, die möglicherweise bei der Pathogenität eine Rolle spielen

könnten. So konnte in der Repeat Region von 75 AS Ähnlichkeit mit dem EF

Protein in Streptococcus suis (103) und mit dem Lmpl in Mycobacterium

hominis (65) gefunden werden. Proteine, die innerhalb ihrer AS-Sequenz

mehrfache Repeats enthalten, sind oft in die Bindung von Liganden involviert

(28, 43, 101, 114). Manchmal sind die AS-Sequenzen innerhalb solcher AS-

Repeatshoch konserviert oder zeigen Homologie Variationen (49, 115). Diese

Variationen wurden schon beim M-Protein von Streptococcus pyogenes (49),

in der Glukosyltransferase von Streptococcus downei und Staphylococcus

mutans und im Toxin A von Clostridium difficile (115) beschrieben. Bei FmtB

besitzen die 17 Repeats untereinander schwache Ähnlichkeit. Vom ersten bis

zum zwölften Repeat sind jeweils vier AS konserviert, während die letzten fünf

weniger gute Ähnlichkeiten untereinander zeigen. Ihre Bedeutung für FmtB ist

noch nicht klar (Komatsuzawa et al, Manuskript eingereicht).

4.2.3. Offene Fragen über den Effekt der fmtB Inaktivierung

Komatsuzawa konnte mit Western Blots zeigen, dass in der mit dem

Plasmid pHK4357 komplementierten fmtB Mutante COL-TSlll tatsächlich

FmtB exprimiert wurde (Komatsuzawa et al., Manuskript eingereicht). Er

konnte ebenfalls zeigen, dass es sich beim FmtB Protein um ein Zellwand-

assoziiertes Protein handelte, da die FmtB Bande nur im Ganz-Zell-Lysat und

im Zellwand-Extrakt, nicht aber im Kulturüberstand oder in der

Diskussion 110

zytoplasmatischen Fraktion nachgewiesen werden konnte. Wurde versucht die

fmtB Mutation entsprechend mit einem plasmidkodierten fmtB zu

komplementieren, so konnte die Resistenz nicht wiederhergestellt werden,

obwohl mittels Western Blot nachgewiesen wurde, dass im komplementierten

Stamm grosse Mengen an FmtB gebildet wurde. FmtB selbst ist daher nicht

direkt in die Methicillin-Resistenz involviert, sondern die Insertion hat

möglicherweise einen polaren Effekt auf andere, die Methicillin-Resistenz

beeinflussende Gene. Es wäre aber auch denkbar, dass FmtB zwar korrekt

gebildet wird und zur Zellwand gelangt, dass der Einbau aber nicht korrekt

erfolgt und somit die Aktivität ausbleibt. Andererseits konnte beobachtet

werden, dass der MRSA KSA8, der nur partielles FmtB ohne Zeliwanddomäne

und Zellwandanker herstellt, hochresistent ist. Dieses partielle FmtB konnte

nur im Kulturüberstand und in der Zytoplasma-Fraktion beobachtet werden.

Da aber eine fmtB;:Tn551 Insertion in KSA8 ebenfalls zur gleichen Reduktion

der Resistenz gegen Oxacillin und TritonX-100 führte wie bei COL-TSlll,

kann davon ausgegangen werden, dass FmtB selbst keinen direkten Einfluss auf

die Resistenz hat, was wiederum auf einen möglichen polaren Effekt Tn55i auf

andere Gene hinweist. In unmittelbarer Nähe zu fmtB weniger als 400

Nukleotide entfernt liegt proximal das Gen glmM. Obwohl Northern und

Western Blots gezeigt haben, dass die fmtB::Tn551 Insertion keinen Einfluss

auf die Transkription und Translation von GlmM hatte, konnte eine

Komplementation mit einem plasmidkodierten glmM die Oxacillin-Resistenz

quasi wieder herstellen, was bei einer fmtB Komplementation nicht der Fall

war. Nach der glmM kodierenden Sequenz folgt ein rho-unabhängiger

Terminator. Die mit einer glmM Probe detektierten Transkripte waren auch

alle zu kurz um zusätzlich fmtB zu beinhalten. Da aber nie ein fintB Transkript

nachgewiesen werden konnte, ist ebenfalls nicht auszuschliessen, dass es

möglicherweise doch ein paar wenige g/mM-/mr5-Transkripte geben könnte.

Neben der Möglichkeit die Oxacillin-Resistenz mittels glmM

Komplementation fast wieder herzustellen, konnte durch Zugabe von

Glukosamin oder N-Acetylglukosamin die Resistenz fast wieder auf Wildtyp

Diskussion 111

Niveau angehoben werden. Bei beiden Substanzen handelt es sich um Vorläufer

des UDP-N-Acetylglukosamin, einem Baustein des Peptidoglykans (Fig. 1).

GlmM wandelt Glukosamin-6-Phosphat in Glukosamin-1-Phosphat um, welches

dann sukzessive für die Zellwandbiosynthese weiterverarbeitet wird (Fig. 1).

Damit überhaupt Glukosamin-1-Phosphat entsteht ist also entweder GlmM

notwendig oder es existiert ein sekundärer Weg, der es ermöglicht, dass glmM

Mutanten das von aussen zugegebene Glukosamin verwerten können. Die

Zugabe eines plasmidkodierten glmM erhöhte in fmtB Mutanten die Oxacillin-

Resistenz fast auf Wildtyp-Niveau. Dies ist vermutlich auf die Überproduktion

von GlmM zurückzuführen, was zu einer effizienteren Umwandlung von

vorhandenen Glukosamin-6-Phosphat zu Glukosamin-1-Phosphat führte.

Andererseits lässt sich die fmtB Mutation gleich der glmM Mutation durch

Zugabe von Glukosamin oder N-Acetylglukosamin biochemisch

komplementieren. Im Gegensatz zu den glmM Mutanten besitzen die fmtB

Mutanten nach wie vor ein intaktes GlmM. Vermutlich wird das zugegebene

Glukosamin oder N-Acetylglukosamin in fmtB Mutanten nicht wie in den

glmM Mutanten über den postulierten sekundären Weg metabolisiert, sondern

die grössere Menge an Vorläufersubstanzen wird vom GlmM metabolisiert.

Die fmtB::Tn551 Insertion scheint offenbar keinen Einfluss auf GlmM zu

haben, da plasmidkodiertes glmM die Resistenz wieder heraufsetzen konnte. Es

ist anzunehmen, dass die fmtB: :Tn551 Insertion möglicherweise einen Einfluss

auf den postulierten sekundären Weg hat und die zugegebenen Substrate vom

chromosomalen glmM metabolisiert werden.

Die Aufgabe, die FmtB ausübt, ist noch nicht klar. Offenbar wirkt aber

FmtB in irgendeiner Form auf die Transkription oder Expression weiterer

chromosomaler Gene oder auf den Einbau von N-Acetylglukosamin-1-P in

UDP-NAG. Dabei kann ausgeschlossen werden, dass die fintB::Tn551 Insertion

einen Einfluss auf die GlmM Transkription oder Translation haben könnte, da

sowohl mit Northern als auch mit Western Blots glmM Transkripte und GlmM

nachgewiesen werden konnten. Möglicherweise beeinflusst FmtB die distal

liegenden Gene. Nach fintB konnte kein rho unabhängiger

Diskussion 112

Transkriptionsterminator gefunden werden und der nächste orf ist 1 kb

entfernt und wird divergent transkribiert. Dass aber nicht das vollständige

FmtB notwendig ist um Methicillin-Resistenz auszuprägen, zeigte sich in der

Wirkung der fmtB::Tn551 Insertion im MRSA KSA8, der für ein

unvollständiges FmtB kodiert.

Da ein plasmidkodiertes FmtB keinen Einfluss auf die Oxacillin-

Resistenz hat, wird angenommen, dass FmtB nur in eis wirken kann.

4.3. Das femX-System (fmhB-System)

Wenige Nukleotide distal zu fmhB konnte ein Gen identifiziert werden,

dessen Protein Ähnlichkeit zu einem Protein zeigt, das einen Einfluss auf die

Akriflavin-Resistenz hat. Es war bekannt, dass E. coli, die Mutationen in einem

Lokus, acrA genannt, tragen, hyperempfindlich gegen basische Farbstoffe,

Detergentien und Antibiotika sind (78). Die Akriflavin-Resistenz vermittelnden

Gene sind am besten in E. coli beschrieben (33). Die erhöhte Empfindlichkeit

ist jedoch nicht auf eine früher aufgestellte Hypothese zurückzuführen, die

besagte, dass eine acrAB Deletion die Permeabilität der äusseren Membran

erhöhe, sondern nach neuesten Ergebnissen auf das Fehlen des aktiven

Exportes der inhibierenden Substanzen. Nun besitzt ein von B. subtilis

kodiertes Protein, YerP, Ähnlichkeit mit dem AcrB, das ein Teil der Pumpe

repräsentiert. Zu diesem Protein YerP wiederum besitzt das unbekannte

Protein, das vom distalen ORF von fmhB kodiert wird, eine Identität von 42%

und eine Ähnlichkeit von 63%.

Literaturverzeichnis 113

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194.

Anhang

6. Anhang

Lebenslauf

Name: Philipp Johann Glanzmann

Geburtsdatum: 6. Mai 1969

Zivilstand: ledig

Heimatort: Luzern

Staatsangehörigkeit: Schweiz

Ausbildung: Seit Juni 1995: Dissertation am Institut für

Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich

bei Frau Prof. B. Berger-Bächi.

Oktober 1990 - Mai 1995: Biologiestudium an der

ETH Zürich. Abschluss als diplomierter

Naturwissenschafter ETH in den Fächern: Gen- und

Enzymtechnologie/Immunologie, Genetik,

Immunbiologie, Mikrobiologie,

Molekularbiologie/Biophysik.

ETH-externe Diplomarbeit am Institut für

Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich.

August 1984 - Juni 1989: Kantonsschule Alpenquai,

Luzern; Literaturgymnasium, Matura Typus B.

August 1982 - Juli 1984: Sekundärschule Utenberg,

Luzern.

August 1976 - Juli 1982: Primarschule Maihof, Luzern.

Anhang 131

Publikationen

Ph. Glanzmann, J. Gustafson, H. Komatsuzawa, K. Ohta and B.

Berger-Bächi. 1999. glmM Operon and Methicillin-Resistant glmM

Suppressor Mutatnts in Staphylococcus aureus.

Antimicrob Agents Chemother 43: 240-245.

H. Komatsuzawa, K. Ohta, M. Sugai, T. Fujiwara, Ph. Glanzmann,

B. Berger-Bächi and H. Suginaka. Tn55 / Mediated Insertional

Inactivation of the fmtB Gene Encoding a Cell Wall Associated Protein

Abolishes Methicillin-Resistance in Staphylococcus aureus.

Manuskript eingereicht.

Konferenzen und Präsentationen:

20. - 21. Februar 1997 SGM St. Gallen; Poster:

femD is a Chromosomally Encoded Factor that affects

Methicillin-Resistance Expression in Staphylococcus

aureus.

25. - 28. Mai 1997 8th European Congress of Clinical Microbiology and

Infectious Diseases, Lausanne; Poster:

femD is a Chromosomally Encoded Factor that affects

Methicillin-Resistance Expression in Staphylococcus

aureus.

15. - 16. Oktober 1998 Scientific Meeting: Evolution of Bacterial Virulence

and Antibiotic Resistance, Lugano; Vortrag:

glmM Operon and Methicillin-Resistant glmM

Suppressor Mutants in Staphylococcus aureus.

Anhang 132

Danksagung

Frau Prof. Dr. Brigitte Berger-Bächi möchte ich besonders herzlich

dafür danken, dass ich in ihrer Arbeitsgruppe meine Dissertation durchführen

konnte und dass sie mich zu jeder Zeit und in jeder Hinsicht unterstützte.

Herrn Prof. Dr. Michael Teuber bin ich sehr dankbar dafür, dass er sich

bereit erklärt mir die Möglichkeit zu gegeben, meine Dissertation extern

auszuführen.

Ein besonderer Dank geht selbstverständlich an alle, die ich während den

Jahren am Institut kennen- und schätzen gelernt habe. Auch auf ihre Hilfe

konnte ich immer zurückgreifen.

Mein abschliessender Dank gebührt meiner Familie, die mir stets

hilfreich zur Seite stand, mich bei all meinen Vorhaben moralisch unterstützte

und mich darin bekräftigt hat nie aufzugeben.

rights / license: research collection in copyright - non ...23140/... · pathwayfor...

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