moleculaire diagnostiek in hematologie gab 18102016...

19-10-2016

1

Het belang van moleculairediagnostiek

bij hematologische aandoeningen

Apr. Biol. Barbara Denys

GAB 18 oktober 2016

2

Overzicht

Organisatie UZ Gent: labo Moleculaire Diagnostiek Hematologie (Klinische Biologie) – Centrum Medische Genetica Gent (CMGG)Pre-analytische fase - aanvraagformulierenMoleculaire diagnostiek bij acute leukemieënMoleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieveaandoeningenMoleculaire diagnostiek bij lymfomenTechnieken komen beperkt aan bodRIZIV terugbetaling / aanrekening

3

� Morfologie/histologie (beenmerg/perifeer bloed/biopsie)

! Microscopie = basis van de hematologischediagnostiekvoordeel: snel – geen geavanceerde technieknadeel: beperkte gevoeligheid – geenbijkomstige info

Rol van het labo binnen de hemato-oncologie

4

� Verfijning van diagnostiekfenotypering: flowcytometrie met monoklonale

antilichamen

→ niveau van eiwit (functie van cel)genotypering: karyotypering - FISH –

PCR/microarrays – sequencing→ niveau van genoom/DNA/RNA

Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen

Rol van het labo binnen de hemato-oncologie

5

Organisatie binnen UZ Gent

Centrum Medische Genetica Gent

(CMGG)Erferlijk overdraagbaarTechnieken: karyotypering, FISH en arraysAnalysen binnen hemato-oncologie (verworven):

karyotypering, FISH bij diagnose AL en MDSKaryotypering, FISH en array CGH bij multiple myeloom en CLLKaryotypering en BCR-ABL FISH bij CMLKaryotypering en FISH bij diverse lymfomen

Labo Moleculaire Diagnostiek

(labo Klinische Biologie)VerworvenTechnieken: PCR, RT-qPCR, sequencingAnalysen:

Opsporen en kwantificeren van fusiegenen en oncogen overexpressie (CML, lymfomen en leukemie)Opsporen van klonaliteit(lymfomen)Opsporen van mutaties oa AML/MDS/CMML – MPN -lymfomen

6

Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie)

18 Centra voor Moleculaire Diagnostiek (CMDs) voor moleculaire diagnostiek (KB ’98) afgeschaft door ar rest Raad van State in 20052005 – 2007: ex-CMD’s niet meer betaald door RIZIV, o p kosten van ziekenhuisArt 33bis in voege vanaf 01/08/2007:

“De verstrekkingen moeten uitgevoerd zijn in een laboratorium dat, een ISO 15189 accreditatie, of een accreditatie volgens een gelijkwaardige laboratoriumnorm bezit voor de uitgevoerde verstrekkingen”

April 2009: CMD UZG accreditatie behaald4 MLT’s (~3 FTE) voor de testen binnen hemato-oncol ogie> 25 verschillende testen (waaronder ook NGS panels )~3000 stalen/analysen per jaar (geaccrediteerd binn en art. 33bis)

19-10-2016

2

7

Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie)

Stalen naar labo Klinische Biologie sturenAanvraagformulier ‘Bijzondere stolling en hematologie’ (achterzijde)Eigen doorstuurformulier met duidelijke specificatie van test en klinische inlichtingen (voor sommige analysen vereist)Labgids: www.labgids.gent

AanvraagformulierAfdeling selecteren – overzicht van alle testenHeel veel informatie: stalen –antwoordtijd - terugbetaling –klinisch belang/interpretatie 8

Startmateriaal - celtypeStalen:

beenmerg, bloed, biopten, parafinnecoupesEDTA tubes (GEEN heparine)

PB/BM -> WBC isolatie door lyse RBC (routine, dagelijks)Bewaring op -80 °C in 75 % EtOH (cellen dood)DNA en RNA isolatie mogelijk (vnl toepassingen op RNA)

Bepaalde toepassingen op DNA -> rechtstreekse DNA-isolatie vanuit volbloed

JAK2V617F mutatie

MNC (Lymfoprep) voor AML/ALL Dx stalen (research)Bewaring in vloeibare N2 (+ DMSO = cryoprotectant)

Cellen levensvatbaarDNA, RNA en eiwitisolatie mogelijk

9

CMGGStalen naar Medische Genetica sturenAanvraagformulier Genetisch Onderzoek voor Maligne Cellen (verworven aandoeningen)Labgids: www.cmgg.be

AanvraagformulierInformatie per pathologie

Stalen: bloed, beenmerg, klieren, bioptenNa/Li-heparine buis met steriel medium (RPMI) (door CMGG geleverd) – bewaring bij 4°C –check houdbaarheid

10

Startmateriaal: RNA versus DNA (1)

DNA stabiel in klinische stalenRNA niet stabiel in klinische stalen

Beide kunnen geïsoleerd worden uit lichaamsvloeistoffen; verse en paraffine ingebedde

weefsels

Aanwezigheid degraderende enzymesDNase relatief instabiel/inactiefRNase heel stabiel / renatureert na autoclaveren, zit op vingertoppen

Bij lyse, sterven cel: RNasen actief

11

Startmateriaal - RNA versus DNA

RNAOnstabiel (RNase)

Beperkte variabiliteit bijfusiegenen resulterend uittranslocaties

genexpressie is abnormaal in neoplastische cellen -> meer (mRNA), tot duizenden kopijen/ cel: betere gevoeligheid

Correlatie met aantal tumorcellenmoeilijk te bepalen (patiënt- en staalafhankelijk)

Interne controle: ABL qPCR(variatie in populatie?)

DNAStabiel(er)

Sterke verschillen in breukpunten bijverschillende patiënten

1 kopij/cel: minder gevoelig

Correlatie met aantaltumorcellen gemakkelijkerte bepalen

Interne controle: CRP qPCR(± constant in populatie)

12

Staal voor DNA isolatie (PB, BM en paraffine)

Tussen de 10 5 en 107 cellen

Maximaal 2 dagen op kamertemperatuur

Tot 5 dagen bij 2-8 °C

Paraffinecoupes en “oude” stalen: fragmentatie PCR

Bepaling aanwezigheid inhibitorenBepalen fragmentatie genomischDNA

Lenze et al., 2011

Fragmentatie PCR

19-10-2016

3

13

Stalen voor toepassing op RNA (PB of BM)

Tussen de 10 6 en 108 cellen<2x 106: proberen maar vooral problematisch voor negatieve stalenStandaard RNA isolatie: 15.106 cellenLiever meer beschikbaar zodat herhaling mogelijk is

Aparte ongeopende EDTA (geen heparine)

Transport zo snel mogelijk naar Klinische Biologie: binnen 24u zodat isolatie WBC max 48 na afname kan gebeuren! Bewaring staal in tussentijd in koelkastBij verdeling stalen steriel verwerken! Onder lafkast !

14

Instabiliteit RNA – praktisch voorbeeld

Staal werd geïncubeerd bij kamertemperatuur of bij 4 °C: aantal kopijen controlegen daalt drastisch, zelfs na één dag bij KT => maat voor gevoeligheid specifiek target

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3

Aan

tal k

opije

n co

ntro

lege

n

KT

4° C

15

Stalen voor karyotypering/FISH

Na/Li-heparine tubeStaal bewaring op kamertemperatuurBuis binnen 24h naar CMMG

16

Apart blauw aanvraagformulier voor speciale hematologie

http://www.labgids.gent

17

Apart blauw aanvraagformulier voor speciale hematologie

http://www.labgids.gent

18

Belang diagnose, prognose en follow-up !

Moleculaire diagnostiek bij ACUTE LEUKEMIEËN

19-10-2016

4

19

Klinisch belang moleculaire diagnostiek

• DIAGNOSEclassificatie van patiënten met acute leukemie

• PROGNOSEbehandeling patiënten aanpassen (‘risk-adapted’ therapy)

• FOLLOW-UPopsporen minimale residuele ziekterest (MRD)opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling

20

NIEUWE DIAGNOSE ACUTE LEUKEMIE

Bij voorkeur BM – staal voor

Karyotypering FISHMoleculaire Diagnostiek

Klinische biologie CMGG

EDTA

Na/Li-heparine buis

Flowcytometrie

21

Uitwerking acute leukemieCentrum Medische

Genetica Gent (CMGG)

Karyotypering

FISH - kwalitatieve detectie meest belangrijke fusiegenen

• t(8;21)• t(9;22)• MLL herschikkingen• t(15;17)• inv(16)/t(16;16)• EVI herschikkingen;

inv(3)/t(3;3)• t(12;21)

Array-CGH analyse –kinderen met ALL

Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische

Biologie)

Kwalitatieve PCR : detectie van fusiegenen m.b.v. multiplex PCR

Kwantitatieve qPCR : � kwantificatie

fusiegenexpressie � Opsporen en kwantificatie

WT1 overexpressie

Mutatieanalyse m.b.v. NGS

22

Screening translocaties leukemieHemaVisionTM is een kwalitatieve multiplex RT-PCR test ontwikkeld om 28

verschillende translocaties of chromosomale herschikkingen, inclusief meer dan 145 breekpunten of splice variants, te detecteren

t(1;11)(p32;q23) MLL/AF1p, t(1;11)(q21;q23)MLL/AF1q, t(1;19)(q23;p13)E2A/PBX1, t(3;21)(q26;q22)AML/EAP/MDS/EVI1, t(3;5)(q25.1;q34)NPM/MLF1, t(4;11)(q21;q23)MLL/AF4, t(5;12)(q33;p13) TEL/PDGFRb, t(5;17)(q35;q21)NPM/RARa, t(6:11)(q27;q23) MLL/AF6, t(6;9)(p23;q34)DEK/CAN, t(8;21)(q22;q22)AML1/MGT8, t(9;11)(q22;q23) MLL/AF9, t(9;12)(q34;p13) TEL/ABL, t(9;22)(q34;q11)BCR/ABL, t(9;9)(q34;q34)SET/CAN, t(10;11)(p12;q23)MLL/AF10, t(11;17)(q23;q21)MLL/AF17, t(11;17)(q23;q21) PLZF/RARa, t(11;19)(q23;p13.1) MLL/ELL, t(11;19)(q23;p13.3) MLL/ENL, t(12;21)(p13;q22)TEL/AML1, t(12;22)(p13;q11) TEL/MN1, t(15;17)(q22;q21)PML/ RARa , t(16;21)(q11;q22)TLS/ERG, t(17;19)(q22;p13) E2A/HLF, inv(16)(p13;q22)CBFb/MYH11, t(X;11)(q13;q23)MLL/AFX, TAL1deletion(p34)SIL/TAL1

23

HemaVision

inv16

Screen = 8 multiplex PCR reacties (nested)

Split-out PCR voor exacte identificatie

translocatie / breekpunt

24

Fusiegenen in acute lymfatische leukemie (ALL)

Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004)

19-10-2016

5

25

Prognostisch belang translocaties in ALL

Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004)26

Adult

Pediatric

Genetische diversiteit fusiegenen bij AML

10% PML-RARA

27Grimwade D, Morzek K; Hematol Oncol Clin N Am 2011

Belang fusiegenen bij AML = PROGNOSE

28

Cytogenetica -> risicogroepen

• Karyotype = belangrijkste prognostische waarde bij diagnose• AML: 30% translocaties / 10-15% non-random

chromosomale afwijkingen• Dus 40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML)

Risicogroepen

Favorable t(8;21)(q22;q22) – t(15;17)(q22;q21) – inv(16)(p13.1;q22)

Intermediate t(9;11)(p22;q23)

Adverse Inv(3)(q21;q26.2 of t(3;3)(q21;q26.2) – t(6;9)(p23;q34) –

11q23 – complex karyotype – del(5q) of -5 – abnl(17p)

29

Belang mutaties bij AML

40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML) = intermediair risicogroep

Betere risico stratificatie vereist

Steeds uitbreidende genetische afwijkingen hebben e en significant impact op prognose:

mutaties en overexpressie bepaalde genen

30

Moleculaire landschap in AML

25% / ongunstig

30% of > 50% CN-AML / gunstig

19-10-2016

6

31

4 grote Europese studies op meer dan 1000 CN-AML patiënten identificeerden een aparte subgroep:

Enkel NPM1 mutatie in afwezigheid van FLT3-ITD = geassocieerd met betere OS/DFS en lager risico op h erval

Schnittger et al, Blood 2005Dohner et al, Blood 2005Verhaak et al, Blood 2005Thiede c, Blood 2006

Prognose NPM1/FLT3-ITD

32

Prognose FLT3/NPM1/CEBPa

Schlenk et al, NEJM 2008, 358:1909-18

33

Moleculair landschap in AML

• Ontdekking van additionele moleculaire merkers die een belangrijke rol

spelen in de prognose van : DNMT3A mutaties (27%), IDH1/2 (18%), TET2

(~10%), RUNX1 (~10%), TP53 (~10%)

The Cancer Genome Atlas Research Network. N Engl J M ed 2013 / TCGA)

200 patiënten met AMLWGS/ WES1623 genen met een mutatie260 genen met tenminste 2 mutatieSlechts in 3 stalen geen mutatie4-5 afwijkingen per patiënt23 genen die het meest gemuteerd zijn (fig)

34

Moleculair landschap in MDS

944 patiënten met MDS2764 mutaties in 96 genen Mediaan: 3 afwijkingen per individu

(range 0 – 12)

Haferlach et al, Leukemia 2014

35

Toepassing voor AML/MDS in diagnostiek?

Rationale:Wat is de klinische nood om voor een bepaalde mutat ie te testen?

1/ Diagnostisch• MDS: klonale ziekte?

2/ Prognostisch• Risicostratificatie• Beslissing allo-SCT

3/ Target voor behandeling• Gerichte therapie• Biomerker voor predictie respons

4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte o f MRD 36

Diagnostische criteria MDS

Verworven klonale mutaties zoals gezien in MDS komen voor in hematopoïetische cellen van gezonde individuen zonder MDSOp heden is de aanwezigheid van MDS-geassocieerde somatische mutaties op zich NIET VOLDOENDE voor een diagnose van een MDS, ook bij een patiënt met e en onverklaarde cytopenie (Arber et al, Blood 2016: WHO 2016 revision!) Bijkomende studies nodig om de link te onderzoeken tussen deze specifieke mutaties, mutatiefrequentie en combinaties van mutaties met de ontwikkeling tot MDS

19-10-2016

7

37© 2010 Universitair Ziekenhuis Gent

MDS metringsideroblasten

SF3B1 mutatiesGen: splicing factor 3b, subunit 1Belangrijke rol in splicing van mRNA. Mutatie in MDS (20-25%) / MDS met ringsideroblasten (~80%)prognostisch gunstig

Klassificatie MDS op basis van % ringsideroblasten en SF3B1 mutaties:

MDS-RS 5% + SF3B1 mutatiesMDS-RS 15% zonder SF3B1 mutaties

Cazzola M et al. Blood. 2013Arber et al, Blood 2016


Toepassing voor AML/MDS in diagnostiek?





4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte o f MRD

39

Risicogroepen in AML

anno 2010

ELN paper, Dohner et al, Blood 2010 40

Nieuwe risicostratificatie in AML gebaseerd op geïntegreerde genetische analyse.

Patel JP et al. N Engl J Med 2012

41

Prognostisch belang van mutaties in AML

Metzeler et al. Blood 2016;128:686-698Papaemmanuil, et al. N Engl J Med 2016; 374:2209-2221 42

Moleculaire diagnostiek in AML en MDS?





4/ Target voor detectie minimale residuele ziekte o f MRD

19-10-2016

8

43

Gerichte therapie in AML

Gen Drug Werking Status

FLT3 Sorafenib Inhibitie Phase 2/3

Midastaurin Inhibitie Phase 3

Quizartinib Inhibitie Phase 3

IDH1/2 AG-120/AG-221 Inhibitie Phase 1/2

DNMT3A / TET2

Azacytidine verwacht

Decitabine

44

Mutatiedetectie in een routinelab

•HRM = ‘High Resolution Melting’

•High resolution = een verschil van 1 bp kan gedetecteerd worden

•Techniek die toelaat om gekende SNPs op te sporen

•Fragmentanalyse mbv capillaire elektroforese (GeneScan)

•Opsporen van deleties/inserties, !geen puntmutaties

•Techniek laat 1 bp resolutie toe (insertie/deletie)

•Gevoeligheid beperkt tot 5%

Sequentiebepaling voor ieder staal niet haalbaar voor een routine labo � mutatie scanning techniek

FLT3 WT

FLT3-ITDNPM1 WT

NPM1 + 4

bp

45

NEXT GENERATION SEQUENCING

MDG of ‘Moleculaire diagnostiek Gent’: nieuw platform waar technieken voor verschillende toepassingen ter beschikking staan; samenwerking Medische Genetica, Klinische Biologie en PathologieNGS: next generation sequencing = hoofdtechniek; andere (nieuwe) moleculaire technieken kunnen ook aan bod komen (toekomst)

In-house NGS protocol:MiSEQ

Bestaande workflow voor constitutionele aandoeningenVoordelen: heel flexibel, snel genen toevoegen aan bestaande panelsNadelen: meer validatiewerk 46

2 NGS panels

Gen Aandoeningen

CALR ET, PMF

CSF3R CNL, aCML

JAK2 PV, ET, PMF

MPL ET, PMF

SETBP1 CMML, aCML, CNL

SRSF2 CMML

Gen Exon Codon

ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646

CEBPA 1 Alle codonsDNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot

op R882FLT3 14-15

(ITD)20 (TKD)

ITD: alle codonsTKD: D835 en I836

IDH1 4 R132IDH2 4 R140 en R172KIT 8/17 Exon 8: T417-R420

Exon 17: D816, D820, N822

NPM1 12 Alle codons, hotspot W288

NRAS 2-3 Codons 12, 13, 61

RUNX1 3-8 Alle codonsSF3B1 14-16 Alle codonsSRSF2 1 P95TET2 1-9 Alle codonsTP53 4-9 Alle codons

U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6)

AML/MDS/CMML panel

MPN

AML/MDS uitwerking

• Translocatiescreening m.b.v. HemaVision

• WT1 overexpressie (qPCR)

• MLL-PTD (qPCR)

• AML/MDS panel met NGS indien klinisch relevant *:

FLT3, NPM1, CEBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1,

IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1 * < 65 jaar altijd; > 65 jaar te bespreken op MOC

Diagnose en herval AML

of MDS-EB-2

• MLL-PTD (enkel bij MDS)

• AML/MDS panel met NGS bij bewezen MDS/CMML/PMF en indien klinisch relevant */**: FLT3, NPM1, CEBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1, IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1

* < 65 jaar en te bespreken op MOC / ** NGS uitwerking bij

twijfelachtige diagnose MDS/CMML enkel na overleg op MOC

Nieuwe diagnose MDS: MDS-(RS)-SLD, MDS-(RS)-MLD, MDS del(5q), MDS-

EB-1, MDS-U

of CMMLof PMF


Terugbetaling RIZIV AML/MDS

Acute leukemie: 5xaanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten)Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1jRAEB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt wordenMUTATIE-analyse kunnen niet worden aangerekend

Op heden – tem 31/10/2016

Acute leukemie: 8xaanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten)Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1jMDS-EB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt wordenKost MUTATIE-analyse met NGS gedekt

Vanaf 1 november 2016

19-10-2016

9


Terugbetaling RIZIV voor MDS

Geen RIZIV tussenkomst voor mutatie-analyse bij MDS patiënten (< 10% blasten)Op heden ook GEEN diagnostisch criteriumCAVE oudere mensenUitwerking wel mogelijk, enkel in duidelijk overleg

50

Klinisch belang moleculaire diagnostiek

• DIAGNOSEclassificatie van patiënten met acute leukemie

• PROGNOSEbehandeling patiënten aanpassen (‘risk-adapted’ therapy)

• FOLLOW-UPopsporen minimale residuele ziekterest (MRD)opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling

51

Belang detectie fusietranscripten bij follow-up

BELANG gevoelige detectie en kwantificatie

‘minimal residual disease’ (MRD):

Real-time PCR kwantificatie van fusietranscripten bij leukemie is relevant voor

de follow-up and detectie van minimaleresiduele ziekte of MRD

52

� monitoring respons op therapie�selectie verder therapiekeuze

�indeling risicogroepen: zo snel mogelijk na inductietherapiehigh risk patiënten (hoge kans op herval) identificeren ondanks

CR

� predictie prognose: voorspelling verder klinischverloop

� detectie vroeg/laat herval

BELANG evaluatie minimale ziekterest (‘minimal residual disease’ of MRD)

Continue monitoring/follow up

53

Overzicht kwantitatieve qPCR UZ GentTarget

(transl/mut/overexpr)Gene Fusions Incidence Prognosis

t(9;22) (q34;q11) ABL/BCR: p190 en p210

Pre B-cel ALL: 25-30% volwassenen; 2-5% kinderen

Slechte prognose

t(8;21) (q22;q22) ETO/AML1 AML: 5-12 %, AML M2: 30 % Goede prognose

t(4;11) (q21;q23) V/MLL11q23 abnormaliteiten

5% pre B-cel ALLMeest frequente 11q23 abnormaliteit bij pre B-ALL

Slechte prognose

t(9;11) (p22;q23) MLL-AF9 Precursor B-cel ALL11q23: 5-6 % van AML (M4-5)

Intermediaire prognose

t(12;21)(q12;q22) TEL/AML-1 25% pre B-ALL bij kinderen Goede prognose

inv(16) (p13;q22) MYH11/CBFbeta 8-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eos

Goede prognose

t(1;19) (q23;p13) E2A-PBX1 3-5% kinderen - 3% volwassen ALL

prognose controversieel

t(15;17)(q22;q21) PML/RARalfa 5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95%

Goede prognose54

Overzicht kwalitatieve RT-PCR UZ Gent

Target (transl/mut/overexpr) Gene Fusions Incidence Pr ognosis

t(6;9) (p23;q34) DEK/CAN 1% AML Slechte prognose

t(1;22)(p13;q13) OTT-MAL AML7 (children) Slechte prognose

Microdeletie 1p32 SIL-TAL 5-25% T-ALL ? controversieel

Target (transl/mut/overexpr)

Gene Fusions Incidence Prognosis

NPM1 mutatie / 25-35% AML (~50% CN-AML) Good

WT1-overexpressie / 80-90% /

Overzicht kwantitatieve qPCR UZ Gent

19-10-2016

10

55

Belang fusietranscript BCR-ABL bij CML

Belang mutatie JAK2V617F, CALR, MPL,… bij Phi-negatieve MPN

Moleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieve

aandoeningen (MPN)

56

- Chronic myelogenous leukaemia, BCR-ABL1 positive

- Chronic neutrophilic leukaemie (CNL)

- Polycythemia vera (PV)

- Primary myelofibrosis (PMF)

- Essential thrombocythaemia (ET)

- Chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified (CEL, NOS)

- Mastocytosis

- Myeloproliferative neoplasm, unclassifiable

Myeloproliferatieve Aandoeningen

o WHO classificatie 2008:

o MDS/MPD: CMML, JMML, atypic CML (BCR-ABL1 negative),MDS/CMD unclassifiable

57

2016 update

Geen significante veranderingen indelingVeranderingen diagnostische criteria

Nieuwe mutatiesBeter inzicht in morfologisch kenmerken

Mastocytose ≠ MPNMDS/MPN met ringsideroblasten en trombocytose = aparte categorie (niet meer provisoir)

58

Chronic myeloid leukemia or CML

CML accounts for 15-20% of all adult leukaemias(incidence: 1-2 cases per 100.000)

Median patient age at diagnosis: 55-60 years3 phases: chronic – accelerated – blast crisisMajority (>80%) of cases of CML diagnosed in chronicphase (CML-CP)

CML is the first cancer to be shown to be caused by anunderlying genetic abnormality

59

Enige CMPD die geassocieerd is met een‘specifieke’ genetische

afwijking:

> 95% t(9;22)(q34;q11)

BCR-ABL1

Gerelateerd aan pathogenese !

60

Tyrosine kinase inhibitoren (TKI):Imatinib mesylate (Gleevec, Glivec, STI-571)

19-10-2016

11

61

M-Bcr = ‘major’ breakpoint cluster region

m-Bcr = ‘minor’ breakpoint cluster region

CML

ALL

genome/DNA

mRNA

Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003)

BCR-ABL1

62

Diagnose CML

Perifeer bloed voor detectie BCR-ABLdoor moleculaire genetische techniekenKaryotypering t(9;22)(q34.1;q11.2)

BM aspiraat is essentieel bij diagnoseComplete karyotypering (bijkomende abnormaliteiten)Ziektestadium bepalen

63

NIEUWE DIAGNOSE CML

staal voor

Karyotypering FISHqPCR


EDTA

Na/Li-heparine buis

PB BM

64

Belang moleculaire monitoring bij FU CML

Response to treatment (imatinib); most patients in CP have an excellent response to imatinib (CCyR)Some patient, however, still progress

Early detection of relapse, progression or treatmentfailure provides an opportunity for alternative therapy(second generation TKI)Prognostic information: MMR

Clinical need for the additional risk stratification is necessary

65IRIS Study,update 2004

No CCyR<3 log reduction>=3 log reduction

% w

ithou

t pro

gres

sion

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Months since randomization0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

estimated rate of survival without progression at 42 months:

n=138 75% PFSn=94 90% PFSn=136 98% PFS

Progression-free Survival on 1 st-line Imatinib by Molecular Response (MR) at 12 months

MMR

66

Definition of the response to TKI (any TKI) first-lin e treatmentRecommendation of European LeukemiaNet: incorporatin g

molecular responses at 3, 6, 12 and 18 months

Baccarani et al, Blood 2013

EvaluationTime

Optimal Warning Failure

3 months BCR-ABL1 ≤ 10%and/orPh+ ≤ 35%

BCR-ABL1 > 10%and/orPh+ ≤ 36-95%

No CHRand/orPh+ > 95%

6 months BCR-ABL1 ≤ 1%and/orPh+ 0

BCR-ABL1 1 - 10%and/orPh+ 1 - 35%

BCR-ABL1 > 10%and/orPh+ >35%

12 months BCR-ABL1 ≤ 0.1% (MMR) BCR-ABL 1 0.1 - 1% BCR-ABL1 > 1%and/orPh+ > 0

After 1 year and any time

BCR-ABL1 ≤ 0.1% Clonal chromosomeabnormalities (CCA) in Ph-cells (-7, or 7q-)

Loss of CHR, loss of CCyR, confirmed loss of MMR (>0.1%), mutations, CCA/Ph+

19-10-2016

12

67

Definitions of CMR

68

JAK2V617F mutatieInvolvement of Janus Kinases in Cytokine Signal Transduction (Panel A) and Structural Map of Janus Kinase 2 (Panel B)

Goldman JM, NEJM 2005

� verworven puntmutatie chrom 9 exon 14; G naar T op codon 617 => Valine naar phenylalanine

� 2005: first reports by 4 groups

� gain-of-function point mutation, resulting in a constitutive tyrosinephosphorylation activity -> cytokine-independent activation of JAK-STAT pathway

� proliferative and survival advantageto affected hematopoietic precursorsstimulatie erythropoïese zonder

groeifactoren zoals EPO

69

Klinisch belang JAK2V617F DIAGNOSTISCHE WAARDE:

! Belangrijke moleculaire merker bij diagnose van BCR-ABL negatieve chronische myeloproliferatieve aandoeningen; heterogene groep met vaak complexe histologische diagnose

JAK2 tijdperk: veel vereenvoudigdsimpele en relatief goedkope assay

� Ziekte van Vaquez of polycythemia vera (PV): >95% JAK2V617F positief

� Essentiële thrombocytemie (ET): ~50% positief

� Primaire myelofibrose (PMF): ~50% positief100% specifiek voor klonale aandoening

Geen onderscheid mogelijk tussen de verschillende MPD 70

JAK2 V617F qPCR

Controle PCR: amplificatie wild type en gemuteerd DNA

Mutatie PCR: amplificatie wild type allel geblokkeerd door LNA (locked nucleidacid) klem

Denys et al., J Mol Diagn 2010

71

Andere mutaties bij MPN

• MPL mutaties‘myeloproliferatieve leukemie virus’ gen codeert voor een trombopoïetine receptor (TPO)Trombopoïetine (TPO) en MPL-receptor reguleren de productie van trombocytenMeest voorkomende mutatie: MPLW515L en MPLW515K5% van PMF en 1% ET

• JAK2 exon 12 mutaties– Reeds meer dan 12 verschillende beschreven– JAK2V617F negatieve PV-patiënten (3-5%)

72

Mutation Calreticulin – CALR (1)December 2013: gelijktijdige publicatie NEJM (Nangalia et al + Klampfl et al)CALR exon 9 mutaties in meest ‘nonmutated JAK2’ MPN20-25% van alle patienten met ET of PMF (of ~60% van de JAK2/MPL negatieve ET/PMF)NIET bij PVInitiële papers JAK2 en MPL niet samen (mutual exclusivity); ondertussen reeds enkele gevallen beschreven wel beide positiefFrameshift inserties of deletiesOp heden meer dan 50 verschillende types mutaties in CALRMeest frequente (80% van CALR mutaties):

Type I: 52-bp deletieType II: 5-bp insertie

Buiten ET/PMF, enkele gevallen bij CMML, atypische CML, MDS, RARS-T

19-10-2016

13

73

Mutation CALR (2)

Belang1) Diagnostisch2) Klinisch/prognostisch

CALR-gemuteerd ET:

• minder risico op trombose

• eerder jonge personen

• Lagere WBC en Hb

• meestal hele hoge plaatjes

Indolent klinisch verloop

CALR-gemuteerd PMF: betere OS tov JAK2+/MPL+

Triple-negative PMF (nonmutated JAK2, CALR, MPL): slechtste OS met grootste risico op evolutie naar AML!

Recent werd ook aangetoond dat het type mutatie impact heeft op de prognose

Chao M P , and Gotlib J Blood 2014;123:1438-1440

74

Klinisch belang mutatieanalyse

WHO 2016 revisie

‘major’ diagnostic criteria

75

Diagnostisch belang – prognose

Belang mutaties bij MPN/MPN-MDS

JAMA Oncol. 2015 76

2016 WHO revisie

RARS-T has been accepted as a full entity (2016)New name: MDS/MPN with ring sideroblasts and thrombocytosis (MDS/MPN-RS-T)

True overlap disease

MDS like MPN like

Clinical refractory anemiatransfusion dependent

thrombocytosis(>450.000/µL)

Morphological dyserythropoiesis in the BM with ring sideroblasts (>15%)

large megakaryocytes with features resembling those in PMF or ET

Genetic SF3B1 mutation (80-90%) JAK2 mutatie (50-60%) rarely CALR/MPL

77

2 NGS panels

Gen Aandoeningen

CALR ET, PMF

CSF3R CNL, aCML

JAK2 PV, ET, PMF

MPL ET, PMF

SETBP1 CMML, aCML

SRSF2 CMML

Gen Exon Codon

ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646

CEBPA 1 Alle codonsDNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot

op R882FLT3 14-15

(ITD)20 (TKD)

ITD: alle codonsTKD: D835 en I836

IDH1 4 R132IDH2 4 R140 en R172KIT 8/17 Exon 8: T417-R420

Exon 17: D816, D820, N822

NPM1 12 Alle codons, hotspot W288

NRAS 2-3 Codons 12, 13, 61

RUNX1 3-8 Alle codonsSF3B1 14-16 Alle codonsSRSF2 1 P95TET2 1-9 Alle codonsTP53 4-9 Alle codons

U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6)

AML/MDS panel

mini MPN-panel

78

Vermoeden MPN

Bloedstaal voor Klinische Biologie (beenmerg niet nodig)

PCR t(9;22) of BCR-ABL bij leukocytose en vermoeden CML

• Opvallende polycythemie, met normale O2 saturatie

• Trombocytose

• Leukocytose

• Cytopenie (vermoeden myelofibrose)

Mutatie JAK2V617F bij polycythemie, trombocytose of vermoeden PMF

OF/EN Mutatieanalyse

m.b.v NGS

OF/EN

19-10-2016

14

79

Diagnostische uitwerking MPN/MPN-MDS panel NGS- stra tegie

Mutatie JAK2V617F

qPCR

POSITIEF>1%

Bevestiging diagnose:

95% PV

~50-60% ET en PMF~50-60% RARS-T

zeldzaam CMML

NEGATIEF OF

POSITIEF maar minimale kloon,

< 1%

- Thrombocytosis (> 400 x 109/L) / vermoeden ET

- Vermoeden myelofibrose(cytopenie)

- Polyglobulie / vermoeden PV

Vermoeden CMML, JMML, aCML, MDS/PMN-U,

RARS-T

NGS MPN panel

NGS AML panel in geval van

CMML of PMF

F

80

Terugbetaling RIZIV MPN

BCR-ABL bij Dx CML (verstrekking 588512-588523): 1x aanrekenen (dus geen uitwerking op BM en PB)

CML FU (588593-588604): 4x aanrekenen

Mutatie JAK2V617F (589691-589702 ): 1x aanrekenen

Op heden – tem 31/10/2016

Verstrekking 589691-589702 voor JAK2V617F valt weg!Aanpassing verstrekking 588512-588523 waarbij genafwijkingen door middel van een moleculair biologische methode worden opgespoord in de diagnostische investigatiefase van een chronische myeloproliferatieve neoplasie (niet meer CML).Uitwerking MPN: 2x aanrekenen (B3500)

Vanaf 1 november 2016

81

Wanneer PCR nodig?

Belang diagnose en follow-up

Moleculaire diagnostiek bij lymfomen

82

Diagnostiek

Kliniek: anamnese en lichamelijk onderzoek (gezwoll en lymfeklier)LABO

Cytomorfologisch onderzoek (klierbiopsie, uitstrijkje bloed en beenmerg)

Hoe zien de cellen eruit? Normaal of afwijkend?

Histologisch onderzoek door anatomopatholoogHoe zien de cellen en het weefsel eruit?

Immunofenotypering m.b.v. flowcytometrie

Klonaliteitsonderzoek en algemene typeringMoleculaire diagnostiek

Klonaliteitsonderzoek en opsporen specifieke translocatie

83

1 2 3 4 5 6 66 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6

VH DH JH Cµs

D J joiningH H→

V D -J joiningH H H→

precursor mRNAIGH

mature mRNAIGH

transcription

RNA splicingV DJ Cµ

27

IgH

IgL IgL

V V

C C

J J

IgHV V

D DJ J

C C

C

C

C

C

C

C

CD

79a

CD

79b

translation

junctional region

Ig (en TCR) genherschikking

84

PCR gebaseerde klonaliteit

BIOMED-2 protocol

Multiplex PCR

Verbetering sensitiviteit

Gestandaardiseerd protocol: betere inter-lab vergelijking

19-10-2016

15

85

IgH Genescan

FR1 FR2 FR3

86

Immunoglobuline genherschikkingVDJ recombinatie is uniek voor elke B-cel5 multiplex PCRs:

3 voor zware keten (FR1, FR2 en FR3)2 voor kappa lichte keten (K+Kde)(IgL: beperkte variabiliteit, interpretatie moeilijk)

IGH IGK all IGH DH-JH

VH-JH DH-JH VH-JH Vκ-Jκ Kde Vκ-Jκ + IGK + Kde*

+DH-JH + Kde

MCL (n=54) 100% 11% 100% 94% 75% 100% 100% 78%

B-CLL/SLL (n=56) 100% 43% 100% 96% 61% 100% 100% 73%

FL (n=109) 84% 19% 86% 63% 59% 84% 100% 64%

MZL (n=41) 88% 51% 95% 68% 54% 83% 100% 68%

DLBCL (n=109) 79% 30% 85% 61% 58% 80% 98% 72%

TOTAL (n=369) 88% 28% 91% 73% 60% 88% 99% 70%

BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241

87

T-cel receptor genherschikking

VDJ recombinatie specifiek voor elke cel5 multiplex PCRs

3 PCRs voor TCR beta keten2 PCRs voor TCR gamma keten

TCRB TCRG TCRB Vβ-Jβ Dβ-Jβ Vβ-Jβ Vγ-Jγ + TCRG

+ Dβ-Jβ

T-PLL (n=33) 94% 47% 100% 94% 100%

T-LGL (n=28) 86% 62% 96% 96% 100%

PTCL-U (n=47) 85% 67% 98% 94% 100%

AILT (n=37) 70% 61% 89% 92% 95%

ALCL (n=43) 70% 48% 74% 74% 79%*

TOTAL (n=188) 80% 58% 91% 89% 94%* (99%)

BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:207-241

88

Klonaliteitanalyse m.b.v. PCR

Startmateriaal: bloed, beenmerg, biopt (vers of in paraffine)

Paraffine coupes: minimum 3 coupes van 50 micron: voldoende weefsel

DNA isolatie

Klinische info !

89

VOORDELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse

Hoge klinische gevoeligheid (zie voorgaande tabelle n)Moleculaire diagnostiek vaak niet eerste lijn in de diagnostische uitwerking; vaak geen vers materiaal meer beschikbaarGefixeerd materiaal / paraffinecoupes nog bruikbaar voor PCR applicaties, FISH

CAVE belang fixatie protocol, waardoor beschadiging nucleïnezuren (gefragmenteerd); afh. Best gebufferde formol (4%) en minder dan 24h fixatieduur

90

NADELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse

ComplexInterpretatie vaak moeilijkVeel pitfallsAnalyse vereist voldoende kwantitatief en kwalitati ef (niet gefragmenteerd) DNA;

niet altijd mogelijk op paraffinecoupesCAVE pseudoklonaliteit door preferentiële amplificatie bepaalde herschikkingen (toevallige amplificatie van 1 kloon)

Vals negativiteit mogelijk: zeldzame herschikkingensomatische hypermutatie kan primer binding sites beinvloeden (vooral zware keten, lichte keten minder gevoelig)te weinig B/T cellen in gekregen materiaal

EXPERTISE VEREIST !

19-10-2016

16

91

Toepassingen klonaliteitsanalyse met PCR

DIAGNOSEHistopathologische DD maligniteit vs reactief beeld: op vers en paraffine materiaalB-cel maligniteiten: uitwerking vermoeden klonaliteit met flowcytometrie (niet altijd duidelijk)T-NHL: uitwerking aberrant fenotype gevonden met flowcytometrie

STAGING (gevoeligheid 1-10 %)

Klonale verwantschap: klonaal verband aantonen tussen verschillende lymfoproliferatieve letsels bi j diagnose of evolutie klonale verwantschap in follow -up stalen

92

Niet geschikt voorBepaling lineage (T vs B vs NK): ook IgH herschikking mogelijk in T-cel abnormaliteit en vice versaFollow-up van behandeling (gevoeligheid is beperkt)Bepaling biklonaliteit (door combinatie van primer technisch meerdere pieken mogelijk te wijten aan 1 kloon)

Toepassingen klonaliteitsanalyse met PCR

93

Vermoeden lymfoproliferatieve aandoening

Bloedstaal voor:

TCR genherschikking PCR

B-cel: bepaling mKappa / mLambda expressie

T-cel: aantonen aberrante populatie (weinig specifiek)

OF/EN

PCR

Klinische biologie UZ Gent

Flowcytometrie:

Ig genherschikking PCR

94

BCL1-IgH of t(11;14)Genetic hallmark voor mantelcellymfomen (vrijwel al le)IgH-BCL1 herschikkingBCL1 (=CCND1):

cycline D1 (oncogen) onder controle van enhancer regio van IgHgeen abnormaal fusieproteïne gevormd, enkel verhoogde expressie van cycline D1

Variabiliteit in breukpunten (FISH is ‘golden stand ard’)

van Dongen et al.,Leukemia, 2003

95

BCL1-IgH of t(11;14)Variabiliteit in breukpunten (FISH is ‘golden stand ard’)PCR gebaseerde methode mbv 5’ MTC regio: 40% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerd

Indien PCR positief, wel nuttig voor MRD analyseGevoelige assay: 0,01%


96

BCL2-IgH of t(14;18)

Folliculair lymfoom of grootcellig B-cel lymfoom

BCL2 (anti-apoptotisch):onder controle van enhancer regio van IgHgeen fusieproteine, enkel verhoogde expressie van BCL2geen supergevoelige PCR gebruiken (translocatie ook te vinden in gezonde individuen)

FISH = gouden standaard (detectie alle breekpunten)

PCR gebaseerde methode; 3 sets van primers 60% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerdMRD analyse

19-10-2016

17

97

BCL2-IgH of t(14;18)

4 belangrijk regio’s met frequente breukpunten 3 multiplex PCRs bij nieuwe DxGevoeligheid follow-up: 0.01-0.001%


Vermoeden MCL of FLStaal voor:

Karyotypering FISHPCR


Flowcytometrie

FISH op celsuspensie

Geen karyotypering meer!

99

CLL-epidemiology

20-25% of all leukemic diseases

• Incidentie: 3 (2- 4,5) /100 000/jaar / western countries (>70 years: 50/100 000/jaar) / 20-25% van alle leukemieën

• Mediane leeftijd: 65–70 jaar

• Maligniteit van rijpe 5 (memory) B-cellen

• Monoclonale proliferatie van afunctionele lymfocyten met een niet gekarakteriseerd apoptosedefect.

100

CLL = heterogene aandoening

101

• Clinical staging Rai, Binet

• Lymphocyte doubling time (LDT)

• Pattern of marrow involvement (nodal, mixed, diffuse)

• Pattern of lymph node infiltration?

• Serum markers: LDH, beta2-microglobulin, thymidinekinase, sCD23, sCD54, sCD20

• Phenotype CD38, ZAP-70

• IGVH gene mutation status

• Genetic aberrations

CLL – prognostische factoren

102

Genetische afwijkingen bij CLL

Chromosomale afwijkingen bij 80% van de CLL patiënten

Meest frequente deleties en gains� Trisomie 12� Deletie 13q14� Deletie 11q22� Deletie 17p13

Verstoring p53 pathway

19-10-2016

18

103

CLL- prognose van cytogenetische afwijkingen

Döhner et al, NEJM 2000104

Genetische afwijkingen: detectiemethoden

Klassieke cytogenetica: karyotypering

FISH: slechts 50% van de chromosoomafwijkingen te detecteren

Array CGH (comparative genomic hybridisation)

105

Deletie 11q, trisomie 12, deletie 15q, deletie Xp?

Array-CGH

106

Genetische afwijkingen bij Multiple Myeloom

Chromosomale afwijkingen bij 90% van de MM patiëntenTranslocaties: IgH gen op chromosoom 14q32 (50-70%) -> t(4;14) / t(11;14) / t(14;16)Meest frequente deleties en gains� 1q afwijking (winst)� Deletie 13q14 (50%)� Deletie 17p13

TP53 mutaties

107

CLL en MMStaal voor:

Karyotypering FISH

PCR

Klinische biologie

CMGG

Flowcytometrie

108

Chronisch lymfoproliferatieve aandoeningen

19-10-2016

19

109

Nieuwe genetische afwijkingen in lymfoproliferatieve aandoeningen

BRAF V600E mutatieWHO 2008: 'no cytogenetic abnormality is specific for hairy cell leukemia’ BRAF V600E mutaties komen voor in hairy cell leukemie (HCL), maar niet in de morfologisch moeilijk te onderscheiden variant, HCL-vBelangrijke diagnostische waarde

MYD88 L265P mutatieTerug gevonden bij > 90% van de M. Waldenström of LPLBelang sensitieve techniekInvloed NF-kB pathway -> Velcade (bortezomib) werkt in op NF-kB pathway

110

MDGElien De Latter

Joni Van der Meulen

Klinische BiologieBarbara Denys

Karl Vandepoele

Centrum Medische Genetica

Nadine Van Roy

111

Postgraduaatvergadering Klinische Biologie

17/11/2016 – 20h

2016 revisie WHO classificatie hematopoïetischemaligniteiten

moleculaire diagnostiek in hematologie gab 18102016...

Documents