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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA
Caracterización espectrofotométrica de compuestos fluorescentes presentes en el
extracto etanólico de Catharanthus roseus
Trabajo de titulación modalidad proyecto de investigación para la obtención del
Título de Químico
AUTOR: Liliana Elizabeth Taco Once
TUTORA: Martha Azucena Suárez Heredia, PhD
Quito, 2019
ii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Liliana Elizabeth Taco Once. en calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales del trabajo de titulación: “Caracterización espectrofotométrica de compuestos
fluorescentes presentes en el extracto etanólico de Catharanthus roseus”, modalidad
proyecto de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE
LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E
INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita,
intransferible y exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en
la normativa citada.
Así mismo autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de
expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de
toda responsabilidad.
Liliana Elizabeth Taco Once
CC. 1724428972
iii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Martha Azucena Suárez Heredia, en calidad de tutor del trabajo de investigación
titulado: “Caracterización espectrofotométrica de compuestos fluorescentes presentes
en el extracto etanólico de Catharanthus roseus” elaborado por el estudiante Liliana
Elizabeth Taco Once con C.I. 1724428972 de la Carrera de Química, Facultad de Ciencias
Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos
y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo
APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que
se designe.
En la ciudad de Quito, a los 15 días del mes de agosto del 2019
Dra. Martha Azucena Suarez Heredia, PhD
CC: 1707242838
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL TRIBUNAL
El tribunal constituido por: PhD. Martha Azucena Suárez Heredia, PhD. Dra. Susana
López, Dr. Iván Tapia. luego de revisar el trabajo de investigación titulado “Caracterización
espectrofotométrica de compuestos fluorescentes presentes en el extracto etanólico de
Catharanthus roseus”, previo a la obtención del título (o grado académico) de Químico
presentado por la Señorita Liliana Elizabeth Taco Once APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman
Dra. Susana López. Dr. Iván Tapia
Cl. 1704814373 CC: 1708468358
Dra. Martha Azucena Suarez Heredia, PhD
CC: 1707242838
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
La presente investigación que tiene como título “Caracterización espectrofotométrica
de compuestos fluorescentes presentes en el extracto etanólico de Catharanthus roseus”,
se ejecutó en el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de
la Universidad Central del Ecuador en el marco del proyecto “Estudio de colorantes naturales
y desarrollo de formas estables con aplicación en la industria alimenticia y cosmética”.
vi
DEDICATORIA
A mi hijo Daian, que me ha brindado amor y ternura desde que nació y me ha dado la
fuerza para seguir adelante. A mi mamá Rosa por su apoyo incondicional desde el inicio de
mis estudios. Por los valores que me ha inculcado desde pequeña es por eso que ahora estoy
aquí. Su inmenso amor aun en los momentos más difíciles. A mi papá Luis, que me ha
apoyado en todo momento.
El comienzo es la parte más importante del recorrido.
vii
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por haberme brindado el apoyo incondicional, por los valores inculcados y
su apoyo para seguir adelante. No me alcanzaría la vida para agradecerles, por ustedes es que
ahora me estoy culminando mi Carrera.
A mis hermanos Christian, a pesar de que ya no estés con nosotros el tiempo que pasamos
juntos fuiste mi apoyo, siempre compartimos el sueño de ser unos profesionales. A mi
hermana Melany por tu cariño incondicional de cada día.
A mi tío, Gonzalo por el gran apoyo que me ha brindado desde niña en mis estudios, sus
consejos siempre han sido de gran ayuda.
A mi tutora, Dra. Martha Suárez por transmitir el amor que le tiene a la Carrera enseñando
sus valiosos conocimientos de una manera extraordinaria. Un enorme agradecimiento por su
tiempo, paciencia y comprensión demostrada durante todo el desarrollo de esta investigación.
Al Carlos Vásquez, analista de laboratorio de Investigación e Innovación del Instituto
Nacional de Patrimonio Cultural, INPC; por su tiempo al compartir sus conocimientos que
me ayudaron enormemente en el desarrollo de esta investigación, de igual manera a la
paciencia para la enseñanza del manejo de los equipos del Instituto.
Al Dr. Christian Alcívar por compartir su tiempo y conocimiento cada vez lo necesitaba
aportado indirectamente al desarrollo de esta investigación.
A la Dra. Susana López, al Dr. Iván Tapia por no restringir su tiempo y conocimiento para
la culminación de esta investigación.
A mis amigos Marlon, Mika, Gaby, Adry y David con quienes compartí experiencias
inolvidables durante toda nuestra vida universitaria, por las ocurrencias que hicieron más
alegre el paso por la Universidad. Por sus consejos y ayuda. Espero seguir compartiendo más
con ustedes.
viii
Índice General
DERECHOS DE AUTOR ........................................................................................... ii
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR................................................. iii
DEDICATORIA .......................................................................................................... vi
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. vii
Lista de tablas ............................................................................................................... x
Lista de Figuras .......................................................................................................... xii
Definición de términos ............................................................................................... xv
Resumen ..................................................................................................................... xvi
Abstract ..................................................................................................................... xvii
Introducción.................................................................................................................. 1
Capítulo I ...................................................................................................................... 2
El Problema .................................................................................................................. 2
Planteamiento del problema ....................................................................................... 2
Formulación del Problema ......................................................................................... 3
Preguntas de investigación ......................................................................................... 3
Objetivos de investigación ......................................................................................... 3
Capítulo II ..................................................................................................................... 5
Marco Teórico .............................................................................................................. 5
Antecedentes............................................................................................................... 5
Fundamento teórico .................................................................................................... 6
Marco metodológico ................................................................................................. 12
Parámetros cromatográficos ..................................................................................... 14
Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina .................................... 16
Espectroscopia ultra violeta – visible ....................................................................... 16
Espectroscopia Infrarroja. ......................................................................................... 16
Marco Legal.............................................................................................................. 17
Hipótesis ................................................................................................................... 18
Sistema de Variables ................................................................................................ 18
ix
Capítulo III ................................................................................................................. 19
Marco metodológico ................................................................................................... 19
Diseño de la investigación ........................................................................................ 19
Población y muestra ................................................................................................. 19
Diseño experimental ................................................................................................. 25
Operacionalización de variables ............................................................................... 26
Técnicas e instrumentos de recolección de datos ..................................................... 27
Capitulo IV ................................................................................................................. 29
Análisis y discusiones de resultados ............................................................................. 29
Preparación de la muestra ......................................................................................... 30
Autofluorescencia de la muestra de Catharanthus roseus ....................................... 31
Preparación del extracto etanólico............................................................................ 31
Separación y caracterización de compuestos fluorescentes ..................................... 32
Separación por Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución (HPTLC) ............ 33
Corrido Cromatográfico ........................................................................................... 34
Segunda extracción de compuestos fluorescentes mediante TLC preparativa ......... 39
Caracterización de los compuestos fluorescentes separados. ................................... 44
Determinación de la temperatura de degradación de los compuestos fluorescentes 48
Análisis espectroscópico .......................................................................................... 50
Diseño Experimental ................................................................................................ 55
Capítulo V ....................................................................................................................... 58
Conclusiones y Recomendaciones ................................................................................. 58
Conclusiones............................................................................................................. 58
Recomendaciones. .................................................................................................... 59
Anexo A Árbol de problemas .................................................................................... 66
Anexo B. Categorización de variables ...................................................................... 67
Anexo C. Equipos, materiales ................................................................................... 68
Anexo D. Reactivos ..................................................................................................... 70
Anexo E Placas desarrolladas a 366 nm, con sus respetivas replicas ................... 71
Anexo F Compuestos fluorescentes obtenidos. ........................................................ 72
x
Lista de tablas
Tabla 1 Ventajas y desventajas de métodos de extracción. ............................................. 12
Tabla 2 Adsorbentes y disolventes más comunes en cromatografía. Orden de elución,
actividad de adsorbentes y fuerza de elución de los disolventes. ......................................... 15
Tabla 3 Bandas de absorción correspondientes de grupos orgánicos. ............................. 17
Tabla 4 Determinación de la fase móvil. ......................................................................... 21
Tabla 5 Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC ........... 21
Tabla 6 Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC ........... 22
Tabla 7 Condiciones de desarrollo del módulo ADC-2. .................................................. 23
Tabla 8 Condiciones para el desarrollo del calorímetro diferencial de barrido DSC ...... 25
Tabla 9 Codificación de los factores y niveles de estudio ............................................... 26
Tabla 10 Matriz Estándar de Experimentos ..................................................................... 26
Tabla 11 Operacionalización de Variables ...................................................................... 27
Tabla 12 Algoritmo de Yates ........................................................................................... 27
Tabla 13 Determinación de humedad total en muestra frasca de Catharanthus roseus. .. 30
Tabla 14 Determinación de humedad relativa en muestra seca de Catharanthus roseus. 31
Tabla 15 Determinación del rendimiento de extracto total obtenido por percolación. .... 32
Tabla 16 Factores de operación ....................................................................................... 33
Tabla 17. Matriz de experimentos aleatorizada original .................................................. 34
Tabla 18. Matriz de experimentos aleatorizada de la replica........................................... 35
Tabla 19 Valores de Rf, altura y porcentaje de los compuestos fluorescentes ................ 42
Tabla 20 Valores de Rf, altura y porcentaje de los compuestos fluorescentes ................ 42
Tabla 21. Masas obtenidas de los tres compuestos separados. ........................................ 44
Tabla 22 Propiedades fiscas y químicas .......................................................................... 45
Tabla 23 Señales de la espectrofotometría FT-IR de los grupos funcionales presentes en
los compuestos fluorescentes separados. .............................................................................. 50
Tabla 24 Transiciones teóricas ........................................................................................ 54
Tabla 25 Efectos calculados sobre el número de manchas fluorescentes mediante el
Algoritmo de Yates. .............................................................................................................. 55
Tabla 26 Determinación de desviación estándar de los efectos ....................................... 56
xi
Tabla 27 Significancia estadística de los efectos Pr, S y su interacción .......................... 56
xii
Lista de Figuras
Figura 1 Fenómeno de la Fluorescencia. Modificado: (Monteleone, 2017) ...................... 7
Figura 2 Fenómeno de Stokes Shift (Lozano et al., 2014) ................................................ 7
Figura 3. Hoja de Catharanthus roseus a 366 nm (Yamamoto et al., 2016) ...................... 9
Figura 4 Estructuras moleculares de compuestos fluorescentes sintéticos. ..................... 10
Figura 5 Compuestos fluorescentes naturales a) clorofila a, b) lignina, c) Flavonoides, d)
Alcaloides ............................................................................................................................. 11
Figura 6 Espectro de absorción de la molécula. Modificado. (Benito, 2010) ................. 16
Figura 7 Compuestos fluorescentes presentes en Catharanthus roseus.(Osorio, 2017) . 29
Figura 8 Impregnación de las fracciones fluorescentes en vidrio y en papel filtro
cualitativo. (Hurtado, 2018).................................................................................................. 29
Figura 9 Placa cromatográfica de fracciones fluorescentes vista a 366 nm. (Hurtado, 2018)
.............................................................................................................................................. 29
Figura 10 A. Muestra de Catharanthus roseus vista en el microscopio electrónico a 10 X.
B. Muestra de Catharanthus roseus vista en el microscopio electrónico 10 X adaptado una
lámpara UV de 366 nm. ........................................................................................................ 31
Figura 11 Placa cromatografía a 366nm obtenida mediante TLC preparativa. F1: fracción
fluorescente para el estudio de la caracterización. ............................................................... 33
Figura 12 Placas cromatográficas de las 4 experimentaciones desarrolladas a 366nm. . 35
Figura 13 Placas cromatográficas a 366nm, modificadas con spot amplification ........... 36
Figura 14 Replica de las placas cromatográficas a 366nm, modificadas con spot
amplification. ........................................................................................................................ 37
Figura 15 Pacas cromatográficas vistas a 366 nm modificado el pH. ............................. 38
Figura 16 Cromatograma de la placa documentada a 366 ............................................... 38
Figura 17 A. Placa de la fracción F1 a 366nm obtenida mediante TLC preparativa; B.
Placa de la fracción F1 a 366nm obtenida mediante TLC preparativa con modificadas con
spot amplification ................................................................................................................. 39
Figura 18 Comparación entre las placas cromatográficas desarrolladas en HPTLC y TLC
preparativa ............................................................................................................................ 40
Figura 19 Placas cromatográficas de las fracciones F2 Y F3 desarrolladas a 366 nm .... 41
Figura 20 Cromatograma de la placa de la fracción F2 a 366nm .................................... 41
Figura 21 Cromatograma de la placa de la fracción F3 a 366nm .................................... 42
xiii
Figura 22 Comparación entre las placas cromatográficas desarrolladas en HPTLC y TLC
preparativa ............................................................................................................................ 43
Figura 23 Comparación entre las placas cromatográficas desarrolladas en HPTLC y TLC
preparativa ............................................................................................................................ 44
Figura 24 Reacción de Baljet ........................................................................................... 45
Figura 25 Reacción de Keller Killani de los compuestos C3F2, C2F3 .............................. 46
Figura 26 Reacción de Dragendorff de los compuestos C2F2, C3F2, C2F3 ....................... 46
Figura 27 Placa cromatográfica de los compuestos C3F2, C2F3, C2F2 revelada a una
longitud de onda de 366nm. ................................................................................................. 47
Figura 28 Placa cromatográfica de los compuestos C3F2, C2F3, C2F2 revelada con p-
anisaldehído y NP. ................................................................................................................ 47
Figura 29 Termograma del compuesto C3F2, a 10°C/min ............................................... 48
Figura 30 Termograma del compuesto C2F2, a 10°C/min ............................................... 49
Figura 31 Termograma del compuesto C2F3, a 10°C/min ............................................... 49
Figura 32 Espectro FT-IR del compuesto fluorescente C2F2 ......................................... 51
Figura 33 Espectro FT-IR del compuesto fluorescente C2F3 ........................................... 51
Figura 34 Espectro FT-IR del compuesto fluorescente C3F2 ........................................... 52
Figura 35 Espectro Ultravioleta del compuesto fluorescente C2F2 .................................. 52
Figura 36 Espectro Ultravioleta del compuesto fluorescente C2F3 .................................. 53
Figura 37 Espectro Ultravioleta del compuesto fluorescente C3F2 .................................. 53
Figura 38 Estructura de alcaloides lactónicos .................................................................. 54
Figura 39 Interacción de los efectos principales .............................................................. 57
Figura 40 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 20 min. S= sin pad ......... 71
Figura 41 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 10 min. S= sin pad ......... 71
Figura 42 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 10 min. S= con pad ........ 71
Figura 43 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 20 min. S= con pad ........ 72
xiv
Anexos
Anexo A Árbol de problemas .......................................................................................... 66
Anexo B. Categorización de variables ............................................................................. 67
Anexo C. Hoja de recolección de Datos .......................................................................... 68
Anexo D. Equipos, materiales ......................................................................................... 69
Anexo E. Reactivos .......................................................................................................... 70
Anexo F Placas desarrolladas a 366 nm, con sus respetivas replicas ............................. 71
Anexo G Compuestos fluorescentes obtenidos. .............................................................. 72
xv
Definición de términos
AcOEt Acetato de etilo.
C2F2 Compuesto dos de la fracción dos.
C2F3 Compuesto dos de la fracción tres
C3F2 Compuesto tres de la fracción dos.
Cy5.5 Cyanine-5.5.
F1 Fracción 1.
F2 Fracción 2.
F3 Fracción 3.
HPTLC Siglas en inglés para Cromatografía e capa fina de alta resolución.
NADH Dinucleótido de nicotinamida adenina.
NP Ácido difenilborico aminoetil éster.
Pad Saturación de la cámara cromatográfica con papel.
PF Punto de fusión.
Pr Preacondicionamiento de la placa cromatográfica.
S Saturación de la cámara cromatográfica.
S0 Singulete basal.
S1 Primer estado excitado singulete (S1).
S2 Segundo estado excitado singulete S2.
UV Luz ultravioleta.
𝜆 Distancia entre dos vientres o dos valles de una onda, expresada en nm.
xvi
TÍTULO: Caracterización espectrofotométrica de compuestos fluorescentes presentes en
el extracto etanólico de Catharanthus roseus
Autor: Liliana Elizabeth Taco Once
Tutor: Suárez Heredia Martha
RESUMEN
Los compuestos fluorescentes tienen importantes aplicaciones en la industria y en el
campo de la medicina. Catharanthus roseus, es una especie vegetal en la cual se han
identificado este tipo de compuestos. Los compuestos fueron separados por cromatografía de
capa fina de alta resolución, HPTLC. Utilizando un diseño experimental 22 con réplica del
diseño completo al 95% de confianza, se analizó el efecto del preacondicionamiento de la
placa (Pr) y la saturación de la cámara cromatográfica (S), sobre el número de compuestos
separados. Los resultados del análisis estadístico mostraron que se obtuvo mayor número de
compuestos fluorescentes utilizando un preacondicionamiento de 10 min y sin utilizar pad
en la saturación de la cámara. Se estableció que el preacondicionamiento de la placa y la
saturación de la cámara individualmente no son estadísticamente significativos en el número
de compuestos separados, pero sí afecta su interacción. Se observó mediante microscopia
electrónica con un haz de luz UV que la especie Catharanthus roseus tiene autofluorescencia
azul-rojiza. Se separaron tres compuestos fluorescentes azules los cuales se aislaron mediante
cromatografía de placa preparativa obteniéndose 8,2 mg de C2F2 con un rango de fusión de
125,5 °C y 128,5°C; 10,5 mg de C3F2 con un punto de fusión de 271,8 °C y 10,6 mg de C2F3
con un PF de 29,33 °C y un proceso exotérmico a 250,0 °C correspondiente a la degradación
del compuesto. Mediante las reacciones de Baljet y Dragendorff se definió que los
compuestos separados tienen un grupo lactónico en su estructura y son alcaloides, lo que fue
confirmado mediante Espectroscopia Infrarroja, pues en los tres compuestos se observan
picos de absorción de grupos enlaces C=O que corresponde al grupo lactónico, OH grupos
hidroxilo, CH alquilos, C=N heterociclo aromático, C=C compuestos aromáticos. En la
espectroscopia ultravioleta se obtuvo bandas de absorción máximas de 241,0 nm, 239,0 nm
y 242,0 nm de los compuestos C2F2, C3F2, C2F3 respectivamente, que según la bibliografía
estudiada se permite concluir que los compuestos separados podrían pertenecer al grupo de
alcaloides lactónicos.
PALABRAS CLAVES: COMPUESTOS FLUORESCENTES, CATHARANTHUS
ROSEUS, ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA, ESPECTROSCOPIA INFRARROJA,
ALCALOIDES LACTÓNICOS.
xvii
TITLE: Spectrophotometric characterization of fluorescent compounds present in the
ethanolic extract of Catharanthus roseus
Autor: Liliana Elizabeth Taco Once
Tutor: Suárez Heredia Martha
ABSTRACT
Fluorescent compounds have important applications in industry and in the medical field.
Catharanthus roseus, is a plant species in which these types of compounds have been
identified. The compounds were separated by high resolution thin layer chromatography,
HPTLC. Using an experimental design 22 with a replica of the complete design at 95%
confidence, the effect of preconditioning of the plate (Pr) and the saturation of the
chromatographic camera (S) on the number of separate compounds was analyzed. The results
of the statistical analysis showed that a greater number of fluorescent compounds were
obtained using a preconditioning of 10 min and without using a pad in the saturation of the
chamber. It was established that the preconditioning of the plate and the saturation of the
chamber individually are not statistically significant in the number of separate compounds,
but it does affect their interaction. It was observed by electron microscopy with a UV beam
that the Catharanthus roseus species has blue-reddish autofluorescence. Three blue
fluorescent compounds were separated which were isolated by preparative plate
chromatography to obtain 8.2 mg of C2F2 with a melting range of 125.5 ° C and 128.5 ° C;
10.5 mg of C3F2 with a melting point of 271.8 ° C and 10.6 mg of C2F3 with a PF of 29.33
° C and an exothermic process at 250.0 ° C corresponding to the degradation of the
compound. Through the reactions of Baljet and Dragendorff it was defined that the separated
compounds have a lactonic group in their structure and are alkaloids, which was confirmed
by Infrared Spectroscopy, since in the three compounds, absorption peaks of corresponding
C = O link groups are observed to the lactonic group, OH hydroxyl groups, CH alkyls, C =
N aromatic heterocycle, C = C aromatic compounds. In ultraviolet spectroscopy, maximum
absorption bands of 241.0 nm, 239.0 nm and 242.0 nm of the compounds C2F2, C3F2, C2F3
respectively were obtained, which according to the literature studied allow to conclude that
the separated compounds could belong to the group of lactonic alkaloids.
KEYWORDS: FLUORESCENT COMPOUNDS, CATHARANTHUS ROSEUS,
ULTRAVIOLET SPECTROSCOPY, INFRARED SPECTROSCOPY, LACTONIC
ALKALOIDS.
1
Introducción
La fluorescencia de una molécula, se debe a la presencia de compuestos llamados
fluoróforos. Se dividen en dos grupos: intrínsecos y extrínsecos. Los intrínsecos se hallan de
manera natural, por ejemplo: los aminoácidos aromáticos, NADH, flavinas, derivados de
piridoxal y clorofilas. Los extrínsecos son fluoróforos que se agregan a una muestra para
emitir fluorescencia por ejemplo la fluoresceína, la rodamina.(Martinez & Moctezuma,
2006).
Existen compuestos fluorescentes de origen vegetal, compuestos que no han sido
caracterizados, ejemplos de ellos se encuentran en Catharanthus roseus que es una especie
nativa de Madagascar, ampliamente cultivada en los trópicos y asilvestrada en varios países,
en el Ecuador crece espontáneamente en senderos, jardines etc.(Naunann, Mereles, &
Ezcurra, 2010).
A partir de la caracterización de compuestos fluorescentes, se conocen sus propiedades
físicas y químicas, asimismo a nivel espectrofotométrico pueden definir sus grupos
funcionales, estabilidad y existe la posibilidad de una dilucidación estructural. La
identificación y caracterización de compuestos fluorescentes naturales es importante por sus
potenciales aplicaciones, ya que la mayoría de los utilizados actualmente son sintéticos y
presentan toxicidad. La determinación estructural, que inicia con la caracterización de estos
compuestos daría la posibilidad de reemplazar aquellos que provienen de síntesis.
La presente investigación se distribuyó en cuatro capítulos detallados a continuación:
El capítulo I; describe el planteamiento y formulación del problema, en donde se busca
conceptualizar y limitar el tema que será presentado, además se planteó preguntas directrices
necesarias para diferenciar los objetivos de la investigación, y justificar el problema.
El capítulo II, detalla los antecedentes del estudio, que se ha desarrollado sobre el tema de
investigación el mismo que servirán para su ejecución. Además, incluye el fundamento
teórico, que sustentan el trabajo de investigación. También se conceptualizan las variables y
se plantea las posibles respuestas al problema.
El Capítulo III corresponde al marco metodológico que muestra el diseño experimental,
variables y consideraciones estadísticas para el análisis de datos provenientes de la ejecución
de la parte experimental.
El Capítulo IV, corresponde al marco administrativo que proyecta los recursos necesarios,
una aproximación del costo del desarrollo de la investigación y el cronograma de actividades
a ser ejecutado.
2
Capítulo I
El Problema
Planteamiento del problema
Los compuestos fluorescentes tienen un gran valor a nivel industrial, pero la mayoría de
ellos son sintéticos a pesar de su diversidad química limitada y características biológicas
indeseables. (Duval & Duplais, 2017). Estos compuestos son tóxicos por lo que provocan
alteraciones en el organismo del ser humano, por ejemplo: el verde de indocianina aprobado
por la FDA (Food and Drug Administration) desde 1956, hace referencia que con 0,1 mL del
mismo con concentración de 2,5 mg/mL, causa la pérdida de visión después de 10 min de
endoiluminación, según estudios realizados en animales; adicionalmente se ha determinado
que lesiona las fibras nerviosas de la cabeza del nervio óptico del ser humano. (Choyke et
al., 2009). La fluoresceína otro compuesto sintético genera el decrecimiento de las neuronas
a una concentración de 0,2 mg/mL, también se ha registrado que cuando se utiliza en
angiografías en mujeres embarazadas causa baja de peso en el bebé. Otro compuesto toxico
es la rodamina 6G que no está aprobado por la FDA debido a que provoca mutagenicidad y
toxicidad en células, tejidos y organismos vivos.(Choyke et al., 2009).
Existen compuestos fluorescentes presentes en especies vegetales y animales que
muestran mayor grado de diversidad estructural, tanto física como química, así como
actividades farmacológicas diversas, a pesar de esto las investigaciones permanecen
limitadas. (Duval & Duplais, 2017).
Catharanthus roseus, es una especie vegetal que tiene demanda en países como Estados
Unidos y Reino Unido por los alcaloides que posee, se adquieren cada año 10 toneladas de
hojas y Alemania muestra interés por las raíces.(Acosta & Rodríguez, 2002). La especie
posee una autofluorescencia azul o amarilla emitida por compuestos fluorescentes presentes
en hojas y tallos (Yamamoto et al., 2016). A pesar de ello, existe poca información de estos
compuestos pues la mayoría de las investigaciones se han desarrollado en base a dos tipos de
alcaloides como son la vinblastina y vincristina, que cobran importancia por su poder
anticancerígeno.(Acosta & Rodríguez, 2002).
Además, el aislamiento de los compuestos naturales se ve restringido por los procesos
largos para su extracción. Según Tikhomiroff & Jolicoeur (2002) los compuestos
fluorescentes se deben extraer mediante sonicación de la muestra en metanol, luego el
extracto debe ser fraccionado para separar los lípidos, proteínas, pigmentos entre otros y, por
último, se realiza el aislamiento mediante TLC o HPLC, este proceso requiere de un tiempo
mayor que los de síntesis. Sin embargo, las aplicaciones de estos compuestos hacen que el
desarrollo de los mismos cobren valor.
3
Los compuestos fluorescentes tienen alta aplicabilidad en varios campos, por ejemplo: en
la biología moderna se puede detectar estructuras biológicas mediante microscopia de
fluorescencia ya sea en tinción de células, inmonoensayos o marcando nucleótidos.(Goswami
& Ganguly, 2003). También se los usa en tintas de impresión con fines de identificación,
decorativos. Una importante aplicación es con fines de seguridad de documentos y para
detectar falsificaciones, ya que la incidencia de radiación ultravioleta se vuelve visibles a
estos compuestos.(Butterfield & Township, 1985; Seccuro, 1985).
Por todo lo expuesto anteriormente nace la necesidad de realizar la caracterización de los
compuestos fluorescentes naturales presentes en Catharanthus roseus con el fin de identificar
sus propiedades físicas, químicas, el tipo de metabolito al que corresponde y realizar una
aproximación a sus grupos funcionales. Esta investigación se enfoca en la extracción,
separación y caracterización espectrofotométrica mediante infrarrojo y ultravioleta de un
grupo de compuestos fluorescentes presentes en Catharanthus roseus.
Formulación del Problema
¿Se pueden caracterizar los compuestos fluorescentes de Catharanthus roseus separados
por cromatografía en capa fina de alta resolución HPTLC mediante métodos
espectrofotométricos?
Preguntas de investigación
¿El método cromatográfico empleado puede individualizar los compuestos de la fracción
fluorescente?
¿La derivatización de la placa cromatográfica permite la caracterización de los grupos
funcionales de los compuestos fluorescentes?
¿La espectroscopia Infrarroja y Ultravioleta caracterizan los compuestos fluorescentes
separados?
Objetivos de investigación
Objetivo general.
Caracterizar espectrofotométricamente los compuestos fluorescentes presentes en el
extracto etanólico de Catharanthus Roseus.
Objetivos Específicos.
Separar la fracción fluorescente del extracto etanólico de Catharanthus roseus mediante
TLC preparativa.
Definir un método para individualizar los componentes de la fracción fluorescente
utilizando Cromatografía en Capa Fina de Alta Resolución, HPTLC.
4
Caracterizar los grupos funcionales, mediante la derivatización de placa cromatográfica,
utilizando la metodología de inmersión.
Emplear espectroscopia Infrarroja y Ultravioleta para caracterizar los compuestos
fluorescentes separados
Justificación e importancia de la Investigación
En la actualidad la mayoría de compuestos fluorescentes son sintéticos y tóxicos, a pesar
de ello son utilizados a nivel industrial o en el campo de la medicina. Existen compuestos
fluorescentes naturales como son los de la especie Catharanthus roseus los cuales no se han
estudiado a profundidad, ya que requieren procesos extensos para su aislamiento y
caracterización, pero el aislamiento de los mismos ayudaría a reemplazar los compuestos
sintéticos.
Catharanthus roseus crece abundantemente en regiones tropicales y por ser una especie
de estudio existen instructivos técnicos para su cultivo en invernaderos lo que facilita su
obtención. (Hurtado, 2018). En su composición general, presenta compuestos fenólicos,
alcaloides derivados del triptófano y la triptamina los cuales poseen fluorescencia. (Hisiger
& Jolicoeur, 2005).
La investigación busca la caracterización de los compuestos fluorescentes naturales que
posee la especie Catharanthus roseus y que pueden obtenerse a partir del extracto etanólico
desengrasado. Con este estudio, se trata de proporcionar información acerca de las
propiedades fiscas y químicas; y, realizar una aproximación a grupos funcionales, que sirva
como base para la dilucidación estructural.
5
Capítulo II
Marco Teórico
Antecedentes
Los compuestos fluorescentes por sus aplicaciones han sido objeto de estudio. Se tienen
reportes tanto de investigaciones en compuestos de síntesis como en compuestos de
extracción a partir de diversas especies vegetales, se detallan a continuación los principales
estudios que sirvieron como base para esta investigación:
Fernández. A. y colaboradores (2011) realizaron un estudio de la actividad antimalárica y
citotoxicidad en extractos hidroalcóholicos de seis especies vegetales usadas en la medicina
tradicional, mediante cromatografía en capa fina se logró separar fracciones fluorescentes, la
fase estacionaria y fase móvil que se utilizaron fueron silica 60 F254 y acetato de etilo:
metanol: agua (10:1,3:1) respectivamente. Para la caracterización se usaron dos tipos de
reveladores, luz ultravioleta con λ = 254 nm , 366 nm y vainillina, con la primera se
observaron fracciones fluorescentes azules a las dos longitudes de onda establecidas y con el
segundo se observaron manchas rojizas en la placa, se concluyó que las manchas visualizadas
eran compuestos terpénicos. (Valdés, Martínez, Rodríguez, & Caballero, 2011)
Garrido, G y colaboradores (2013), determinaron fenoles y flavonoides totales de extracto
de hojas de Lampaya medicinalis F. Phil. Se realizó una cromatografía en capa fina de
extractos etanólicos, se usó fase estacionaria de gel de sílice 60 F254 y dos fases móviles la
primera de acetato de etilo: ácido fórmico: ácido acético: agua (100:11:11:26) y la segunda
n-butanol: acetato de etilo: amoníaco: agua (12:8:1:2). La caracterización se realizó con el
reactivo Natural Products , NP y se observaron manchas fluorescentes de color azul-verde
bajo una cámara UV a una λ = 366 nm, se concluyó que se trataba de ácidos fenil-
carboxilicos. Además, se presentaron manchas fluorescentes de color amarillo anaranjado
característico de los flavonoides.(Garrido, Ortiz, & Pozo, 2013)
En la Universidad Central del Ecuador se realizó una investigación de compuestos
fluorescentes en la especie Catharanthus roseus, en extractos etanólicos de esta especie, la
separación de los compuestos fue realizada mediante cromatografía en capa fina de alto
rendimiento, HPTLC; usando como fase móvil acetato de etilo: metanol (2:7) con una
polaridad 5,48, se obtuvieron 8 manchas fluorescentes de las cuales una de ellas presentó
buena impregnación en vidrio boro silicatado. Además, mediante espectroscopia ultravioleta
se obtuvo picos de absorción entre 230 - 280 nm, lo que indicó que la presencia de
compuestos aromáticos conjugados, grupos carboxílicos, ésteres. (Hurtado, 2018)
Betancourt y Trujillo fraccionaron y caracterizaron química el extracto en butanol
obtenido de la corteza interna de Tabebuia rosea (Bertol) DC. Se realizó una cromatografía
en columna utilizando fases móviles en gradiente de cloroformo, cloroformo – metanol,
6
metanol y metanol – agua. Se aislaron 123 fracciones, que se reunieron según características
semejantes consiguiéndose así 11 fracciones. La caracterización se la realizó mediante
pruebas químicas, dando como resultado la presencia mayoritaria de flavonoides, terpenos y
cumarinas. De igual manera se observaron manchas fluorescentes de color azul a una λ =
366 nm. Por otro lado, mediante espectroscopía ultravioleta se obtuvo un rango de absorción
entre 304 - 350 nm de las fracciones aisladas lo que permitió concluir que son moléculas de
tipo flavonas, flavonoles. (Betancourt & Trujillo, 2013).
Fundamento teórico
Luminiscencia.
La luminiscencia es la emisión de radiación visible presentada por una sustancia como
consecuencia de la absorción de energía, sin implicar radiación térmica en la misma. Existen
dos tipos de luminiscencia, según el tiempo de duración que se da entre emisión y excitación
como son: la fluorescencia, que dura un lapso de tiempo 𝑡 ≤ 10−3𝑠 y la fosforescencia, que
tiene un tiempo de decaimiento más largo que es 𝑡 ≥ 10−3𝑠, este proceso puede continuar
durante un tiempo más largo después de remover la fuente de excitación.(Rodríguez, 2007)
La luminiscencia de cada sustancia puede ser provocada mediante diferentes formas de
excitación, como son: a) bioluminiscencia excitación de reacciones bioquímicas; b) cátodo-
luminiscencia, es la excitación de los rayos catódicos; c) quimioluminiscencia, se da en las
reacciones químicas; d) fotoluminiscencia, se da por medio de la excitación de la luz visible
o ultravioleta produciendo la fluorescencia de la molécula.(Borbón, 2010)
Fluorescencia.
La fluorescencia involucra transiciones en estados simples S1 y S2 decayendo a S0 como
muestra la figura 1, los cuales tienen electrones excitados con un spin contrario que los del
estado base pues así existe un decaimiento sin problemas de un enfrentamiento de spin.
(Alfaro, 2005).
El tiempo de vida de un estado excitado es aproximadamente de 10−9 s a 10−7 s y por
ende es el tiempo de duración de la fluorescencia. (Martinez & Moctezuma, 2006). Durante
este tiempo pueden ocurrir reacciones reversibles o no, tomando en cuenta que las reacciones
del estado excitado son diferentes a las reacciones del estado basal por su distribución
electrónica. (Martinez & Moctezuma, 2006).
7
Figura 1 Fenómeno de la Fluorescencia. Modificado: (Monteleone, 2017)
Fenómeno de Stokes Shift.
El fenómeno de Stokes Shift se da cuando el fotón emitido tiene menor energía que el
fotón absorbido lo que produce que la fluorescencia se desplace a longitudes de onda más
largas como muestra la figura 2. (Fishman, 2012; Lozano, Torres, & Baeza, 2014). Este
fenómeno se mide como la diferencia entre las longitudes de onda máximas de los espectros
de excitación y emisión del fluoróforo, el tamaño depende de la estructura de la molécula y
del ambiente químico.(Fishman, 2012)
Figura 2 Fenómeno de Stokes Shift (Lozano et al., 2014)
Fluoróforos.
Las moléculas responsables de la fluorescencia son estructuras llamadas fluoróforos se
pueden dividir en dos clases: intrínsecos y extrínsecos. Los fluoróforos intrínsecos son
aquellos que ocurren naturalmente; estos incluyen los aminoácidos aromáticos, NADH,
flavinas, derivados de piridoxilo y clorofila. Los fluoróforos extrínsecos se agregan a la
8
muestra para proporcionar fluorescencia cuando no existe, o para cambiar las propiedades
espectrales de la muestra. Los fluoróforos extrínsecos incluyen dansilo, fluoresceína,
rodamina y muchas otras sustancias (Lackowicz, 2006).
Factores que afectan la intensidad de la fluorescencia en los fluoróforos.
Los fluoróforos presentan en su estructura grupos funcionales aromáticos, carbonilos
alifáticos y alicíclicos, dobles enlaces conjugados todos con un alto grado de estabilidad de
resonancia y bajas energías de transición π→π∗. Por otro lado, la intensidad de la
fluorescencia se ve afectada por varios factores que son:
Efecto de la sustitución.
La sustitución de grupos funcionales cambia la longitud de onda de máxima absorción
del fluoróforo con un cambio correspondiente en la posición e intensidad de la línea de
emisión de fluorescencia.(Skoog, Holler, & Nieman, 2001)
Efecto de la temperatura y naturaleza del solvente.
El efecto de un aumento en la temperatura incrementa el número de choques moleculares,
por lo que la desactivación tiende a efectuarse a través de procesos no radioactivos y por lo
tanto se inhibe la fluorescencia. La viscosidad del solvente tiene efectos similares, a mayor
viscosidad menor número de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia. La
polaridad del solvente también tiene influencia en la fluorescencia, debido al efecto
hipsocrómico y batocrómico que el solvente ejerce sobre el compuesto. (C. Gooijer, 2000)
Efecto del pH.
Debido a las diferentes formas químicas que son posibles a diferentes condiciones de pH,
la intensidad de fluorescencia también es afectada por este factor. Por ejemplo: el fenol y el
ión fenolato tienen diferentes propiedades fluorescentes, por lo que si las condiciones son de
pH básico la especie estará en el equilibrio químico en la forma del fenol y/o ion fenolato,
afectando así la intensidad de fluorescencia. Cuanto mayor sea el número de estructuras
resonantes es mayor la estabilidad del estado excitado por lo tanto la molécula tendrá
fluorescencia en el rango del ultravioleta. (Skoog et al., 2001)
Efecto del oxígeno disuelto.
Debido al paramagnetismo de la molécula de oxígeno, esta tiende a desactivar cualquier
estado activado por oxidación fotoquímica de la especie fotoluminiscente, provoca
cruzamiento intersistemas y conversiones de las moléculas excitadas al estado triplete, por lo
que es deseable que el oxígeno no se encuentre presente en solución o su concentración sea
mínima. (Skoog et al., 2001)
9
Autofluorescencia de plantas.
La autofluorescencia de los tejidos vivos es un fenómeno natural que se debe a la presencia
de metabolitos endógenos y compuestos fluorescentes orgánicos e inorgánicos. En las células
vegetales, la autofluorescencia se deriva principalmente de la presencia de clorofila, lignina,
los carotenos y las xantofilas cuando se usan longitudes de onda de excitación en el rango
del azul y el ultravioleta.(Alché, Olmedilla, & Rodríguez, 2010).
En la figura 3 se muestra el fenómeno de la autofluorescencia de la especie Catharanthus
roseus hecha al tallo con un corte longitudinal. (Yamamoto et al., 2016)
Figura 3. Hoja de Catharanthus roseus a 366 nm (Yamamoto et al., 2016)
Compuestos fluorescentes sintéticos.
Gran parte de los compuestos fluorescentes sintéticos son aplicados en el campo de la
medicina y la mayoría de ellos son tóxicos. Además, cuando la síntesis añade sustituyentes a
una molécula natural se produce un cambio en la vida útil de la fluorescencia natural. (Dols,
Mansell, Dols, & Mansell, 2018). En la figura 4 se muestran varios compuestos sintéticos
tóxicos como (a) Alexa Fluor 488 con una estimación de toxicidad aguda: > 2.000 mg/kg a
nivel cutáneo e inhalación. (MERK, 2007). (b) BODIPY FL un conjugado de BODIPY-
verapamilo es tóxico para líneas celulares de carcinoma de KB humano resistentes a
múltiples fármacos en cultivo a concentraciones superiores a 10 µM (aproximadamente 7,3
µg / mL). (Choyke et al., 2009) (c) Cy5.5 es perjudicial si se ingiere y puede causar reacciones
alérgicas respiratorias y cutáneas. (d) la fluoresceína puede irritar las raíces nerviosas cuando
se inyecta por vía intratecal (dentro de la médula espinal) y afecta el sistema nervioso central.
(Choyke et al., 2009)
10
Compuestos fluorescentes naturales.
Son compuestos que presentes en especies vegetales en sus hojas, tallo y raíz. Emiten
fluorescencia de varios colores en diferentes longitudes de onda. Por ejemplo, la clorofila a,
muestra su fluorescencia roja a una longitud de onda de 366 nm. La lignina, tiene
fluorescencia azul a una longitud de onda que va desde 330 nm - 385 nm.(Sampaio, Abreu,
Silveira, Silva, & Ibanez, 2016). Los alcaloides emiten fluorescencia azul a una longitud de
a) b)
c)
d)
Figura 4 Estructuras moleculares de compuestos fluorescentes sintéticos.
Modificado: (Choyke et al., 2009)
11
onda de 366 nm.(Merino, 2015). Los flavonoides presentan fluorescencia anaranjada a una
longitud de onda de 365 nm. (Barrón-Yánez, del Rosario García-Mateos, Soto-Hernández,
Colinas-León, & Kite, 2011). Sus estructuras se presentan en la figura 5.
Separación de los compuestos fluorescentes naturales.
Para separar los compuestos fluorescentes se los debe extraer mediante técnicas como son
la maceración, percolación, extracción Söxleth. Se utilizan solventes con polaridad creciente
a)
b) c)
d)
Figura 5 Compuestos fluorescentes naturales a) clorofila a, b) lignina, c)
Flavonoides, d) Alcaloides
Modificado: (Barrón-Yánez et al., 2011)
12
entre estos están: metanol, etanol, acetato de etilo, los cuales extraen la mayor cantidad de
metabolitos secundarios fluorescentes presentes en las especies vegetales. Cada una de las
técnicas de separación tiene sus ventajas y desventajas, en la tabla 1 se detalla las más
utilizadas.
Tabla 1 Ventajas y desventajas de métodos de extracción.
Técnica Ventajas Desventajas
Maceración
Sirven para drogas rígidas
Reducción de costos de
solvente
Lentitud del proceso
Extracción incompleta de la
droga
Saturación del solvente
Percolación
Extracción completa de
principios activos, es
posible conocer la
concentración exacta de
principios activos
No se produce saturación
del solvente y se requiere
menor tiempo para la
extracción comparado con
la maceración.
Alto consumo de solvente
Tiempos largos
Si las sustancias activas son
termolábiles, la evaporación
de grandes volúmenes de
percolado diluido pueden
provocar una pérdida parcial
de metabolitos secundarios.
Fuente:(Carrión, Cándida, & García Gómez, 2010; Handa, Khanuja, Longo, & Rakesh,
2008). Modificado por. Taco L.
Una vez obtenido el extracto se realiza la separación de los metabolitos mediante
cromatografía en capa fina, cromatografía en columna, cromatografía de gases entre los más
comunes los cuales se explican en el siguiente apartado.
Marco metodológico
Estandarización de la muestra vegetal.
La estandarización de la muestra incluye: limpieza, desinfección, secado, reducción del
tamaño de partícula y determinación de humedad relativa las cuales se exponen a
continuación.
Limpieza y desinfección.
La limpieza realiza de forma mecánica para separar organismos o sustancias ajenas al
material vegetal tales como: insectos, arena, polvo, piedras, tierra, entre otros. Además, se
retiran el material en mal estado como flores marchitas, u hojas con clorosis debida a la
deficiencia de clorofila. (Osorio, 2017)
13
La desinfección del material vegetal se realiza empleando agentes químicos como
hipoclorito de sodio, permanganato de potasio diluidos. Este procedimiento ayuda a eliminar
e impedir la proliferación de microorganismos. (Osorio, 2017)
Secado.
El secado de la muestra, permite retirar el exceso de agua, interrumpiendo procesos
enzimáticos a nivel celular e impidiendo el crecimiento de microorganismos (bacterias y
hongos). Asimismo, facilita el transporte y almacenamiento sin el riesgo de deterioro. (Otazu,
2010)
Reducción del tamaño de partícula.
La reducción del material vegetal, hace que exista mayor superficie de contacto con el
solvente a extraerse facilitando la extracción del mayor número de metabolitos secundarios.
Un adecuado proceso de molienda también incluye una separación previa de impurezas,
presentes en la muestra. (Osorio, 2017).
Determinación de humedad relativa.
La determinación de humedad relativa, permite conocer la cantidad de agua de un sólido,
que ha sido sometido a secado a 40°C. El procedimiento puede realizarse de forma
tradicional, calculando la diferencia entre el peso inicial y final de la muestra, al ser sometida
a calentamiento a 110°C. (Otazu, 2010)
Desengrasado.
El desengrasado se lo hace mediante una extracción Söxleth lo cual ayuda a la eliminación
de sustancias apolares de la muestra mediante un disolvente de iguales características.
(Otazu, 2010)
Extracción por el método de percolación.
La percolación es el paso lento de un solvente generalmente alcohólico a través de un
material poroso siempre en un solo sentido. La muestra pulverizada, se pone en contacto con
suficiente cantidad de solvente y este tiene que ser renovado constantemente.
Concentración del extracto.
Busca aumentar el contenido de sólidos disueltos en el extracto con la finalidad de fabricar
extractos blandos y alcanzar un determinado contenido del residuo seco, se usan equipos
comunes y a presión normal o al vacío, sin embargo, la mayoría de los extractos precisan ser
evaporados, en lo posible a temperaturas bajas y al vacío. (Otazu, 2010)
14
Cromatografía.
Es un método físico de separación en el que los componentes se distribuyen entre dos
fases una móvil y otra estacionaria. Se tiene como resultado procesos de sorción-desorción
durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil. (CSIC,
2011). En la tabla 2 se observa la influencia en orden ascendente que tiene la fuerza de elución
del solvente con los distintos grupos funcionales a eluir.
Parámetros cromatográficos
Retención.
Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que
puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido. (Erazo Proaño & Jativa, 2013).
Desplazamiento.
Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un
líquido o un gas. El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de
la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. (CSIC, 2011)
La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaria, mientras que la fase móvil
atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a diferente velocidad,
dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se
eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la
fase móvil y la fase estacionaria. (Erazo Proaño & Jativa, 2013).
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden
analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. (Universidad autonoma de México, 2012)
15
Tabla 2 Adsorbentes y disolventes más comunes en cromatografía. Orden de elución,
actividad de adsorbentes y fuerza de elución de los disolventes.
Secuencia Orden de elución
de compuestos
Actividad de
adsorbentes
Fuerza de elución
de disolventes
-
+
Hidrocarburos
saturados
Celulosa Éter de petróle
Hidrocarburos
aromáticos
Ciclohexano
Derivados
Halogenados
Benceno
Éteres
Tetracloruro de
carbono
Sulfato cálcico
(yeso)
Diclorometano
Cetonas Sílice Cloroformo
Aldehídos Florisil Éter dietílico
Esteres Oxido de magnesio Acetato de etilo
Alcoholes Alúmina
Aminas
Ácidos Acetona
n-propanol
Metanol
Etanol
Agua
Ácido acético
Fuente. (CSIC, 2011). Modificado por Taco L
16
Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina
Luz UV: Cuando la sustancia absorbe luz ultravioleta se puede usar fase estacionaria
impregnada con un indicador fluorescente (F254 o F366). (Erazo Proaño & Jativa, 2013).
Vainillina (H2SO4): Se usa para la identificación de alcoholes, esteroides, fenoles, y
aceites esenciales. (Rey & Vargas, 2009)
Reactivo de Neu: Identifica flavonoides y cumarinas al igual que el hidróxido de potasio
que es un reactivo específico para cumarinas.
Anisaldehído: Es un reactivo que identifica glucósidos. (Rey & Vargas, 2009)
Espectroscopia ultra violeta – visible
La espectroscopia UV-vis se basa en el análisis de la cantidad de radiación
electromagnética en el rango de longitudes de onda ultravioleta y visible que pueden absorber
o transmitir una muestra en función de la cantidad de sustancia presente (Vandergriff, 2009).
Ley de Lambert-Beer: Esta ley permite relacionar la fracción de radiación absorbida con
la concentración del analito y el espesor del medio. Cada sustancia tiene un espectro de
absorción característico que dependerá la configuración electrónica de la molécula átomo o
ion y de los posibles tránsitos electrónicos como se muestra en la figura 6 (Benito, 2010)
Figura 6 Espectro de absorción de la molécula. Modificado. (Benito, 2010)
Espectroscopia Infrarroja.
Estudia los fenómenos de interacción entre la radiación de origen infrarrojo y la materia.
Para que se produzca una vibración en una molécula al incidir sobre ella un haz de energía
es la presencia de momentos dipolares. La radiación infrarroja es la proporción de espectro
electromagnético que va desde 4000 a 625 cm-1. (Carey, 2006)
La radiación que registra debe ser solamente la originada por los movimientos
vibracionales de las moléculas presentes en la sustancia.
Por otro lado, las bandas que poseen los espectros tienen localizaciones e intensidades
específicas para cada grupo funcional, además las intensidades de las bandas son
17
generalmente proporcionales a las concentraciones de los componentes individuales de una
mezcla por lo que permite determina la concentración de cualquiera de ellas. (Carey, 2006)
El espectro electromagnético IR con número de onda del infrarrojo medio entre 4000 y
1300 cm-1 suele observarse una serie de bandas de absorción provocadas por las vibraciones
entre únicamente dos átomos de la molécula que contienen hidrógeno o de grupos con dobles
o triples enlaces aislados (Peguero, 2010).
El espectro electromagnético IR con número de onda comprendidas entre 1300 y 400 cm-
1 con el nombre de infrarrojo lejano se asignan las bandas de absorción de vibraciones
moleculares más difíciles de observar la se denomina zona de la huella dactilar donde se
observan la flexión de enlaces CH, CO, CN, CC. En la tabla 3 se encuentra las absorciones
principales de grupos funcionales (Montoro, 2013).
Tabla 3 Bandas de absorción correspondientes de grupos orgánicos.
Grupo funcional Número de onda
(cm-1)
Grupo funcional Número de onda
(cm-1)
OH enlace de
hidrógeno 3100-3200 Amidas 1690-1630
OH sin enlace de
hidrogeno 3600 NH 3500-3300
Cetonas C=O 1725-1700 C=N- 1690-1480
Aldehídos C=O 1740-1720 δ-Lactonas 1750-1735
Aldehídos y cetonas
α,βinsaturados C=O 1715-1660
Aromáticos (núcleos
bencénicos) en
sistemas
condensados
1500-1490
Ciclopentanonas 1750-1740 C=C alquenos
1680-1600
Ácidos carboxílicos 1725-1700
Fuente: (Serrano Martínez, 2009) Modificado Taco L
Marco Legal
Al ser una investigación que implica productos naturales; se necesita el permiso
entregado por el Ministerio del Ambiente, para la especie Catharanthus roseus, el mismo
que el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la Universidad Central del
Ecuador obtuvo con el nombre de:
“Contrato Marco de Acceso a los Recursos Genéticos del proyecto de
Investigación Científica denominado: Estudio de Productos Naturales con aplicación
Industrial (Alimentos y Cosméticos) Celebrado entre el Ministerio del Ambiente a
través de la subsecretaria de Patrimonio Natural y la Universidad Central del
Ecuador”. MAE-DNB-CM-2017-0078
18
Hipótesis
Hipótesis de trabajo Hi.
Hi: Es posible la caracterización espectrofotométrica de los compuestos fluorescentes,
separados del extracto etanólico Catharanthus Roseus mediante cromatografía en Capa Fina
de Alta Resolución, HPTLC.
Hipótesis Nula Ho.
Ho: No es posible la caracterización espectrofotométrica de los compuestos fluorescentes
separados, del extracto etanólico Catharanthus Roseus mediante cromatografía en Capa Fina
de Alta Resolución, HPTLC
Sistema de Variables
Variable dependiente.
Numero de compuestos fluorescentes separados
Variable independiente.
Preacondicionamiento de la placa cromatográfica
Saturación de la placa cromatográfica.
19
Capítulo III
Marco metodológico
Diseño de la investigación
El trabajo de investigación tiene un enfoque cuantitativo, esto quiere decir que su objetivo
es la medición de una serie de repeticiones que incluye un tratamiento estadístico entre las
variables propuestas presentando así confiabilidad, validez entre las mediciones. (Monje
Álvarez, 2011)
Así mismo el nivel de investigación es explicativo ya que tiene una relación causa- efecto,
por lo que el método de análisis está orientado a diseñar un modelo experimental
estadístico(Zetino, 2005), en donde se permita concluir que la variación en el número de
compuestos separados son consecuencia de las variaciones en el preacondicionamiento de la
placa y tipo de saturación de la cámara cromatográfica. Por lo antes expuesto esta
investigación es de tipo experimental ya que se van a manipular variables.
Población y muestra
Muestra.
La población que se utilizó en la investigación es perteneciente a la familia Apocynaceae
de género Catharanthus y la muestra fue 300 g de hojas de Catharanthus roseus en total y
para cada tratamiento se utilizó 2 g de muestra.
Método y materiales.
En la presente investigación se utilizaron los siguientes materiales-equipos y reactivos
para la ejecución de la parte experimental que se detallan en los anexos C y D.
Preparación de la muestra.
Se recolectaron hojas de Catharanthus Roseus, en el cantón Puerto Quito provincia de
Pichincha, con las siguientes coordenadas geográficas 0°07′38″N 79°15′11″O. Se
seleccionaron las hojas con las mejores condiciones tanto en color como en textura. La
desinfección se realizó de acuerdo con la metodología de (Osorio, 2017). La muestra limpia
se colocó en una caja de papel corrugado y se secó en una estufa de aire caliente BINDER, a
una temperatura de 40°C por 6 días. Se redujo el tamaño de partícula en un molino
CORONA, se homogenizó en una tamizadora eléctrica GILSON utilizando un tamiz N°20
TAYLER. Se almacenó la muestra en un frasco color ámbar (Hurtado, 2018).
20
Determinación de la humedad relativa.
En una balanza analítica marca Denver Instrument se pesó por triplicado
aproximadamente 0,5000 g de muestra seca de Catharanthus roseus, la muestra se llevó a
una estufa BINDER y se programó a 105°C las hojas se se secaron hasta peso constante.
Desengrasado.
Se pesó en la balanza analítica DENVER (A±0,0001g), 2,0000g de muestra seca
estandarizada de Catharanthus roseus, y se desengrasó mediante una extracción Söxleth
durante 5h, utilizando como solvente n-hexano. Osorio, (2017).
Preparación del extracto etanólico.
La muestra desengrasada se percoló con etanol al 96% (v/v) a una velocidad de flujo
promedio de 23 gotas por minuto, como recomienda Osorio (2017). El proceso se llevó a
cabo durante 4h hasta reacción negativa con cloruro férrico. El extracto obtenido se almacenó
en frascos ámbar, protegidos de la luz. Se concentró el extracto en un rotavapor SELECTA,
hasta alcanzar un volumen inferior a 20 mL, el cual se colocó en una caja Petri previamente
tarada. Se evaporó el solvente en una estufa BINDER a 40°C hasta peso constante.
Separación y caracterización de compuestos fluorescentes.
Separación por TLC preparativa.
Se elaboró una placa preparativa con dimensiones 20x20 cm siguiendo la metodología de
Hurtado (2018). Con la ayuda de una pipeta Pasteur se sembró el extracto etanólico de
Catharanthus Roseus de concentración 1,53% (p/v) y se dejó evaporar el solvente a
temperatura ambiente. Para la separación de los compuestos se siguió la metodología de
Hurtado (2018).
Extracción de la fracción fluorescente.
Utilizando una cámara UV y con la ayuda de una espátula se raspó el segmento de sílice
de la fracción fluorescente de interés, la misma que se disolvió en alcohol metílico, se filtró
para eliminar la silica. La fracción se colocó en una caja Petri previamente tarada y se evaporó
el solvente a 40 °C en una estufa BINDER hasta peso constante.
Separación por Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución (HPTLC).
Pruebas preliminares.
Para elegir las condiciones del corrido cromatográfico se realizaron 10 experimentaciones.
Se analizó la polaridad de la fase móvil y el tipo de solvente para eluir la muestra
21
manteniendo contantes los tiempos de pre-acondicionamiento de la placa, la saturación de la
cámara cromatográfica y el volumen de inyección.
En la primera experimentación se utilizaron placas marca HPTLC Fertigplatten nano-Sil
C18-100/UV254 de dimensiones 10x10cm. Para determinar la polaridad optima de la fase
móvil se preparó 1 mL de extracto fluorescente metanolico. Utilizando el módulo
LINOMAT-5 se inyectaron 8 tracks de extracto fluorescente en seis placas variando la fase
móvil como se observa en la tabla 4.
Tabla 4 Determinación de la fase móvil.
N° Placa Fase móvil Proporción Polaridad
1 hexano:metanol 9:1 0,66
2 Etanol: acetato de etilo 6:4 4,84
3 Etanol:AcOEt:ciclohexanona 4:5,5:0,5 4,67
4 Etanol:AcOEt:ciclohexanona 4:5,5:0,7 4.66
5 Etanol:AcOEt:ciclohexanona 4:5,5:2 4,64
6 Etanol:AcOEt:ciclohexanona 4:5,5:3,5 4,63
Elaborado por. Taco L.
Para el desarrollo de las placas, se configuraron las condiciones del módulo ADC-2, con
los parámetros descritos en la tabla 5
Tabla 5 Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC
Parámetros Condiciones de desarrollo
Pre-secado Tiempo 5 min
Inyección
Volumen de jeringa 100µL
Volumen de inyección extracto 5µL
Velocidad de inyección 150 nl/seg.
Control de humedad
Tiempo 10 min
Solución Cloruro de magnesio
Volumen de llenado 800 mL
Humedad relativa 43%
Saturación Volumen de fase móvil 35 mL
Desarrollo
Distancia de migración 70,0 mm
Ancho de banda 6,0 mm
Volumen de fase móvil 10,0 mL
Modificado: (Hurtado, 2018)
22
Las placas se foto documentaron en el módulo TLC-VISUALIZER para seleccionar la
fase móvil adecuada.
Para la segunda experimentación se emplearon placas de marca HPTLC Fertigplatten
nano-Sil C18-100/UV254 de dimensiones 10x10 cm. Se inyectaron 8 tracks a cada placa de
extracto fluorescente variando el eluyente del mismo. El desarrollo cromatográfico se hizo
en las condiciones descritas en la tabla 5. Además, se realizaron ocho experimentaciones más
para definir los niveles (-1) y (+1) del preacondicionamiento de la placa y saturación de la
cámara.
Corrido cromatográfico.
Se prepararon las muestras de extracto fluorescente pesando 4 - 6 mg del mismo disuelto
en 1 𝑚𝐿 de metanol analítico. Se usó el módulo LINOMAT-5 para inyectar 8 tracks con 5
𝜇L de extracto fluorescente, cada uno en una placa de 10x10 cm marca HPTLC Fertigplatten
nano-Sil C18-100/UV254. La placa se llevó al siguiente módulo ADC-2 para su desarrollo,
se configuraron los parámetros descritos en la tabla 6 por el software WinCats del equipo.
Tabla 6 Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC
Parámetros Condiciones de
desarrollo
Pre-secado Tiempo 5 min
Inyección
Volumen de jeringa 100µL
Volumen de inyección
extracto 5µL
Velocidad de inyección 150 nl/seg.
Control de humedad
Tiempo 10 min
Solución Cloruro de magnesio
Volumen de llenado 800 mL
Humedad relativa 43%
Fase móvil Etanol: acetato de etilo:
ciclohexanona 4:5,5:0,7
Saturación Volumen de fase móvil 35 mL
Desarrollo
Distancia de migración 70,0 mm
Ancho de banda 6,0 mm
Volumen de fase móvil 10,0 mL
Modificado: (Hurtado, 2018)
En el módulo TLC-VISUALIZER se fotodocumentaron las placas a las longitudes onda
de 254 nm y 366 nm. Se almacenaron las fotografías en un formato no editable (.cpf) en el
software VideoScan del equipo. Utilizando la herramienta “spot amplification” se evaluaron
23
los compuestos fluorescentes. Se seleccionó las condiciones experimentales para la placa con
el mayor número de compuestos fluorescentes.
Para definir mejor los compuestos fluorescentes se corrió una placa 10 x 10 cm HPTLC
Fertigplatten nano-Sil C18-100/UV254 modificando el pH de la fase móvil. El desarrollo de
la placa se llevó a cabo con los parámetros descritos en la tabla 7. Se fotodocumentó la placa
a las longitudes de onda de 254 nm y 366 nm usando el modulo TLC-VISUALIZER.
Tabla 7 Condiciones de desarrollo del módulo ADC-2.
Parámetros Condiciones de
desarrollo
Pre-secado Tiempo 5 min
Inyección
Volumen de jeringa 100µL
Volumen de inyección
extracto 5µL
Velocidad de inyección 150 nl/seg.
Control de humedad
Tiempo 10 min
Solución Cloruro de magnesio
Volumen de llenado 800 mL
Humedad relativa 43%
Fase móvil Etanol: AcOEt:
ciclohexanona: NH4OH 4:5,5:0,7:1
Saturación Volumen de fase móvil 35 mL
Desarrollo
Distancia de migración 70,0 mm
Ancho de banda 6,0 mm
Volumen de fase móvil 10,0 mL
Modificado (Hurtado, 2018)
Extracción de compuestos fluorescentes.
Se prepararon tres placas TLC preparativa siguiendo la metodología de (Hurtado, 2018).
Para la primera placa con la ayuda de una pipeta Pasteur se sembró 54,3 mg de extracto
fluorescente disuelto en 5 mL de metanol, la siembra se realizó a lo largo de la placa
preparativa.
Se saturó la cámara cromatográfica durante 20 min con 50 mL de eluyente, Etanol:
Acetato de etilo Ciclohexanona: Hidróxido de amonio (4:5,5:0,7:1). Transcurrido el tiempo
de saturación se colocó la placa preparativa en la cámara cromatográfica para su desarrollo.
Para la extracción de los compuestos fluorescentes de la placa preparativa se siguió la
metodología expuesta en el ítem (Extracción de la fracción fluorescente). Se extrajeron los
24
compuestos fluorescentes de la silica, mediante Söxleth por un tiempo de 5 h utilizando como
solvente metanol.
Antes de evaporar el solvente de cada compuesto se realizó una filtración utilizando filtros
de jeringa de 22 µm de diámetro. Se evaporó el solvente utilizando un rotavapor SELECTA
hasta alcanzar un volumen inferior a 5 mL, cada compuesto extraído se colocó en una caja Petri
previamente tarada y se dejó evaporar el solvente en una estufa BINDER a 40°C hasta peso
constante.
Se realizó una segunda separación por cromatografía preparativa de las fracciones obtenidas
en el primer fraccionamiento. Se siguió la misma metodología anterior para la extracción de los
compuestos finales.
Caracterización de los compuestos separados.
Análisis químico.
Reacción de Baljet. En un tubo de ensayo se disolvió 0,5 mg a 1 mg de cada compuesto
fluorescente en metanol y se añadió 5-6 gotas de solución de Baljet.
Reacción de Keller Killani. En un tubo de ensayo se disolvió aproximadamente 0,5 mg de
cada compuesto fluorescente en 3 mL de ácido acético glacial, a la disolución se agregó gotas
de cloruro férrico en etanol al 5% y por las paredes gotas de ácido sulfúrico concentrado.
Reacción de Dragendorff. En un tubo de ensayo se disolvió aproximadamente 1 mL de
cada compuesto fluorescente en metanol al cual se le añadió 2 gotas de ácido clorhídrico y
se añadió 4 gotas de reactivo de Dragendorff.
Revelado.
Se reveló cada una de las placas cromatográficas usando el modulo en TLC-
VISUALIZER del equipo HPTLC a las longitudes de onda de 254nm y 366nm. Las
fotografías se almacenaron en un formato no editable (. cpf).
La derivatización se realizó a dos placas cromatográficas con el mayor número de
compuestos separados. Se colocó la placa en el equipo de derivatización CAMAG y se
añadieron 200 mL del reactivo revelador (Baljet y Anisaldehído-Ácido sulfúrico) al tanque
del equipo, usando el método de inmersión se sumergió la placa por 5 segundos en el reactivo
de revelado. Cada placa se secó en una plancha calefactora CAMAG a 100°C. Se
fotodocumentó cada placa revelada en TLC-VISUALIZER del equipo HPTLC a las
longitudes de onda de 254nm y 366nm. Las fotografías se almacenarán en un formato no
editable (. cpf).
25
Determinación de la temperatura fusión de los compuestos fluorescentes.
Se pesó cada compuesto fluorescente en una capsula de aluminio de 25 µL de base plana,
los mismos fueron llevados a una prensa de encapsulamiento para sellar cada caja. Se colocó
la porta muestra en el auto muestreador junto a un porta muestras vacío (blanco) y se llevó a
cabo el desarrollo térmico bajo las condiciones que se muestran en la tabla 8.
Tabla 8 Condiciones para el desarrollo del calorímetro diferencial de barrido DSC
Compuesto Masa
(mg)
Rango de
temperatura
(°C)
Velocidad de
descomposición
(°C/min)
C2F2 0,222 0-300 10
C2F3 0,227 0-300 10
C3F2 0,205 0-300 10
Elaborado por Taco L.
Análisis espectroscópico.
Espectroscopia Infrarroja IR.
En un mortero de ágata se mezcló 1 mg de compuesto fluorescente con aproximadamente
40 mg de bromuro de potasio, la mezcla se colocó en el molde de la pastilla para el Infrarrojo.
El molde se colocó en una prensa hidráulica se ajustó y se sometió a una presión de 2,5
toneladas por tres minutos. La pastilla formada se colocó en un portamuestra para ser leído
en el programa Spectra Manager. Se llevó a cabo primero el background para luego analizar
el compuesto fluorescente. El mismo procedimiento se efectuó para los dos compuestos
restantes.
Determinación de longitud de onda máxima de absorción.
Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis marca VARIAN CARY50 BIO en donde se
colocó en celdas de cuarzo cada compuesto fluorescente diluido en metanol y se realizó un
barrido espectral (Scan) utilizando el software Cary WinUV instalado en el computador, de
la misma manera se procedió con los dos compuestos restantes.
Diseño experimental
La variable respuesta se ve influenciada por varios factores los cuales se muestran en la
ecuación 1. Para la selección de los factores de estudio se tomará como referencia la
investigación realizada por Osorio (2017) en donde señala que el volumen de aplicación (V),
la longitud de banda (B), la humedad Relativa (%HR), y la distancia de desarrollo (D) no
afecta considerablemente los resultados del análisis. Por otro lado, los factores que si pueden
26
afectar en los resultados del análisis son el grado de modificación de fase estacionaria (Fs),
la polaridad de la fase móvil (P), saturación de la cámara cromatográfica S, y el
preacondicionamiento de la placa PA (Hurtado, 2018; Osorio, 2017)
𝐻𝑃𝑇𝐿𝐶 = 𝑓(𝑉, 𝐵, %𝐻𝑅, 𝐷, 𝑃𝑟, 𝑆, 𝐹𝑠, 𝑃)
Ecuación 1. Factores que influyen en la variable respuesta
Por lo antes mencionado la presente investigación tiene un diseño factorial completo 22
en donde los factores de estudio serán el tiempo de preacondicionamiento de la placa (Pr) y
el tipo de saturación de la cámara (S) cada uno con dos niveles (+1,-1). El diseño se realizará
a un 95% de confianza. La tabla 9 muestra la codificación de los factores y niveles de estudio.
Tabla 9 Codificación de los factores y niveles de estudio
Factor Codificación
+ -
Preacondicionamiento
de la placa (𝑷𝑨) 20 10
Tipo de saturación (𝑺) Con
pad
Sin
pad
Elaborado por Taco L.
De acuerdo al diseño experimental 22 se realizarán 4 experimentos como muestra la
tabla 10. Por lo mismo se generará 3 efectos posibles sobre la variable respuesta, estos
efectos son primarios y secundarios, por lo que se tendrá dos primarios y 1 secundario.
Tabla 10 Matriz Estándar de Experimentos
Corridas 𝑷𝑨 S
1 - -
2 + -
3 - +
4 + +
Elaborado por Taco L.
Operacionalización de variables
La tabla 11 muestra la operacionalización de variables, se registran los valores que toma
la variable respuesta la cual es el número de compuestos separados y la misma permitirá
evaluar la significancia estadística de cada uno de los factores de estudio con sus respectivos
niveles.
27
Tabla 11 Operacionalización de Variables
Factores Niveles Respuesta
Preacondicionamiento de
la placa (Pr)
10 min Numero de compuestos separados
20 min Numero de compuestos separados
Tipo de saturación de
cámara (S)
Sin pad Numero de compuestos separados
Con pad Numero de compuestos separados
Elaborado por Taco L.
Técnicas e instrumentos de recolección de datos
Se realizará el análisis estadístico por el algoritmo de Yates aplicando al diseño
experimental de la tabla 11 para determinar la magnitud de los efectos de los factores de
estudio sobre la variable respuesta.
Técnicas de procesamiento de datos
Los datos experimentales se utilizarán para el cálculo de los efectos mediante algoritmo
de Yates que se observa en la tabla 12.(Gutiérrez Humberto, 2008)
Tabla 12 Algoritmo de Yates
Número de
Experimentos
Matriz del
diseño
experimental
Algoritmo Identificación
Pr S Respuesta (1) (2) Divisor Efectos
1 - - R1 X1 Y1 4 Efecto 1 Promedio
2 + - R2 X2 Y2 2 Efecto 2 Pr
3 - + R3 X3 Y3 2 Efecto 3 S
4 + + R 4 X4 Y4 2 Efecto 4 Pr,S
Elaborado por Taco L.
La significancia estadística de los efectos será calculada de acuerdo al método de réplica
de diseño completo con un 95% de confianza. Este cual permitirá calcular la desviación
estándar de los efectos acorde a la ecuación 2.
28
𝑆𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 =2𝑆𝑟𝑒𝑠𝑝
√𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎𝑠
Ecuación 2. Calculo de la desviación estándar del efecto, Sefecto. (Montgomery, 2001)
Tomando en cuenta el criterio de Montgomery, (2001) donde indica que un efecto es
estadisticamente significativo cuando su valor absoluto es mayor al del Sefecto,
correspondiente al límite de confianza seleccionado.
|𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜| > 𝑆𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜
Ecuación 3. Criterio para determinar la significancia estadística. (Montgomery, 2001)
29
Capitulo IV
Análisis y discusiones de resultados
Los resultados que se expondrán toman como base la investigación que se realizó en el
Laboratorio de Productos Naturales de la Universidad Central del Ecuador por Osorio (2017)
en donde encontraron manchas fluorescentes con coloraciones azul y rojo, como muestra la
figura 7, esta observación se realizó cuando se desarrollaba metodo cromatográfico para
cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en Catharanthus roseus.
Figura 7 Compuestos fluorescentes presentes en
Catharanthus roseus.(Osorio, 2017)
Por otro lado, Hurtado (2018) encontró una técnica de separación de las fracciones
fluorescentes antes mencionadas para definir su potencial aplicación industrial. Se tuvo una
mejor separación usando como fase estacionaria una placa C18-50/UV254 y una fase móvil
de metanol: AcOEt de polaridad 5,48; los resultados de este estudio se muestran en la figura
9.
Figura 9 Placa cromatográfica de
fracciones fluorescentes vista a 366
nm. (Hurtado, 2018)
Figura 8 Impregnación de las fracciones
fluorescentes en vidrio y en papel filtro
cualitativo. (Hurtado, 2018)
30
En la figura 8 se observa la impregnación de las fracciones fluorescentes separadas en
vidrio borosilicato y papel celulosa.
Estos antecedentes hicieron que se inicie la caracterización de estos compuestos
fluorescentes.
Preparación de la muestra
El tamaño de partícula de la muestra estandarizada de Catharanthus roseus fue de 0,84
mm lo que indica que la muestra tendrá mayor superficie de contacto con el disolvente de
extracción, pues para mantener una extracción eficaz se necesita que la muestra este en polvo
lo más homogenizada posible, este parámetro es importante si se considera trabajar con nano
partículas. (Azwanida, 2015).
La muestra de Catharanthus roseus presento un porcentaje de humedad total promedio
que se muestra en la tabla 13 el cual coincide con las condiciones ambientales que necesita
la planta para su crecimiento. Además, el valor obtenido está dentro del rango de humedad
del lugar de recolección (Puerto Quito) que es de 85%-87%. (Calvopiña, 2015)
Tabla 13 Determinación de humedad total en muestra frasca de Catharanthus roseus.
Masa de
muestra
fresca
Temperatura de
secado
°C
% humedad
total
% de
humedad
promedio
0,225 70 85,5
85,1 ± 0,33 % 0,230 70 84,5
0,225 70 85,5
Elaborado por: Taco L.
La humedad relativa promedio de la muestra seca de Catharanthus roseus se presenta en
la tabla 14 la cual indica que la muestra perdió aproximadamente el 90% de agua presente en
su estructura. Este rango de humedad ayuda a que se pueda almacenar por un largo periodo
sin perder sus principios activos al igual que sus propiedades como el color u olor, se evita
la la proliferación de microorganismos.(Otazu, 2010).
31
Tabla 14 Determinación de humedad relativa en muestra seca de Catharanthus roseus.
Masa de
muestra seca
Temperatura de
secado
°C
% humedad
total
% de
humedad
promedio
0,505 105 5,14
5,19 ± 0,04 % 0,512 105 5,27
0,503 105 5,16
Elaborado por: Taco L
Autofluorescencia de la muestra de Catharanthus roseus
Mediante un microscopio electrónico se observó que la muestra de Catharanthus roseus
presentaba una autofluorescencia en tonalidades rojas, azules como se indica en la figura 10,
este fenómeno señala que la muestra puede contener metabolitos endógenos o compuestos
fluorescentes orgánicos e inorgánicos como son las clorofilas, lignina (Sancho, 2010).,
alcaloides, compuesto fenólicos, porfinas. (García-Plazaola et al., 2015).
Figura 10 A. Muestra de Catharanthus roseus vista en el microscopio electrónico a 10
X. B. Muestra de Catharanthus roseus vista en el microscopio electrónico 10 X adaptado
una lámpara UV de 366 nm.
Preparación del extracto etanólico
Los metabolitos fluorescentes en estudio tienen carácter polar y para facilitar su extracción
se desengrasó previamente a la muestra estandarizada de Catharanthus roseus utilizando
como solvente hexano ayudando así a eliminar los compuestos apolares como son las
clorofilas, grasas, ceras entre otros.
El extracto de la muestra estandarizada de Catharanthus roseus se la realizó mediante
percolación ya que este método mejora notablemente la calidad del principio activo lo que
no sucede con otros métodos como es la maceración que al ser un método estatico no alcanza
A B
32
a extraer el total de los metabolitos secundarios presentes en la muestra (Amaguaña Rojas &
Churuchumbi Rojas, 2018).
El solvente que se usó para la extracción es etanol el mismo que ayuda a que se extraigan
el mayor número de fitoconstituyentes como son alcaloides, saponinas, carbohidratos,
taninos, flavonoides entre otros (Azwanida, 2015).
La cantidad de extracto total seco de Catharanthus roseus se muestra en la tabla 15. Cabe
señalar que el extracto en esas condiciones no permite la contaminación por microrganismos.
(Osorio, 2017)
Tabla 15 Determinación del rendimiento de extracto total obtenido por percolación.
Numero de
muestra
Rendimiento
promedio de
extracto seco (%)
% de extracto
etanólico obtenido
1 25,58
24,41 ±0,78 % 2 24,43
3 22,21
4 25,42
Elaborado por: Taco L
El porcentaje de extracto etanólico presente en la muestra estandarizada de Catharanthus
roseus fue de 24,41% con un error de 0,78 % comparándole con el valor obtenido por Hurtado
(2018) que fue de 22,75 ± 0,63 % se observa que hubo un pequeño aumento ocasionado por
las condiciones ambientales en donde se desarrolló la muestra ya que el clima afecta
directamente a la humedad de la muestra.
Separación y caracterización de compuestos fluorescentes
Separación por TLC preparativa.
La separación de la fracción fluorescente de interés se realizó por TLC preparativa
utilizando una fase estacionaria de Sílica-gel 60 GF254 y una fase móvil de acetato de etilo
AcOEt: metanol (7:2), se usó este método ya que permite sembrar cantidades grandes de
extracto de 100-200 mg según sea el espesor de la placa. La fracción fluorescente fue
extraída durante ocho ocasiones ya que sirvió para el desarrollo del diseño experimental, en
cada placa se sembraron 33,66 mg de extracto etanólico. En la figura 11 se indica la fracción
fluorescente de la cual se realizó la caracterización.
33
Figura 11 Placa cromatografía a 366nm obtenida mediante TLC preparativa.
F1: fracción fluorescente para el estudio de la caracterización.
Se tomó en consideración la fracción fluorescente azul por haber presentado la propiedad
impregnación en vidrio borosilicato lo que no sucedió con las demás fracciones separadas
según la investigación realizada por Hurtado (2018). Cabe mencionar que las fracciones
fluorescentes rojas que muestra la figura 11 podrían referirse a tipos de clorofila ya que según
la bibliografía las clorofilas poseen fluorescencia roja a 366 nm. (Garcia & Gutierrez, 2015).
Separación por Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución (HPTLC)
Pruebas preliminares.
Se realizaron 10 experimentaciones para definir las variables de estudio descritos en el
apartado diseño experimental (Capitulo III). Los factores definidos se indican en la tabla 16.
Tabla 16 Factores de operación
Factor Parámetro de operación
Fase móvil Etanol:AcOEt: ciclohexanona
(4:5,5:0,7)
Índice de Polaridad 4,7
Solvente de la muestra Metanol
Porcentaje de humedad
relativa
43 %
Elaborado por: Taco L
34
La fase móvil depende tanto del tipo de fase estacionaria como de las propiedades físicas
y químicas del analito (Srivastava, 2011). La fase móvil que se seleccionó fue (etanol:AcOEt;
ciclohexanona) con una polaridad de 4,7 lo que significa que es medianamente polar pues
posee dos solventes con índices de polaridad de 4,5 y 4,3 de la ciclohexanona y el AcOEt
respectivamente, que ayudó a que la retención hidrofóbica disminuya y por ende se dé una
mejor distribución de los compuestos fluorescentes sobre la fase estacionaria. Además, a
menor polaridad de la fase móvil mayor será su fuerza de elución (Esquivel & Leal, 2004).
El solvente de la muestra debe ser volátil y formar un complejo muestra-solvente ya que
el analito debe integrarse a la estructura del mismo, es decir que la muestra debe estar
solvatada por el solvente (Spangenberg, Poole, & Weins, 2011). Entonces el solvente debe
ser afín a los compuestos que contiene dicha muestra por esta razón se usó metanol para eluir
los compuestos fluorescentes ya que la mayoría de ellos tienen una polaridad media y según
Aziz, Saha, Sultana, Ahmed, & Al-Mansur, (2014) expone que en los extractos de metanol
eluye la mayor cantidad de fitoconstituyentes en Catharanthus roseus.
La humedad relativa ayuda a controlar el porcentaje de agua presente en la placa
cromatográfica, pues si no se controla este parámetro la placa puede adsorber vapor de agua
del ambiente y afectar el desarrollo cromatográfico, pues se desactivan los sitios activos de
la misma, (Spangenberg et al., 2011) además, puede cambiar la polaridad del sistema.
Los parámetros descritos en la tabla 16 ayudaron a que se desarrollen mejor los
cromatogramas y se dé una mejor separación y resolución de los compuestos fluorescentes.
Además, los parámetros como el volumen de inyección (V), longitud de la banda (B),
distancia de desarrollo (D) fueron establecidos por investigaciones anteriores (Hurtado,
2018; Osorio, 2017), por tanto se utilizaron iguales valores.
Corrido Cromatográfico
Mediante el software JPM© se determinó el orden de los ensayos con las unidades
experimentales para los diferentes tratamientos. En la tabla 17 y Tabla 18 se muestran las
experimentaciones y sus réplicas aleatorizadas.
Tabla 17. Matriz de experimentos aleatorizada original
N
experimentos
Preacondicionamiento Saturación
2 10 Sin pad
1 20 Sin pad
4 10 Con pad
3 20 Con pad
Elaborado por Taco L
35
Tabla 18. Matriz de experimentos aleatorizada de la replica
N
experimentos
Preacondicionamiento Saturación
3 10 Sin pad
2 20 Sin pad
1 10 Con pad
4 20 Con pad
Elaborado por Taco L
Tomando en consideración los parámetros de la tabla 17 se corrieron los cromatogramas
para separar los compuestos fluorescentes de la fracción F1 utilizando el software WinCats.
Se realizó la siembra de la fracción F1 con una concentración de 0,40 mg/mL para todos los
tratamientos garantizando así la homogeneidad de los resultados, cabe señalar que la
concentración de la fracción F1 es baja debido a que los compuestos son afines a la fase
estacionaria y a pesar de los lavados que se realizó parte de la fracción quedó atrapada de la
silica gel de la placa preparativa.
La figura 12 muestra las imágenes digitales de las placas cromatográficas desarrolladas
en las condiciones establecidas en la tabla 18. Las fotografías fueron capturadas a 366 nm
en un formato no editable (.cpf).
1 2 3 4
Figura 12 Placas cromatográficas de las 4
experimentaciones desarrolladas a 366nm.
La figura 12 muestra las cuatro experimentaciones con los diferentes niveles de
preacondicionamiento de la cámara (Pr) y la saturación de la cámara cromatográfica (S). En
las cuatro experimentaciones se evidencia la separación de compuestos fluorescentes, pero
36
con baja resolución esto debido a la baja concentración de la fracción F1. Por tal razón se
empleó la herramienta - spot amplification- incluida en el software WinCats para un
minucioso análisis de las fotografías documentadas. Esta herramienta se utilizará únicamente
para el análisis cualitativo ya que altera la resolución de los compuestos separados. La figura
13 indica las cuatro experimentaciones utilizando la herramienta antes mencionada.
1 2 3 4
Figura 13 Placas cromatográficas a 366nm, modificadas
con spot amplification
Los cuatro experimentos que se observan en la figura 13 muestran el número de
compuestos separados así pues la primera experimentación se ve 4 compuestos separados no
tan definidos todos con tonalidades azules. La segunda experimentación también se observa
4 compuestos separados, pero mejor definidos. En la tercera experimentación se observan 3
compuestos no definidos ya que estos se acercan más al punto de siembra. Por ultimo en la
cuarta experimentación se observan 4 compuestos separados. Cabe señalar que en todas las
experimentaciones se observa un tipo de cola que existe entre el compuesto 1 y el 2
empezando desde el punto de siembra, esto se debe a la afinidad que tiene los compuestos
con la fase estacionaria y la fase móvil.
La figura 14 muestra la réplica de los corridos cromatográficos, modificadas con la
herramienta spot amplifitation.
37
1 2 3 4
Figura 14 Replica de las placas cromatográficas a
366nm, modificadas con spot amplification.
En la figura 14 se muestra las 4 réplicas presentadas en la tabla 18. La primera
experimentación muestra 2 manchas no definidas, pues se encuentran junto al punto de
siembra. La segunda experimentación muestra 5 compuestos bien definidos. La tercera
experimentación se observa 4 compuestos separados con baja resolución a pesar de ello la
deferencia de color de cada compuesto ayuda a su distinción. En la última experimentación
se observan 4 compuestos no definidos pues se nota que están sobrepuestos. De igual manera
se observa en todos los casos una cola de color turquesa que se arrastra por la placa.
Al analizar las cuatro experimentaciones con sus respectivas replicas se puede observar
que existe variabilidad en el número de compuestos separados lo cual ayuda a realizar un
análisis estadístico para saber cuáles son las mejores condiciones de separación de los
mismos. Además, se puede evidenciar cualitativamente que en la experimentación 2 se
obtuvo el mayor número de compuestos separados con mejor resolución donde se utilizaron
los niveles bajos.
Como se mencionó anteriormente las experimentaciones mostraban en las placas una cola,
por lo que se vio la necesidad de modificar el medio de la fase móvil, según Osorio (2017)
modificar el pH mejora la compactación de las manchas, se utilizó hidróxido de amonio para
obtener un pH básico. (Osorio, 2017).
En la figura 15 se muestran las placas sin modificar el pH (7,2) figura A y modificado el
pH (11.3) figura B notándose en la última que las manchas se compactaron mejorando la
separación.
38
Figura 16 Cromatograma de la placa documentada a 366
A B
Figura 15 Pacas cromatográficas vistas a 366
nm modificado el pH.
La placa B se desarrolló a las condiciones de la experimentación 2 expuesta en la tabla 17
ya que fue la que obtuvo el mayor número de compuestos separados. También se observa
que la intensidad de la fluorescencia bajo notoriamente ya que en medio básico los
compuestos fluorescentes se encuentran en equilibrio.(Skoog et al., 2001)
Desarrollo del cromatograma.
La figura 16 muestra el cromatograma correspondiente a la placa desarrollada en medio
básico obtenida en el software VideoScan. Cabe mencionar que el cromatograma no indica
la pureza del compuesto si no la intensidad de fluorescencia, pero si muestra la existencia de
compuestos sobrepuestos.
39
El cromatograma de la figura 16 muestran la presencia de 6 posibles compuestos
fluorescentes donde la fracción 1 con un Rf de 0,45 presenta una mayor intensidad por ende
es la que se encuentra en mayor concentración la cual fue seleccionada para la separación
por TLC preparativa.
Segunda extracción de compuestos fluorescentes mediante TLC preparativa
Una vez obtenida una buena separación de los compuestos fluorescentes por HPTLC se
extrajo la fracción 1 mediante TLC preparativa. Para ello se sembró 54,3 mg de fracción
fluorescente F1 y se desarrolló la placa utilizando Silica Gel F254 como fase estacionaria y
una fase móvil de Etanol: AcOEt:ciclohexanona:hidróxido de amonio (5,4:4:0,2:1). El TLC
preparativa desarrollada se muestra en la figura 17.
Figura 17 A. Placa de la fracción F1 a 366nm obtenida mediante TLC preparativa; B.
Placa de la fracción F1 a 366nm obtenida mediante TLC preparativa con modificadas con
spot amplification
La figura 18 muestra que no existe diferencia en el Rf de fracciones de la placa
cromatográfica de HPTLC y la placa de TLC preparativa a pesar de haber cambiado las
condiciones de la fase estacionaria.
40
Figura 18 Comparación entre las placas cromatográficas desarrolladas en HPTLC y TLC
preparativa
En la figura 18 se observa que fracción 2 de la placa de HPTLC corresponde a la fracción
F2 de la placa de TLC preparativa. Asimismo, las fracciones 6 y 7 de la placa de HPTLC
corresponden a la fracción F3 de la placa de TLC preparativa. Por otro lado, no se pudo
distinguir con claridad las fracciones 3 y 4 de la placa de HPTLC en la de TLC preparativa
pues como se observó en el cromatograma de la figura 16 estas fracciones se encuentran en
baja concentración.
Se extrajeron de la placa preparativa las fracciones F2 y F3 ya que tienen mejor
separación. Se realizó el lavado de la silica de cada fracción mediante Söxleth durante 5 h
con el fin de extraer mayor cantidad, este método tiene la ventaja de mantener en contacto
íntimo y repetido al solvente y la muestra (Caldas, 2012)
Se realizó una nueva separación de F2 y F3 mediante HPTLC usando la misma fase móvil
de TLC preparativa y una fase estacionaria de Silica Gel F254 de dimensiones 10x10 para
descartar la presencia de otros compuestos. Usando el software WinCats del cromatógrafo
HPTLC se desarrolló la placa a las mismas condiciones de la tabla 5.
La figura 19 muestra la separación cromatográfica de la fracción F2 y F3 donde se ve que
la fracción F2 se separó en tres compuestos fluorescentes azules mientras que la fracción F3
solo se separó en dos compuestos fluorescentes azules.
41
Figura 20 Cromatograma de la placa de la fracción F2 a 366nm
Cromatograma.
La figura 20 muestra el cromatograma de la separación de la fracción F2 de la cual se
obtuvo tres compuestos bien definidos, se desarrolló utilizando el software VideoScan.
La tabla 19 presenta los valores de Rf, altura de los picos y el porcentaje de cada uno de
los compuestos fluorescentes.
F2 F3
Figura 19 Placas cromatográficas de las fracciones F2 Y F3 desarrolladas a 366 nm
42
Figura 21 Cromatograma de la placa de la fracción F3 a 366nm
Tabla 19 Valores de Rf, altura y porcentaje de los compuestos fluorescentes
N° compuesto Rf Altura % compuesto
1 0,075 47754,7 23,07
2 0,629 38296,2 18,50
3 0,990 12093,1 58,43
Elaborado por Taco L.
La tabla 19 indica que los compuestos 1 y 3 presentan mayor concentración, por otro lado,
se observa en la figura 20 que el pico del compuesto 3 tiene una amplitud mayor que los otros
compuestos lo que indica la presencia de una cola en la placa, aun así, no se observa picos
sobrepuestos por lo que se concluye que la cola es del mismo compuesto.
La figura 21 muestra el cromatograma de la separación de la fracción F3 de la cual se
obtuvo dos compuestos bien separados, se desarrolló utilizando el software VideoScan.
Tabla 20 Valores de Rf, altura y porcentaje de los compuestos fluorescentes
N° compuesto Rf Altura %
1 0,048 14710,0 24,52
2 0,994 48285,5 75,48
Elaborado por Taco L
La tabla 20 indica que el compuesto 2 presenta mayor concentración que el compuesto 1,
por otro lado, se observa en la figura 21 que el pico del compuesto 2 tiene una amplitud
mayor al otro compuesto esto se debe a la presencia de cola en la placa.
43
Para extraer los compuestos fluorescentes separados por HPTLC se realizaron dos placas
preparativas adicionales en las que se sembró la fracción F2 y F3 en cada una de las placas.
Se realizó la extracción de cada compuesto fluorescente siguiendo la misma metodología
usada para la fracción F1.
En la figura 22 se muestra una pequeña diferencia de Rf de los compuestos fluorescentes
(C1F2, C2F2) de la fracción F2 que existe entre la placa cromatográfica desarrollada en
HPTLC con la placa desarrollada en TLC preparativa.
Como se observa en la figura 22 el compuesto C2F2, corresponde al compuesto 2 de la
placa de HPTLC, difieren un poco en el Rf, este cambio pudo haber ocurrido por las
condiciones ambientales en las que se elaboró la placa pues un factor que influye en la
separación es la humedad, donde si existe agua ocupando los puntos activos de la placa se
demora el corrido cromatográfico en consecuencia no se tiene una separación adecuada
afectando directamente al Rf. Por otro lado, el compuesto C3F2 corresponde al compuesto 3
de la placa de HPTLC.
En la figura 23 se muestra una pequeña diferencia de Rf de los compuestos fluorescentes
(C1F2, C2F2) de la fracción F2 que existe entre la placa cromatográfica desarrollada en
HPTLC con la placa desarrollada en TLC preparativa.
Figura 22 Comparación entre las placas cromatográficas desarrolladas en
HPTLC y TLC preparativa
44
Figura 23 Comparación entre las placas cromatográficas
desarrolladas en HPTLC y TLC preparativa
En la figura 23 se muestran dos compuestos 1 y 2 de la placa de HPTLC donde el
compuesto 1 corresponde a C1F3, del TLC preparativa mientras que el compuesto 2 del
HPTLC corresponde al compuesto C2F3 del TLC preparativo. En la tabla 21 se indica las
masas de los tres compuestos separados.
Tabla 21. Masas obtenidas de los tres compuestos separados.
Compuesto Masa (mg)
C2F2 8,2
C3F2 10,6
C2F3 10,5
Elaborado por Taco L
Caracterización de los compuestos fluorescentes separados.
Al ser pequeña la cantidad de compuestos separados se corrieron cuatro placas
preparativas y se partió de 300 mg de extracto de Catharanthus roseus, con el fin de extraer
la mayor cantidad de compuestos fluorescente. Se realizó la separación seguida de los
compuestos fluorescentes mediante TLC preparativa.
Propiedades fiscas y químicas de los compuestos fluorescentes obtenidos.
La fluorescencia que se observa en los compuestos obtenidos en estado sólido es distinta
a la que se ve en solución, como muestra la tabla 22 esto se debe a que se consigue perturbar
las variaciones de energía entre los orbitales HOMO-LUMO de los compuestos al
interaccionar con otras moléculas, lo que se traduce en la modificación de la fluorescencia.
(Gomez, 2015) Además la fluorescencia se ve afectado por el solvente ya que a mayor
viscosidad del solvente mayor será la intensidad de fluorescencia o viceversa. (Skoog et al.,
2001).
45
Tabla 22 Propiedades fiscas y químicas
N° compuesto Aspecto fisico Fluorescencia
en solido 366
nm
Fluorescencia
en sol. 366 nm
Solubilidad
C2F2 Aceitoso Amarillo Turquesa Etanol
Metanol
Acetato de etilo
C3F2 Aceitoso Amarillo-
verdoso
Azul
C2F3 Solido Amarillo Azul
Elaborado por Taco L
Pruebas cualitativas.
En la figura 24 se observa los resultados de la reacción Baljet realizada a los tres
compuestos fluorescentes donde dio reacción positiva para anillos lactónicos, formando un
precipitado rojo. Químicamente lo que se produce es una complejo formado por el ácido
pícrico y la lactona α, β, γ insaturadas produciendo un color o precipitado (Morales, 2008).
C2F2 C3F2 C2F3
Figura 24 Reacción de Baljet
En la figura 25 se puede observar la reacción de Keller Killani el cual dio positiva para
los compuestos C3F2, C2F3 donde se observa un anillo café claro en cada tubo de ensayo. Esta
reacción es positiva para los desoxiazúcares (Villa, Hormaza, & Arias, 2011), por lo que
existe la sospecha de que los compuestos C3F2 y C2F2 son de naturaleza glicosídica de igual
manera su aspecto físico concuerda con esa clase de metabolitos.
46
Figura 25 Reacción de Keller Killani de los compuestos C3F2, C2F3
En la figura 26 se puede observar la reacción de Dragendorff el cual dio positiva para los
compuestos, C2F2, C3F2, C2F3 donde se observa un precipitado tomate en cada tubo de ensayo,
esta reacción es positiva para alcaloides. (Coy Barrera, Parra, & Cuca Suárez, 2014).
Tomando en cuenta las reacciones realizadas se puede decir que los compuestos separados
son alcaloides de tipo glicosídico que en su estructura contiene un grupo lactonico.
C2F2 C3F2 C2F3
Figura 26 Reacción de Dragendorff de los compuestos C2F2, C3F2, C2F3
Revelado.
En la figura 27 se indica la derivatización de los compuestos mediante luz ultravioleta a
366 nm donde se observó la coloración fluorescente de cada uno de ellos.
C3F2 C2F2
47
Figura 27 Placa cromatográfica de los compuestos C3F2, C2F3, C2F2 revelada a una
longitud de onda de 366nm.
De igual manera en la figura 28 se muestra el revelado de los compuestos con el reactivo
p-anisaldehído para verificar la presencia de terpenos, aceites esenciales y saponinas
triterpénicas no se obtuvo resultado positivo pues los compuestos no presentaron
coloraciones violetas, lo mismo ocurrió al utilizar el reactivo NP para flavonoides.(Fallis,
2013)
Figura 28 Placa cromatográfica de los compuestos C3F2, C2F3, C2F2 revelada con p-
anisaldehído y NP.
Por otro lado, al ser positiva la reacción en tubo de ensayo con el reactivo de Baljet se
derivatizó la placa donde no se observó coloraciones rojas de los compuestos puede deberse
al límite de detección de la reacción, según la bibliografía el reactivo que se utiliza para el
revelado en placa puede detectar cantidades hasta de 0,1 mg (Stoddard, Nguyen, Mata-
Chavez, & Nguyen, 2007).
48
Determinación de la temperatura de degradación de los compuestos fluorescentes
Los termogramas de los compuestos fluorescentes separados se corrieron con el fin de
determinar la temperatura de fusión de cada uno de ellos e indicar su pureza.
En la figura 29 se observa que el termograma del compuesto C3F2 muestra un pico
endotérmico agudo con una temperatura de fusión de 271,86 °C. No se observó picos de
degradación pues el rango se da a partir de 250 °C. Además, al tener solo un pico de fusión
se puede decir que no existe mezcla de compuestos. (Cordenonsi, Sponchiado, Campanharo,
Garcia, & Raffin, 2017; Granados, 2015)
Figura 29 Termograma del compuesto C3F2, a 10°C/min
En la figura 30 se observa que el termograma del compuesto C2F2 muestra dos picos de
temperatura de fusión que son 125,55 °C y 128,56 °C, asimismo sus picos son agudos y
endotérmicos. Tener dos picos endotérmicos indica dos cosas, la primera que el compuesto
no sea puro y la segunda en que haya existido perdidas sucesivas de moléculas de agua.
(Cordenonsi et al., 2017)
49
Figura 30 Termograma del compuesto C2F2, a 10°C/min
En la figura 31 se observa que el termograma del compuesto C3F2 muestra un pico ancho
con una temperatura de fusión de 29,33 °C, y a partir de ahí el compuesto vuelve a cristalizar
el cual tiene el nombre de cristalización desde el fundido. (Mishra, Joshi, Srivastava, Tandon,
& Jain, 2014). En 250, 0 °C se observa un proceso exotérmico que puede corresponder a la
degradación del compuesto, lo que en los dos compuestos anteriores no sucedió.
Figura 31 Termograma del compuesto C2F3, a 10°C/min
50
Análisis espectroscópico
Espectroscopia infrarroja.
Para interpretar los picos de los compuestos fluorescentes, el espectro se dividió en dos
regiones: entre 4,000-1,300 cm-1, que es la región llamada de grupos funcionales y entre
1,300-600 cm-1 que es la llamada región de la huella dactilar (Cordenonsi et al., 2017). En la
tabla 23 se muestra el rango de los grupos funcionales presentes en los tres compuestos
obtenidos.
Tabla 23 Señales de la espectrofotometría FT-IR de los grupos funcionales presentes en
los compuestos fluorescentes separados.
Intervalo cm-1 Especie química
3400-3200 R-OH
3550-3310 R-NH2
2960-2855 CH3- CH2 estiramiento asimétrico
1725-1705 >C=O
1650-1550 C=N
1500-1490 Aromáticos (núcleos bencénicos)
en sistemas condensados
810-750 1:3 di sustituidos (1 y/o 3
hidrógenos libres)
Fuente:(González, 2017) Modificado Taco L
En el espectro Infrarrojo del compuesto C2F2 (figura 32) se encontraron bandas
características de absorción en 3412,42 cm-1 con una banda ancha aguda característica del
grupo OH que puede tratarse del enlace glucosídico o propios del alcaloide, por otro lado, en
el rango de 3550-3310 cm-1 también están presentes el grupo R-NH2 lo que indica que podría
estar traslapado por el grupo OH. En 924,52 cm-1 y 2852,2 cm-1 se encuentran grupos alquilo
(CH3-CH2), el grupo C=O perteneciente a ɣ lactona α, β insaturada en 1725,01 cm-1, el grupo
1596,84 cm-1 se encuentra C=N su desplazamiento puede verse influenciado por anillos
aromáticos en su estructura (Vilaplana, Manteca, & González, 2004), el grupo C=C en
1460,81 cm-1 de aromáticos y el grupo C-O-C con un pico en 1116,58 cm-1.
51
Figura 32 Espectro FT-IR del compuesto fluorescente C2F2
Figura 33 Espectro FT-IR del compuesto fluorescente C2F3
En el espectro Infrarrojo del compuesto C2F3 (figura 33) se encontraron picos
característicos de OH con una banda de absorción de 3423,03 cm-1 de la misma forma esta
vibración puede deberse al OH de glucósidos del alcaloide, grupos alquilo (CH3, CH2) en
2927,52 cm-1 y 2856,06 cm-1, así también el grupo C=O perteneciente a ɣ lactona α, β
insaturada en 1728,87 cm-1su desplazamiento electrónico se ve influenciado por el oxígeno
por lo que absorben en campos más bajos, el grupo C=N en 1615,84 desplazamiento que
puede deber a anillos aromáticos junto a su estructura, el grupo C=C en 1460,81 cm-1, por
último, el grupo C-O-C con un pico en 1113,59 cm-1
En el espectro Infrarrojo del compuesto C3F2 (figura 34) se encontraron picos de absorción
característicos, en 3412,42 cm-1 se manifiesta una banda ancha del grupo OH. En 2856,06
cm-1 y 2924,52 cm-1 se presentan vibraciones de grupos alquilo (CH3, CH2), en 1725,01 cm-
1 del grupo C=O perteneciente a ɣ lactona α, β insaturada cm-1 de un éster, 1615,09 cm-1 se
52
Figura 34 Espectro FT-IR del compuesto fluorescente C3F2
encuentra vibración del grupo C=N desplazamiento que puede deber a anillos aromáticos
junto a su estructura, en 1377,89 cm-1 amina aromática, 1020 cm-1 -1270 cm-1 del grupo C-
O-C.
Espectroscopia Ultravioleta.
Los tres compuestos fluorescentes C2F2, C2F3, C3F2 presentaron los espectros de las figuras
35, 36, 37 respectivamente, donde se observa la presencia de varios picos de absorción en la
región ultravioleta del espectro electromagnético de 200 a 400nm.
Figura 35 Espectro Ultravioleta del compuesto fluorescente C2F2
La figura 35 muestra la presencia de un pico con una absorbancia (A) de 2,046 a una
longitud de onda (λmax) de 241,0 nm, también presenta varios picos con menor intensidad que
53
pueden ser producidos por la presencia de transiciones electromagnéticas en distintas
moléculas.
Figura 36 Espectro Ultravioleta del compuesto fluorescente C2F3
La imagen 36 muestra una longitud de onda máxima (λmax) 239 nm se produjo una
transición electromagnética con una absorbancia (A) de 1,544. Además, existen picos no
definidos, pudiendo ser producidos por el ruido experimental.
Figura 37 Espectro Ultravioleta del compuesto fluorescente C3F2
En la figura 37 se observa la presencia de un pico con una longitud de onda máxima (λmax)
de 242,1 nm y una absorbancia (A) de 1,562.
54
Las longitudes de onda de máxima absorción de los tres compuestos fluorescentes C2F2,
C2F3, C3F2 se midieron en el espectrofotómetro UV-VIS con doble haz descartando la
influencia del solvente ya que algunos solventes tienden a eliminar la forma fina del espectro
como resultado de los efectos vibracionales. (F.C.Q, 1998).
En la tabla 24 se muestra el tipo de transiciones presentas los compuestos separados, su
absorción intensa y débil.
Tabla 24 Transiciones teóricas
Transiciones
Absorción Intensa Absorción Débil Grupo Funcional
𝜋 → 𝜋∗ 𝑛 → 𝜋∗ -C=C-C=O
240 nm -245 nm 320 nm -330 nm
Modificado (Olivares, 2000)
Por tanto, los compuestos separados tienen una longitud máxima en un rango de 230,0 nm
- 250,0 nm que corresponde a la conjugación de un anillo con un grupo carbonilo donde
tienen una menor extensión de conjugación.(Osmany Cuesta R, Ingrid Márquez H, 2015).
Existe un grupo de alcaloides llamados alcaloides lactónicos (figura 38) que tienen
máximo de absorción en un rango de 224 nm a 253 nm comparándoles con los λmax de los
compuestos C2F2, C3F2, C2F3 todos están dentro del rango, este resultado concuerda con los
grupos funcionales que se obtuvieron de la espectroscopia Infrarroja pues los tres compuestos
posee el grupo C=N, el grupo OH de grupos hidroxilo o glicosídicos, C=O del grupo
lactónico y C=C del anillo aromático.(Pelletier, 1995; Soares, Marcheafave, Gomes,
Scarminio, & Bruns, 2018). Además, al tener electrones libres en su estructura y al irradiar
luz UV estos entran a un estado de excitación provocando la fluorescencia de la molécula.
Por otro lado, la especie Catharanthus roseus es conocida por que en su composición química
la mayoría de compuestos son alcaloides(Dávila, Rojas Corrales, & Castillo, 2018), la figura
38 muestra la estructura de un alcaloide lactónico donde R1, R2 Y R3 pueden ser un azúcar
u otros anillos que pueden estar conjugados.
Figura 38 Estructura de alcaloides lactónicos
55
Diseño Experimental
Cálculo de los efectos sobre la variable respuesta.
Se utilizó la matriz estandarizada del capítulo III y el algoritmo de Yates para calcular los
valores de los efectos sobre los compuestos fluorescentes. La tabla 25 indica la magnitud y
el sentido de los valores de los efectos de Pr, S y su interacción.
Tabla 25 Efectos calculados sobre el número de manchas fluorescentes mediante el
Algoritmo de Yates.
N° de
experimentos
Factores
Algoritmo Identificación
Pr S Respuesta (1) (2) Divisor Efectos
1 10 Sin pad 5 8 16 4 4 Promedio
2 20 Sin pad 3 8 -2 2 -1 Pr
3 10 Con pad 4 -2 0 2 0 S
4 20 Con pad 4 0 2 2 1 Pr´S
Elaborado por Taco L
Los valores de la tabla 25 indican que el preacondicionamiento de la placa (P) influye de
forma negativa en la separación de los compuestos fluorescentes. La influencia negativa
producida por el cambio en el tiempo de preacondicionamiento de la placa desde -1 (10 min)
a +1 (20 min) puede deberse a la sobresaturación de la placa pues si bien es cierto que la
placa debe estar en equilibrio con fase de vapor del eluyente, pero no debe sobrepasar los 5
min de preacondicionamiento, cabe recalcar que este tiempo solo rige para las placas que
ingresen después de una previa saturación de la cámara cromatográfica pues de otra manera
debe la placa permanecer máximo 30 min dentro de la cámara para que entre en equilibrio
con la fase de vapor. Por lo tanto, un aumento de tiempo en el preacondicionamiento de la
placa con previa saturación va a provocar que los puntos activos de la placa se saturen y
demoren más en suceder el intercambio del vapor durante la separación. (Spangenberg et al.,
2011)
Además, los valores indicados en la tabla 25 sobre el tipo de saturación de la cámara
cromatográfica muestra que no influye en la separación de los compuestos fluorescentes,
pues realizar la experimentación sin papel (-1) o con papel (+1) da como resultado el mismo
número de compuestos. Esto se debe a que el papel filtro es bueno para saturar cámaras que
no se hayan saturado previamente, por otro lado, el papel filtro se usa para saturar cámaras
grandes en poco tiempo, ya que ayuda a que el solvente pueda evaporarse en un área de
mayor superficie en tan solo 5 min. (Spangenberg et al., 2011). Por esta razón no sirve mucho
realizar este procedimiento porque cabe la posibilidad de que se sobresature la cámara y al
mismo tiempo el vapor del solvente ocupe la mayor cantidad de puntos activos de la placa, e
impida la separación de los componentes de la mezcla.
56
Cálculo de la significancia estadística de los efectos.
Para el cálculo de la significancia estadística de los efectos se emplearon los valores de la
desviación estándar de los efectos expresados en la tabla 26.
Tabla 26 Determinación de desviación estándar de los efectos
N° Exp Pr S R 1 R 2 Media
�̅�
Varianza
(s2)
Desviación
estándar de las
réplicas (S réplica
Desviación
estándar del
efecto (S efecto)
1 10 Sin pad 4 5 4,5 0,5
0,71 0,71
2 20 Sin pad 3 2 2,5 0,5
0,71 0,71
3 10 Con pad 3 4 3,5 0,5
0,71 0,71
4 20 Con pad 4 4 4 0 0 0
Elaborado por Taco L
La significancia estadística se estimó al 95% de confianza (2σ), por el método de réplica
de diseño completo. Para el 95% de confianza y 3 grados de libertad, k tomó el valor de
2,353.(Gutiérrez Humberto, 2008)
Tabla 27 Significancia estadística de los efectos Pr, S y su interacción
Tipo de
efecto
efecto Valor del efecto k K*SE Significancia
estadística
Primario Pr |−1,00| 2,353 1,18 No
Significativo
Primario S 0 2,353 1,18 No
significativo
Secundario Pr´S |1,00| 2,353 0 Significativo
Elaborado por Taco L
En la tabla 27 se muestra la significancia estadística que tiene cada variable con respecto
a la variable respuesta la cual es el número de compuestos fluorescentes separados. Se puede
observar que el preacondicionamiento de placa (Pr) y el tipo de saturación de la cámara (S)
son factores estadísticamente no significativos porque su valor absoluto es menor a la
desviación estándar del efecto esto quiere decir que los dos factores individualmente no
producen ningún cambio en la variable respuesta.
Por otro lado, que la interacción de los dos factores Pr y S presentan significancia
estadística como se observa en la figura 39.
57
Figura 39 Interacción de los efectos principales
La figura 39 indica que cuando el tiempo de preacondicionamiento se encuentra en su
nivel más bajo el tipo de saturación influye considerablemente en el número de compuestos
fluorescentes separados, por el contrario, cuando el tiempo de preacondicionamiento se
encuentra en su nivel más alto la saturación no influye demasiado en el número de
compuestos fluorescente separados.
Los datos del diseño experimental permitieron establecer que el mejor sistema
cromatográfico para la separación de compuestos fluorescentes de Catharanthus roseus se
obtuvo a las condiciones de preacondicionamiento (Pr)=10 min y tipo de saturación de la
cámara cromatográfica (S) = sin pad, por ende al tener una buena separación de estos
compuestos se pudo verificar la hipótesis de trabajo de la investigación pues se caracterizó
espectrofotométricamente tres compuestos fluorescentes separados obtenidos del extracto
etanólico de Catharanthus roseus.
Por lo tanto, se caracterizó tres compuestos con fluorescencia azul C2F2, C3F2, C2F3
mediante pruebas cualitativas, espectroscopia infrarroja, espectroscopia ultravioleta
concluyendo que los mismos se tratan de alcaloides lactonicos (figura 38).
58
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
Se prepararon muestras estandarizadas de Catharanthus roseus mediante la
homogenización del tamaño de partícula y determinación de humedad relativa. La muestra
estandarizada tuvo humedad relativa de 5,19 % ± 0,04 %.
Se obtuvieron extractos etanólicos totales de las muestras estandarizadas de Catharanthus
roseus mediante el método de percolación dando como resultado un porcentaje promedio de
24,41 % ±0,78 %. De igual manera se identificó la autofluorescencia de la especie mediante
un microscopio electrónico adaptado una luz ultravioleta de 365 nm.
Se seleccionó el mejor sistema de cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HPTLC) utilizando un diseño factorial completo 22 con un nivel de confianza al 95%, se
obtuvo que el mayor número de compuestos fluorescentes separados y la mejor resolución
se dio con los parámetros de tiempo de preacondicionamiento (Pr) = 10 min y tipo de
saturación de la cámara = sin pad. Donde ninguno de los dos factores tuvo significancia
estadística pero su interacción si fue estadísticamente significativa.
Se separaron los compuestos fluorescentes mediante cromatografía en capa fina
preparativa (TLC preparativa) , se obtuvieron tres compuestos con masas de 8,2 mg de C2F2;
10,5 mg de C3F2 y 10,6 mg de C2F3, con un aspecto fisco semiaceitosos para C2F2; C3F2 y un
sólido para C2F3.
Mediante calorimetría de barrido se identificó los puntos de fusión de los compuestos
fluorescentes las cuales son para C3F2 271,86 °C, el compuesto C2F2 presento dos
temperaturas de fusión 125,55 °C y 128,56 °C lo que indicó que el compuesto esta impuro.
El compuesto C2F3 presento un proceso de cambio de fase a una temperatura de 29,33 °C y
un proceso exotérmico a 250,0 °C.
Mediante espectroscopia Infrarroja se determinó que los tres compuestos tienen en su
estructura grupos carbonilo de la 𝜶, 𝜷, 𝜸 lactona, alquilo, C-O-C, C=N, C=C de los anillos
aromáticos.
Se obtuvo mediante espectrofotometría ultravioleta longitudes de onda máxima de
absorción (λ máx.) para los tres compuestos fluorescentes C2F2; C3F2; C2F3 de 241 nm, 242
nm y 239 nm respectivamente.
Por último, se puede concluir que los tres compuestos separados son un tipo alcaloides
lactonicos pues los datos obtenidos de la espectroscopia UV e Infrarroja concuerdan con la
bibliografía estudiada.
59
Recomendaciones.
Se recomienda al Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad Central del Ecuador desarrollar un nuevo método de separación de los
compuestos fluorescentes mediante cromatografía flash con detector UV- vis y utilizar
química computacional como método de caracterización.
Se recomienda realizar una investigación de la capacidad antioxidante, antibacteriana, y
citotóxica de los compuestos fluorescentes obtenidos pues los mismos se aplican en el campo
de la biomedicina como sondas fluorescentes.
60
Bibliografía
Acosta, L., & Rodríguez, C. (2002). Instructivo técnico para el cultivo de Catharanthus roseus
(L.) G. Don. Vicaria. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 7(2), 9–12.
Alché, J. de D., Olmedilla, A., & Rodríguez, M. I. (2010). Análisis estructural del aparato
fotosintético en plantas C4 y CAM mediante microscopía de fluorescencia/confocal. C4
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Zetino, M. (2005). Niveles explicativos a partir de tres visiones de causalidad seleccion de
metodo. 1–10.
66
Anexo A Árbol de problemas
Caracterización espectrofotométrica de
compuestos fluorescentes.
Falta de
información de
metabolitos
secundarios
fluorescentes
Procedimientos
largos de
extracción de
compuestos
naturales
Falta de
dilucidación
estructural de
compuestos
fluorescentes
naturales
Uso excesivo
de compuestos
fluorescentes
sintéticos
Investigaciones
repetidas de las
mismas especies
naturales
Síntesis de
compuestos
fluorescentes a
partir de
reactivos tóxicos
Daños a la salud
67
Anexo B. Categorización de variables
Metabolitos secundarios
fluorescentes
Clasificacion de los metabolitos secundarios
Compuestos fluorescentes
Naturales
Sintéticos
Espectroscopía Infrarroja
Ultravileta- vis
68
Anexo C. Hoja de recolección de Datos
Elaborado por Taco L.
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Instrumento de recolección de datos
Datos para la caracterización de compuestos fluorescentes
Fecha del análisis:
N°
Patrón
Preacondicionamiento
de la placa
cromatográfica (min)
Tipo de
saturación de
la cámara
cromatográfica
Numero
de
compuestos
separados
Picos
de
absorción
en el
espectro
IR
Longitud
de onda
máxima de
absorcion
1
2
3
4
69
Anexo D. Equipos, materiales
Equipos y materiales Marca Modelo
Equipo
Balanza analítica Denver Instrument PI 214
Balanza de precisión Ohanus PA 1502
Calorímetro diferencial de Barrido TA Instruments Q 2000
Cromatógrafo HPTLC CAMAG Linomat-
5
Espectrofotómetro IR JASCO FT/IR
Espectrofotómetro UV-Visible Varian Cary 50
Estufa con convección natural Binder BD240
Estufa de convención forzada Binder BF 53
Microscopio Electrónico
Purificador de agua Mokcekk
1805 a
Rotavapor J.P. Selecta -
Tamizadora vibratoria Gilson SS-15
Material
Cámara cromatográfica -
Camara UV - -
Equipo de percolación - -
Equipo Söxhlet - -
Material de vidrio
Molino Victoria -
Placas cromatográficas C18/100
Placas de vidrio 20*20
Plancha de agitación THERMO SCIENTIFIC
Elaborado por Taco L.
70
Anexo E. Reactivos
Reactivos Marca Grado
Acetato de etilo - Analítico
Agua Destilada Tipo I
Baljet
Ciclohexanona - -
Etanol - Analítico
Hexano - -
Hidroxido de Sodio Merck KgaA 1310-73-2 99%
Metanol - Analítico
Silica gel GF254 -
Elaborado por Taco L.
71
Anexo F Placas desarrolladas a 366 nm, con sus respetivas replicas
Figura 40 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 20 min. S= sin pad
Figura 41 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 10 min. S= sin pad
Figura 42 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 10 min. S= con pad
1 Experimentación
2 Experimentación
3 Experimentación
Replica
Experimen
tación
Replica
Replica
72
Figura 43 Placas desarrolladas a 366 nm del tratamiento Pr = 20 min. S= con pad
Anexo G Compuestos fluorescentes obtenidos.
C2F2
C3F2
C2F3.
4 Experimentación Replica